專利名稱：一種從鴉膽子中提取純化鴉膽子素d的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥制備技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種中藥藥物活性成分的提取制備方法，特別是涉及一種從鴉膽 子中提取純化鴉膽子素D的制備方法。
背景技術(shù)：
鴉膽子素D (bruceine D)是從苦木科鴉膽子屬植物鴉膽子CSrwcea javanica (L)Merr)中分離到的一種四環(huán)三萜類苦木素，研究表明其不僅對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有強(qiáng)的抑制活性，而且對(duì)多種植物病毒的侵染和增殖具有強(qiáng)烈的抑制作用。鴉膽子素D不僅可以抑制煙草花葉病毒(TMV)基因組RNA及亞基因組RNA的復(fù)制，阻止病毒相關(guān)蛋白CP和MP的表達(dá)夕卜，還可抑制煙草葉片中TMV向莖部及植株上部葉片的移動(dòng)，誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生對(duì)TMV的抗性并對(duì)感染TMV的煙草起到保護(hù)作用，是研制新型、高效、安全的植物源抗病毒劑的理想化合物。然而由于鴉膽子素D的化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、手性碳多，難以化學(xué)合成，目前其來(lái)源仍然依賴于從植物中分離獲得。通常提取純化鴉膽子素D的方法是材料粉碎——95%工業(yè)乙醇回流提取一提取液濃縮一有機(jī)溶劑萃取(或有機(jī)溶劑回流提取)一娃膠柱層析一重結(jié)晶。在有機(jī)溶劑萃取(或有機(jī)溶劑回流提取)工藝中，通常使用石油醚、氯仿、甲醇等有毒有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取或提?。辉诠枘z柱層析工藝中，最常用的是采用濕柱法進(jìn)行分離，即用經(jīng)有機(jī)溶劑浸泡后的硅膠粉填充層析柱，將樣品加到填充層析柱上部，再用不同有機(jī)溶劑進(jìn)行洗脫，分部收集洗脫液，如此反復(fù)層析直至獲得純品。整個(gè)工藝較繁瑣、耗時(shí)，制備人員與有毒溶劑接觸的時(shí)間長(zhǎng)，嚴(yán)重?fù)p害制備人員的身體健康。DlOl大孔吸附樹脂是一種具有多孔海綿狀結(jié)構(gòu)人工合成的聚合物吸附劑，依靠樹脂骨架和被吸附的分子之間的范德華力，通過(guò)樹脂巨大的比表面積進(jìn)行物理吸附而達(dá)到從水溶液中分離提取水溶性較差的有機(jī)物質(zhì)的目的。DlOl樹脂是一種非極性吸附劑，一般用于中草藥中皂甙類物質(zhì)的提取與分離，具有操作簡(jiǎn)便、成本較低、樹脂可反復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種更為簡(jiǎn)便、高效地從鴉膽子中提取純化鴉膽子素D的制備方法，以解決當(dāng)前從植物鴉膽子中提取純化鴉膽子素D效率低、費(fèi)時(shí)、制備人員與有毒有機(jī)溶劑接觸時(shí)間長(zhǎng)，嚴(yán)重?fù)p害制備人員的身體健康等問(wèn)題。本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)施的
本發(fā)明的一種從鴉膽子中提取純化鴉膽子素D的制備方法，包括材料粉碎、回流提取、提取液濃縮、提取物去糖、硅膠柱層析、重結(jié)晶。所述制備方法的具體步驟如下
(1)材料粉碎取新鮮鴉膽子經(jīng)曬干或置烘干箱中經(jīng)45°c-55°C烘干后，用植物粉碎機(jī)粉碎成粉末；
(2)回流提取取一定量的粉末于回流燒瓶中，按樣品與提取溶劑的質(zhì)量體積比為I:8-10加入95%的乙醇，搖勻，安裝好相應(yīng)的冷凝裝置，將回流燒瓶置于電熱恒溫水浴鍋中，80°c回流1-2小時(shí)，自然冷卻至室溫，過(guò)濾，殘?jiān)猛瑯臃椒ɑ亓?-2次，合并濾液，即為提取液；
