Hsp90抑制肽偶聯(lián)物及其在腫瘤治療中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及腫瘤革El向治療劑，具體涉及一種熱休克蛋白90抑制狀偶聯(lián)物在制備 治療腫瘤的靶向治療偶聯(lián)物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤嚴(yán)重威脅人類的生命健康，改善當(dāng)前腫瘤的治療效果是醫(yī)藥工作者的一 項重要使命。臨床使用的大部分化療藥物對腫瘤的靶向性較差，用藥后并不是優(yōu)先在腫瘤 病灶富集，腫瘤藥物總量通常只占總給藥劑量的5-10%。同時化療藥物的毒副作用常常限 制了化療藥物的最佳使用量，最終導(dǎo)致化療不完全、早期復(fù)發(fā)和化療耐藥。
[0003]目前針對腫瘤細(xì)胞特有的突變信號通路的酪氨酸激酶抑制劑類在臨床使用中獲 得了巨大成功。對于突變型病人而言，這類藥物不僅療效好，而且毒副作用很小。然而這些 新型藥物存在抑瘤譜窄、使用10-12月后出現(xiàn)耐藥等不足。原癌信號通路之間存在多重平 行關(guān)系，很多情況下可以互相補(bǔ)償、代替，因而簡單阻斷一條通路往往不足以危及癌細(xì)胞的 生存。為了彌補(bǔ)這種不足，人們開始著眼于這些通路的交匯點，希望以一種藥物同時阻斷多 條通路，提高藥物的作用效果，改善藥物的抑瘤譜和病人個體普適性，HSP90就是其中一種。
[0004] HSP90是廣泛存在于真核細(xì)胞的一種分子伴侶，正常條件下主要協(xié)助細(xì)胞內(nèi)新合 成的客戶蛋白肽鏈（NascentpeptideofClientprotein)以正確折疊成具有各種生化功 能的酶、受體或信號因子等。在化療藥物作用下，腫瘤細(xì)胞啟動保護(hù)性機(jī)制，其中包括快速 上調(diào)HSP90的表達(dá)。這種保護(hù)機(jī)制是構(gòu)成腫瘤化療逃逸及耐藥的重要基礎(chǔ)。腫瘤細(xì)胞的 HSP90表達(dá)水平普遍較正常細(xì)胞高2-10倍[1]，此外細(xì)胞膜上也有高豐度HSP90表達(dá)[2]。 現(xiàn)已知有數(shù)十種原癌信號蛋白屬于HSP90的客戶蛋白[3]，從而使HSP90成為一個重要的原 癌信號網(wǎng)絡(luò)交匯點，對腫瘤細(xì)胞的HSP90分子伴侶功能進(jìn)行抑制，就有可能同時促進(jìn)多種 原癌蛋白質(zhì)的降解。同樣HSP90通過調(diào)控細(xì)胞自噬過程參與細(xì)胞對藥物的應(yīng)答，因而抑制 HSP90有望顯著改善腫瘤治療效果。
[0005] 如發(fā)明人在其發(fā)明專利（專利號：ZL201310258476.0;發(fā)明名稱：一種腫瘤特異性 靶向肽及其應(yīng)用）所述，利用噬菌體展示技術(shù)，篩選到與肺癌具有特異性結(jié)合的靶向肽（其 氨基酸序列為LPLTPLP，下文簡稱為P7)，并將該腫瘤特異性靶向肽與包載多西紫杉醇的生 物高分子材料聚乳酸連接，在制備腫瘤早期診斷和治療試劑中的用途。在下文中，所述靶向 肽與包載多西紫杉醇的聚乳酸形成的偶聯(lián)物又稱為靶向肽的納米制劑（TN-DTX)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 申請人提取了腫瘤細(xì)胞膜表面蛋白，經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳回收蛋白并進(jìn)行質(zhì) 譜鑒定，經(jīng)過質(zhì)譜鑒定明確氨基酸序列為LPLTPLP的靶向肽（下文簡稱為靶向肽）的結(jié)合 位點蛋白為HSP90。通過蛋白印跡實驗研宄了所述靶向肽對HSP90的表達(dá)影響。結(jié)果顯示， 靶向肽作用于腫瘤細(xì)胞后，可以直接降低HSP90的表達(dá)。因此該靶向肽是一種HSP90的抑 制肽。
[0007] 如【背景技術(shù)】部分所述，HSP90在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，有利于細(xì)胞對抗外界的溫 度、藥物及放射線刺激，在腫瘤復(fù)發(fā)和耐藥過程中發(fā)揮重要作用。申請人對靶向肽聯(lián)合多西 紫杉醇的作用進(jìn)行了探討。
