專利名稱：抗菌蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗菌劑領(lǐng)域，特別是作用于人或動(dòng)物的病原體的抗菌劑。
背景技術(shù)：
細(xì)菌感染細(xì)菌是至今為止最普遍的人類感染的病因。全球大于三分之一的人口有可能被細(xì)菌性病原體感染，并且每年兩百萬人死于細(xì)菌性病原體感染。根據(jù)疾病控制中心(CDC)和世界健康組織(WHO)的記載，現(xiàn)今全球最普遍的感染性疾病包括以下細(xì)菌感染:霍亂:該疾病主要通過被污染的飲用水和不衛(wèi)生條件進(jìn)行傳播。該疾病是印度次大陸，俄羅斯，和南撒哈拉非洲的地方性疾病，它是一種霍亂弧菌(Vibrio cholerae)引起的急性腸道感染病。其主要癥狀是大量腹瀉。5%到10%的感染者會(huì)呈現(xiàn)嚴(yán)重癥狀，包括嘔吐和腿痛性痙攣。在這些嚴(yán)重的表現(xiàn)癥狀中，霍亂會(huì)導(dǎo)致脫水致死。每年世界健康組織(WHO)約有200，000例相關(guān)報(bào)道。腦膜炎:也稱為脊膜炎，這是一種脊髓感染疾病。通常是由病毒或細(xì)菌感染的結(jié)果。細(xì)菌性腦膜炎比病毒性腦膜炎更為嚴(yán)重，并可能引發(fā)大腦損傷，聽力損失，以及學(xué)習(xí)障礙。該疾病可能是由以下細(xì)菌引起，比如，B型流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae),腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)，或肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)。每年約有120萬個(gè)細(xì)菌性腦膜炎病例，其中死亡率大于十分之一。癥狀包括劇烈頭痛，高燒,惡心，嘔吐,嗜睡,譫妄,畏光,和僵頸。肺炎:該疾病有許多可能病因，但通常是鏈球菌或支原體細(xì)菌感染。這些細(xì)菌可以在人體內(nèi)存活若干年而不引發(fā)感染，并僅在其他疾病降低了人體對(duì)疾病的免疫力的時(shí)候顯現(xiàn)出來。最普遍的類型是肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)引發(fā)的比支原體性肺炎更為嚴(yán)重的鏈球菌性肺炎。每年高于100,000的肺炎住院治療是由肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)引起的，以及6，000, 000的中耳炎和高于60，000的侵襲性疾病比如腦膜炎也是由鏈球菌性肺炎引起的。志賀桿菌病:該感染每年全球大約引發(fā)600，000例死亡。在衛(wèi)生條件欠佳的發(fā)展中國家非常普遍。志賀桿菌可以引起細(xì)菌性痢疾，或志賀桿菌病。癥狀包括伴有血便的痢疾，嘔吐，以及腹絞痛。膿毒性咽喉炎:該疾病是由鏈球菌引起。每年會(huì)發(fā)生數(shù)百萬例膿毒性咽喉炎。其癥狀包括咽喉腫痛，高燒，頭痛，疲勞，以及惡心。結(jié)核病:該疾病每年引起將近兩百萬死亡例，根據(jù)WHO預(yù)計(jì)，在2000到2020年之間，如果不采取更有效的預(yù)防措施，將會(huì)有近十億人感染該病。結(jié)核桿菌(比如分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis))最常發(fā)現(xiàn)于肺中，可以引發(fā)胸部疼痛以及引起血痰的劇烈咳嗽。其他癥狀包括疲勞，體重減輕，食欲不振，寒戰(zhàn)，高燒，以及盜汗。

傷寒:傷寒熱是由傷寒桿菌引起，每年在12，000，000-17，000，000個(gè)病例中，大約有600，000例死亡例。該疾病通常通過感染的食物或水傳播。其癥狀包括突然和持續(xù)高燒，劇烈頭痛，惡心，嚴(yán)重食欲不振，便秘，以及有時(shí)會(huì)有腹瀉。但是，準(zhǔn)確的病例數(shù)量難以確定，尤其是多數(shù)該類疾病是發(fā)展中國家的地方性疾病，許多人無法得到現(xiàn)代醫(yī)療。每年由感染性疾病引起的死亡中，其中大約一半僅是由三種疾病引起:結(jié)核病，瘧疾，以及艾滋病?？傊?，這些疾病每年引起超過300，000，000例病患并導(dǎo)致超過5，000, 000例死亡。現(xiàn)代時(shí)期抗生素的使用始于19世紀(jì)和20世紀(jì)早期，伴隨由青霉(Penicilliumnotatum)產(chǎn)生的具有有效的抗菌活性的青霉素活性成分的鑒定而產(chǎn)生。但是，在1955年之前，其銷售未受控制，過度無控制的使用導(dǎo)致耐藥菌的出現(xiàn)?？股啬退幮员愠蔀橹饕獑栴}，葡萄球菌耐藥感染流行病開始在醫(yī)院中出現(xiàn)。20世紀(jì)早期已經(jīng)可見抗生素的發(fā)展，比如磺胺，鏈霉素，新霉素，氯霉素，頭孢菌素，以及四環(huán)素。許多這些化合物至今仍在使用，但所有這些抗生素都面臨抗藥性發(fā)展的挑戰(zhàn)，以及其中一些面臨存在毒性問題。例如，鏈霉素會(huì)引起腎臟損傷和耳聾，而氯霉素會(huì)引起嚴(yán)重的副作用(比如，嚴(yán)重的血液疾病，包括貧血和白血病)。對(duì)抗生素的進(jìn)一步研究發(fā)生于上世紀(jì)60年代，導(dǎo)致了第二代抗生素的發(fā)展。其中包括青霉素的半合成衍生物甲氧西林，這是特別針對(duì)青霉素的耐藥性問題而生產(chǎn)的。甲氧西林被譽(yù)為對(duì)抗青霉素細(xì)菌耐藥性戰(zhàn)爭(zhēng)中的一個(gè)主要突破，但是 不幸的是，事實(shí)并非如此，現(xiàn)在已經(jīng)存在耐甲氧西林的細(xì)菌。氨芐青霉素也是青霉素衍生物。其開發(fā)為擴(kuò)大青霉素可治療的感染的范圍，并如今在很大程度上取代了青霉素。在治療包括呼吸道和泌尿道感染全范圍感染中，該藥物往往是第一選擇。阿莫西林是另外一個(gè)廣泛應(yīng)用的青霉素衍生物。如同氨芐青霉素，該藥物具有廣譜活性。慶大霉素與鏈霉素(于1943年發(fā)現(xiàn)的抗結(jié)核藥物)一樣，屬于相同的抗生素家族。該藥物因?yàn)閷?duì)耳朵和腎臟有嚴(yán)重的毒副作用，通常保留用于治療嚴(yán)重感染。最近，藥物實(shí)驗(yàn)室開發(fā)了一種叫做喹諾酮類藥物的抗生素家族，也稱為氟喹諾酮類藥物。除了對(duì)廣范圍的細(xì)菌有效之外，該類抗生素口服便可以在血液中達(dá)到高濃度。這意味著更多曾經(jīng)需要住院治療的感染現(xiàn)在可以在家治療。氟喹諾酮類藥物僅用于嚴(yán)重疾病的病人和/或需要長(zhǎng)期使用抗生素情況(幾周或幾個(gè)月)的病人。除了這些第二代化合物的發(fā)展，不斷涌現(xiàn)的抗性問題仍然是個(gè)問題。典型的是使用后的藥物抗性，尤其是藥物的廣泛使用或誤用，最終導(dǎo)致該藥物在治療人類疾病中的有效性喪失?？刮⑸锼幬锏某掷m(xù)使用增加了選擇性壓力，這些選擇性壓力有利于耐藥菌株的出現(xiàn)，倍增，以及傳播。其原因是抗微生物藥物的不合理使用和不加控制的使用，包括處方用藥過量，亞適量給藥，治療時(shí)間不足，導(dǎo)致藥物的選擇不當(dāng)?shù)恼`診，以及在家中和學(xué)校等地方使用(尤其是過量使用)抗菌家用產(chǎn)品。在某些情況下,抗性迅速顯現(xiàn)(比如，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)對(duì)惡啉(OXALIN)的抗性僅在幾年內(nèi)形成)，但是在其他情況下，可能需要更長(zhǎng)時(shí)間才出現(xiàn)(比如，屎腸球菌(Enterococcus faecium)對(duì)萬古霉素的抗性經(jīng)過30年才形成)。這時(shí)間幀差異的原因尚不清楚，但很可能是多因素導(dǎo)致。但是，細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的殺傷作用的規(guī)避能力已經(jīng)明顯的阻礙了其在治療個(gè)體病人中的能力以及控制傳染病大爆發(fā)的能力。例如，WHO評(píng)估每年有將近500，000耐多藥結(jié)核(MDR-TB)的新例，大約在9.000.000所有類型的結(jié)核病例中占了 5%。
