在重組fviii的生產(chǎn)中提高真核細(xì)胞生產(chǎn)率的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種增加重組凝血因子VIII(rFVIII)的生產(chǎn)率的方法，所述生產(chǎn)率特別是細(xì)胞特異性生產(chǎn)率，所述重組凝血因子VIII是在真核細(xì)胞懸浮液在培養(yǎng)基中的培養(yǎng)期間在所述真核細(xì)胞懸浮液中產(chǎn)生的，所述培養(yǎng)基含有不超過500μMCaCl2、至少一種非離子清潔劑以及細(xì)胞生長和rFVIII產(chǎn)生所需的其他營養(yǎng)成分，其特征在于，所述細(xì)胞懸浮液是在通過機(jī)械裝置誘導(dǎo)剪切應(yīng)力施加至真核細(xì)胞懸浮液的條件下培養(yǎng)的，該剪切應(yīng)力是通過添加至少3W/m3的功率密度而實(shí)現(xiàn)的。
【專利說明】在重組FVI I I的生產(chǎn)中提高真核細(xì)胞生產(chǎn)率的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明涉及在細(xì)胞培養(yǎng)期間提高重組人凝血因子VIII (rFVIII)的產(chǎn)率的方法。【背景技術(shù)】
[0002]本發(fā)明提供提高通過培養(yǎng)細(xì)胞(特別是哺乳動物細(xì)胞)進(jìn)行的蛋白質(zhì)生產(chǎn)中的產(chǎn)率的方法。具體而言，本發(fā)明涉及制備蛋白質(zhì)產(chǎn)物的方法，例如糖蛋白產(chǎn)物，其中蛋白質(zhì)產(chǎn)物特性通過操作細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境以增加施加至細(xì)胞的應(yīng)力而被控制。
[0003]大部分生物技術(shù)產(chǎn)物，無論是可商購的或正在研發(fā)中的，都是蛋白治療劑。對于哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物中的蛋白質(zhì)生產(chǎn)以及這種生產(chǎn)相關(guān)的改進(jìn)的方法的需求很大并逐漸增加。特別是當(dāng)以細(xì)胞表達(dá)水平生產(chǎn)大糖蛋白時(shí)，更需要這種改進(jìn)的方法。一種這樣的蛋白質(zhì)，F(xiàn)VIII，其表達(dá)水平比在哺乳動物細(xì)胞中生產(chǎn)的其他重組蛋白質(zhì)低至少兩至三倍。大規(guī)模治療性蛋白質(zhì)生產(chǎn)的晚期研發(fā)中遇到的一個(gè)普遍的問題是由于較大的臨床試驗(yàn)而導(dǎo)致需求量逐漸增加以及細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)設(shè)備中污染導(dǎo)致產(chǎn)能降低。為滿足增加的需求量，可通過幾種方式提高總生產(chǎn)水平。但是，大多數(shù)方式(例如找到更好的細(xì)胞克隆或改進(jìn)培養(yǎng)介質(zhì))都非常耗時(shí)，因此通常并非是足夠快速的選擇。增加生產(chǎn)率的其他方式是增加生產(chǎn)規(guī)?；蛟谘a(bǔ)料分批模式或灌注模式培養(yǎng)中增加細(xì)胞密度。而且，這些過程變化伴隨大的投資成本，并且對于高密度培養(yǎng)的情況，培養(yǎng)槽中的氧限制通常給可用于生產(chǎn)的最大細(xì)胞密度設(shè)定了一個(gè)限值。因此，本領(lǐng)域中需要新的增加生產(chǎn)率的方法。
[0004]Keane J.T.等在 Effect of shear stress on expression of a recombinantproetine by Chinese hamster ovary cells; Biotechnology and Bioengineering,81:211-220, 2003中使附著CHO細(xì)胞經(jīng)受剪切力32 h并監(jiān)控重組人生長激素生產(chǎn)以及葡萄糖代謝。他們觀察到，當(dāng)剪切力從0.005 N/m2 (0.02 W/m3)增加至0.80 N/m2 (6.4 x IO2W/m3)時(shí)，重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)速率降低51 %，葡萄糖吸收速率增加42 %，并且乳酸生產(chǎn)降低50%。
