專利名稱：一種離子交換色譜分離乳源α_s-酪蛋白的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及組分分離技術，具體涉及一種離子交換色譜分離乳源a s-酪蛋白的方法。
背景技術：
乳制品因其乳蛋白含量豐富，營養(yǎng)價值高，容易被人體消化吸收而被公認為是對人身體和智力發(fā)育有良好的作用的健康食品，乳中最有價值的成分也就是乳蛋白，主要包含酪蛋白和乳清蛋白，還有少量脂肪球蛋白，其中酪蛋白含量約占乳蛋白的80% 82%。是由多種蛋白質(zhì)組成的混合物，酪蛋白(casein，CN)又稱為干酪素，由四種組分組成，包括a s-酪蛋白、酪蛋白和K-酪蛋白，a s-酪蛋白又分為a sl-酪蛋白和as2_酪蛋白，約占酪蛋白總量的48%，是乳源酪蛋白生物活性肽的主要來源。 a s-酪蛋白可作為食品添加劑，應用于食品的生產(chǎn)，改善食品的風味；a s-酪蛋白是含磷蛋白復合體，經(jīng)水解可產(chǎn)生酪蛋白磷酸肽(CPP)，促進人體鈣吸收，因此a s-酪蛋白可作為酪蛋白磷酸肽制備的最優(yōu)原料；此外a s-酪蛋白水解可產(chǎn)生抗菌肽、免疫肽、阿片肽、抗高血壓肽以及促進礦物組織吸收，促進免疫，激素調(diào)節(jié)，抗病毒，降血脂等生物活性肽，且一些生物活性肽已經(jīng)運用于工業(yè)化生產(chǎn)?，F(xiàn)今的a s-酪蛋白分離技術大致可分為三種化學分級沉淀法，色譜法和鈣低溫系統(tǒng)分離法。雖然化學分級沉淀法和鈣低溫系統(tǒng)分離法較為常用，但其分離的條件要求嚴格(如鈣低溫系統(tǒng)分離法對溫度的依賴高)，且分離出的a s_酪蛋白常常混有酪蛋白的其他組分，在酪蛋白生物活性肽的研究應用中受到較多的限制，如陸曉民的發(fā)明專利(專利申請?zhí)?00510096244. 5)名稱為一種酪蛋白組分分離方法及應用和張列兵等人的發(fā)明專利(專利申請?zhí)?01010144728. 3)名稱為一種a s-酪蛋白的分離方法，分離出的a s-酪蛋白純度最高為97.8%。而色譜法有分辨率高，操作簡易，重復性好，成本低等優(yōu)點在蛋白質(zhì)純化過程中廣泛應用。離子交換色譜(Ion exchange chromatography, IEC),也叫離子交換層析,是利用離子交換介質(zhì)對各種離子的親和力不同，借以分離混合物中各種離子的一種層析技術，其主要特點是依靠帶有相反電荷的顆粒之間的吸引力的作用。離子交換色譜的固定相是離子交換劑，它是由一類不溶于水的惰性高分子聚合物質(zhì)，通過一定的化學反應共價結合上某種電荷基團形成的，可分為三部分高分子聚合物基質(zhì)、電荷基團和平衡離子。電荷基團與高分子聚合物共價結合，形成一個帶電的可進行離子交換的基團。平衡離子是結合于電荷基團上的相反離子，它能與溶液中其他的離子基團發(fā)生可逆的交換反應，根據(jù)其交換的離子基團種類不同又分為陽離子交換劑(與帶正電的基團交換)和陰離子交換劑(與帶負電的基團交換)。流動相是具有一定PH值和一定離子強度的電解質(zhì)溶液。蛋白質(zhì)在不同pH值緩沖液中，可帶有游離的氨基或羧基可與離子交換劑的基團進行交換吸附。用緩沖液進行洗脫，當緩沖液中的離子基團與結合在離子交換劑上的蛋白質(zhì)基團相競爭時，親和力小的蛋白質(zhì)分子先被解吸而被洗脫下來，而親和力大的后被解吸下來。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有技術中存在的上述不足，提供一種Cis-酪蛋白離子交換色譜分離法。本方法以酪蛋白素為原料，用離子交換色譜法，經(jīng)不連續(xù)梯度洗脫，尋找能洗脫出蛋白的離子強度所含有的鹽的濃度，將a s-酪蛋白與酪蛋白其他組分分離，得到高純度的a s-酪蛋白。本發(fā)明上述目的通過以下技術方案予以實現(xiàn)