一些耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)菌株尤其容易在醫(yī)院傳播。美國的很多醫(yī)院，高于70%的從病人中分離的金黃色葡萄球菌(S.aureus)為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，并且這些菌株往往對(duì)除萬物霉素，利奈唑胺，達(dá)托霉素和替加環(huán)素以外的所有許可類藥物都有抗性。最近，美國在病人中分離出完全耐萬古霉素金黃色葡萄球菌菌株，這將進(jìn)一步增加治療難度。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌在很多醫(yī)院已經(jīng)高度流行，該微生物一旦被引入到醫(yī)院，將很難根除。根除問題在耐萬古霉素屎腸球菌(E.faecium)菌株(VRE)中也存在，該菌株通常也對(duì)各種其他臨床許可藥物具有抗性。屎腸球菌中的萬古霉素耐性經(jīng)常是質(zhì)粒介導(dǎo)的，并可能是多種特殊的耐受因素的結(jié)果。屎腸球菌中耐青霉素和耐糖肽的結(jié)合會(huì)引發(fā)無法有效治療的感染。但幸運(yùn)的是，多數(shù)耐萬古霉素屎腸球菌引發(fā)定植而非感染。當(dāng)感染發(fā)生時(shí)使用抗生素是無法治療的。喹諾酮類藥物耐性甚至在治療期間會(huì)快速形成?，F(xiàn)今，一些細(xì)菌已經(jīng)取得“超級(jí)細(xì)菌”的地位，比如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，耐萬古霉素腸球菌，耐喹諾酮類肺炎鏈球菌。針對(duì)這些病原體僅有少量或根本沒有可以用于治療的抗生素，但是，令人吃驚的是，在過去的40年里，且均從1999年開始，僅引入了少數(shù)幾類新型抗生素，包括鏈霉殺陽菌素組合，奎奴普丁 /達(dá)福普丁(共殺素)，惡唑烷酮利奈唑酮，和脂肽達(dá)托霉素。對(duì)用來治療細(xì)菌病原體誘發(fā)的疾病的新型抗生素的需求不斷增長(zhǎng)，尤其是由于抗菌素耐藥性問題。如上所述，許多病原體都顯現(xiàn)對(duì)用于治療的強(qiáng)效抗生素的抗性。令人吃驚的是，耐藥性通常不僅局限于單一藥物，而是可能涉及多重藥物耐藥性。尋找新的和更有效的藥物至今仍在繼續(xù)，尤其是尋找針對(duì)譜抗生素來規(guī)避多藥耐藥性的機(jī)制。但是，這種探索的進(jìn)程非常緩慢，因?yàn)槿缃裰扑幑精@得新藥許可越來越困難。此外，其中涉及的費(fèi)用以及從實(shí)驗(yàn)室中新型抗生素的鑒定到產(chǎn)品商業(yè)化生產(chǎn)許可之間的延時(shí)非常大，這已經(jīng)使許多公司完全放棄了該市場(chǎng)。真菌感染真菌感染的發(fā)生率 在過去的三十年中一直增長(zhǎng)，在某種程度上是因?yàn)槊庖呦到y(tǒng)失調(diào)的病人數(shù)量的增加的結(jié)果。真菌感染是近年來醫(yī)學(xué)進(jìn)步的直接結(jié)果，尤其是在癌癥治療中，導(dǎo)致免疫抑制患者數(shù)量增加。真菌感染數(shù)量增加的一些其他原因也已經(jīng)提出，其中包括腸外營養(yǎng)和中心靜脈導(dǎo)管，廣譜抗生素治療，懷孕，非控制糖尿病患者，實(shí)體器官移植受體，艾滋病患者，接受細(xì)胞毒性化療的癌癥患者，燒傷或中性粒細(xì)胞減少癥患者，以及胃腸道疾病。最嚴(yán)重的真菌感染是伴隨高死亡率的侵襲性真菌感染(IFI)(比如，血液感染)。念珠菌屬(Candida)是侵襲性真菌感染最常見的致病物，其平均死亡率為30%。50%的侵襲性念珠菌感染是由白色念珠菌(Candida albicans)引起，但是非白色念珠菌引發(fā)感染的相對(duì)頻率也在穩(wěn)步增長(zhǎng)，也即光滑念珠菌(Candida glabrata),近平滑念珠菌(Candidaparapsilosis),熱帶念珠菌(Candida tropicalis)和克柔念珠菌(Candida krusei)。曲霉(Aspergillus)屬真菌是最常分離的侵襲性霉菌,其中主要種類為煙曲霉(Aspergillusfumigatus)。如同念珠菌感染，侵襲性曲霉病通常伴隨危重患者，雖然依賴于特異個(gè)體感染情況考慮，但該病的死亡率更高:比如，85%或更高的為侵染性或中央神經(jīng)系統(tǒng)疾病，以及60 %的為彌散性肺病。
侵襲性真菌感染的流行和死亡率在過去的三十年中持續(xù)增長(zhǎng)。美國數(shù)據(jù)顯示，1980年有828例死亡例是由該疾病引起，該病是致死感染病中第十大主要原因。1997年，同樣數(shù)據(jù)資料顯示，死亡數(shù)量已經(jīng)上升至2370并且已經(jīng)成為終極感染中第七大最主要原因。最近數(shù)據(jù)顯示，念球菌已經(jīng)比大腸桿菌(Escherichia coli)和假單胞菌(Pseudomonas)更廣泛流行，如今已成為美國第四大最普遍的致死感染。念珠菌侵襲性真菌感染在醫(yī)院環(huán)境中增加，并且可以預(yù)計(jì)這些感染的危險(xiǎn)因素的增加會(huì)進(jìn)一步增長(zhǎng)。美國每年8% -10%的醫(yī)院中的侵襲性真菌感染是由念珠菌引起，并且每年發(fā)生率為每100，000個(gè)人中有6-23人感染。侵襲性念珠菌病的主要問題并不僅是它的高死亡率，而是感染病人3-10天的過長(zhǎng)的住院時(shí)間，美國每年治療念珠菌病的預(yù)算估計(jì)大約為一億美元。最近發(fā)表的關(guān)于葡萄牙人口的研究顯示，病房真菌血癥的發(fā)生率為每1，000個(gè)住院者中有2.7例，死亡率為39.3%。據(jù)另一個(gè)發(fā)表的關(guān)于歐洲侵襲性真菌感染發(fā)生率的最近研究表明，該數(shù)量仿佛與歐洲其他國家的發(fā)生率更相近，但是比美國人口中發(fā)現(xiàn)的發(fā)生率要低很多。另一項(xiàng)近期報(bào)告顯示，蘇格蘭念珠菌血癥的發(fā)生率為每年每100，000人口中有4.8例。自二十世紀(jì)五十年代末，對(duì)威脅生命的真菌感染的治療護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)一直是兩性霉素B。該化合物以真菌細(xì)胞膜中的固醇類為靶點(diǎn)并與之結(jié)合，從而產(chǎn)生離子通道，導(dǎo)致膜電位的損失并之后瓦解。盡管該類藥物仍然是最廣譜有效的殺真菌劑，其高毒性和需要腸胃外給藥限制了該類藥物的使用。1990年代見證了兩性霉素B脂質(zhì)體的制備，以及三唑，氟康唑和伊曲康唑的引入。三唑通過抑制CYP-450依賴的羊毛留醇14 α -去甲基化酶，其可以干擾細(xì)胞生長(zhǎng)，從而影響麥角固醇的合成從而發(fā)揮作用 并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。這些藥物與兩性霉素B相比具有明顯優(yōu)勢(shì)，但其仍受限于制備，活性譜和/或增長(zhǎng)的耐藥性。自2000年以來，新型抗真菌藥物持續(xù)發(fā)展，以克服現(xiàn)有藥物的局限性，比如廣譜三唑類(伏立康唑和泊沙康唑)，以及棘白菌素(卡泊芬凈、米卡芬凈、阿尼芬凈)。棘白菌素抑制β -1，3-D-葡聚糖的合成，導(dǎo)致真菌細(xì)胞壁的不穩(wěn)定、細(xì)胞裂解、以及細(xì)胞死亡。該藥在體外對(duì)白色念珠菌(Candida)和曲霉菌(Aspergillus)類也具有活性，但是對(duì)大范圍的其他新出現(xiàn)的病原真菌并不具有活性。即使在這些新藥物中，仍具有如藥物不良反應(yīng)(尤其是伏立康唑)，伴隨三唑藥物的藥物之間相互作用，以及缺乏替代制劑(如，靜脈制劑缺乏泊沙康唑，而口服制劑缺乏棘白菌素)等局限?，F(xiàn)今有效的抗真菌藥物對(duì)白色念珠菌(Candida albicans)定植的預(yù)防性根除也是低效的。事實(shí)上，這種酵母具有生物膜生長(zhǎng)的能力，該生物膜生長(zhǎng)表現(xiàn)出對(duì)抗真菌劑的天然耐性的增加，該類抗真菌劑如唑類，多烯類和5-氟胞嘧啶。因此，念珠菌經(jīng)常與內(nèi)置的醫(yī)療器械相關(guān)(比如，牙種植體、導(dǎo)管、心臟瓣膜、血管旁路移植術(shù)、眼晶狀體、人工關(guān)節(jié)、以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)分流器)，此類器械都是可以作為生物膜的生長(zhǎng)基質(zhì)。在427例念珠菌血癥患者的多中心研究中，與導(dǎo)管相關(guān)的念珠菌血癥患者的死亡率為41%。因此，盡管新的抗菌藥物在持續(xù)發(fā)展，病房真菌感染的死亡率仍然相當(dāng)高。