[0005]Godoy-Silva R 等在 Physiological responses of CHO cells to repetitivehydrodynamic stress; Biotechnology and Bioengineering, Vol.103, N0.6, August15，2009中檢驗(yàn)了重復(fù)的水動力應(yīng)力對CHO細(xì)胞的影響，并得出結(jié)論:最高至6.4 x IO6 ff/m3的能量耗散率不會影響細(xì)胞生長、死亡和生產(chǎn)率。
[0006]J.A.Frangos 等在 Shear stress induced stimulation of mammalian cellmetabolism; Biotechnology and Bioengineering, Vol.32, Pp.1053-1060 (1988)中公開了一種流動儀，用于研究貼壁依賴性細(xì)胞在控制良好的情況下對各種穩(wěn)定的和脈沖式的剪切應(yīng)力的代謝響應(yīng)。數(shù)據(jù)證實(shí)，穩(wěn)定剪切應(yīng)力的生理水平以及剪切力的開始急劇刺激培養(yǎng)的人內(nèi)皮細(xì)胞中的前列腺環(huán)素的產(chǎn)生。
[0007]Giard和他的同事們觀察到，當(dāng)維持在旋轉(zhuǎn)燒瓶中的微載體上時(shí)，與在滾瓶中的細(xì)胞相比，人成纖維細(xì)胞分泌的干擾素的量增加最多30倍(D.J.Giard, D.H.Loeb, ff.G.Thilly, D.1.C.Wang, and D.ff.Levine, Biotechnol.Bioeng., 21, 433(1979))。因?yàn)樾D(zhuǎn)燒瓶中細(xì)胞被施加的剪切應(yīng)力比滾瓶中的細(xì)胞大得多，產(chǎn)量的增加可歸因于干擾素合成的剪切誘導(dǎo)刺激。
[0008]Timm Tanzeglock 等，Induction of mammalian cell death by simple shearand extensional flows; Biotechnology and Bioengineering, Vol.104， N0.2，October I, 2009公開了細(xì)胞所經(jīng)受的剪切流類型是否會影響細(xì)胞死亡的啟動。實(shí)際上，哺乳動物細(xì)胞區(qū)分離散類型的流并做出不同響應(yīng)。該文獻(xiàn)中使用了兩種流裝置，以施加精確的流體動力學(xué)流場:均一且穩(wěn)定的簡單剪切流和振動拉伸流(oscillating extensionalflow)。為區(qū)分壞死性細(xì)胞死亡和凋亡性細(xì)胞死亡，使用了熒光激活細(xì)胞分選和培養(yǎng)物上清液DNA釋放。結(jié)果顯示，在振動拉伸流中，當(dāng)受到低水平流體動力學(xué)應(yīng)力(約2Pa)時(shí)，中國倉鼠卵巢細(xì)胞和人胚腎細(xì)胞將進(jìn)入凋亡路徑。相反，當(dāng)細(xì)胞在簡單剪切流中，受到流體動力學(xué)應(yīng)力為約IPa時(shí)，或在拉伸流中，應(yīng)力約500Pa時(shí)，主要是壞死性死亡。當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞用于重組蛋白生產(chǎn)時(shí)，細(xì)胞進(jìn)入各死亡路徑的這些閾值應(yīng)當(dāng)避免，以增強(qiáng)培養(yǎng)時(shí)間和生產(chǎn)率。
[0009]WO 2006/103258A1公開了一種增加蛋白質(zhì)產(chǎn)率的方法，包括培養(yǎng)真核細(xì)胞和在收集蛋白質(zhì)之前將離子物質(zhì)添加至培養(yǎng)基。合適的離子物質(zhì)是霍夫邁斯特序的鹽以及氨基酸。