酪蛋白為酸性蛋白質(zhì)，在pH>pI時帶負電荷，可選擇陰離子交換劑進行分離，而酪蛋白不同組分所帶電荷不同，與離子交換劑結合程度不同，因此改變洗脫液的離子強度可使不同組分分離開來。本發(fā)明所用的離子交換介質(zhì)DEAE-Sepharose CL-6B,經(jīng)其分離得到的a s-酪蛋白純度可為100%。本方法以購買得到的酪蛋白全素為原料。離子交換色譜分離a s-酪蛋白組分的分離方法包括以下步驟
(I)取標準酪蛋白全素用樣品緩沖液A液配制濃度為4mg/ml的標準液，冰箱4°C放置12h, 0. 45um濾膜過濾后備用。(2)取色譜柱用20%乙酸浸泡處理24h后清洗備用，取DEAE-S印harose CL-6B用樣品緩沖液A液浸泡，裝柱，高約30cm，用樣品緩沖液A液平衡。(3)上樣，樣品溶液約10ml，繼續(xù)用樣品緩沖液A液洗脫出未結合的蛋白，待未結合的蛋白完全洗脫出后改用樣品緩沖液B液進行不連續(xù)梯度洗脫，流速2mL/min，檢測波長為280nm紫外可見光，收集每個梯度洗脫出來的峰進行檢測。(4)收集的每個峰的洗脫液，SDS-PAGE電泳檢測，分離膠為12%，濃縮膠為5%。(5)將收集的每一個峰的蛋白溶液透析后經(jīng)0. 45 ii m過濾后進行反向高效液相色譜(RP-HPLC)檢測。色譜柱Jupiter 300 C18 反相蛋白柱,5 y m, 250_X4. 6mm i. d ;流動相A :0. 1% TFA水溶液；流動相B :100%乙腈溶液；梯度條件:0 40min，32% 49%流動相B ；操作條件流速為I. Oml/min ;檢測波長為214nm ;進樣體積為70 y I。(6)上述技術方案中樣品緩沖液A液為含3M尿素，0. 1%0_巰基乙醇，pH值為8.0的50mM的tris-HCl緩沖液。樣品緩沖液B液為含不同濃度NaCl的樣品緩沖液A液。(7)步驟(3)中動態(tài)吸附量約為9. 2mg/ml，上樣量約為40mg。本發(fā)明方法可用于不同乳源酪蛋白的分離，若原料為乳蛋白，需通過等電點沉淀法(Pl約為4. 6)除去乳清蛋白，得到酪蛋白。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果
本方法有操作簡單，分辨率高，重復性好，得到的蛋白純度高、回收率高，離子交換劑可重復利用等優(yōu)點。在2h內(nèi)可獲得純度為100%的a s-酪蛋白。分離得到的a s-酪蛋白課進行乳源活性肽的制備和深加工，使獲得的目的活性肽比例大大提高，經(jīng)擴大還可用于工業(yè)需要。本發(fā)明制得的酪蛋白可作為酪蛋白源生物活性肽研究的原料，為功能酪蛋白源活性肽的研究奠定基礎。


圖I為本發(fā)明處理流程示意 圖2為實施例I步驟(I)中的離子交換色譜圖，其中I為步驟(3)層析峰，II為步驟(4)層析峰，III為步驟(5)層析峰；
圖3為實施例I的電泳檢測結果，其中，I a s-酪蛋白標準品，2 : P -酪蛋白標準品，3 K -酪蛋白標準品，4 :步驟(3)收集的蛋白，5 :步驟(4)收集的蛋白，6 :步驟(5)收集的蛋白；