此外，新出現(xiàn)的真菌病原體也越來越多，包括念珠菌屬非白色念珠菌(Candida)和曲霉屬非煙曲霉(Aspergillus),該類真菌通常更難診斷治療，從而引發(fā)更高的死亡率。本發(fā)明的發(fā)明目的在于試圖解決所述問題，其目的尤其在于，例如，提供一種對(duì)人/動(dòng)物病原體具有有效和廣譜活性并同時(shí)低毒性的可替代的抗菌劑。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明人驚訝的發(fā)現(xiàn),源自羽扇豆屬(Lupinus)的Blad多肽(Blad polypeptide)對(duì)大量不同的對(duì)人或動(dòng)物體致病的細(xì)菌和真菌生物體均顯示出有效的抗菌活性。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)，該Blad多肽對(duì)動(dòng)物體是無毒的，因此該多肽作為針對(duì)人和動(dòng)物病原體的抗菌劑，是一種非常好的化合物，廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。因此，本發(fā)明提供了一種含Blad或其活性變體的抗菌多肽的組合物，通過治療或預(yù)防手段用于人或動(dòng)物體的治療方法。本發(fā)明還提供了所述組合物在被微生物感染的個(gè)體體內(nèi)或體表的治療或預(yù)防的方法中的應(yīng)用。在優(yōu)選實(shí)施例中，該組合物進(jìn)一步包含一個(gè)藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑和/或螯合劑。優(yōu)選的，該組合物應(yīng)用于上述方法中，其中，所述個(gè)體為免疫系統(tǒng)缺乏的個(gè)體或重病個(gè)體。本發(fā)明還提供了一種包含含Blad或其活性變體的抗菌多肽的組合物的應(yīng)用，用以殺死或抑制對(duì)人類或動(dòng)物致病的微生物的生長(zhǎng)，該作用位點(diǎn)不在人或動(dòng)物體體內(nèi)或體表。優(yōu)選的，所述組合物用于針對(duì)人或動(dòng)物病原微生物，對(duì)由人類或動(dòng)物攝入或者直接置于人或動(dòng)物體表或體內(nèi)的物品或有需要消毒的表面進(jìn)行消毒，優(yōu)選地，其中所述物品為食物或醫(yī)療器件或其中所述的表面位于以下的環(huán)境中:(a)進(jìn)行健康檢查，診斷或治療的環(huán)境；(b)制作食物或處理食物或儲(chǔ)存食物的環(huán)境；(c)進(jìn)行個(gè)人清洗和/或個(gè)人衛(wèi)生的環(huán)境；和/或(d)具有特殊風(fēng)險(xiǎn)的人所在的環(huán)境

(i)具有獲得微生物感染風(fēng)險(xiǎn)的人；和/或(ii)具有離開醫(yī)療干預(yù)便無法清除微生物感染的風(fēng)險(xiǎn)的人。 在這些應(yīng)用的優(yōu)選實(shí)施例中，所述組合物還進(jìn)一步包含一個(gè)螯合劑。在優(yōu)選實(shí)施例中，所述微生物體為細(xì)菌或真菌，其中優(yōu)選的:-所述細(xì)菌是以下屬中的其中一種病原菌屬:假單胞菌(Pseudomonas),李斯特菌(Listeria),芽抱桿菌(Bacillus),葡萄球菌(Staphylococcus)和沙門氏菌(Salmonella);或者-所述真菌是以下屬中的其中一種病原菌屬:念珠菌(Candida),曲霉菌(Aspergillus),鏈格孢菌(Alternaria),鐮孢菌(Fusarium),隱球菌(Cryptococcus)，和毛孢子菌(Trichosporon)，優(yōu)選的其中所述真菌能引發(fā)侵襲性真菌感染，優(yōu)選的為白色念珠菌(C.albicans),煙曲霉(A.fumigatus)或互隔交鏈格抱菌(Alternaria alternata)。發(fā)明人還提供了:-一種人或動(dòng)物的治療方法，包括向有需要的個(gè)體施用含有治療有效劑量的抗菌多肽的組合物，該抗菌多肽包含Blad或其活性變體；-一種預(yù)防或治療微生物感染的方法，包括給有需要的個(gè)體施用含有治療有效劑量的抗菌素多肽的組合物，該抗菌多肽包含Blad或其活性衍生物；以及-一種殺死或抑制對(duì)人或動(dòng)物致病的微生物生長(zhǎng)的方法，其作用位點(diǎn)不在人或動(dòng)物體體表或體內(nèi)，所述方法包括在所述作用點(diǎn)施用含有治療有效劑量的抗菌多肽的組合物，該抗菌多肽包含Blad或其活性衍生物。


本發(fā)明將參考附圖進(jìn)行說明，其中:圖1,顯示單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)和銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginos)的時(shí)間-殺菌曲線；圖2,顯不金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis),銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)和單核細(xì)胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)的抑菌圈；圖3A,顯示白色念珠菌(C.albicans)的時(shí)間-殺菌曲線；圖3B和圖4,顯示白色念珠菌(C.albicans)的生長(zhǎng)曲線；圖5至圖8共同顯不白色念珠菌(C.albicans)、新型隱球菌(Cryptococcusneoformans)和煙曲霉(A.fumigatus)的抑菌圈；圖9顯示單核細(xì)胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)、銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)和白色念珠菌(C.albicans)的時(shí)間-殺菌曲線；圖10顯示白羽扇豆(Lupinus albus) β -球蛋白前體編碼序列(SEQ ID NO:1)；以及圖11顯示對(duì)應(yīng)于Blad的β-球蛋白前體的內(nèi)部片段的編碼序列，(SEQ ID NO:3)。`
具體實(shí)施例方式BladBlad(" ban da de Lupinus albus doce" -band from sweet L.albus,名稱源自白花羽扇豆)是以β -球蛋白的穩(wěn)定的中間的分解產(chǎn)物命名的，是羽扇豆屬(Lupinus)的種子中主要的儲(chǔ)存蛋白。Blad為一個(gè)20kD的多肽，由173個(gè)氨基酸殘基組成，并由羽扇豆中的球蛋白前體的編碼基因(1791個(gè)核苷酸，GenBank中儲(chǔ)存的收錄編號(hào)為AAS97865)的內(nèi)部片段(519個(gè)核苷酸，GenBank中儲(chǔ)存的收錄編號(hào)為ΑΒΒ13526)所編碼。當(dāng)編碼Blad末端序列的引物用于擴(kuò)增羽扇豆DNA基因組序列時(shí)，可以得到一個(gè)大約620bp的產(chǎn)物，表明在編碼Blad的基因片段中有一個(gè)內(nèi)含子存在。天然形成的Blad是210kD的低聚糖的主要成分，該低聚糖在開始發(fā)芽之后的4-12天，特異的聚集于羽扇豆的子葉中(隨后β-羽扇豆球蛋白發(fā)生密集的限制性蛋白水解)。同時(shí)，所述低聚物被糖基化，天然形成的Blad是非糖基化的。含Blad的寡聚糖由多個(gè)多肽組成，其中主要的幾個(gè)分子量分別為14、17、20、32、36、48和50kD。該20kD的多肽Blad，是至今為止低聚物中最豐富的多肽，并且可能是唯一一個(gè)具有凝集素活性的多肽。天然形成的Blad在8天齡植物子葉總蛋白中占大約80%。圖10顯示所述白花羽扇豆β -球蛋白前體的編碼序列(SEQ ID NO:1)。β -球蛋白母亞基編碼序列位于70-1668位殘基。編碼的533氨基酸殘基β-球蛋白母亞基(SEQID NO:2)為:MGKMRVRFPTLVLVLGIVFLMAVSIGIAYGEKDVLKSHERPEEREQEEffQPRRQRPQSRREEREQEQEQGSPSYPRRQSGYERRQYHERSEQREEREQEQQQGSPSYSRRQRNPYHFSSQRFQTLYKNRNGKIRVLERFDQRTNRLENLQNYRIVEFQSKPNLILPKHSDADYVLVVLNGRATIIVNPDRRQAYNLEYGDALRIPAGSSYILNPDDNQKLRffKLAIPINNPGYFYDFYPSSKDQQSYFSGFSRNTLEAFNTRYEEIQRIILGNEDEQEYEEQRRGQEQSDQDEGVIVIVSKKQIQKLTKHAQSSSGKDKPSDSGPFNLRSNEPIYSNKYGNFYEIPDRNPQVQDLNISLTYIKINEGALLLPHYNSKAlYffffDEGEGNYELVGIRDQQRQQDEQEEKEEEVIRYSARLSE⑶IFVIPAGYPISINASSNLRLLGFGINADENQRNFLAGSKDNVIRQLDRAVNELTFPGSAEDIERLIKNQQQSYFANGQPQQQQQQQSEKEGRRGRRGSSLPF圖11顯示了對(duì)應(yīng)Blad的β-球蛋白前體內(nèi)部片段的編碼序列(SEQ ID NO:3)。該 Blad 多肽(SEQ ID NO:4)為:RRQRNPYHFSSQRFQTLYKNRNGKIRVLERFDQRTNRLENLQNYRIVEFQSKPNTLILPKHSDADYVLVVLNGRATIIVNPDRRQAYNLEYGDALRIPAGSSYILNPDDNQKLRWKLAIPINNPGYFYDFYPSSKDQQSYFSGFSRNTLEAFNTRYEEIQRIILGNED
