有效的肽偶聯(lián)及其在環(huán)戊二烯并[g]喹唑啉三鈉鹽的合成和分離中的用途
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種合成L-谷氨酰基-γ-D-谷氨酸的新方法及其在合成(2R)-((4S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羥基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氫-3H-環(huán)戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸1中的用途。還提供了一種有效的分離和純化上述酸的三鈉鹽2的方法，該三鈉鹽2呈適合長期儲存和用于腸胃外劑型的形式。
【專利說明】有效的肽偶聯(lián)及其在環(huán)戊二烯并[G]喹唑啉三鈉鹽的合成和分離中的用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及(R)-2-((S)-4-氨基-4-羧基丁酰胺基)戊二酸(L-谷氨?；?Y -D-谷氨酸，L-Glu- y -D-Glu)的合成，及其在合成中的用途，尤其是在合成(2，R) - ((4，S)-羧基-4- (4，N- (((6S) -2-(羥基甲基)_4_ 氧代-3，4，7，8-四氫-3H-環(huán)戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)_戊二酸中的用途，以及上述酸的三鈉鹽的分離和純化。
【背景技術(shù)】
[0002]為更充分地描述和公開本發(fā)明以及其所屬的【技術(shù)領(lǐng)域】，此處引用了多篇專利和公開。這些參考文獻中的每一篇均在此整體引入作為本文內(nèi)容的參考，如同每一篇單獨的引文均具體地、單獨地指出引入作為參考。
[0003]在整個本說明書中，包括其后的權(quán)利要求，除非上下文另有所指，“包含”及其變型“包括”和“含有”，應當理解為意味著包括所述的整數(shù)或步驟或者整數(shù)組或步驟組，但不排除任何其它整數(shù)或步驟或者整數(shù)組或步驟組。
[0004]必須指出，如本說明書和所附權(quán)利要求使用的，單數(shù)形式“一種”、“一個”和“該”包括復數(shù)對象，除非上下文明確的另有指定。因此，例如，提及“一種藥用載體”包括兩種或多種該載體的混合物，等。
[0005]此處范圍經(jīng)常表示為從“約”某一具體值，和/或至“約”另一具體值。當范圍如此表達時，另一實施方案包括從一個具體值和/或至另一具體值。類似地，數(shù)值通過使用先行詞“約”表示為近似值時，應理解為該具體值形成另一實施方案。
[0006]當方法或過程在本文表示為步驟的列表或順序(包括數(shù)字編號、字母編號，或項目符號編號的步驟的列表)時，列表中步驟呈現(xiàn)的順序并不意味著該方法中這些步驟有任何特殊的順序或時限，除非特殊順序是要求的或明確說明的。因此，除非另有規(guī)定，每種公開方法的步驟可以任何合理的順序進行，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所明確的，即任何適合達到該方法所陳述的目的和產(chǎn)物的順序。而且，除非明確的說明，本方法中不排除存在附加的步驟。
[0007]該新的胸苷酸合成酶抑制劑(2，R) - ((4，S)-羧基-4- (4，N- (((6S) -2-(羥基甲基)-4_氧代_3，4，7，8-四氫-3!1-環(huán)戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸1，作為其三鈉鹽也稱為CB300945、BCG945或0NX-0801)是胸苷酸合成酶很有效的抑制劑，對該酶的IC5(I為3nM。
[0008]不像大多數(shù)胸苷酸合成酶抑制劑如甲氨蝶(呤和培美曲塞)，2的活化或細胞滯留不需要聚谷氨?；?polyglutamoylation),而且它并不是聚谷氨酰化合成酶的底物。
[0009]此外,2不是普遍表達的Ki>250 μ Μ的還原性葉酸載體蛋白(reduced folatecarrier protein, RFCP)的底物，并且不能輕易地穿過正常的細胞膜。然而，它以很高的亞納摩爾級親和力(ΚΑ5ηΜ)與葉酸受體a (FRa)結(jié)合，并且可通過該受體以適當?shù)乃俾兽D(zhuǎn)運至細胞中，即使2的血清水平非常低。
[0010]一旦進入細胞，2抑制胸苷酸合成酶并且隨著其慢慢地降解和從細胞中排出，它對胸苷酸合成酶產(chǎn)生長效的抑制作用。這造成DNA加工錯誤，而啟動了修復周期，而由于缺乏三磷酸胸苷摻入到DNA中，該修復最終是無效的。這導致了凋亡DNA損傷反應和細胞死亡。
[0011]這是胸苷酸合成酶抑制劑通常的作用方式，臨床經(jīng)驗表明胸苷酸合成酶抑制劑對人類腫瘤有強烈的細胞毒作用，但是由于相當廣譜的毒性，其使用受到了限制；靶組織，特別是骨髓，受到該藥物細胞毒性的嚴重影響。