[0010]WO 2008/006494A1公開了一種在反應(yīng)器的細(xì)胞培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的方法，所述細(xì)胞優(yōu)選是El-永生HER細(xì)胞，更優(yōu)選是PER.C6細(xì)胞，其中細(xì)胞產(chǎn)生生物學(xué)物質(zhì)，優(yōu)選是抗體，其中至少一種細(xì)胞培養(yǎng)基成分被添加至細(xì)胞培養(yǎng)物，并且其中包含細(xì)胞、生物學(xué)物質(zhì)和細(xì)胞培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)分離系統(tǒng)被循環(huán)，其中分離系統(tǒng)將生物學(xué)物質(zhì)與具有比生物學(xué)物質(zhì)分子量低的物質(zhì)分離，其中生物學(xué)物質(zhì)被保留在或輸送回至反應(yīng)器。優(yōu)選地，一部分所述較低分子量的物質(zhì)被連續(xù)地從細(xì)胞培養(yǎng)物中移除。
[0011]Zhang, Hu 等在 Current Pharmaceutical Biotechnology, Volume 11, Number1，January 2010，pp.103-112(10)中報(bào)道稱，哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)在最近十幾年在生產(chǎn)蛋白質(zhì)治療劑方面起到重要作用。哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝開發(fā)中考慮了許多工程學(xué)參數(shù)以實(shí)現(xiàn)工藝優(yōu)化，但該文章中僅特別研究了剪切和混合。該文章認(rèn)為，之前高估了由攪拌引起的剪切應(yīng)力對細(xì)胞損傷的作用，但剪切可導(dǎo)致非致死性的生理反應(yīng)。在氣泡形成、破裂并聚集的區(qū)域，沒有出現(xiàn)細(xì)胞損傷，但剪切應(yīng)力在氣泡升起之后變得顯著，并且在泡沫破裂區(qū)域?qū)?xì)胞造成很大損傷?；旌喜蛔阋栽诖笠?guī)模生物反應(yīng)器中提供均質(zhì)溶解的氧張力、pH、C02和營養(yǎng)物質(zhì)，這會為細(xì)胞生長、產(chǎn)物形成和工藝控制帶來嚴(yán)重的問題?？s減反應(yīng)器(scale-down reactors)已被開發(fā)出來以解決并行操作的混合問題和剪切問題。常規(guī)的和最近開發(fā)的縮減生物反應(yīng)器的工程特征已作簡要介紹。文中還展望了以高細(xì)胞密度進(jìn)行工業(yè)細(xì)胞系培養(yǎng)的工藝?yán)щy以及用于再生醫(yī)療、組織工程和基因治療的干細(xì)胞培養(yǎng)和其他人細(xì)胞培養(yǎng)的工藝?yán)щy。重要的技術(shù)正在開發(fā)以解決這些困難，例如單細(xì)胞分析的微米級操作和納米級操作(光鑷子)，用于剪切和混合特征化的計(jì)算機(jī)流體動力學(xué)(CFD)以及微型生物反應(yīng)器。
[0012]Timothy A.Barrett 等在Biotechnology and Bioengineering, Vol.105, N0.2，pages 260-275報(bào)道了有關(guān)震蕩微板式的實(shí)驗(yàn)，為細(xì)胞培養(yǎng)條件的快速評價(jià)和優(yōu)化提供了潛在的平臺技術(shù)。該文章描述了微孔系統(tǒng)中液體混合和氣液傳質(zhì)的詳細(xì)工程特性以及它們對懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的影響。[0013]如果細(xì)胞生長和抗體生產(chǎn)動力學(xué)與目前使用的搖瓶系統(tǒng)中的相當(dāng)，那么該微孔方 法為更加便宜地且以降低的材料要求獲得早期工藝設(shè)計(jì)數(shù)據(jù)提供了可能性。該工作描述了 微孔系統(tǒng)中液體混合和氣液傳質(zhì)的詳細(xì)工程特性以及它們對懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的影響。