專(zhuān)利名稱(chēng)：對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)高毒力殺蟲(chóng)基因cry2Ah-like及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及蘇云金芽孢桿菌對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)高毒力的新的殺蟲(chóng)基因 cry2Ah_like, cry2Ah_likesp, cry2Ah_likevp 及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蟲(chóng)害是造成農(nóng)作物減產(chǎn)的重要原因之一，減少蟲(chóng)害的損失是增加糧食與飼料作物產(chǎn)量的重要途徑。據(jù)統(tǒng)計(jì)全球糧食與飼料作物總產(chǎn)量每年因蟲(chóng)害造成的損失達(dá)14%，直接給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)千億美元。我國(guó)每年因蟲(chóng)害造成的損失水稻減產(chǎn)10%、小麥減產(chǎn)20%、棉花減產(chǎn)30%以上。采用噴施化學(xué)農(nóng)藥和生物殺蟲(chóng)劑等防治手段固然可以減輕害蟲(chóng)對(duì)農(nóng)作物的為害，但化學(xué)農(nóng)藥造成環(huán)境污染，生物殺蟲(chóng)劑成本較高。長(zhǎng)期以來(lái)，大量噴施化學(xué)殺蟲(chóng)劑，不僅會(huì)增強(qiáng)害蟲(chóng)的抗藥性，使益蟲(chóng)及其它生態(tài)區(qū)系遭受破壞，而且嚴(yán)重污染環(huán)境，提高生產(chǎn)成本，破壞生態(tài)平衡。因此，減少殺蟲(chóng)劑使用量，發(fā)展現(xiàn)代植物保護(hù)技術(shù)，已成為可持續(xù)發(fā)展農(nóng)業(yè)中必須正視的課題之一。蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,簡(jiǎn)稱(chēng)Bt)是一種分布廣泛的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，是一種對(duì)害蟲(chóng)毒力強(qiáng)且對(duì)天敵無(wú)毒性的昆蟲(chóng)病原微生物，對(duì)高等動(dòng)物和人無(wú)毒性。它是目前研究最為深入、使用最為廣泛的微生物殺蟲(chóng)劑，對(duì)16個(gè)目3000多種害蟲(chóng)有活性。Bt在芽孢形成期可形成殺蟲(chóng)晶體蛋白(Insecticidal CrystalProteins,ICPs)，也稱(chēng) δ -內(nèi)毒素(delta-endotoxin) [Brav0.A., Gi I IS.S., Soberon M.BacillusthuringiensisMechanisms and Use.Comprehensive Molecular InsectScienceElsevier, 2005, 175 206.]，它的形狀、結(jié)構(gòu)和大小均與其毒力有著密切關(guān)系。蘇云金芽胞桿菌殺蟲(chóng)晶體蛋白因其殺蟲(chóng)效果好、對(duì)人畜無(wú)害[De Maagd R.A., Bravo A., CrickmoreN.How Bacillus thuringiensis has evolved specific toxins to col onize theinsect world.Trends Genet, 2001, 17:193 199.]，不污染環(huán)境，因而B(niǎo)t在害蟲(chóng)的生物防治中得到了最廣泛的應(yīng)用。

1996年全世界第一例轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植物在美國(guó)獲準(zhǔn)應(yīng)用，它使用的基因來(lái)自BtcryIAcο在接下來(lái)的幾年里，轉(zhuǎn)cryIAb基因的抗蟲(chóng)玉米,轉(zhuǎn)cry3Aa基因的抗蟲(chóng)土豆等相距問(wèn)世。在中國(guó)，自1998年開(kāi)始正式推廣含有crylAc/crylA基因的抗蟲(chóng)棉以來(lái)，已經(jīng)被普遍種植。在轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化的第一個(gè)12年(1996-2007)中，由于能得到持續(xù)穩(wěn)定的收益，農(nóng)民種植轉(zhuǎn)基因作物量逐年增加。2009年有25個(gè)國(guó)家的1400萬(wàn)小農(nóng)戶(hù)和大農(nóng)場(chǎng)主種植了 1.34億公頃(3.3億英畝)的轉(zhuǎn)基因作物，比2008年增長(zhǎng)了 7%，即900萬(wàn)公頃(2200萬(wàn)英畝)，達(dá)到歷史最高點(diǎn)；相應(yīng)的“性狀或?qū)嶋H面積”增長(zhǎng)了 8%，即相比2008年的1.66億公頃，增長(zhǎng)了 1400萬(wàn)公頃，達(dá)到2009年的1.8億公頃。1996年至2009年間轉(zhuǎn)基因作物種植面積空前地增長(zhǎng)了 80倍，使轉(zhuǎn)基因成為農(nóng)業(yè)近代史上利用最快的作物技術(shù)。由于目前商品化的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)作物的抗蟲(chóng)基因種類(lèi)比較單一，如此大面積推廣種植存在害蟲(chóng)避難所減少與害蟲(chóng)抗藥性上升的風(fēng)險(xiǎn)。因此需要不斷分離高毒力的或者新的基因組合來(lái)避免害蟲(chóng)抗藥性上升的風(fēng)險(xiǎn)。
