一種1,8-萘酰亞胺類衍生物熒光探針制備方法及利用該生物探針檢測酪蛋白的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種1,8-萘酰亞胺類衍生物熒光探針制備方法及利用該生物探針檢測酪蛋白的方法，利用酪蛋白膠團的特性，建立一種基于聚集誘導發(fā)光的酪蛋白檢測方法。本發(fā)明的聚集誘導同步發(fā)光檢測酪蛋白帶來技術效果如下：1、首次提出了1,8-萘酰亞胺探針對酪蛋白膠團的聚集誘導發(fā)光現(xiàn)象并建立酪蛋白檢測技術；2、提出了基于含雙羧基為前導嵌入基團、熒光基元聚集于酪蛋白表面提供聚集發(fā)光效率的新思路來設計高性能聚集誘導發(fā)光探針；3、本發(fā)明中對外源非法添加物對檢測具有良好的選擇性；4、本發(fā)明酪蛋白聚集誘導同步發(fā)光有靈敏度高、簡便快速、準確的特點，與傳統(tǒng)的雙縮脲法及比色ELISA法比較，靈敏度可以提高三個數(shù)量級。
【專利說明】一種1 ’ 8-萘酰亞胺類衍生物熒光探針制備方法及利用該生物探針檢測酪蛋白的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及發(fā)光材料檢測領域，具體涉及一種1，8-萘酰亞胺類衍生物熒光探針制備方法及利用該生物探針檢測酪蛋白的方法，用于檢測乳制品中真蛋白的含量。
【背景技術】
[0002]酪蛋白是乳品真蛋白中最重要的蛋白質(zhì)，大約占到總蛋白含量的80%，主要以膠束狀態(tài)存在于乳中。由于中國國家標準中乳品蛋白質(zhì)檢測方法的缺陷，出現(xiàn)摻加尿素、銨肥、三聚氰胺等氮含量高的有機物來提高“蛋白質(zhì)含量”的違法操作，嚴重制約了我國乳制品的質(zhì)量提升，影響了消費者的身體健康。雖然2008年10月20日，農(nóng)業(yè)部發(fā)布了行業(yè)標準NY/T 1678-2008《乳與乳制品中蛋白質(zhì)的測定雙縮脲比色法》。該標準利用三氯乙酸作為變性劑使蛋白質(zhì)沉淀，然后用雙縮脲顯色法測定沉淀物中蛋白質(zhì)的含量。但存在測定結果有可能受脂肪及碳水化合物等因素干擾的缺陷，尤其該法對水解蛋白及動物蛋白等劣質(zhì)蛋白具有相似的響應作用，同樣為不法分子摻加劣質(zhì)蛋白以提高蛋白質(zhì)含量提供可乘之機。因此檢測三聚氰胺、尿素、銨肥、水解蛋白及動物蛋白只能解決一時之需，它不能從根本上解決原料奶的質(zhì)量安全問題，食品分析中必須從真蛋白質(zhì)測試入手，測定真蛋白質(zhì)含量，才能夠有效避免假冒劣質(zhì)蛋白質(zhì)的濫竽充數(shù)。
[0003]目前國內(nèi)外酪蛋白檢測方法有凱氏定氮法、雙縮脲法、第四導數(shù)光譜法、液質(zhì)聯(lián)用、ELISA法、電泳法、蛋白質(zhì)免疫印跡、反相色譜、芯片及熒光探針法。但這些方法都具有不同程度的局限性，如靈敏度和選擇性較差、檢測儀器價格昂貴、操作過程復雜等。因此，在當前乳制品質(zhì)量安全問題的嚴重時期，急需建立適應新?lián)郊偾闆r的快速、高效的真蛋白檢測方法，以確保乳制品的品質(zhì)安全和消費者的健康。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004]為了解決現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明利用酪蛋白膠團的特性，建立一種基于聚集誘導發(fā)光的酪蛋白檢測方法。該方法具有靈敏度高、選擇性好、檢測成本低廉、適用性廣等特點。
[0005]本發(fā)明采取如下的技術解決方案:一種1，8-萘酰亞胺類衍生物熒光探針制備方法，將4-溴-1，8萘酐和乙二胺加熱攪拌后冷卻；經(jīng)真空干燥去除乙二胺后和氯乙酸甲酯溶解在甲醇中，加入等質(zhì)量的NaH2PO4和KI并加熱攪拌，溶液澄清后加入NaOH后繼續(xù)攪拌，冷卻后將溶液的PH值調(diào)節(jié)至2-3，無水乙醇重結晶至少兩次得到固體探針。
[0006]本發(fā)明的進一步改進包括:
[0007]所述的pH值由lmol/L的HCl溶液或0.05mol/L磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)。