對于生 產(chǎn)IgGl的小鼠雜交瘤細(xì)胞的生長，查明了 24孔平板在能量耗散（P/V)(通過計(jì)算機(jī)流體動 力學(xué)，CFD)、流體流動、混合以及氧傳輸速率方面與震蕩頻率和液體填充提及的關(guān)系。預(yù)測 的值為1. 3至291T1 ;液相混合時(shí)間（經(jīng)碘退色實(shí)驗(yàn)定量）為1. 7 s至3. 5 h ;而預(yù)測的 P/V為5至35 ff m_3。CFD模擬剪切速率預(yù)測的流體動力學(xué)力不會對細(xì)胞有害。但對于雜 交瘤培養(yǎng)物，高震蕩速度（>250 rpm)對細(xì)胞生長有負(fù)面影響，而低震蕩速度與高孔填充體 積的結(jié)合（120 rpm; 2，000ML)導(dǎo)致出現(xiàn)氧有限情況?；谶@些發(fā)現(xiàn)，在匹配的平均能量耗 散率下，進(jìn)行微孔和搖瓶形式中細(xì)胞培養(yǎng)動力學(xué)的第一工程學(xué)比較。細(xì)胞生長動力學(xué)和抗 體滴度在24孔微量滴定板和250 mL搖瓶中類似。整體上，該工作證實(shí)了在震蕩微孔板中 進(jìn)行的細(xì)胞培養(yǎng)能夠提供可在目前使用的搖瓶系統(tǒng)中重復(fù)并且與其相當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)，同時(shí)操作 規(guī)模和材料要求降低了至少30倍。結(jié)合自動化，該方案為實(shí)現(xiàn)在實(shí)際的懸浮培養(yǎng)條件下穩(wěn) 健的細(xì)胞系的高通量評價(jià)提供了途徑。
[0014]William G. Whitford和 John S. Cadwell 在 BioProcess International 2009, Vol. 7，No. 9，pages 54_64報(bào)道了人們對中空纖維灌注生物反應(yīng)器的興趣漸增。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]本發(fā)明的目的在于提供一種增加重組凝血因子VIII (rFVIII)的生產(chǎn)率的方法， 特別是其細(xì)胞特異性生產(chǎn)率，所述重組凝血因子VIII特別是在真核細(xì)胞懸浮液在培養(yǎng)基 中的培養(yǎng)期間在所述真核細(xì)胞懸浮液中產(chǎn)生的人rFVIII，所述培養(yǎng)基含有不超過500 m CaCl2、至少一種非離子清潔劑以及細(xì)胞生長和rFVIII產(chǎn)生所需的其他營養(yǎng)成分，其特征在 于，所述細(xì)胞懸浮液是在通過機(jī)械裝置誘導(dǎo)剪切應(yīng)力施加至真核細(xì)胞懸浮液的條件下培養(yǎng) 的。該剪切應(yīng)力通過向細(xì)胞懸浮液中添加高于3 W/m3的功率密度輸入而實(shí)現(xiàn)的。誘導(dǎo)剪 切應(yīng)力的條件是包括誘導(dǎo)細(xì)胞懸浮液的機(jī)械運(yùn)動或誘導(dǎo)懸浮液中細(xì)胞的機(jī)械運(yùn)動在內(nèi)的 事件。通常，剪切應(yīng)力被直接施加至培養(yǎng)的細(xì)胞。機(jī)械裝置特別是那些能夠攪拌細(xì)胞培養(yǎng) 懸浮液的裝置。
[0016]雖然本發(fā)明的效果已通過HEK293研究，這些細(xì)胞是典型的人細(xì)胞，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以預(yù)期到，HEK293細(xì)胞所獲得的結(jié)果也可由其他人細(xì)胞系的細(xì)胞獲得。
[0017]機(jī)械裝置所引入的功率輸入（功率密度，能量耗散率的等效術(shù)語，e)是根據(jù)下 式計(jì)算出來的：e =Np ? n3 ? di5)/V,其中Np是葉輪的紊流功率數(shù)（turbulent power number), n是攪拌速率（葉輪轉(zhuǎn)數(shù)/秒），di是葉輪直徑（米），V是培養(yǎng)基體積（立方米)。 添加至細(xì)胞懸浮液以引入剪切應(yīng)力的功率不應(yīng)超過細(xì)胞被破壞時(shí)的值，通常不應(yīng)超過2000 W/m3的最大值。特別地，添加至細(xì)胞懸浮液以引入剪切應(yīng)力的功率密度為3W/m3至2000 W/m3，優(yōu)選為15 W/m3至1500 W/m3，更優(yōu)選為30 W/m3至1250 W/m3，更優(yōu)選為50 W/m3至 1000 W/m3。