(3)提取液濃縮將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至溶液成粘稠狀，得到濃縮液；
(4)提取物去糖按體積比為I:5-8于濃縮液中加入蒸餾水，80°C水浴加熱并攪拌使之充分溶解，抽濾，濾液經(jīng)DlOl大孔樹脂柱層析吸附，先用2-4個(gè)柱體積的水洗脫，再用3-5個(gè)柱體積的80%乙醇洗脫，收集醇洗脫液，減壓濃縮至膏狀，得到膏狀提取物；
(5)硅膠柱層析采用硅膠干柱層析法結(jié)合濕柱層析法對(duì)提取物進(jìn)行分離，先用干柱法分離，再用濕柱法分離；采用干柱法分離時(shí)，膏狀提取物先用適量甲醇充分溶解，再將溶液與硅膠拌勻，提取物與拌樣硅膠的質(zhì)量比為I :5_10，待甲醇揮干后，將拌樣硅膠加到填好硅膠的干柱上，拌樣硅膠與填柱硅膠的質(zhì)量比為I :15-20，以氯仿與丙酮體積比為8 :5的混合溶劑作為展開劑進(jìn)行柱層析，當(dāng)展開劑到達(dá)柱底部時(shí)結(jié)束展開，待層析柱中多余溶劑揮干后，根據(jù)鴉膽子素D標(biāo)準(zhǔn)品在硅膠薄層層析中所測(cè)的Rf值，推算其在層析柱上的相應(yīng)位置，以該位置為中心，將柱中硅膠平均分為4-8段，每段約5-10 cm，分別取出各段硅膠并用甲醇充分洗脫，將各洗脫液進(jìn)行薄層層析檢測(cè)，合并含鴉膽子素D的部位，并用常規(guī)方法濃縮，得濃縮物A ;將干柱法分離得到的濃縮物A再用濕柱法分離，濕柱法分離與通常采用的硅膠柱層析法相同，以氯仿、丙酮、甲醇體積比為10 2 1的混合溶劑為洗脫劑進(jìn)行洗脫，分部收集洗脫液柱(一般為直徑3cm，長(zhǎng)80cm的柱每約20 mL收集一份)，將各洗脫液進(jìn)行薄層層析檢測(cè)，合并僅在與鴉膽子素D標(biāo)準(zhǔn)品Rf值相同處出現(xiàn)點(diǎn)的部位，即可獲得含鴉膽子素D的洗脫液；
(6)重結(jié)晶將薄層層析檢測(cè)僅在與鴉膽子素D標(biāo)準(zhǔn)品Rf值相同處出現(xiàn)點(diǎn)的合并洗脫液減壓濃縮后，用甲醇充分溶解，過(guò)濾，濾液靜置于4°C冰箱中，待結(jié)晶析出后，濾出結(jié)晶即為鴉膽子素D純品。所述步驟(I)中的鴉膽子為鴉膽子植物的種子、皮、葉中的任一種。所述步驟(5)中若不能獲得純度高的鴉膽子素D洗脫液，可用濕柱法再進(jìn)行一次分離。本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)
(I)在提取物去糖工藝中采用提取液濃縮后的水懸浮液上DlOl大孔樹脂，先用水洗脫2-4個(gè)柱體積，再用80%乙醇洗脫3-5個(gè)柱體積，收集乙醇洗脫液并減壓濃縮處理。通過(guò)該處理可有效除去提取物中糖份等雜質(zhì)，富集提取物中鴉膽子素D等水溶性較差的有機(jī)成分，提高柱層析過(guò)程中硅膠的承載量及分離效率，避免采用有機(jī)溶劑萃取或有機(jī)溶劑回流提取工藝中有毒有機(jī)溶劑的使用。(2)本方法通過(guò)大孔樹脂和硅膠干柱層析兩步處理后，可去除提取物中的大部分雜質(zhì)，使目標(biāo)成分鴉膽子素D得到有效的富集，顯著提高分離效率，鴉膽子素D的提取率可達(dá)75%-85%。而現(xiàn)有技術(shù)中鴉膽子素D的提取率較低，一般為50%-70%。(3)本發(fā)明人通過(guò)多次試驗(yàn)證明，采用本發(fā)明方法可從鴉膽子中提取純化到高純度的鴉膽子素D，純度(采用HPLC檢測(cè))可達(dá)98%以上，可用于各種生物活性研究，具有制備方法簡(jiǎn)單、制備過(guò)程有毒有機(jī)溶劑使用量少、制備人員與有毒溶劑接觸時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。


圖I為從鴉膽子種子中提取純化的鴉膽子素D結(jié)晶。