[0012]目前這代胸苷酸合成酶抑制劑是普遍表達的RFCP的良好底物，可很好的分布到大多數(shù)組織，而2僅僅有效地分布到表達或優(yōu)選過表達FRa的組織中。相對地很少有組織內(nèi)源性表達FRa，即使在適中水平。大多數(shù)組織在細胞遠極面以極化方式表達FRa，意味著細胞面向循環(huán)內(nèi)皮一面沒有運載體。這樣的結(jié)果是，即使在這些組織中，之的穿透也往往是非常無效的。這意味著血漿中高循環(huán)水平的2導致相當?shù)偷娜矶拘浴?br> [0013]如果對于腫瘤同樣如此，也可以預期其產(chǎn)生低抗腫瘤療效。然而,有些種類的腫瘤組織傾向于過表達FRa。作為腫瘤細胞，它們已經(jīng)失去極性并在近極面和遠極面均表達FRa。因此，這些腫瘤組織有著異常的傾向，能夠在細胞中聚集非常大量的、細胞毒性的2的劑量，而血漿藥物水平足夠低，只有非常小的毒性作用。這導致在過表達腫瘤類型中，之的治療指數(shù)提聞。
[0014]有些腫瘤類型過表達FR α，最顯著的是卵巢癌，其中90%最常見的腫瘤類型，粘液型卵巢癌，過表達FRa。因此4是一種非常有吸引力的化療藥物，用于治療FRa過表達的癌癥，特別是卵巢癌，然而并不限于那一種腫瘤類型，其中子宮癌、間皮瘤和腎癌均有高百分比的FRa過表達。
[0015]化合物I和I以及若干相似同源物，在W02003/020748中被公開，盡管是作為在6位的非對映異構(gòu)體1:1的混合物。
[0016]
【權(quán)利要求】
1.一種合成L-Glu-Y-D-Glu 二妝的方法,其包括以下步驟: a)活化N-α O-雙保護的L-Glu衍生物的Y -羧酸； b)甲硅烷基化D-谷氨酸；和 c)將步驟a)產(chǎn)生的活化的羧酸衍生物與步驟b)的甲硅烷基化產(chǎn)物反應以生成被保護的 L-Glu-Y-D-Glu 物質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在步驟a)中，活化包括將N-α O-雙保護的L-Glu衍生物轉(zhuǎn)化成活化的衍生物，例如混合酸酐。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中活化包括用氯甲酸烷基酯和叔胺堿處理N-αO-雙保護的L-Glu衍生物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中氯甲酸酯是氯甲酸異丁酯。
5.根據(jù)權(quán)利要求2至4的方法，其中緩慢加入N-α O-雙保護的L-Glu衍生物至氯甲酸烷基酯和叔胺堿的低溫溶液中。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中氯甲酸烷基酯和叔胺堿的溶液的溫度為-10°C至-50°C，優(yōu)選約-30°C。
7.根據(jù)權(quán)利要求3至6 任一項的方法，其中叔胺堿為N-甲基嗎啉。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項的方法，其中N-α O-雙保護的L-Glu衍生物為N-芐氧基擬基_L_谷氨酸-α -節(jié)酯。
9.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項的方法，其中在步驟b)中，甲硅烷基化包括用甲硅烷基化劑處理D-谷氨酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中甲硅烷基化劑為O，N-二-(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(BSA)。
11.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項的方法，其中在步驟b)中，D-谷氨酸被若干當量的甲硅烷基化劑溶解；和步驟c)中，將該溶液加入來自步驟a)的羧酸衍生物的冷溶液，以形成被保護的L-Glu- Y -D-Glu物質(zhì)的甲硅烷基酯化溶液。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中Ν-αO-雙保護的L-Glu衍生物為N-芐氧基羰基-L-谷氨酸-α -芐酯且產(chǎn)物為2R- (N- (S) _4_ (芐氧基羰基)_4_芐氧羰基氨基)_1_氧代丁基)氨基)戊二酸的甲硅烷基酯化溶液。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中反應后，將2R-(N-(S)-4-(節(jié)氧基擬基)-4_節(jié)氧擬基氨基)-1_氧代丁基)氨基)戊二酸的甲硅烷基酯化溶液進行去甲硅烷基化水溶液后處理，從而以良好的收率和純度產(chǎn)生2R- (N- (S) -4-(芐氧基羰基)-4-芐氧羰基氨基)-1-氧代丁基)氨基)戊二酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中去甲硅烷基后處理包括在水和有機溶劑之間分配溶液。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至14任一項的方法，其還包括: d)脫保護該被保護的L-Glu-Y -D-Glu物質(zhì)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中脫保護包括除去芐基和/或芐氧基羰基保護基以產(chǎn)生L-谷氨酰基-Y -D-谷氨酸。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16的方法，其中脫保護包括氫解。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中氫解包括在乙醇水溶液中，使用合適的過渡金屬催化劑氫解。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中催化劑包括鈀碳催化劑。