本發(fā)明涉及一種包含含有Blad或其活性變體的抗菌多肽的組合物。因此，其涉及一種含抗菌多肽的組合物，該抗菌多肽含SEQ ID NO:4的多肽序列或其活性變體。在其中可選的具體實(shí)施例中，該組合物主要由含blad或其活性變體的抗菌多肽組成，和/或所述抗菌多肽主要由blad或其活性變體組成。在進(jìn)一步的具體實(shí)施例中，所述含(或主要包含)blad或其活性變體的抗菌多肽可能以單獨(dú)的方式使用。Blad的活性變體是指保持了作為抗菌劑的能力(即具有抗菌活性-參照以下關(guān)于該活性水平和如何測(cè)量的說明)的Blad變體?！癰lad的活性變體”包括在其范圍內(nèi)的一個(gè)SEQ ID N0:4片段。在優(yōu)選的具體實(shí)施例中，SEQ ID NO:4片段為選自為SEQ ID NO:4序列長(zhǎng)度的至少10%，優(yōu)選的為至少其長(zhǎng)度的20%，優(yōu)選的為至少其長(zhǎng)度的30%，優(yōu)選的為至少其長(zhǎng)度的40%，優(yōu)選的為至少其長(zhǎng)度的50%，優(yōu)選的為至少其長(zhǎng)度的60%，優(yōu)選的為至少其長(zhǎng)度的70%，優(yōu)選的為至少其長(zhǎng)度的80%，優(yōu)選的為至少其長(zhǎng)度的90%，以及最優(yōu)選的為至少SEQ ID NO:4序列長(zhǎng)度的95%。Blad或其變體通常具有至少10個(gè)氨基酸殘基的長(zhǎng)度,如至少20個(gè)、25個(gè)、30個(gè)、40個(gè)、50個(gè)、60個(gè)、80個(gè)、100個(gè)、120個(gè)、140個(gè)、160個(gè)或173個(gè)氨基酸殘基的長(zhǎng)度?！癇lad的活性變體”還包括在其范圍內(nèi)的一個(gè)與SEQ ID NO:4同源的多肽序列，比如至少40 %相同,優(yōu)選的至少60 %相同，優(yōu)選的至少70 %相同,優(yōu)選的至少80 %相同,優(yōu)選的至少85 %相同，優(yōu)選的至少90 %相同，優(yōu)選的至少95 %相同，優(yōu)選的至少97 %相同，以及最優(yōu)選的至少99%相同，例如，超過全序列或超過至少20個(gè)連續(xù)氨基酸殘基區(qū)域，優(yōu)選的超過至少30個(gè)連續(xù)氨基酸殘基區(qū)域，優(yōu)選的超過至少40個(gè)連續(xù)氨基酸殘基區(qū)域，優(yōu)選的超過至少50個(gè)連續(xù)氨基酸殘基區(qū)域，優(yōu)選的超過至少60個(gè)連續(xù)氨基酸殘基區(qū)域，優(yōu)選的超過至少80個(gè)連續(xù)氨基酸殘基區(qū)域，優(yōu)選的超過至少100個(gè)連續(xù)氨基酸殘基區(qū)域，優(yōu)選的超過至少120個(gè)連續(xù)氨基酸殘基區(qū)域，優(yōu)選的超過至少140個(gè)連續(xù)氨基酸殘基區(qū)域，以及最優(yōu)選的超過至少160或更多的連續(xù)氨基酸殘基的區(qū)域。測(cè)量蛋白同源性的方法是本領(lǐng)域公知常識(shí)，而且在本文內(nèi)容中本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解同源性是基于相同氨基酸而計(jì)算的(有時(shí)也稱為“硬同源”)。具有同源活性的Blad變體典型的是通過取代，插入或缺失從而與SEQ ID N0:4多肽序列區(qū)別開來的，例如，通過1、2、3、4、5到8或更多位取代，缺失或插入的方式。該取代更多為“保守的”，也即，一個(gè)氨基酸可能被另一個(gè)相似氨基酸取代，相似氨基酸可以借由為以下組的其中一個(gè):芳香殘基(F/H/W/Y)，非極性脂肪族殘基(G/A/P/I/L/V)，極性不帶電脂肪族殘基(C/S/T/M/N/Q)和極性帶電脂肪族殘基(D/E/K/R)。優(yōu)選的亞族包括:G/A/P ；I/L/V ；C/S/T/M ；N/Q ；D/E ;和 K/R?！N含Blad或其活性變體的抗菌多肽(如上所述)可能由在N末端和/或C末端添加了任意數(shù)量的氨基酸的Blad或其活性變體組成，并且該抗菌多肽保持了抗菌活性(再次參照以下關(guān)于所述活性水平和如何測(cè)量的說明)。優(yōu)選的，不超過300個(gè)氨基酸殘基添加至Blad或其活性變體的一個(gè)末端或者兩個(gè)末端，更優(yōu)選的，不超過200個(gè)氨基酸殘基添加至Blad或其活性變體的一個(gè)末端或者兩個(gè)末端，更優(yōu)選的，不超過150個(gè)氨基酸殘基添加至Blad或其活性變體的一個(gè)末端或者兩個(gè)末端，更優(yōu)選的，不超過100個(gè)氨基酸殘基添加至Blad或其活性變體的一個(gè)末端或者兩個(gè)末端，更優(yōu)選的，不超過80、60、或40個(gè)氨基酸殘基添加至Blad或其活性變體的一個(gè)末端或者兩個(gè)末端，最優(yōu)選的，不超過20氨基酸殘基添加至Blad或其活性變體的一個(gè)末端或者兩個(gè)末端。一種包括(或主要包括)Blad或其活性變體的抗菌多肽(如上所述)可以以純化的形式(例如，從植物、動(dòng)物或微生物來源中提取)和/或重組蛋白形式。重組形式的產(chǎn)品使得能夠產(chǎn)生Blad的活性變體。本領(lǐng)域已經(jīng)公開了純化天然形成的Blad的方法(如,Ramos et al.(1997)Planta203(1):26-34 和 Monteiro et al.(2010)PLoS ONE 5(1):e8542)。天然形成的 Blad 的一個(gè)合適的來源為一種羽扇豆屬植物，如白色羽扇豆(Lupinus albus),優(yōu)選的,所述為所述植物的子葉，優(yōu)選的，取在發(fā) 芽開始后大約4到14天收獲，更優(yōu)選的，取在發(fā)芽開始后大約6到12天收獲(如，發(fā)芽開始后的8天收獲)。本領(lǐng)域已經(jīng)公開了獲得含Blad的粗提的全蛋白提取物的方法，以及對(duì)上述提取物純化從而獲得部分純化提取物的蛋白純化方法，如包含Blad的低聚糖構(gòu)成的Blad?？梢杂镁郾０纺z電泳(SDS-PAGE)法和/或，優(yōu)選的，采用C_18柱反相高效液相色譜法(RP-HPLC)分離Blad本身。另一種獲得含Blad的低聚糖的部分純化提取物的方法是利用了 Blad的甲殼素綁定活性。所述低聚糖與甲殼素柱以強(qiáng)有力的形式結(jié)合，作為甲殼素親和色譜純化的一部分，以0.05N HCl洗脫。所述純化方法的實(shí)施例詳細(xì)說明如下:收獲8天齡的羽扇豆植物的子葉并在含IOmM CaCljP IOmM MgClJ^Mill1-Q plus中加水勻漿(pH調(diào)至8.0)。勻漿通過粗棉布過濾并30，000轉(zhuǎn)，4°C離心I小時(shí)。隨后取沉淀物并懸浮于PH7.5的IOOMm三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液中，該緩沖液含重量體積比為 10% (w/v)的 NaCl，10mM EDTA和 IOmM EGTA，4°C攪拌 I 小時(shí)，并在 4°C，3000轉(zhuǎn)離心I小時(shí)。上清中的總球蛋白片段用硫酸銨(561g/L)沉淀，低溫?cái)嚢鐸小時(shí)并在4°C，3000轉(zhuǎn)離心30分鐘。