[0008]所述加入等質(zhì)量的NaH2PO4和KI并在40° C溫度下加熱攪拌3天，溶液澄清后加入3mol/L的NaOH后繼續(xù)攪拌12小時。
[0009]本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用1，8-萘酰亞胺類衍生物熒光探針檢測酪蛋白的方法，其特征在于，制得1，8-萘酰亞胺類衍生物熒光探針；以1，8-萘酰亞胺類衍生物熒光探針的雙羧基作為前導嵌入式官能團，插入酪蛋白膠團內(nèi)部的疏水腔內(nèi)與殘基相結合，而探針的熒光基元聚集于酪蛋白膠團表面，引起聚集誘導同步熒光發(fā)光效應。
[0010]上述檢測方法的進一步改進包括:
[0011]所述的探針的濃度為5 μ mol/L。
[0012]所述的同步突光光譜檢測條件為:波長間隔為15和60nm,狹縫寬度為IOnm,最大發(fā)射峰為360nm。
[0013]所述的檢測條件是PH值為7.4。
[0014]所述的酪蛋白檢測范圍分別為0.1 -20.0 μ gmL—1和0.1 - 16.0 μ gmL—1。
[0015]所述的pH值由0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)。
[0016]待檢測酪蛋白溶解于PH為7.4的磷酸鹽緩沖液中，所述的磷酸鹽緩沖液由
0.05mol/L 的 NaH2PO4 水溶液和 0.05mol/L 的 Na2HPO4 溶液組成。
[0017]本發(fā)明的有益效果是:1、首次提出了 1，8-萘酰亞胺探針對酪蛋白膠團的聚集誘導發(fā)光現(xiàn)象并建立酪蛋白檢測技術；2、提出了基于含雙羧基為前導嵌入基團、熒光基元聚集于酪蛋白表面提供聚集發(fā)光效率的新思路來設計高性能聚集誘導發(fā)光探針；3、本發(fā)明中水解蛋白、血清蛋白、乳清蛋白、三聚氰胺、尿素、銨肥等外源非法添加物對檢測結果的誤差均在±5%之內(nèi)，對于酪蛋白具有良好的選擇性；4、本發(fā)明酪蛋白聚集誘導同步發(fā)光有靈敏度高、簡便快速、準確的特點，與傳統(tǒng)的雙縮脲法及比色ELISA法比較，靈敏度可以提高三個數(shù)量級。有望在乳品真蛋白含量的檢測中發(fā)揮重要作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為1，8-萘酰亞胺類熒光探針的合成路線圖。
`[0019]圖2A為波長間隔為15nm的條件下在不同濃度探針對于酪蛋白同步熒光光譜的影響。
[0020]圖2B為波長間隔為60nm的條件下在不同濃度探針對于酪蛋白同步熒光光譜的影響。
[0021]圖3為酪蛋白聚集誘導發(fā)光機理圖；
[0022]圖4A為波長間隔為15nm時，不同濃度酪蛋白對于探針同步熒光光譜的影響，插圖為工作曲線。
[0023]圖4B為波長間隔為15nm時，不同濃度酪蛋白對于探針同步熒光光譜的影響，插圖為工作曲線。
【具體實施方式】
[0024]實施例1:
[0025]在圓底燒瓶中加入2.77g，10.0mmol/L 4-溴-1,8萘酐和IOOmL乙二胺，60° C下加熱攪拌6小時后冷卻，真空干燥去除乙二胺后得到中間產(chǎn)物。將所述的中間產(chǎn)物和
11.9mL, 140mmol/L氯乙酸甲酯溶解在15mL乙腈中，加入NaH2PO4,KI各0.5g,40° C下加熱攪拌3天后溶液為澄清，加入0.25mL, 3mol/L NaOH加入再繼續(xù)攪拌12小時，冷卻后用IMHCl將體系pH值調(diào)節(jié)至2-3，無水乙醇重結晶兩次得黃色固體探針。[0026]產(chǎn)率:(79%).1R(cm_1): 3376 (vNH) ; 2830 ( v CH) ; 1732( v C=O) ; 1693( vas 萘二甲酰亞胺 N-C=O) ; 1656( va 萘二甲酰亞胺 N-C=O).1H NMR (400MHz, CDCl3) δ:8.03-7.92 (d, J=8.4Hz, 3H)，7.56 (t, J=7.8Hz, 1H)，6.66 (d, J=7.1Hz, 1H)，5.83 (t, J=7.3Hz, 1H)，4.9 (m, 1H)，4.05 (s, 4H)，3.75-3.86 (t, J=9.2Hz, 4H)，3.17 (s, 8H)，2.66-2.70 (t, J=8.0Hz, 4H).元素分析:計算:C24H26N4O1。(分子量:530.5)C 54.34, H 4.94, N 10.56, O 30.16%;實際:C 53.18, H