20.根據(jù)權(quán)利要求15至19任一項的方法，其中脫保護后，該產(chǎn)物經(jīng)硫代硅膠處理以獲得含〈lOppm鈀的產(chǎn)物。
21.合成(2，R)-((4，S)-羧基-4-(4，N-(((6S)-2-(羥基甲基)-4-氧代-3，4，7，8-四氫-3H-環(huán)戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸或其可藥用鹽或溶劑合物的方法，其包括將甲硅烷基-保護的L-Glu- Y -D-Glu物質(zhì)與(63)-4，^((2-(羥基甲基)-4-氧代-3，4，7，8-四氫-3H-環(huán)戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酸偶聯(lián)的步驟。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中偶聯(lián)包括活化(6S)-4，N-((2-(羥基甲基)-4-氧代-3，4，7，8-四氫-3H-環(huán)戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酸的羧酸部分和用甲硅烷基-保護的L-Glu- Y -D-Glu物質(zhì)處理。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中活化包括通過用1-羥基苯并三唑水合物和偶聯(lián)劑處理將(65)-4，^((2-(羥基甲基)-4-氧代-3，4，7，8-四氫-3!1-環(huán)戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酸轉(zhuǎn)化成活化的HOBT酯。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中偶聯(lián)劑為二酰亞胺偶聯(lián)劑。
25.根據(jù)權(quán)利要求21至24任一項的方法，其中甲硅烷基保護的L-Glu-y -D-Glu物質(zhì)是由L-谷氨?；?Y -D-谷氨酸二肽的甲硅烷基化產(chǎn)生的。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中甲硅烷基-保護的L-Glu-y -D-Glu物質(zhì)是從根據(jù)權(quán)利要求I至19任一項的方法產(chǎn)生的L-Glu- Y -D-Glu 二肽制備的。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中甲硅烷基化包括用甲硅烷基化劑處理。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中甲硅烷基化劑為0，N-二(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(BSA)。
29.根據(jù)權(quán)利要求21至28任一項的方法，其中偶聯(lián)反應是在乙腈中進行的。
30.根據(jù)權(quán)利要求21至29任一項的方法，其中任何涉及存在甲硅烷基化劑的操作都是在溫度范圍-10°C至+10°C進行的。
31.根據(jù)權(quán)利要求21至30任一項的方法，其還包括純化步驟，包括過濾、稀釋和沉淀，其通過加入謹慎限定量的堿水溶液，優(yōu)選飽和碳酸氫鈉溶液，或酸水溶液，優(yōu)選甲酸。
32.制備(2，R)-((4，S)-羧基-4-(4，N-(((6S)-2-(羥基甲基)-4-氧代-3，4，7，8-四氫-3H-環(huán)戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸的三鈉鹽(0NX-0801)的方法，其包括以下步驟: (i)提供(2，R)-((4，S)-羧基-4-(4，N-(((6S)-2-(羥基甲基)-4-氧代-3，4，7，8-四氫-3H-環(huán)戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸或其亞化學計量的鈉鹽在水性鈉堿中的溶液； (ii)如有必要，調(diào)節(jié)pH; (iii)柱色譜分離； (iv)任選地，濃縮從步驟(iii)洗脫的產(chǎn)物；和 (V)凍干。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中用于步驟⑴的(2，R)-((4，S)_羧基-4-(4，^(((65)-2-(羥基甲基)-4-氧代-3，4，7，8-四氫-3!1-環(huán)戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸或其亞化學計量的鈉鹽是根據(jù)權(quán)利要求1至30任一項的方法制備的。
34.根據(jù)權(quán)利要求32或33的方法，其中在步驟(i)中，水性鈉堿溶液是碳酸氫鈉或碳酸鈉溶液。
35.根據(jù)權(quán)利要求32至34任一項的方法，其中在步驟(ii)中，將pH調(diào)節(jié)到范圍pH7.5-9.0ο