[0018]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，該功率是通過細(xì)胞懸浮液的機(jī)械運(yùn)動被引入的。在 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞懸浮液的機(jī)械運(yùn)動是通過將細(xì)胞懸浮液泵送通過切向過 濾膜（例如中空纖維膜）而進(jìn)行的，或者細(xì)胞懸浮液的機(jī)械運(yùn)動是通過轉(zhuǎn)動元件（例如攪拌器、螺旋槳或葉輪)來進(jìn)行的。
[0019]特別地，rFVIII是B結(jié)構(gòu)域缺失的rFVIII，特別是人B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII。
[0020]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述真核細(xì)胞是HEK293細(xì)胞。rFVIII分子特別是在HEK293細(xì)胞的表面產(chǎn)生并累積。為分離rFVIII，使用將rFVIII從細(xì)胞表面分離的條件將是有利的，例如通過增加細(xì)胞周圍介質(zhì)的離子強(qiáng)度或弱化rFVIII與HEK293細(xì)胞表面的吸引力的其他手段。
[0021]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述非離子清潔劑選自Pluronic_F68、Tween 20和Tween 80。通常，非離子清潔劑的濃度為0.0000lwt%至lwt%,特別是0.0001wt%至
0.lwt%，最合適地為 0.001wt% 至 0.01wt%o
[0022]在本發(fā)明的方法的另一個(gè)實(shí)施方式中，培養(yǎng)基中的低CaCl2濃度被調(diào)節(jié)，以用于控制細(xì)胞聚集，例如使細(xì)胞聚集最小化。
[0023]根據(jù)本發(fā)明，功率可通過細(xì)胞懸浮液的機(jī)械運(yùn)動而被引入至細(xì)胞培養(yǎng)中。細(xì)胞懸浮液的機(jī)械運(yùn)動可通過例如攪拌器或機(jī)械類似物(如震蕩裝置)來進(jìn)行。
[0024]在本發(fā)明的一個(gè)特別的實(shí)施方式中，由于例如細(xì)胞懸浮液的機(jī)械起始運(yùn)動導(dǎo)致的功率密度輸入是通過裝配有葉輪的培養(yǎng)容器啟動的，或者是通過例如無葉輪或類似裝置的一次性wave?培養(yǎng)袋的培養(yǎng)容器啟動的，取而代之的是以地球引力移動培養(yǎng)袋(具有例如搖擺機(jī))，從而誘導(dǎo)所述細(xì)胞懸浮容器中的剪切應(yīng)力，或者細(xì)胞懸浮容器中的剪切應(yīng)力通過將細(xì)胞懸浮液泵送通過靜態(tài)混合物或過濾裝置來誘導(dǎo)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1是活細(xì)胞密度曲線。
[0026]圖2是累積的FVIII = C曲線。
[0027]圖3是細(xì)胞特異性增長速率。
[0028]圖4是不同攪拌速率下連續(xù)培養(yǎng)操作中細(xì)胞特異性生產(chǎn)率。
[0029]圖5是連續(xù)培養(yǎng)中連續(xù)離心與ATF中空纖維裝置相比較的細(xì)胞特異性生產(chǎn)率。
【具體實(shí)施方式】[0030]在本發(fā)明的方法中，與常規(guī)方法相比，通過引入較高功率獲得的較高機(jī)械能被施加至含有真核細(xì)胞懸浮液的培養(yǎng)容器中，該真核細(xì)胞培養(yǎng)液產(chǎn)生rFVIII。功率的量可依據(jù)能力耗散來確定，但其他參數(shù)也可與功率輸入相關(guān)聯(lián)。本發(fā)明是基于當(dāng)細(xì)胞在搖瓶或攪拌罐生物反應(yīng)器中以高攪拌速率被攪拌時(shí)得到異常高的FVIII生產(chǎn)率而完成的。