所得的顆粒沉淀物溶解在pH 7.5,50mM的Tris-HCl緩沖液中，在用相同緩沖液平衡過的ro-1o柱中脫鹽并通過在相同緩沖液中預(yù)平衡了的甲殼素親和層析柱。該柱用pH7.5，50mMTris-HCl緩沖液沖洗，并且將該結(jié)合蛋白用0.05NHC1洗脫。該洗脫物片段立即用2M Tris中和，并用SDS-PAGE收集其峰值區(qū)的洗脫物片段，凍干并分析。甲殼素柱的制備，從Sigma公司購買粗甲殼素并做以下處理:甲殼素樣品用Mill1-Q plus加水充分洗滌，然后用0.05NHC1充分洗滌。然后用重量體積比為1% (w/v)的碳酸鈉洗滌，之后用乙醇洗滌，直至洗到光吸收度小于0.05。將甲殼素裝入移液管端部并用 ρΗ7.5,50mMTris-HCl 平衡。生產(chǎn)重組蛋白的方法為本領(lǐng)域公知常識(shí)。其在本發(fā)明中使用的方法涉及將編碼含Blad或其活性變體的多肽的多核苷酸插入到合適的表達(dá)載體上，使得所述多核苷酸與一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子(如誘導(dǎo)性啟動(dòng)子，如T71ac)以及其他目的多核苷酸或目的基因并置，將表達(dá)受體引入到合適的細(xì)胞或者組織中(比如，大腸桿菌E.Coli),在轉(zhuǎn)化細(xì)胞或組織中表達(dá)該多肽，并將表達(dá)的重組多肽從細(xì)胞或組織中提取。表達(dá)載體可以包含多核苷酸額外編碼的構(gòu)建以輔助純化，例如，一個(gè)末端標(biāo)簽可以輔助純化:例如，用于親和純化的一個(gè)組氨酸殘基標(biāo)簽。一旦該重組多肽被純化，純化標(biāo)簽可以從多肽中去除。比如，通過溶蛋白性裂解。在一個(gè)包含含有(或主要含有)Blad或其活性變體的抗菌多肽的組合物中，所述多肽優(yōu)選的為以部分純化的形式，更優(yōu)選的以純化的形式。當(dāng)在缺少一種或多種天然與之相連的多肽的環(huán)境中和/或?yàn)橹辽?0%總蛋白的多肽代表時(shí)，所述多肽為部分純化形式。當(dāng)在一個(gè)缺少全部，或多數(shù)與之天然相連的其他多肽的環(huán)境中時(shí)，所述多肽為純化的形式。例如，純化的Blad是指組合物中Blad代表了至少50%的總蛋白，至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%的總蛋白。在一個(gè)包含含有(或主要含有)Blad或其活性變體的抗菌多肽的組合物中，所述羽扇豆蛋白含量可能主要由含多肽的Blad-低聚糖組成，該多肽含(或主要包含)Blad或其變體。一個(gè)含(或主要包含)Blad的抗菌多肽的組合物其也可以是包含由本領(lǐng)域技術(shù)人員添加了其他化合物的配方。在優(yōu)選具體實(shí)施例中，所述配方為包括一個(gè)含(或主要包含)Blad的抗菌多肽和一個(gè)藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑的制藥配方。目標(biāo)微生物本發(fā)明涉及Blad作為抗菌化合物的應(yīng)用，即，抑制對(duì)人或動(dòng)物致病的微生物的生長(zhǎng)，或殺死該微生物。所述微生物尤其包括細(xì)菌和真菌，該病原微生物能引起人和/或動(dòng)物中的傳染病或任意其他健康不佳(例如，食物中毒，過敏)，并可能影響并感染以下部位包括眼睛，皮膚，燒傷，傷口，上呼吸道，肺，胃腸道，泌尿生殖道，腎臟，肝臟，神經(jīng)系統(tǒng)和/或心血管系統(tǒng)(比如血液)。所述病原微生物可能是天生致病的或可能機(jī)會(huì)性致病(即在健康宿主中不引發(fā)疾病，但對(duì)免疫系統(tǒng)欠佳的宿主致病)。該病原微生物可能通過釋放對(duì)人或動(dòng)物有毒的化合物，從而也導(dǎo)致或選擇性引起健康不佳。Blad可以作為抗菌劑針對(duì)革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌性病原體。尤其優(yōu)選的目標(biāo)細(xì)菌包括假單胞菌屬病原菌(Pseudomonas),如銅綠假單胞菌(P.aeruginosa),棲稻假單胞菌(Pseudomonas oryzihabitans)和變形假單胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)(最優(yōu)選的銅綠假單胞菌(P.aeruginosa),李斯特菌屬病原菌(Listeria),如單核細(xì)胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)和伊氏李斯特菌(Listeria ivanovii)(最優(yōu)選的是單核細(xì)胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)),芽孢桿菌屬病原菌(Bacillus),如枯草芽抱桿菌(B.subtilis),炭疽芽抱桿菌(Bacillus anthracis)和臘狀芽抱桿菌(Bacilluscereus)(最優(yōu)選枯草芽孢桿菌(B.subtilis)),葡萄球菌屬病原菌(Staphylococcus)Jn金黃色葡萄球菌(S.aureus)(包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcus aureus)MRS A)，偽中間型葡萄球菌(Staphylococcuspseudintermedius)，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)，里昂葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)，施氏葡萄球菌(Staphylococcus schleiferi)和山羊葡萄球菌(Staphylococcus caprae)(最優(yōu)選金黃色葡萄球菌(S.aureus))，沙門氏菌屬病原菌(Salmonella)，如沙門氏菌亞種(Salmonella enterica)如亞利桑那沙門菌(Salmonella arizonae)，豬霍亂沙門氏菌(Salmonella choleraesuis)，腸炎沙門氏菌(Salmonella enter itidis)，甲型副傷寒沙門氏菌(Salmonella paratyphi A)，乙型副傷寒沙門氏菌(Salmonella paratyphiB)，傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)，鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium),都桕林沙門氏菌(Salmonella dublin)，豬傷寒沙門氏菌(Salmonella typhisuis)和勃蘭登堡沙門氏菌(Salmonella brandenburg)(最優(yōu)選腸炎沙門氏菌(S.enteritidis)、傷寒沙門氏菌(S.typhi)，以及彎曲菌屬病原菌(Campylobacter)，比如空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)和大腸桿菌彎曲菌(Campylobacter coli)(最優(yōu)選空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)，在優(yōu)選的具體實(shí)施例中，Blad用來對(duì)抗病原菌，所述病原體能引發(fā)普通炎癥的和敗血癥的(如銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)，霍亂(如霍亂弧菌(V.cholerae)，腦膜炎(如單核細(xì)胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)，乙型流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae type b)，腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)，肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)，肺炎(如肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)，無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)或金黃色葡萄球菌(S.aureus)，痢疾(如鮑氏痢疾桿菌(Shigella boydii)，痢疾志賀菌(Shigella dysenteriae)，弗氏志賀菌(Shigella flexneri)，宋內(nèi)志賀菌(Shigella sonnei)，鏈球菌性喉炎(如釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)，肺結(jié)核(如結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)，牛型分枝桿菌(Mycobacterium bovis)，結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium ajricanum)，氏分支桿菌(Mycobacterium canetti)和田鼠分枝桿菌(Mycobacterium microti)，傷寒(鼠傷寒沙門氏菌(S.typhi)或食物中毒(如以下種屬中的一種病原種類:李斯特菌(Listeria)，葡萄球菌(Staphylococcus)和沙門氏菌(Salmonella)。