[0008] 多西紫杉醇及靶向肽處理后，腫瘤細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白Beclin1及LC3的蛋白 表達(dá)水平發(fā)生變化。單獨給予靶向肽不影響腫瘤細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白Beclin1及LC3的 蛋白表達(dá)。單獨使用多西紫杉醇時，細(xì)胞內(nèi)Beclin1表達(dá)水平明顯升高，同時LC3-I型向 LC3-II型發(fā)生轉(zhuǎn)變，表明細(xì)胞內(nèi)自噬水平升高。當(dāng)同時加入多西紫杉醇及靶向肽后，與單純 使用多西紫杉醇相比較，自噬相關(guān)蛋白Beclin1表達(dá)水平明顯下降，LC3-I型向LC3-II型 的轉(zhuǎn)變也有所逆轉(zhuǎn)，結(jié)果表明靶向肽能夠顯著抑制多西紫杉醇引起的腫瘤細(xì)胞自噬。
[0009] 由此可以看出，所述靶向肽不僅具有靶向作用，與多西紫杉醇聯(lián)合使用時能夠促 進(jìn)腫瘤細(xì)胞由自噬向凋亡轉(zhuǎn)變，從而提高對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。基于此，申請人將所述 靶向肽與多西紫杉醇偶聯(lián)制備一種集成靶向遞送、自噬抑制和腫瘤殺傷功能于一體的偶聯(lián) 物，下文以DTX-P7表示。
[0010] 本發(fā)明通過在體實驗顯示，與常規(guī)制劑和基于該靶向肽制備的納米制劑相比，所 述偶聯(lián)物能夠顯著縮小腫瘤體積，對肺腺癌、乳腺癌、黑素瘤等細(xì)胞也有明顯的殺傷作用。
[0011] 本發(fā)明提供了基于該HSP90抑制肽在制備細(xì)胞毒性劑偶聯(lián)物方面的用途。本發(fā)明 所述的HSP90抑制肽能夠特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞并抑制細(xì)胞內(nèi)HSP90的表達(dá)。
[0012] 本發(fā)明還提供一種由HSP90抑制肽與細(xì)胞毒性劑通過接頭連接形成的偶聯(lián)物。優(yōu) 選地，所述HSP90抑制肽的氨基酸序列為LPLTPLP，優(yōu)選地所述HSP90抑制肽的氨基端連接 1-3個G，羧基端連接S、SH或SHS。優(yōu)選地，所述細(xì)胞毒性劑選自多西紫杉醇、紫杉醇和阿 霉素。優(yōu)選地，所述的接頭具有如下所示的通式：-C〇-(CH2CH2)n-C〇-，其中n選自1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10,所述接頭最優(yōu)選為-CO-CH2CH2-CO-。
[0013] 本發(fā)明提供所述的HSP90抑制肽由接頭通過酯化或酰胺化反應(yīng)與細(xì)胞毒性劑如 多西紫杉醇，紫杉醇和阿霉素等制備偶聯(lián)物，優(yōu)選靶向肽的氨基端通過接頭與多西紫杉醇 和紫杉醇的2-0H相連接，制備偶聯(lián)物。
[0014] 在另一方面，本發(fā)明還提供所述的HSP90抑制肽氨基端通過接頭與阿霉素的 10-來蘇己吡喃基上的-3-NH2相連接所制備的偶聯(lián)物。
[0015] 在另一方面，本發(fā)明還提供所述HSP90抑制肽氨基端通過接頭與阿霉素的8-羥乙 醜基相連接，制備偶聯(lián)物。
[0016] 本發(fā)明涉及以上述本發(fā)明偶聯(lián)物作為活性成份的藥物。通過將本發(fā)明偶聯(lián)物與一 種或多種藥學(xué)上可接受的固體或液體賦形劑和/或輔劑結(jié)合，制成適于人或動物使用的任 何劑型。本發(fā)明還涉及所述偶聯(lián)物在制備用于預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物中的用途。所述 腫瘤是HSP90高表達(dá)腫瘤，優(yōu)選自肺癌、肺腺癌、黑色素瘤、胃癌、乳腺癌、腎癌、肝癌、口腔 表皮癌、宮頸癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌和神經(jīng)腫瘤，更優(yōu)選為肺腺癌、乳腺癌和 黑色素瘤，進(jìn)一步優(yōu)選為肺腺癌。
[0017] 本發(fā)明偶聯(lián)物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、靜脈 注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮膚、陰道、直腸等。