4.85, Nil.00, O 30.97%。合成路線圖如圖1所示，圖中可見，所含雙羧基可作為前導嵌入式基團插入酪蛋白疏水腔內(nèi)部與色氨酸及酪氨酸等氨基酸殘基相結合。
[0027]實施例2
[0028]在圓底燒瓶中加入2.77g，10.0mmol/L 4-溴-1,8萘酐和IOOmL乙二胺，70° C下加熱攪拌4小時后冷卻，真空干燥去除乙二胺后得到中間產(chǎn)物。將所述的中間產(chǎn)物和
11.9mL，140mmo I /L氯乙酸甲酯溶解在15mL甲醇中，加入NaH2PO4，KI各0.5g，45° C下加熱攪拌2天后溶液為澄清，加入0.25mL, 3mol/L NaOH加入再繼續(xù)攪拌10小時，冷卻后用IMHCl將體系pH值調(diào)節(jié)至2，無水乙醇重結晶三次得黃色固體探針。
[0029]產(chǎn)率:(79%).1R(cm_1): 3376 (vNH) ; 2830 ( v CH) ; 1732( v C=O) ; 1693( vas 萘二甲酰亞胺 N-C=O) ; 1656( va 萘二甲酰亞胺 N-C=O).1H NMR (400MHz, CDCl3) δ:8.03-7.92 (d, J=8.4Hz, 3H)，7.56 (t, J=7.8Hz, 1H)，6.66 (d, J=7.1Hz, 1H)，5.83 (t, J=7.3Hz, 1H)，4.9 (m, 1H)，4.05 (s, 4H)，3.75-3.86 (t, J=9.2Hz, 4H)，3.17 (s, 8H)，2.66-2.70 (t, J=8.0Hz, 4H).元素分析:計算:C24H26N4O1。(分子量:530.5)C 54.34, H 4.94, N 10.56, O 30.16%;實際:C 53.18, H
4.85, Nil.00, O 30.97%。合成路線圖如圖1所示，圖中可見，所含雙羧基可作為前導嵌入式基團插入酪蛋白疏水腔 內(nèi)部與色氨酸及酪氨酸等氨基酸殘基相結合。
[0030]實施例3
[0031]將500mg酪蛋白溶解于IOOmL PBS (pH 7.4)緩沖溶液中制得5mg/mL的酪蛋白溶液，將0.5 μ mo I的熒光探針溶解于IOOmL PBS (pH 7.4)緩沖溶液中制得5 μ mol/L的熒光探針溶液。
[0032]將500mg酪蛋白溶解于50mL PBS (pH 7.4)緩沖溶液中制得10mg/mL的酪蛋白溶液，加入4滴0.lmol/L的NaOH溶液超聲Imin至固體溶解，再加入0.1M HCl調(diào)節(jié)pH值至
7.4，將0.5 μ mo I的熒光探針mol/L溶解于IOOmL PBS (pH 7.4)緩沖溶液中制得5 μ mol/L的熒光探針mol/L溶液。
[0033]實施例4
[0034]在同步突光光譜中設置波長間隔為15和60nm,取3mL探針mol/L溶液置于比色皿中，在360nm處記錄光強，即為F。，向比色皿中每次加入I μ L酪蛋白溶液，在360nm處記錄熒光強度，即為F，分別以15和60nm處的F/匕為縱坐標，酪蛋白濃度為橫坐標建立工作曲線。
[0035]取3mL探針溶液置于比色皿中，在同步熒光光譜中設置激發(fā)波長297nm，在250-320nm發(fā)射波長范圍內(nèi)記錄最大光強，即為F。，向比色皿中每次加入I μ L酪蛋白溶液，在同步熒光光譜中設置激發(fā)波長297nm，在250-320nm發(fā)射波長范圍內(nèi)記錄最大光強，即為F，分別以最大光強值FziFtl為縱坐標，酪蛋白濃度為橫坐標建立工作曲線。
[0036]實施例5
[0037]I) 50mg奶粉溶解在IOmL PBS (pH 7.4)緩沖溶液中；[0038]2)上述溶液4000rpm下離心10分鐘去除上層飽和脂肪酸；
[0039]3)加入HCl (0.1M)將體系pH值調(diào)節(jié)至4.7后1000Orpm下離心10分鐘，沉淀為酪
蛋白；
[0040]4)沉淀溶解于乙醇中過濾后去除脂肪酸，用0.1M NaOH溶解沉淀，終體積為3mL。最后用0.1M HCl將體系pH值調(diào)節(jié)至7.0.取出10 μ L酪蛋白樣品加入裝有探針的比色皿中，以15和60nm為波長間隔,在360nm處記錄光強,帶入工作曲線中計算酪蛋白含量。