具體實(shí)施例方式為了對(duì)本發(fā)明的一種從鴉膽子中提取純化鴉膽子素D的制備方法作進(jìn)一步說(shuō)明，以下介紹鴉膽子素D的具體提取制備方法，但其絕不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成限制。實(shí)施例I ::稱取曬干的鴉膽子種子1.0 kg，用植物粉碎機(jī)粉碎后用10 L 95%的工業(yè)乙醇回流提取3次(條件為80°C回流I小時(shí))，合并提取液，過(guò)濾并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至粘稠狀，得到約165 mL的濃縮液，加入蒸餾水至1000 mL，80°C水浴加熱攪拌使之充分溶解，抽濾，濾液分3次上DlOl大孔樹脂。每次取約300 mL懸浮液過(guò)裝有IOOOg DlOl大孔樹脂的層析柱(柱直徑6cm，長(zhǎng)60cm)，上樣流速約為10 mL/min，先用2個(gè)柱體積的水洗脫，再用3個(gè)柱體積的80%乙醇洗脫，收集醇洗脫液，合并3次洗脫液，減壓濃縮成膏狀，得膏狀物46 g。將膏狀物用甲醇溶解后加入260 g硅膠粉均勻吸附，待甲醇揮干后，將樣品加到裝有4. 5 kg硅膠粉(200-300目)的干柱(柱直徑8cm，長(zhǎng)120cm)上，以氯仿丙酮(體積t匕)=8 5的溶劑為展開劑進(jìn)行層析，當(dāng)展開劑到達(dá)柱底部時(shí)結(jié)束展開，待多余溶劑揮干后， 根據(jù)薄層層析所測(cè)鴉膽子素D的Rf值，計(jì)算目標(biāo)成分在柱體中的位置，將該位置及附近的硅膠分4段取出，每段約7 cm，分別用甲醇將取出的各部分洗脫并將各洗脫液進(jìn)行薄層層析檢測(cè)，合并含鴉膽子素D的第2、3部分洗脫液，減壓濃縮成膏狀，將含鴉膽子素D的濃縮物再用濕柱法分離，以氯仿、丙酮、甲醇體積比為10 2 1的混合溶劑為洗脫劑進(jìn)行洗脫，分部收集洗脫液，將各洗脫液進(jìn)行薄層層析檢測(cè)，合并僅在與鴉膽子素D標(biāo)準(zhǔn)品Rf值相同處出現(xiàn)點(diǎn)的部位，待其中溶劑揮干后即為高純度的鴉膽子素D，用甲醇重結(jié)晶(用甲醇充分溶解，過(guò)濾，濾液靜置于4°C冰箱中，待結(jié)晶析出后，濾出結(jié)晶即為鴉膽子素D純品，下同)后最終獲得純度為99%的鴉膽子素D 78 mg，鴉膽子素D的提取率為83. 7%。實(shí)施例2 :稱取經(jīng)55°C烘干的鴉膽子植物的皮I. O kg,用植物粉碎機(jī)粉碎后用8 L95%的工業(yè)乙醇回流提取3次(條件為80°C回流I. 5小時(shí))，合并提取液，過(guò)濾并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至約180 mL，加入蒸餾水至1200 mL，于80°C水浴中攪拌加熱使之充分溶解，抽濾，濾液分3次上DlOl大孔樹脂。每次取約400 mL懸浮液過(guò)裝有1300g DlOl大孔樹脂的層析柱(柱直徑6cm，長(zhǎng)80cm)，上樣流速約為10 mL/min，先用3個(gè)柱體積的水洗脫，再用4個(gè)柱體積的80%乙醇洗脫，收集醇洗脫液，合并3次洗脫液，減壓濃縮成膏狀,得膏狀物41go將膏狀物用甲醇溶解后加入280 g硅膠粉均勻吸附，待甲醇揮干后，將樣品加到裝有4. 3kg硅膠粉(200-300目)的干柱(柱直徑8cm，長(zhǎng)120cm)上，以氯仿丙酮(體積比)=8 5的溶劑為展開劑進(jìn)行層析，當(dāng)展開劑到達(dá)柱底部時(shí)結(jié)束展開，待多余溶劑揮干后，根據(jù)薄層層析所測(cè)鴉膽子素D的Rf值，計(jì)算目標(biāo)成分在柱體中的位置，將該位置及附近的硅膠分5段取出，每段約6 cm，分別用甲醇將取出的各部分洗脫并將各洗脫液進(jìn)行薄層層析檢測(cè)，合并含鴉膽子素D的洗脫液，減壓濃縮成膏狀。