[0018] 給藥劑型可以是液體劑型、固體劑型或半固體劑型。液體劑型可以是溶液劑（包 括真溶液和膠體溶液）、乳劑（包括0/V型、《/〇型和復(fù)乳）、混懸劑、注射劑（包括水針劑、 粉針劑和輸液）、滴眼劑、滴鼻劑、洗劑和搽劑等；固體劑型可以是片劑（包括普通片、腸溶 片、含片、分散片、咀嚼片、泡騰片、口腔崩解片）、膠囊劑（包括硬膠囊、軟膠囊、腸溶膠囊）、 顆粒劑、散劑、微丸、滴丸、栓劑、膜劑、貼片、氣（粉）霧劑、噴霧劑等；半固體劑型可以是軟 膏劑、凝膠劑、糊劑等。
[0019] 本發(fā)明偶聯(lián)物可以制成普通制劑、也制成是緩釋制劑、控釋制劑、靶向制劑及各種 微粒給藥系統(tǒng)。
[0020] 為了將本發(fā)明偶聯(lián)物制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種賦形劑，包括稀 釋劑、黏合劑、潤濕劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑。稀釋劑可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳 糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纖維素、硫酸鈣、磷酸氫鈣、碳酸鈣等；濕潤劑可以是水、乙 醇、異丙醇等；粘合劑可以是淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纖維素、阿拉伯膠 漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、乙基纖維素、丙烯酸樹脂、卡 波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解劑可以是干淀粉、微晶纖維素、低取代羥丙基纖維 素、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、羧甲基淀粉鈉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、聚氧乙 烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉等；潤滑劑和助流劑可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂 酸鹽、酒石酸、液體石蠟、聚乙二醇等。
[0021] 還可以將片劑進(jìn)一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙 層片和多層片。
[0022] 為了將給藥單元制成膠囊劑，可以將有效成分本發(fā)明偶聯(lián)物與稀釋劑、助流劑混 合，將混合物直接置于硬膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分本發(fā)明化合物先與稀釋劑、黏合 劑、崩解劑制成顆?；蛭⑼?，再置于硬膠囊或軟膠囊中。用于制備本發(fā)明化合物片劑的各稀 釋劑、黏合劑、潤濕劑、崩解劑、助流劑品種也可用于制備本發(fā)明化合物的膠囊劑。
[0023] 為將本發(fā)明偶聯(lián)物制成注射劑，可以用水、乙醇、異丙醇、丙二醇或它們的混合物 作溶劑并加入適量本領(lǐng)域常用的增溶劑、助溶劑、PH調(diào)劑劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑。增溶劑或助溶 劑可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羥丙基-0-環(huán)糊精等；PH調(diào)劑劑可以是磷酸鹽、醋酸鹽、鹽酸、 氫氧化鈉等；滲透壓調(diào)節(jié)劑可以是氯化鈉、甘露醇、葡萄糖、磷酸鹽、醋酸鹽等。如制備凍干 粉針劑，還可加入甘露醇、葡萄糖等作為支撐劑。
[0024] 此外，如需要也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑或其它添加 劑。
[0025] 為達(dá)到用藥目的，本發(fā)明的藥物可用任何公知的給藥方法給藥。
[0026] 本發(fā)明的偶聯(lián)物可單獨服用，或與其他治療藥物或?qū)ΠY藥物