[0031]根據(jù)本發(fā)明，可使用任何真核細(xì)胞或細(xì)胞系，特別地，該真核細(xì)胞是HE K29 3細(xì)胞。如例如W0-A-2001/070968和WO-A -2007/003582所公開的，該基因改造的細(xì)胞生產(chǎn)rFVIII，特別是B結(jié)構(gòu)域缺失的rFVIII。
[0032]在HEK293細(xì)胞中制造rRVIII分子是本發(fā)明的方法的一個(gè)特別的實(shí)施方式，并將下文的實(shí)施例中進(jìn)一步解釋。
[0033]在本發(fā)明的方法中，已顯示出，HEK293細(xì)胞中產(chǎn)生的rFVIII分子與細(xì)胞相連并在產(chǎn)生在細(xì)胞內(nèi)部后附著至細(xì)胞表面，這在以下文獻(xiàn)中作了進(jìn)一步描述:W0-A-2006/103258，Kohlind 2010 (Kohlind et.al., The B-domain of Factor VIII reduces cell membraneattachment to host cells under serum free conditions.Journal of Biotechnology,147 (2010)，198-204.)和 Kohlind 2011 (Kohlind et.al.，Optimisation of theFactor VIII yield in mammalian cell cultures by reducing the membrane boundfraction.Journal of Biotechnology, 151 (2011)， 357-362.)。
[0034]在本發(fā)明的方法中，用于細(xì)胞生長和rFVIII生產(chǎn)的培養(yǎng)基含有非離子清潔劑。通常，單月桂酸山梨醇酐酯的聚氧乙烯衍生物，例如Tween'它是一個(gè)包含許多產(chǎn)品的家族，通過聚氧乙烯鏈長和脂肪酸酯部分區(qū)分。另一種有用的非離子清潔劑是Poloxamer，它們是非離子三嵌段共聚物，由聚氧丙烯(聚(環(huán)氧丙烷))的中央疏水鏈以及兩側(cè)的聚氧乙烯(聚(環(huán)氧乙燒))的兩個(gè)親水鏈構(gòu)成。Poloxamer也被稱為商品名Pluronics?。非離子清潔劑可選自 Pluronic_F68、Tween 20 和 Tween 80,特別地，濃度為 0.0000lwt% 至 lwt%,或
0.0001wt% 至 0.lwt%,或 0.001wt% 至 0.01wt%。
[0035]以下更詳細(xì)地描述本發(fā)明的方法。在125 mL的帶擋板的E-瓶(E-bottle)中，以不同震蕩頻率培養(yǎng)細(xì)胞。雖然細(xì)胞生長曲線與在低速攪拌和高速攪拌培養(yǎng)中類似(圖1)，但在3天的分批培養(yǎng)后，高速攪拌培養(yǎng)物中的累積生產(chǎn)率驚人地高出83%(圖2)。
[0036]本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式以分批模式培養(yǎng)在平行的受控?cái)嚢璨凵锓磻?yīng)器中進(jìn)行。經(jīng)受較高機(jī)械應(yīng)力的培養(yǎng)物相比于低速攪拌培養(yǎng)物而言顯示出較高的生產(chǎn)率。這顯示出，雖然其他培養(yǎng)參數(shù)(例如PH、D0T (溶解氧張力)和溫度)保持恒定，但較高速的攪拌導(dǎo)致生產(chǎn)率增加。
[0037]在另一個(gè)實(shí)施方式中，在一個(gè)2L的攪拌槽生物反應(yīng)器中，以灌注模式培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)性地檢驗(yàn)本發(fā)明。該培養(yǎng)以穩(wěn)定狀態(tài)灌注模式運(yùn)行，指數(shù)生長的細(xì)胞被保持在期望的細(xì)胞密度，這通過將細(xì)胞從反應(yīng)器 中排出而實(shí)現(xiàn)，排出的速率使得保持反應(yīng)器中的細(xì)胞密度恒定。雖然其他培養(yǎng)參數(shù)保持恒定，但較高攪拌速率增加了細(xì)胞特異性生產(chǎn)率。
