一種快速提取純化檢測毛樣蛋白方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速提取純化檢測毛樣蛋白方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)樣品分類，分別剪成小段；(2)0.15％壬基酚聚氧乙烯(9)醚60℃清洗20min，吸干；(3)dd水60℃清洗5min，吸干；(4)二氯甲烷和乙醇洗常溫清洗20min，吸干；(5)dd水60℃清洗5min，吸干；(6)0.1M甲醇堿KOH，室溫30min，吸干；(7)dd水60℃清洗5min，吸干；(8)磨碎：用水浸濕，液氮研磨；(9)提?。?00μL?of7M尿素，2M硫脲，50mM?Tris，and50mM?TCEP，pH4，室溫，過夜消化；.(10)純化步驟。
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于化學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種快速提取純化檢測毛樣蛋白方法。 一種快速提取純化檢測毛樣蛋白方法

【背景技術(shù)】
[0002] 毛發(fā)蛋白主要是角蛋白組成，而角蛋白分子間主要是靠二硫鍵形成穩(wěn)定的空間網(wǎng) 狀結(jié)構(gòu)。溶解毛發(fā)中的蛋白主要是使二硫鍵（-s-s)斷裂，此外蛋白質(zhì)分子間高密度的氫 鍵、鹽式鍵等也不能忽視。目前國內(nèi)現(xiàn)有蛋白質(zhì)提取技術(shù)時間相對較長，程序繁瑣，不利于 實驗室高通量大規(guī)模地應(yīng)用，制備角蛋白主要有一下幾種方法：1)機械法，有高壓水解法、 膨化法、擠壓法和擠出法。主要是加熱（100?200°C )、加壓（0. 294?0. 98MPa)的方法使 角蛋白內(nèi)部的二硫鍵斷裂水解，從而使其變?yōu)榭扇?、易消化的多肽混合物?)化學(xué)法，有酸 堿法、還原法、氧化法和金屬鹽法。機械法不僅能夠讓二硫鍵發(fā)生斷裂，還能讓多肽鏈發(fā)生 斷裂，得率不高，不利于對蛋白質(zhì)組成份分析?；瘜W(xué)法中的酸堿法提取過程中會產(chǎn)生堿性廢 水和廢酸的蒸汽，污染環(huán)境，并對人體有害。近年人們更多地采用還原法制備可溶性角蛋白 研究蛋白質(zhì)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于克服上述技術(shù)存在的缺陷，提供一種快速提取純化檢測毛樣蛋 白方法。其具體技術(shù)方案為：
[0004] 一種快速提取純化檢測毛樣蛋白方法，包括以下步驟：
[0005] (1)樣品分類，分別剪成小段；
[0006] (2)0.15%壬基酚聚氧乙烯（9)醚601：清洗201^11，吸干；
[0007] (3) dd 水 60°C 清洗 5min，吸干；
[0008] (4)二氯甲烷和乙醇洗常溫清洗20min，吸干；
[0009] (5)超純水60°C清洗5min，吸干；
[0010] (6) 0· 1M 甲醇堿 Κ0Η，室溫 30min，吸干；
[0011] (7)超純水60°C清洗5min，吸干；
[0012] (8)磨碎：用水將毛絨浸濕后在液氮中研磨粉碎；
[0013] (9)提?。喝》勰?200mg 加入 500yL of7M 尿素、2M硫脲、50mM Tris 和 50mM TCEP 溶液（pH4)，37°C，振蕩消化過夜；.