Blad可以用作一種 針對(duì)單細(xì)胞(酵母)和多細(xì)胞(絲狀病原真菌，霉菌)，真菌病原菌的抗菌劑。尤其優(yōu)選的目標(biāo)真菌包括念珠菌屬(Candida)真菌病原菌，如白色念珠菌(C.albicans)，光滑念珠菌(Candida glabrata)，葡萄牙念珠菌(Candida lusitaneae)，近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)，熱帶念珠菌(Candida tropicalis)，克柔念珠菌(Candida krusei)和都桕林念珠菌(Candida dubliniensis)，交鏈抱菌屬病原菌(Alternaria)，如鏈格抱菌(A.alternata)和心蟲鏈格抱菌(Alternaria molesta)，曲霉屬真菌病原菌(Aspergillus)，如煙曲霉(A.fumigatus)，黑曲霉(Aspergillus niger)，黃曲霉(Aspergillus flavus)和棒曲霉(Aspergillus clavatus)，德抱菌屬真菌病原體(Fusarium)，如腐皮鐮刀霉(Fusarium solani)，尖孢鐮刀霉(Fusarium oxysporum)，輪枝德抱菌(Fusarium verticillioides)，再育德抱菌(Fusarium proliferatum)，隱球菌屬真菌病原菌(Cryptococcus)，如新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)，羅倫隱球菌(Cryptococcus laurentii)，淺白隱球菌(Cryptococcus albidus)和 gattii 隱球菌(Cryptococcus gattii),以及毛孢子菌屬真菌病原菌(Trichosporon)，如卵圓形毛抱子菌(Trichosporon ovoides)，因肯毛孢子菌(Trichosporon inkin)，阿薩希毛抱子菌(Trichosporon asahii),粘狀毛抱子菌(Trichosporon mucoides),星狀毛抱子菌(Trichosporon asteroides),和皮狀絲包酵母(Trichosporon cutaneum)(全部按照白色毛孢子菌的一般命名先前考慮)，以及真皮毛孢子菌(Trichosporon dermatis),Trichosporon dohaense,和Trichosporon 1ubieri。在優(yōu)選的具體實(shí)施例中，Blad用作對(duì)抗引起侵襲性真菌感染(IFI)的病原菌，該侵襲性真菌感染通常定義為系統(tǒng)的，廣義的以及內(nèi)臟性真菌感染，(與表面的，局部的，兩性的，自限性的真菌疾病相反)，該感染往往是嚴(yán)重的和/或危及生命的。特別優(yōu)選的，引發(fā)IFI的真菌包括念珠菌屬病原菌(Candida)，曲霉屬(Aspergillus),鏈格孢屬(Alternaria)均屬于上述所定義，優(yōu)選的白色念珠菌(C.albicans),煙曲霉(A.fumigatus)和交鏈孢菌(A.alternata),最優(yōu)選的為白色念珠菌(C.albicans)和煙曲霉(A.fumigatus)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過常規(guī)方法，用含(或主要含)Blad (或其活性變體)的抗菌多肽用來在任何特定情況下的抗菌劑，確定一個(gè)合適的劑量濃度。優(yōu)選的，例如，Blad的濃度至少為I μ g/ml,濃度至少為5 μ g/ml,濃度至少為10 μ g/ml,濃度至少為20 μ g/ml,濃度至少為50 μ g/ml,濃度至少為100 μ g/ml,直到濃度為500 μ g/ml,直到濃度為600 μ g/ml，直到濃度為lmg/ml，直到濃度為2.5mg/ml，直到濃度為5mg/ml，直到濃度為10mg/ml。優(yōu)選的，使用Blad的濃度選自10 μ g/ml和5mg/ml之間，更優(yōu)選的50 μ g/ml和2.5mg/ml之間，更優(yōu)選的100 μ g/ml和lmg/ml之間，以及更優(yōu)選的100 μ g/ml和600 μ g/ml之間(如大約250 μ g/ml)。本發(fā)明提供證據(jù)證明了 Blad直到濃度至少為400 μ g/ml，對(duì)宿主無毒(參照例4和5)。本發(fā)明驚訝的發(fā)現(xiàn)，將Blad與螯合劑GBEDTA)結(jié)合能產(chǎn)生協(xié)同抗菌作用。因此，優(yōu)選的螯合劑用于改善所述含(或主要包含)Blad(或其活性變體)多肽的抗菌活性，以及該螯合劑的使用可能降低達(dá)到抗菌活性特定水平所需的抗菌多肽的濃度。螯合試劑(也稱螯合劑，絡(luò)合劑或多價(jià)螯合劑)可以是與金屬離子結(jié)合的以形成非共價(jià)復(fù)合物以及減少離子活性的任意組合物。合適的螯合劑包括多胺羧酸鹽，如EDTA(乙二胺四乙酸)和EGTA(乙二醇-雙_(β_氨基乙醚)-N，N，N’，N’ -四乙酸)。優(yōu)選的，螯合劑為EDTA，優(yōu)選的EDTA濃度至少為10 μ g/ml,至少為50 μ g/ml,至少為100 μ g/ml,至少為500 μ g/ml,直到濃度為lmg/ml，直到濃度為5mg/ml，直到濃度為10mg/ml，直到濃度為20mg/ml。優(yōu)選的，EDTA的濃度在0.lmg/ml和lmg/ml之間。`實(shí)驗(yàn)結(jié)果所述含(或主要包含)Blad (或其活性變體)的抗菌多肽可用于抑制人或動(dòng)物病原微生物的生長(zhǎng)(這意味著其具有抑菌活性)或者用于殺死該微生物(意味著其具有殺菌劑活性)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定一個(gè)合適的劑量和/或濃度從而實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng)抑制或殺死該微生物的特定的需要。優(yōu)選的，當(dāng)作為抑菌劑使用時(shí)，與相同條件下但無抗菌多肽時(shí)相比，所述抗菌多肽降低了 10%的生長(zhǎng)率，更優(yōu)選的降低了 50%的生長(zhǎng)率，更優(yōu)選的降低了 75%的生長(zhǎng)率，更優(yōu)選的降低了 90%的生長(zhǎng)率，更優(yōu)選的降低了 95%的生長(zhǎng)率，更優(yōu)選的降低了 98%的生長(zhǎng)率，更優(yōu)選的降低了 99%的生長(zhǎng)率，以及更優(yōu)選的降低了 99.9%的生長(zhǎng)率。最優(yōu)選的，抗菌多肽能防止任何微生物的生長(zhǎng)。優(yōu)選的，當(dāng)用作殺菌劑時(shí)，與相同條件下無抗菌多肽時(shí)相比，該抗菌多肽能殺死微生物總數(shù)的10%，更優(yōu)選的，能殺死微生物總數(shù)的50%，更優(yōu)選的，能殺死微生物總數(shù)的75 %，更優(yōu)選的，能殺死微生物總數(shù)的90 %，更優(yōu)選的，能殺死微生物總數(shù)的95 %，更優(yōu)選的，能殺死微生物總數(shù)的98%，更優(yōu)選的，能殺死微生物總數(shù)的99%，以及更優(yōu)選的，能殺死微生物總數(shù)的99.9%，最優(yōu)選的，抗菌多肽殺死所有的微生物。當(dāng)用于預(yù)防或治療人或生物體體內(nèi)或體表的感染，所述抗菌多肽優(yōu)選的使用治療有效劑量，也就是說，該劑量水平是指能夠殺死和/或抑制微生物生長(zhǎng)，能達(dá)到預(yù)防感染或消除感染的臨床可檢測(cè)水平。優(yōu)選的，所述抗菌多肽的治療有效劑量對(duì)人或動(dòng)物個(gè)體是無毒的。