將含鴉膽子素D的濃縮物再用濕柱法分離，以氯仿、丙酮、甲醇體積比為10 2 1的混合溶劑為洗脫劑進(jìn)行洗脫，分部收集洗脫液，將各洗脫液進(jìn)行薄層層析檢測(cè)，合并僅在與鴉膽子素D標(biāo)準(zhǔn)品Rf值相同處出現(xiàn)點(diǎn)的部位，待其中溶劑揮干后即為高純度的鴉膽子素D，用甲醇重結(jié)晶后最終獲得純度為99%的鴉膽子素D 47mg,鴉膽子素D的提取率為81. 1%。實(shí)施例3 :稱取經(jīng)45°C烘干的鴉膽子植物的葉I. 5 kg,用植物粉碎機(jī)粉碎后用15L 95%的工業(yè)乙醇回流提取3次(條件為80°C回流2小時(shí))，合并提取液，過(guò)濾并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至約300 mL，加入蒸餾水至2000 mL，于80°C水浴中攪拌加熱使之充分溶解，抽濾，濾液分5次上DlOl大孔樹脂。每次取約400 mL懸浮液過(guò)裝有1300g DlOl大孔樹脂的層析柱(柱直徑6cm，長(zhǎng)80cm)，上樣流速約為10 mL/min，先用4個(gè)柱體積的水洗脫，再用5個(gè)柱體積的80%乙醇洗脫，收集醇洗脫液，合并5次洗脫液，減壓濃縮成膏狀,得膏狀物62g。將膏狀物用甲醇溶解后加入320 g硅膠粉均勻吸附，待甲醇揮干后，將樣品加到裝有5. 6kg硅膠粉(200-300目)的干柱(柱直徑8cm，長(zhǎng)130cm)上，以氯仿丙酮(體積比)=8 5的溶劑為展開劑進(jìn)行層析，當(dāng)展開劑到達(dá)柱底部時(shí)結(jié)束展開，待多余溶劑揮干后，根據(jù)薄層層析所測(cè)鴉膽子素D的Rf值，計(jì)算目標(biāo)成分在柱體中的位置，將該位置及附近的硅膠分6段取出，每段約7 cm，分別用甲醇將取出的·各部分洗脫并將各洗脫液進(jìn)行薄層層析檢測(cè)，合并含鴉膽子素D的洗脫液，減壓濃縮成濃縮物A。將濃縮物A用濕柱法分離，以氯仿、丙酮、甲醇體積比為10 2 1的混合溶劑為洗脫劑進(jìn)行洗脫，分部收集洗脫液，將各洗脫液進(jìn)行薄層層析檢測(cè)，合并含鴉膽子素D的部位，常規(guī)方法濃縮后獲得濃縮物B，濃縮物B再用濕柱法分離一次，以氯仿與甲醇體積比為9 1的混合溶劑為洗脫劑，其余步驟與第一次濕柱法相同，合并僅在與鴉膽子素D標(biāo)準(zhǔn)品Rf值相同處出現(xiàn)點(diǎn)的部位，待其中溶劑揮干后用甲醇重結(jié)晶后可得純度為99%的鴉膽子素D 22 mg,鴉膽子素D的提取率為76. 2%。
權(quán)利要求
1.一種從鴉膽子中提取純化鴉膽子素D的制備方法，包括材料粉碎、95%工業(yè)乙醇回流提取、提取液濃縮、提取物去糖、硅膠柱層析、重結(jié)晶，其特征在于所述提取物去糖是采用提取液濃縮液的水懸浮液上DlOl大孔樹脂，先用2-4個(gè)柱體積的水洗脫，再用3-5個(gè)柱體積的80%乙醇洗脫，收集醇洗脫液后減壓濃縮。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種從鴉膽子中提取純化鴉膽子素D的制備方法，其特征在于所述硅膠柱層析是先用干柱法分離，再用濕柱法分離。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種從鴉膽子中提取純化鴉膽子素D的制備方法，其特征在于所述干柱法分離中樣品與拌樣硅膠的質(zhì)量比為I :5_10，拌樣硅膠與填柱硅膠的質(zhì)量比為I 15-20 ;所述濕柱法分離與通常采用的硅膠柱層析法相同。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種從鴉膽子中提取純化鴉膽子素D的制備方法，其特征在于所述制備方法的步驟如下 (1)材料粉碎取新鮮鴉膽子經(jīng)曬干或置烘干箱中經(jīng)45°C_55°C烘干后，用植物粉碎機(jī)粉碎成粉末； (2)95%工業(yè)乙醇回流提取取一定量的粉末于回流燒瓶中，按樣品與提取溶劑的質(zhì)量體積比為I :8-10加入95%的工業(yè)乙醇，搖勻，安裝好相應(yīng)的冷凝裝置，將回流燒瓶置于電熱恒溫水浴鍋中，80°C回流1-2小時(shí)，自然冷卻至室溫，過(guò)濾，殘?jiān)猛瑯臃椒ɑ亓?