[0038]在另一個(gè)實(shí)施方式中，在一個(gè)100L的生產(chǎn)規(guī)模生物反應(yīng)器中實(shí)驗(yàn)性地檢驗(yàn)本發(fā)明，該反應(yīng)器以灌注模式運(yùn)行以實(shí)現(xiàn)較高的細(xì)胞密度。該實(shí)驗(yàn)證實(shí)，通過增加剪切力以及有增加的攪拌引起的能量輸入，在大規(guī)模培養(yǎng)中也可實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)率增加。
[0039]在另一個(gè)實(shí)施方式中，在一個(gè)2L的攪拌槽生物反應(yīng)器中實(shí)驗(yàn)性地檢驗(yàn)本發(fā)明，該生物反應(yīng)器以灌注模式運(yùn)行，并且具有連續(xù)離心單元或以交替式切向流(ATF)運(yùn)行的中空纖維單元。令人驚訝的是，通過ATF單元添加至培養(yǎng)物的增加的剪切也使得FVIII產(chǎn)率增加。
實(shí)施例
[0040]實(shí)施例1
將生產(chǎn)BDDrFVIII的指數(shù)生長的HEK293F細(xì)胞離心，其后將細(xì)胞團(tuán)塊重懸于無血清細(xì)胞培養(yǎng)基中至活細(xì)胞密度為0.5xl06個(gè)細(xì)胞/mL。其后，將細(xì)胞在125 mL的帶擋板的錐形瓶中培養(yǎng)，錐形瓶置于震蕩培養(yǎng)箱中，100 rpm或200 rpm, 5%/95% CO2/空氣覆蓋，37°C。通過臺盼藍(lán)排除法和Cedex (Innovatis)自動細(xì)胞計(jì)數(shù)器每天測定所有培養(yǎng)物中的細(xì)胞密度。通過將細(xì)胞懸液中的離子濃度增至I M NaCl + 30 mM CaCl2而將累積的FVIII從細(xì)胞釋放。離心去除細(xì)胞，發(fā)色底物法(Coatest? SP FVIII)測定FVIII。生長曲線類似(圖1)，但高速攪拌培養(yǎng)物在3天的分配培養(yǎng)后顯示出高出83%的累積FVII1:C濃度(圖2)。[0041]實(shí)施例2
在具有6個(gè)0.4L的生物反應(yīng)器的設(shè)備(Multifors, Infors)中，在不同攪拌速率下，以分批模式并行培養(yǎng)產(chǎn)生BDDrFVIII的HEK293細(xì)胞。目的在于檢驗(yàn)攪拌速率如何在其他細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)保持恒定的受控環(huán)境下影響生產(chǎn)率。為了能夠檢驗(yàn)高攪拌速率(>300 rpm),生物反應(yīng)器的攪拌電機(jī)(通常用于細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用)被換成更強(qiáng)力的攪拌電機(jī)(通常用于細(xì)菌培養(yǎng)應(yīng)用，可運(yùn)行至1200 rpm)。溶解氧張力(DOT)設(shè)定點(diǎn)被設(shè)置成90%，并且通過細(xì)胞懸浮液中的鼓泡石(sparger stone)添加空氣來調(diào)節(jié)。使用Cedex (Innovatis)細(xì)胞計(jì)數(shù)器測定活細(xì)胞密度、存活率和聚集速率。通過將細(xì)胞懸浮液中的離子強(qiáng)度增至I M NaCl +30 mM CaCl2來從細(xì)胞釋放累積的FVIII。離心去除細(xì)胞，發(fā)色底物法(Coatest? SP FVIII)測定FVIII。表1中顯示了所檢驗(yàn)的攪拌速率、能量耗散率(本文所述功率密度的等效術(shù)語)(ε )和細(xì)胞特異性生產(chǎn)率(gp)。200至950 rpm的增加的攪拌速率增加了細(xì)胞特異性生產(chǎn)率。1200 rpm處Cip相比于950rpm處降低,顯示高于950rpm導(dǎo)致生產(chǎn)率下降。
【權(quán)利要求】