也即，治療有效劑量的抗菌多肽在作為含抗菌多肽的組合物的一部分給藥時(shí)，是治療有效的。發(fā)明人驚訝的發(fā)現(xiàn)，在相似的濃度(質(zhì)量濃度)下，Blad對(duì)白色念珠菌和煙曲霉(在殺真菌和抑真菌活性方面)與兩性霉素B的效力大致相當(dāng)，且比氟康唑更為有效。這是一個(gè)驚人的結(jié)果，使得(i)與相對(duì)更小的兩性霉素B和氟康唑有機(jī)分子相比，Blad有更大的分子質(zhì)量，以及(ii)Blad對(duì)人類和其他動(dòng)物是無毒和可食用的。醫(yī)學(xué)應(yīng)用和方法本發(fā)明提供了一種包含含有Blad或其活性變體的抗菌多肽的組合物，通過治療或預(yù)防手段用于人或動(dòng)物體的治療方法。為此，本發(fā)明還提供了人或動(dòng)物的治療方法，其中包括給有需要的個(gè)體施用含治療有效劑量抗菌多肽的組合物，其中所述抗菌多肽含Blad或其活性變體。本發(fā)明還提供了一種含抗菌多肽的組合物在人體或動(dòng)物體體內(nèi)或體表的預(yù)防或治療微生物感染的方法中的應(yīng)用。其中所述抗菌多肽含Blad或其活性變體。為此，本發(fā)明還提供了:-一種預(yù)防或治療微生物感染的方法，其中包括對(duì)有需要的個(gè)體施用含治療有效劑量抗菌多肽的組合物，其中 所述抗菌多肽含Blad或其活性變體，及-一種含抗菌多肽的組合物在制備用于人體或動(dòng)物體體內(nèi)或體表的預(yù)防或治療微生物感染的藥物中的應(yīng)用，其中所述抗菌多肽含Blad或其活性變體。所述組合物可以以注射(如真皮內(nèi)注射,皮下注射,肌肉注射,靜脈注射,骨內(nèi)注射，以及腹腔注射)，真皮內(nèi)顆粒輸送，吸入，局部施用，口服或粘膜施用(如鼻，舌下，陰道或直腸)的方式給藥。優(yōu)選的，所述組合物包括一個(gè)藥學(xué)可接受載體或稀釋劑。這種藥學(xué)組合物能以常規(guī)藥學(xué)方法制備。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過利用標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)配方化學(xué)物和方法完成。例如，含Blad(或其活性變體)的抗菌多肽可以與一種或多種藥學(xué)可接受載體或稀釋劑結(jié)合從而制備液體藥劑。其中也可以包含輔助物質(zhì)，如濕潤(rùn)劑及或乳化劑，PH緩沖物質(zhì)等。所述載體，稀釋劑和輔助物質(zhì)為一般藥學(xué)制劑，其給藥無異常毒性，以及對(duì)接受該組合物的個(gè)體本身不會(huì)引起免疫應(yīng)答。藥學(xué)可接受載體包括但不僅限于，液體如水，鹽水，聚乙二醇，透明質(zhì)酸，甘油和乙醇。也可以包括藥學(xué)可接受的鹽，比如，無機(jī)酸鹽如鹽酸鹽，溴酸鹽，磷酸鹽，硫酸鹽等；以及如乙酸鹽，丙酸鹽，丙二酸鹽，苯甲酸鹽等有機(jī)酸鹽。優(yōu)選的但不必需的，該制備包含藥學(xué)可接受的載體作為穩(wěn)定劑，尤其對(duì)含有多肽(如Blad)的組合物特別有利。也可以作為多肽的穩(wěn)定劑的合適的載體的例子包括，但不僅限于，藥物等級(jí)的葡萄糖，蔗糖，乳糖，海藻糖，甘露醇，山梨醇，肌醇，葡聚糖等。其他適合的載體包括但也不僅限于，淀粉，纖維素，磷酸鈉鹽或鈣鹽，檸檬酸，酒石酸，甘氨酸，高分子量的聚乙二醇(PEG)，和以上物質(zhì)的組合。一經(jīng)制備，所述組合物可以以現(xiàn)有的各種途徑和方法體內(nèi)給個(gè)體給藥。例如，液體藥劑能作為可注射溶液，懸浮液或乳劑并通過胃腸外，皮下，皮膚，肌肉，靜脈，骨內(nèi)或腹腔注射，以常規(guī)針頭和注射器或使用液體噴射注射系統(tǒng)，給個(gè)體給藥。液體藥劑也可以在眼睛，皮膚，頭發(fā)或粘膜組織(例如，鼻，舌下，陰道或直腸)部位局部給藥，或作為精細(xì)噴霧適用于呼吸道或肺部給藥。其他給藥方法包括，口服，栓劑，以及主動(dòng)或被動(dòng)透皮給藥技術(shù)。在優(yōu)選的具體實(shí)施例中，該抗菌多肽以化合物的形式制備，適合作為外用洗液，護(hù)手霜，滴眼液，洗發(fā)水或護(hù)發(fā)素。需要該抗菌多肽的個(gè)體可以是任何人或動(dòng)物個(gè)體。在優(yōu)選的具體實(shí)施例中，該抗菌多肽可用于預(yù)防具有獲得微生物感染的特定風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體的感染和/或用于治療具有離開醫(yī)療干預(yù)便無法清除微生物感染的特定風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體的感染，例如年輕人，(如小于16歲的個(gè)體，如小于5歲的個(gè)體，小于3歲的個(gè)體，小于2歲的個(gè)體，小于6個(gè)月的個(gè)體，或小于I個(gè)月的個(gè)體)，老年人(如大于70歲的個(gè)體，如大于80歲或大于90歲的個(gè)體)，免疫系統(tǒng)較弱的個(gè)體(如有原發(fā)性免疫缺陷的個(gè)體，有獲得性免疫缺陷的個(gè)體如艾滋病患者，和因?yàn)榛熁蛎庖咭种扑幬飳?dǎo)致的免疫系統(tǒng)抑制的個(gè)體)，病危個(gè)體，或者可能特定的高度暴漏于微生物病原菌的個(gè)體(如醫(yī)療專業(yè)人員)。其他的抗菌劑的應(yīng)用和方法本發(fā)明還提供了一種包含抗菌多肽的組合物在用來殺死或抑制對(duì)人或動(dòng)物致病的微生物生長(zhǎng)中的應(yīng)用，其中，所述抗菌多肽含Blad或其活性變體，所述組合物的作用位點(diǎn)不在人或動(dòng)物體體內(nèi)或體表。為此，本發(fā)明還涉及一種殺死或抑制對(duì)人類或動(dòng)物致病的微生物生長(zhǎng)的方法，其中，所述組合物的作用位點(diǎn)不在人或動(dòng)物體體內(nèi)或體表，所述方法包括在所述作用位點(diǎn)，施用含有效劑量的含Blad或其活性變體的抗菌多肽的組合物的給藥方法。所述有效劑量是能夠抑 制微生物生長(zhǎng)和/或殺死微生物的，能達(dá)到預(yù)防或消除微生物定殖的可檢測(cè)的劑量水平。優(yōu)選的，所述抗菌多肽的有效劑量是對(duì)人或動(dòng)物個(gè)體無毒的。其目的是，所述抗菌多肽的有效劑量當(dāng)作為含抗菌多肽的組合物的一部分進(jìn)行給藥的時(shí)候，是有效的。該類具體實(shí)施例目的在于說明，所述抗菌多肽可以用做消毒劑以預(yù)防物品上微生物病原體的生長(zhǎng)和/或殺死物品上微生物病原體，所述物品為可以被人或動(dòng)物攝入，或直接放置于人或動(dòng)物體體表或體內(nèi)的，或有需要消毒的物體表面(如可能直接或間接與人或動(dòng)物接觸的表面)，以致減少了如下所述的風(fēng)險(xiǎn):(i)人或動(dòng)物被所述微生物病原體感染的風(fēng)險(xiǎn)；或(ii)人或動(dòng)物與微生物病原體釋放的毒素接觸的風(fēng)險(xiǎn)。在優(yōu)選的具體實(shí)施例中，所述抗菌多肽用在食品之中或之上，來預(yù)防該食品之上或其中人/動(dòng)物微生物病原體的生長(zhǎng)，或殺死已經(jīng)存在于食品之上或之中的人/動(dòng)物微生物病原體。以這種方式抗菌多肽能用來減少由于攝取該食品而導(dǎo)致的人或動(dòng)物被微生物病原體感染的風(fēng)險(xiǎn)，或減少攝取該食品導(dǎo)致的人或動(dòng)物攝入微生物病原體釋放的毒素的風(fēng)險(xiǎn)。在這些具體實(shí)施例中，特別優(yōu)選的，所述微生物病原體能夠?qū)е率澄镏卸?如直接或通過釋放的毒素)。通過食品是指任何因?yàn)闋I養(yǎng)或令人愉悅的消費(fèi)的液體或固體物質(zhì)。所述含抗菌多肽的組合物例如能在食品制造過程中與其他食品成分混合或能應(yīng)用于食品表面(如作為液體薄膜或噴霧)。尤其是，具體實(shí)施例中考慮的食品包括，水，軟飲料如果汁，含酒精飲料，生肉，煮熟的家禽肉，蛋，牛奶，奶油，冰激凌，奶酪，生蔬菜和水果，加工食品(尤其與單核細(xì)胞增生李斯特菌(L.monocytogenes),霍亂弧菌(V.cholerae),病原葡萄球菌(Staphylococcus),病原沙門氏菌(Salmonella)和病原彎曲菌(Campylobacter)種類相關(guān)的加工食品)，以及堅(jiān)果和含淀粉的食物如面包，大米以及馬鈴薯(尤其是與致病性曲霉菌(Aspergillus)種類相關(guān)的)。