圖4為實施例I a s-酪蛋白標準品的高效液相色譜 圖5為實施例I P-酪蛋白標準品的高效液相色譜 圖6為實施例I K-酪蛋白標準品的高效液相色譜圖； 圖7為實施例I空白溶液的高效液相色譜 圖8為實施例I步驟(3)收集的蛋白的高效液相色譜 圖9為實施例I步驟(4)收集的蛋白的高效液相色譜 圖10為實施例I步驟(5)收集的蛋白的高效液相色譜圖。
具體實施例方式以下結合實施例來進一步解釋本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。實施例I
(I)取標準酪蛋白全素用樣品緩沖液A液(含3M尿素，0. 1%^-巰基乙醇，pH值為8. 0的50mM的tris-HCl緩沖液)配制濃度為4mg/ml的標準液，冰箱4°C放置12h，0. 45 u m濾膜過濾后備用。(2)取色譜柱用20%乙酸浸泡處理24h后清洗備用，取DEAE-S印harose CL-6B用樣品緩沖液A液浸泡，裝柱，高約30cm，用樣品緩沖液A液平衡后上樣標準蛋白樣品溶液IOml(上樣量為40mg)，繼續(xù)用樣品緩沖液A液洗脫出未結合的蛋白。(3)待未結合的蛋白完全洗脫出后改用含0. lmol/L濃度NaCl的樣品緩沖液A液進行梯度洗脫，流速為2mL/min，檢測波長為280nm紫外可見光，收集此梯度洗脫出來的峰進行檢測。(4)待此梯度下蛋白完全洗脫出后，按照步驟(3)改用含0.2mol/L濃度NaCl的樣品緩沖液A液進行梯度洗脫，收集此梯度洗脫出來的峰進行檢測。(5)按照步驟(4)改用含0. 3mol/L濃度NaCl的樣品緩沖液A液進行梯度洗脫，收集此梯度洗脫出來的峰進行檢測(具體流程圖見圖1，層析的色譜圖見圖2)。(6)將收集的蛋白進行電泳檢測，分離膠為12%，濃縮膠為5% (見圖3)。(7)將收集的每一個峰的蛋白溶液透析后經(jīng)0. 45 ii m進行反向高效液相色譜檢測。色譜柱Jupiter 300 C18 反相蛋白柱,5 u m, 250_X4. 6mm i. d ;流動相 A :0. 1% TFA水溶液；流動相B :100%乙腈溶液；梯度條件(T40min，32%^49%流動相B ;操作條件流速為I. Oml/min ;檢測波長為214nm紫外可見光；進樣體積為70 yl。其分離得到的a s-酪蛋白純度為100% (見圖4)。實施例2
(I)取新鮮市售水牛奶，4000r/min離心30min,收集下層脫脂乳，lmol/L HCl調(diào)pH至4. 6,4000r/min離心15min。沉淀用蒸懼水洗漆2次,丙酮洗漆2-3次,每次4000r/min離心IOmin,最后將沉淀自然風干，_ 20 C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> (2)取水牛奶酪蛋白用樣品緩沖液A液(含3M尿素，0. 1%3 -巰基乙醇，pH值為8. 0的50mM的tris-HCl緩沖液)配制濃度為4mg/ml的標準液，冰箱4°C放置12h，0. 45 u m濾膜過濾后備用。(3)取色譜柱用20%乙酸浸泡處理24h后清洗備用，取DEAE-S印harose CL-6B用樣品緩沖液A液浸泡，裝柱，高約30cm，用樣品緩沖液A液平衡后上樣標準蛋白樣品溶液IOml(上樣量為40mg)，繼續(xù)用樣品緩沖液A液洗脫出未結合的蛋白，