36.根據(jù)權(quán)利要求32至35任一項的方法，其中在步驟(iii)中，色譜分離包括在改良的聚苯乙烯樹脂柱上通過柱色譜純化，用水或含1-10%的水混溶性溶劑的水洗脫。
37.根據(jù)權(quán)利要求32至36任一項的方法，其中步驟(iv)包括濃縮收集的色譜級分，該級分包含(2，R) - ((4，S)-羧基-4- (4，N- (((6S) -2-(羥基甲基)_4_ 氧代-3，4，7，8-四氫-3H-環(huán)戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸三鈉鹽的稀水溶液，所述濃縮使用連續(xù)蒸發(fā)技術(shù)如刮膜式蒸發(fā)；基于膜的濃縮方法如超濾；或柱裝載和洗脫。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其包括在0°C至10°C使用超濾將柱洗脫液濃縮4倍至16倍。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其還包括在0°C至10°C將超濾儀器中的保留物透濾，以減少水溶性低分子量雜質(zhì)的量。
40.根據(jù)權(quán)利要求32至39任一項的方法，其中步驟(v)產(chǎn)生的凍干餅狀物含有不超過10%重量的水。
41.化合物，其用于合成(2，R)-((4，S)_羧基-4-(4，N-(U6S)-2-(羥基甲基)-4-氧代-3，4，7，8-四氫-3H-環(huán)戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸及其三鈉鹽，其選自:(R) - 二(0-三甲基甲硅烷基)2- ((S) -5-(芐氧基)-4-(芐氧羰基氨基)-5-氧代戊酰胺基)戊二酸酯；(R) -2- ((S) -5-(芐氧基)-4-(芐氧羰基氨基)-5-氧代戊酰胺基)戊二酸；(S)-O-1H-苯并[d][l，2，3]三唑-1-基 4-((2-(羥基甲基)-4-氧代-4，6，7，8-四氫-3H-環(huán)戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酸酯；(R)- 二(0-三甲基甲硅烷基)2-((S)-4-(4-(((S)-2-(羥基甲基)-4-氧代-4，6，7,8-四氫-3H-環(huán)戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)-5_氧代-5-(三甲基甲硅烷氧基)戊酰胺基)戊二酸酯；(S)-O-1H-苯并[d][l，2，3]三唑-1-基4-((2-(三甲基甲硅烷氧基甲基)-4-氧代-4，6，7,8-四氫-3H-環(huán)戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酸酷；(R) - 二(0-三甲基甲硅烷基)2-(⑶-4- (4-((⑶-2-(三甲基甲硅烷氧基甲基)-4-氧代-4，6，7，8-四氫-3H-環(huán)戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)-5_氧代-5-(三甲基甲硅烷氧基)戊酰胺基)戊二酸酯。
42.制備(2，R)- ((4，S)-羧基-4- (4，N- (((6S) -2-(羥基甲基)_4_ 氧代-3，4，7，8-四氫-3H-環(huán)戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸三鈉鹽2的方法，包括: 根據(jù)權(quán)利要求1至19任一項的方法合成L-GlU- Y -D-GlU 二肽； 根據(jù)權(quán)利要求25至30任一項的方法從所述的L-Glu- Y -D-Glu 二肽合成(2，R) - ((4，S)-羧基-4- (4，N- (((6S) -2-(羥基甲基)_4_ 氧代-3，4，7，8-四氫-3H-環(huán)戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸；和根據(jù)權(quán)利要求31至39任一項的方法，從所述的(2，R)-((4，S)_羧基-4-(4，^(((65)-2-(羥基甲基)-4-氧代-3，4，7，8-四氫-3!1-環(huán)戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸制備和純化(2，R) - ((4，S)-羧基-4- (4，N- (((6S) -2-(羥基甲基)_4_ 氧代-3，4，7，8-四氫-3H-環(huán)戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸的三鈉鹽(0NX-0801) 。
【文檔編號】C07D239/80GK103748106SQ201180066993
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2011年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2010年12月22日
【發(fā)明者】J.A.克申, A.J.布里奇斯, M.D.喬巴爾, S.M.達爾齊爾, T.E.杰克斯, A.S.湯普森, J.R.澤勒 申請人:奧尼克斯醫(yī)藥品股份有限公司