-2次，合并濾液，即為提取液； (3)提取液濃縮將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至溶液成粘稠狀，得到濃縮液； (4)提取物去糖按體積比為I:5-8于濃縮液中加入蒸餾水，80°C水浴加熱并攪拌使之充分溶解，抽濾，濾液經(jīng)DlOl大孔樹脂柱層析吸附，先用2-4個(gè)柱體積的水洗脫，再用3-5個(gè)柱體積的80%乙醇洗脫，收集醇洗脫液，減壓濃縮至膏狀，得到膏狀提取物； (5)硅膠柱層析先用干柱法分離，用適量甲醇充分溶解膏狀提取物，將所得溶液與硅膠拌勻，提取物與拌樣硅膠的質(zhì)量比為I :5_10，待甲醇揮干后，將拌樣硅膠加到填好硅膠的干柱上，拌樣硅膠與填柱硅膠的質(zhì)量比為I :15_20，以氯仿與丙酮體積比為8 :5的混合溶劑作為展開劑進(jìn)行柱層析，當(dāng)展開劑到達(dá)柱底部時(shí)結(jié)束展開，待層析柱中多余溶劑揮干后，根據(jù)鴉膽子素D標(biāo)準(zhǔn)品在硅膠薄層層析中所測(cè)的Rf值，推算其在層析柱上的相應(yīng)位置，以該位置為中心，將柱中硅膠平均分為4-8段，每段約5-10 cm，分別取出各段硅膠并用甲醇充分洗脫，將各洗脫液進(jìn)行薄層層析檢測(cè)，合并含鴉膽子素D的部位，并用常規(guī)方法濃縮，得濃縮物A ;將干柱法分離得到的濃縮物A再用濕柱法分離，濕柱法分離與通常采用的硅膠柱層析法相同，以氯仿、丙酮、甲醇體積比為10 2 1的混合溶劑為洗脫劑進(jìn)行洗脫，分部收集洗脫液，將各洗脫液進(jìn)行薄層層析檢測(cè)，合并僅在與鴉膽子素D標(biāo)準(zhǔn)品Rf值相同處出現(xiàn)點(diǎn)的部位，即可獲得含鴉膽子素D的洗脫液； (6)重結(jié)晶將薄層層析檢測(cè)僅在與鴉膽子素D標(biāo)準(zhǔn)品Rf值相同處出現(xiàn)點(diǎn)的合并洗脫液減壓濃縮后，用甲醇充分溶解，過(guò)濾，濾液靜置于4°C冰箱中，待結(jié)晶析出后，濾出結(jié)晶即為鴉膽子素D純品。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述一種從鴉膽子中提取純化鴉膽子素D的制備方法，其特征在于所述步驟(I)中的鴉膽子為鴉膽子植物的種子、皮、葉中的任一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述一種從鴉膽子中提取純化鴉膽子素D的制備方法，其特征在于所述步驟(5)中若不能獲得獲得純度高的鴉膽子素D洗脫液，可用濕柱法再進(jìn)行一次分離。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種從鴉膽子中提取純化鴉膽子素D的制備方法，所述方法包括材料粉碎、95%工業(yè)乙醇回流提取、提取液濃縮、提取物去糖、硅膠柱層析、重結(jié)晶，其中提取物去糖工藝采用提取濃縮液的水懸浮液上D101大孔樹脂，先用水洗脫，再用80%乙醇洗脫，收集醇洗脫液處理。通過(guò)該處理可有效除去提取物中的糖份等雜質(zhì)，提高硅膠的承載量及分離效率。硅膠柱層析工藝采用先進(jìn)行一次干柱法分離，再用濕柱法分離處理。干柱法分離可縮短分離時(shí)間，減少人力投入。本發(fā)明提供的制備方法獲得的鴉膽子素D純度可達(dá)98%以上，且操作簡(jiǎn)單，可節(jié)約有毒溶劑的使用量，節(jié)省人力，節(jié)約時(shí)間。
文檔編號(hào)C07D493/10GK102924467SQ20121043956
公開日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月7日
發(fā)明者陳啟建, 歐陽(yáng)明安, 譚慶偉 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)