[0041]I) 50mg奶粉溶解在IOmL PBS (pH 7.4)緩沖溶液中；
[0042]2)加入4滴NaOH后超聲Imin至固體溶解，再加入0.1M HCl調(diào)節(jié)pH值至7.4，
[0043]3)上述溶液4000rpm下離心10分鐘去除上層飽和脂肪酸；
[0044]4)加入HCl (0.lmol/L)將體系pH值調(diào)節(jié)至4.7后1000Orpm下離心10分鐘,沉淀為釀蛋白；
[0045]5)沉淀溶解于乙醇中過濾后去除脂肪酸，用0.1M NaOH溶解沉淀，終體積為3mL。最后用0.1M HCl將體系pH值調(diào)節(jié)至7.0.取出10 μ L酪蛋白樣品加入裝有探針的比色皿中，在同步熒光光譜中設置激發(fā)波長297nm，在250_320nm發(fā)射波長范圍內(nèi)記錄最大光強，帶入工作曲線中計算酪蛋白含量。
[0046]以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術人員應該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等效物界定?！?br> 【權利要求】
1.一種1，8-萘酰亞胺類衍生物熒光探針制備方法，其特征在于，將4-溴-1，8萘酐和乙二胺加熱攪拌后冷卻；經(jīng)真空干燥去除乙二胺后和氯乙酸甲酯溶解在甲醇中，加入等質(zhì)量的NaH2PO4和KI并加熱攪拌，溶液澄清后加入NaOH后繼續(xù)攪拌，冷卻后將溶液的pH值調(diào)節(jié)至2-3，無水乙醇重結晶至少兩次得到固體探針。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種1，8-萘酰亞胺類衍生物熒光探針制備方法，其特征在于，所述的PH值由lmol/L的HCl溶液或0.05mol/L磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種1，8-萘酰亞胺類衍生物熒光探針制備方法，其特征在于，加入等質(zhì)量的NaH2PO4和KI并在40° C溫度下加熱攪拌3天，溶液澄清后加入3mol/L的NaOH后繼續(xù)攪拌12小時。
4.一種利用1，8-萘酰亞胺類衍生物熒光探針檢測酪蛋白的方法，其特征在于，制得I,8-萘酰亞胺類衍生物熒光探針；以1，8-萘酰亞胺類衍生物熒光探針的雙羧基作為前導嵌入式官能團，插入酪蛋白膠團內(nèi)部的疏水腔內(nèi)與殘基相結合，而探針的熒光基元聚集于酪蛋白膠團表面，引起聚集誘導同步熒光發(fā)光效應。
5.根據(jù)權利要求4所述的一種利用1，8-萘酰亞胺類衍生物熒光探針檢測酪蛋白的方法，其特征在于，所述的探針的濃度為5 μ mol/L。
6.根據(jù)權利要求4所述的一種利用1，8-萘酰亞胺類衍生物熒光探針檢測酪蛋白的方法，其特征在于，所述的同步熒光光譜檢測條件為:波長間隔為15和60nm，狹縫寬度為IOnm,最大發(fā)射峰為360nm。
7.根據(jù)權利要求4所述的一種利用1，8-萘酰亞胺類衍生物熒光探針檢測酪蛋白的方法，其特征在于，所述的檢測條件是pH值`為7.4。
8.根據(jù)權利要求4所述的一種利用1，8-萘酰亞胺類衍生物熒光探針檢測酪蛋白的方法，其特征在于，所述的酪蛋白檢測范圍分別為0.1 - 20.0 μ gmr1和0.1 - 16.0y gmL'
9.根據(jù)權利要求7所述的一種利用1，8-萘酰亞胺類衍生物熒光探針檢測酪蛋白的方法，其特征在于，所述的pH值由0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)。
10.根據(jù)權利要求4所述的一種利用1，8-萘酰亞胺類衍生物熒光探針檢測酪蛋白的方法，其特征在于，待檢測酪蛋白溶解于pH為7.4的磷酸鹽緩沖液中，所述的磷酸鹽緩沖液由`0.05mol/L 的 NaH2PO4 水溶液和 0.05mol/L 的 Na2HPO4 溶液組成。
【文檔編號】C07D221/14GK103848786SQ201210520661
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2012年12月4日 優(yōu)先權日:2012年12月4日
【發(fā)明者】孫洋, 楊曉慧, 韓權, 李巖, 翟云會, 李靖, 焦寶娟 申請人:西安文理學院