(4)待未結合的蛋白完全洗脫出后改用含0. lmol/L濃度NaCl的樣品緩沖液A液進行梯度洗脫，流速為2mL/min，檢測波長為280nm紫外可見光，收集此梯度洗脫出來的峰進行檢測。(5)待此梯度下蛋白完全洗脫出后，按照步驟(4)改用含0.2mol/L濃度NaCl的樣品緩沖液A液進行梯度洗脫，收集此梯度洗脫出來的峰進行檢測。 (6)按照步驟(5)改用含0. 3mol/L濃度NaCl的樣品緩沖液A液進行梯度洗脫，收集此梯度洗脫出來的峰進行檢測。(7)將收集的蛋白進行電泳檢測，分離膠為12%，濃縮膠為5%。 (8)將收集的每一個峰的蛋白溶液透析后經(jīng)0. 45 ii m進行反向高效液相色譜檢測。色譜柱Jupiter 300 C18 反相蛋白柱,5 u m, 250_X 4. 6mm i. d ;流動相 A :0. 1% TFA水溶液；流動相B :100%乙腈溶液；梯度條件(T40min，32%^49%流動相B ;操作條件流速為
I.Oml/min ;檢測波長為214nm ;進樣體積為70 yl。其分離得到的a s-酪蛋白純度為100%。
權利要求
1.一種離子交換色譜分離乳源a s-酪蛋白的方法，其特征在于包括如下步驟 (1)以標準酪蛋白全素為原料，用樣品緩沖液A配制濃度為4mg/ml的標準液，冰箱4°C放置12h, 0. 45 u m濾膜過濾后備用； (2)取色譜柱，用20%乙酸浸泡24h后清洗備用；再取DEAE-S印haroseCL-6B，用樣品緩沖液A浸泡，裝柱，高度為30cm，再用樣品緩沖液A平衡； (3)上樣，樣品溶液為10ml，繼續(xù)用樣品緩沖液A洗脫出未結合的蛋白，待未結合的蛋白完全洗脫出后改用樣品緩沖液B進行不連續(xù)梯度洗脫，硫酸為2ml/min，收集每個梯度洗脫出來的峰進行檢測，檢測波長為280nm紫外可見光； (4)收集每個峰的洗脫液，SDS-PAGE電泳檢測，分離膠為12%，濃縮膠為5%； (5)將收集的每個峰的蛋白溶液透析后，經(jīng)0.45 過濾，然后進行反向高效液相色譜，其中，動相為0. 1%TFA水溶液，流動相為100%乙腈溶液；梯度條件為32 49%流動相，OlOmin ;操作條件是流速為I. Oml/min,檢測波長為214nm,進樣體積為70ii I ; 其中，樣品緩沖液A為含3M尿素、0. 1% P -巰基乙醇、pH值為8. 0的50mM的tris_HCl緩沖液；樣品緩沖液B為含不同濃度NaCl的樣品緩沖液A。
2.根據(jù)權利要求I所述離子交換色譜分離乳源Cis-酪蛋白的方法，其特征在于步驟(3)中的動態(tài)吸附量為9. 2mg/ml，上樣量為40mg。
3.根據(jù)權利要求I所述離子交換色譜分離乳源Cis-酪蛋白的方法，其特征在于當原料為乳蛋白時，需通過等電點沉淀法(Pl為4. 6)除去乳蛋白中的乳清蛋白，然后得到酪蛋白，然后再進行后續(xù)處理步驟。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種離子交換色譜分離乳源αs-酪蛋白的方法。本發(fā)明所述方法具有產(chǎn)品純度高、操作簡易、重復性好、分辨率高、成本低等優(yōu)點，是酪蛋白純化分離的重要手段和方法。經(jīng)離子交換色譜分離的αs-酪蛋白可用于酪蛋白源生物活性肽的生產(chǎn)。
文檔編號C07K1/18GK102746394SQ20121000180
公開日2012年10月24日 申請日期2012年1月5日 優(yōu)先權日2012年1月5日
發(fā)明者向明霞, 徐明芳, 成希飛, 李子超, 王麗娜 申請人:暨南大學