[0014] (10)純化步驟
[0015] 1).取0. 1ml消化液至2ml離心管，加入0. 4ml甲醇，渦旋混勻；
[0016] 2) ·再加入0· 2ml氯仿，渦旋混勻；
[0017] 3)再加入0. 3ml超純水，劇烈震蕩，10000g離心，lmin ;
[0018] 4).小心棄掉上清；
[0019] 5).加入0· 3ml甲醇，渦旋混勻，10000g，離心2min ;
[0020] 6).棄掉上清，倒置室溫干燥，備下一步使用；
[0021] 7). 50-100微升IX蛋白上樣緩沖液溶解，沸水浴5min，備SDS-PAGE跑膠使用。
[0022] 進一步優(yōu)選，步驟（4)中所述二氯甲烷和乙醇洗的體積比為V/V2 : 1。
[0023] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0024] 本發(fā)明采用的"壬基酚聚氧乙烯（9)醚"非離子表面活性劑，能夠有效的清洗毛樣 表面污漬，再用二氯甲烷和乙醇祛除內(nèi)部脂質(zhì)，再用甲醇堿祛除結(jié)合脂肪酸。通過物理粉 碎，采用還原法，Tris (2_carboxyethyl)phosphine (TCEP)還原角蛋白二硫鍵，再利用利用 高濃度尿素和硫脲使其蛋白膨脹溶解，最終得到可溶性蛋白質(zhì)，該方法反應(yīng)活性溫和易溶、 毒性小，而更容易操作和應(yīng)用后續(xù)蛋白質(zhì)譜分析。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1為SDS-PAGE檢測結(jié)果，其中：M為預(yù)染蛋白marker(14. 4-120KD) ;1為陜北白 絨山羊A的毛樣，2、3為陜北白絨山羊A的絨毛羊；4為陜北白絨山羊B的毛樣，5、6為陜北 白絨山羊B的絨毛羊。

【具體實施方式】
[0026] 下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步詳細地說明。
[0027] 一種快速提取純化檢測毛樣蛋白方法，包括以下步驟：
[0028] (1)樣品分類，分別剪成小段；
[0029] (2)0.15%壬基酚聚氧乙烯（9)醚601：清洗201^11，吸干；
[0030] (3) dd 水 60°C清洗 5min，吸干；
[0031] (4)二氯甲烷和乙醇洗常溫清洗20min，吸干；
[0032] (5)超純水60°C清洗5min，吸干；
[0033] (6) 0· 1M 甲醇堿 Κ0Η，室溫 30min，吸干；
[0034] (7)超純水60°C清洗5min，吸干；
[0035] (8)磨碎：用水將毛絨浸濕后在液氮中研磨粉碎；
[0036] (9)提?。喝》勰?200mg 加入 500 μ L of7M 尿素、2M硫脲、50mM Tris 和 50mM TCEP 溶液（pH4)，37°C，振蕩消化過夜；.
[0037] (10)純化步驟
[0038] 1).取0. 1ml消化液至2ml離心管，加入0. 4ml甲醇，渦旋混勻；
[0039] 2).再加入0. 2ml氯仿，渦旋混勻；
[0040] 3)再加入0. 3ml超純水，劇烈震蕩，10000g離心，lmin ;
[0041] 4).小心棄掉上清；
[0042] 5) ·加入0· 3ml甲醇，渦旋混勻，10000g，離心2min ;
[0043] 6).棄掉上清，倒置室溫干燥，備下一步使用；
[0044] 7). 50-100微升IX蛋白上樣緩沖液溶解，沸水浴5min，備SDS-PAGE跑膠使用。
[0045] 步驟（4)中所述二氯甲烷和乙醇洗的體積比為V/V2 : 1。
[0046] 將得到的膠條送至華大公司測序得到如下結(jié)果：
[0047] 陜北白絨山羊A :毛樣檢測出205種毛蛋白，絨樣檢測出252種毛蛋白。
【權(quán)利要求】
1. 一種快速提取純化檢測毛樣蛋白方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 樣品分類，分別剪成小段； (2) 0. 15%壬基酚聚氧乙烯（9)醚60°C清洗20min，吸干； (3) 超純水6(TC清洗5min，吸干； (4) 二氯甲烷和乙醇洗常溫清洗20min，吸干； (5) 超純水60°C清洗5min，吸干； (6) 0· 1M甲醇堿KOH，室溫30min，吸干； (7) 超純水60°C清洗5min，吸干； (8) 磨碎：用水浸濕，液氮研磨； (9) 提取：200yL of7M 尿素，2M 硫脲，50mM Tris，and50mM TCEP，pH4,室溫，過夜消 化;· (10) 純化步驟 1) .向0. lml蛋白溶液中加入0.4ml甲醇，渦旋，瞬時離心，10s ; 2) .再加入0. 2ml氯仿，渦旋，瞬時離心，10s ; 3) 再加入0. 3ml ddH20,劇烈震蕩，瞬時離心，lmin ; 4) .小心棄掉上清，用槍吸； 5) .加入0.3ml甲醇，潤旋，瞬時離心，2min，沉淀； 6) .棄掉上清，倒置室溫干燥，干燥完成后保存?zhèn)溆茫? 7) . 50-100微升5 % SDS溶解蛋白，不容物可用蛋白上樣buffer溶解，備用，跑 SDS-PAGE。
2. 快速提取純化檢測毛樣蛋白方法，其特征在于，步驟（4)中所述二氯甲烷和乙醇洗 的體積比為V/V2 : 1。
【文檔編號】G01N1/28GK104101524SQ201410318956
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月7日
【發(fā)明者】王小龍, 陳玉林, 周光現(xiàn), 牛怡源, 師丙波 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)