在另一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施例中，所述抗菌多肽用在醫(yī)療設(shè)備或儀器之中或之上，所述設(shè)備為放置在身體之內(nèi)或身體之上進(jìn)行診斷，治療或手術(shù)功能的任意設(shè)備，如人工機(jī)體組織，心臟起搏器，導(dǎo)管，支架，閥門，溫度計(jì)，注射器，皮下注射針頭，監(jiān)控設(shè)備，呼吸機(jī)，心臟電擊器，心肺機(jī)，心電波室(EEG室)和腦電波室(ECG室)，超聲設(shè)備，鉆頭，鋸，刀，解剖刀，舌簧片，剪刀，夾子和針等。所述抗菌多肽可以以上述方式用來預(yù)防在醫(yī)療過程中與設(shè)備或儀器接觸的身體感染。在另一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施例中，所述抗菌多肽用在有需要的表面(如可能直接或間接接觸人類或動(dòng)物的表面)?？梢允褂每咕嚯牡谋砻鏋槲挥谝韵碌沫h(huán)境中:(a)進(jìn)行健康檢 查，診斷或治療的環(huán)境；(b)制造食物或處理食物或儲(chǔ)存食物的環(huán)境；(c)進(jìn)行個(gè)人清洗和/或個(gè)人衛(wèi)生的環(huán)境；和/或(d)具有特殊風(fēng)險(xiǎn)的人所在的環(huán)境(i)具有受到微生物感染風(fēng)險(xiǎn)的人；和/或(ii)具有離開醫(yī)療干預(yù)便無法清除微生物感染的風(fēng)險(xiǎn)的人(具有該風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)人在上文已有說明)。該表面包括任何工業(yè)食品廠內(nèi)涉及的表面和食品超市的貨架/工作臺(tái)的表面。該可以使用抗菌多肽的表面可以是建筑物的地板或墻壁(如其一個(gè)房間)或所述房間或建筑物內(nèi)的物體表面?？稍O(shè)想的特別的建筑包括，醫(yī)院和其他醫(yī)療建筑，學(xué)校和其他兒童護(hù)理中心，老年護(hù)理大廈，餐廳和其他餐館，食品制造地，處理地和/或儲(chǔ)存地(如市場(chǎng)，食品商店，超市，和食品工業(yè)工廠)，以及私人住宅?？稍O(shè)想的特別房間包括，醫(yī)療環(huán)境中所有房間，尤其是手術(shù)室，事故和緊急部門，重癥監(jiān)護(hù)病房，以及廚房，衛(wèi)生間，廁所，餐館和食品制造/處理大廳。實(shí)施例在以下的例子中，BLAD是指天然形成的含Blad的低聚糖，其包含20kD的Blad多肽，按“per Ramos et al.(1997) Planta 203(1):26_34”中的方法純化，參照該文獻(xiàn)中材料和方法部分的“植物材料和生長(zhǎng)條件”以及“蛋白純化”的內(nèi)容。定義:MIC-最小抑制濃度:抑制微生物可見生長(zhǎng)的抗菌劑的最低濃度MFC/MBC-最低殺真菌濃度/最低殺細(xì)菌濃度(或最小致死濃度):在標(biāo)準(zhǔn)化條件下24小時(shí)后，殺死99.9%初始接種菌數(shù)所需的最低殺菌劑濃度。時(shí)間-殺菌曲線-在控制條件下測(cè)定一種或多種抗菌劑在不同時(shí)間下殺死的隔離體即為殺菌分析方法。這是一種基于液體培養(yǎng)基的方法，固定菌落的殺死率通過測(cè)定一定時(shí)間間隔的對(duì)照樣品(有機(jī)體，無藥物)和含殺菌劑的試管或燒瓶，并將每個(gè)樣品涂在瓊脂平板上測(cè)定存活菌落數(shù)來測(cè)定(cfu/ml)。實(shí)施例1 Blad的殺菌活性不同種類的細(xì)菌的BLAD的MIC和MBC (使用Mueller-Hinton培養(yǎng)基)
權(quán)利要求
1.一種用在通過治療或預(yù)防手段對(duì)人類或動(dòng)物體治療的方法中的包含抗菌多肽的組合物，其中所述抗菌多肽含Blad或其活性變體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，應(yīng)用于治療或預(yù)防個(gè)體體內(nèi)或體表被微生物感染的方法中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，進(jìn)一步包括藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的化合物，進(jìn)一步包含螯合劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的化合物應(yīng)用于所述的方法中，其中所述個(gè)體有較弱的免疫系統(tǒng)或?yàn)椴∥！?br> 6.一種包含含有Blad或其活性變體抗菌多肽的組合物的用途，用以殺死或抑制對(duì)人類或動(dòng)物致病的微生物的生長(zhǎng)，其作用位點(diǎn)不在人體或動(dòng)物體體表或體內(nèi)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其中所述組合物針對(duì)人或動(dòng)物致病性微生物，對(duì)由人類或動(dòng)物攝入或者直接置 于人或動(dòng)物體表或體內(nèi)的物品或有需要的表面進(jìn)行消毒。
8.如權(quán)利要求7所述的用途，其中所述物件為食物或醫(yī)療器件或儀器。
9.如權(quán)利要求7所述的用途，其中所述表面為位于以下的環(huán)境中: a進(jìn)行健康檢查，診斷或治療的環(huán)境； b制作食品或處理食物或儲(chǔ)存食物的環(huán)境； c進(jìn)行個(gè)人清洗和/或個(gè)人衛(wèi)生的環(huán)境；和/或 d具有特殊風(fēng)險(xiǎn)的人所在的環(huán)境 i具有獲得微生物感染風(fēng)險(xiǎn)的人；和/或 具有離開醫(yī)療干預(yù)便無法清除微生物感染的風(fēng)險(xiǎn)的人
10.如權(quán)利要求6-9任意一項(xiàng)所述的用途，其中，所述組合物進(jìn)一步包括螯合劑。
11.如權(quán)利要求2-5任意一項(xiàng)所述的組合物,或如權(quán)利要求6-10任意一項(xiàng)所述的用途，其中，所述微生物為細(xì)菌或真菌。
12.如權(quán)利要求11所述的組合物或用途，其中所述細(xì)菌為以下種屬的其中一種病原種類:假單胞菌，李斯特菌，芽孢桿菌，葡萄球菌和沙門氏菌。
13.如權(quán)利要求11所述的組合物或用途，其中所述真菌為以下種屬的其中一種病原種類:念珠菌，曲霉，鏈格孢菌，鐮刀霉，隱球菌和毛孢子菌。
14.如權(quán)利要求13所述的組合物或用途，其中所述真菌能引發(fā)侵襲性真菌感染，優(yōu)選的真菌為白色念珠菌、煙曲霉或互隔交鏈格孢菌。
15.一種人類或動(dòng)物的治療方法包括對(duì)有需要的個(gè)體施以含藥學(xué)有效劑量的抗菌多肽的組合物，所述抗菌多肽含Blad或其活性變體。
16.一種預(yù)防或治療微生物感染的方法包括給有需要的個(gè)體施用含有治療有效劑量抗菌多肽的組合物，所述抗菌多肽含Blad或其活性變體。
17.—種殺死或抑制對(duì)人類或動(dòng)物致病的微生物生長(zhǎng)的方法，其作用位點(diǎn)不在人或動(dòng)物體體表或體內(nèi)，所述方法包括給所述位點(diǎn)施用含有效劑量的抗菌多肽的組合物，所述抗菌多肽含Blad或其活性變體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種包含含有Blad或其活性變體的抗菌多肽的組合物，用于通過治療或預(yù)防手段對(duì)人或動(dòng)物體治療的方法中，例如用于被微生物感染的個(gè)體體內(nèi)或體表的治療或預(yù)防的方法。本發(fā)明還提供了一種包含含Blad或其活性變體的抗菌多肽的組合物的應(yīng)用，用以殺死或抑制對(duì)人類或動(dòng)物致病的微生物的生長(zhǎng)，該作用位點(diǎn)不在人或動(dòng)物體體內(nèi)或體表。
文檔編號(hào)C07K14/00GK103228160SQ201180049655
公開日2013年7月31日 申請(qǐng)日期2011年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月12日
發(fā)明者亞歷山德拉·曼露埃拉·洛倫索·卡雷拉, 薩拉·亞歷山德拉·瓦爾德斯·達(dá)席爾瓦·蒙泰羅, 里卡多·曼努埃爾·德塞夏斯·包維達(dá)·費(fèi)雷拉 申請(qǐng)人:肯蘇墨艾姆維德-生物技術(shù)達(dá)思植物有限公司