1.一種增加重組凝血因子VIII(rFVIII)的生產(chǎn)率的方法，所述生產(chǎn)率特別是細(xì)胞特異性生產(chǎn)率，所述重組凝血因子VIII是在真核細(xì)胞懸浮液在培養(yǎng)基中的培養(yǎng)期間在所述真核細(xì)胞懸浮液中產(chǎn)生的，所述培養(yǎng)基含有不超過500 μΜ CaCl2、至少一種非離子清潔劑以及細(xì)胞生長和rFVIII產(chǎn)生所需的其他營養(yǎng)成分，其特征在于，所述細(xì)胞懸浮液是在通過機(jī)械裝置誘導(dǎo)剪切應(yīng)力施加至真核細(xì)胞懸浮液的條件下培養(yǎng)的，該剪切應(yīng)力是通過添加至少3 W/m3的功率密度而實(shí)現(xiàn)的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述功率密度通過所述細(xì)胞懸浮液的機(jī)械運(yùn)動被引入至細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中細(xì)胞懸浮液的機(jī)械運(yùn)動是通過將細(xì)胞懸浮液泵送通過切向過濾膜，特別是中空纖維膜，而進(jìn)行的。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中細(xì)胞懸浮液的機(jī)械運(yùn)動是通過轉(zhuǎn)動元件而進(jìn)行的，所述轉(zhuǎn)動元件例如是攪拌器、螺旋槳或葉輪。
5.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中rFVIII是B結(jié)構(gòu)域缺失的rFVIII。
6.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述真核細(xì)胞是HEK293細(xì)胞。
7.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中rFVIII分子是在HEK293細(xì)胞中產(chǎn)生的并且與HEK293細(xì)胞相連。
8.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述非離子清潔劑選自PluroniC-F68、Tween 20 和 Tween 80。
9.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述非離子清潔劑的濃度為0.0000 lwt% 至 lwt%,特別是 0.0001wt% 至 0.lwt%,最合適地是 0.001wt% 至 0.01wt%。`
10.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中通過將培養(yǎng)基中的低CaCl2濃度并通過增加剪切而增加CaCl2從培養(yǎng)物環(huán)境中的運(yùn)出，從而將細(xì)胞聚集降至最低。
11.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中細(xì)胞懸浮液的機(jī)械運(yùn)動是通過配備葉輪的培養(yǎng)容器來啟動的，或者是通過由于地球重力而移動而誘導(dǎo)在所述細(xì)胞懸浮液中的剪切應(yīng)力的培養(yǎng)容器來啟動，或細(xì)胞懸浮液容器中的剪切應(yīng)力是通過將細(xì)胞懸浮液泵送通過靜態(tài)混合物或過濾裝置而誘導(dǎo)的。
12.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中添加至細(xì)胞懸浮液以引入剪切應(yīng)力的功率密度最大為2000 W/m3。
13.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中添加至細(xì)胞懸浮液以引入剪切應(yīng)力的功率密度為3W/m3至2000 W/m3。
【文檔編號】C07K14/755GK103517919SQ201280021390
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年5月14日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月13日
【發(fā)明者】皮特·埃扎娃, 伊瑞麗·埃基科維斯特 申請人:歐克塔醫(yī)藥公司