因此，篩選分離克隆新的、高毒力的Bt殺蟲(chóng)基因，可以豐富殺蟲(chóng)基因資源，為轉(zhuǎn)基因作物與工程菌株提供新的基因來(lái)源，提高Bt轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的抗蟲(chóng)效果，并且可以降低害蟲(chóng)對(duì)Bt毒蛋白的抗性風(fēng)險(xiǎn)，避免新的生態(tài)災(zāi)難降臨，具有重要的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和生態(tài)效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種新的對(duì)玉米螟、棉鈴蟲(chóng)等鱗翅目害蟲(chóng)具有高毒力的蘇云金芽孢桿菌晶體殺蟲(chóng)蛋白基因序列，以應(yīng)用于轉(zhuǎn)化微生物，使之表現(xiàn)出對(duì)相關(guān)害蟲(chóng)的毒性，并克服、延緩害蟲(chóng)對(duì)工程菌的抗藥性產(chǎn)生。對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)高毒力殺蟲(chóng)蛋白Cry2Ah_like, Cry2Ah_likesp, Cry2Ah_likevp,其蛋白序列分別如SEQ ID NOUSEQ ID N02、SEQ ID N03所示。編碼上述蛋白的殺蟲(chóng)基因，名稱(chēng)為cry2Ah_like, cry2Ah_likesp, cry2Ah_likevp,其基因序列分別如SEQ ID N04、SEQ ID N05、SEQ ID N06所示。含有上述基因的載體。所述載體分別為pET2Ah-like、pET2Ah_likesp 和 pET2Ah_likevp，其骨架載體為pET。 所述基因在殺滅棉鈴蟲(chóng)、玉米螟中的應(yīng)用。所述應(yīng)用為將基因表達(dá)的蛋白制成藥劑殺滅棉鈴蟲(chóng)、玉米螟。所述應(yīng)用為將基因轉(zhuǎn)化微生物或植物，使植物受體表達(dá)對(duì)棉鈴蟲(chóng)、玉米螟的抗性。本發(fā)明從SC6H8菌株(新型cry2基因克隆、表達(dá)及活性分析，張靜濤，2009，碩士論文)中克隆得到了一個(gè)新的基因即cry2Ah-like，該基因序列如SEQ ID N04，蛋白序列如SEQ ID N01，該基因?qū)γ掴徬x(chóng)、玉米螟具有高毒力。利用重復(fù)PCR得到了 cry2Ah-like的兩個(gè)突變體，該兩個(gè)突變基因的序列分別為SEQ ID N05, SEQ ID N06 ;蛋白序列如SEQ ID N02, SEQ ID N03，該兩個(gè)突變體基因?qū)γ掴徬x(chóng)的毒力較cry2Ah_like高。本發(fā)明提供的新的基因?qū)γ掴徬x(chóng)、玉米螟具有高毒力，豐富了殺蟲(chóng)基因資源，同時(shí)將基應(yīng)用于轉(zhuǎn)化微生物，使之表現(xiàn)出對(duì)相關(guān)害蟲(chóng)的毒性，并克服、延緩害蟲(chóng)對(duì)工程菌的抗藥性產(chǎn)生。


圖1 cry2Ah_like基因在大腸桿菌BL21菌株中表達(dá)，圖2 cry2Ah_likesp和cry2Ah_likevp基因在大腸桿菌BL21菌株中表達(dá)，圖3殺蟲(chóng)活性趨勢(shì)圖，圖4pET2類(lèi)基因的載體結(jié)構(gòu)圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。Bt質(zhì)粒提取RNaseA (10mg/ml):稱(chēng)取 0.1g RNaseA 溶于 IOmllOmM Tris HCl (pH7.5)，15mMNaCl中，100°C煮沸15min，冰浴冷卻，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> SC6H8菌株，申請(qǐng)人的實(shí)驗(yàn)室有保存，可以對(duì)外公開(kāi)發(fā)放。1.過(guò)夜培養(yǎng)5ml SC6H8菌液。2.離心收集菌體，用含有30mg/ml溶菌酶的25%的蔗糖溶液懸浮細(xì)胞，總體積為200 μ 1，37。。孵育 15mins。3.加入400 μ I堿裂解液(3%SDS，0.2N NaOH)，立即緩慢混勻，室溫孵育5mins。4.加入300 μ I冰冷的3Μ醋酸鈉(ρΗ4.8)，立即混勻，12000g離心IOmins05.取上清，加入等體 積的異丙醇，充分混勻，_20°C放置30mins，12000g離心5mins。6.棄上清，70%乙醇洗滌沉淀，晾干后加入320ul純水溶解沉淀，加入200 μ I含有0.5mg/ml EB的7.5M醋酸銨溶液?；靹蚝蠹尤氲润w積的酹氯仿,混勻。12000g離心5mins。7.取上清，加入2倍體積冰冷的無(wú)水乙醇，充分混勻，_20°C放置30mins，12000g離心 5mins。8.去上清，70%乙醇洗滌沉淀，晾干，加入40 μ I TE溶解沉淀，加入I μ I RNase A除 RNA。0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。DNA回收(步驟參見(jiàn)Axygen公司試劑盒)1.在長(zhǎng)波紫外燈下切下含所需目的DNA片段的凝膠，置于1.5mL離心管中；2.加入3倍溶膠體積的ED-A溶膠緩沖液，置于70° c水浴鍋中；3.待溶解后加入0.5個(gè)ED-A溶膠緩沖液的ED-B ；4.混勻后轉(zhuǎn)入回收柱，離心12000r/min0.5min ；5.棄去殘液,加入洗脫緩沖液W1SOO μ L,離in心12000r/min0.5min ；6.棄去殘液，加入洗脫緩沖液W2700 y L，重復(fù)一次；7.將15 30 μ L TE或超純水適量加入回收柱中，靜置5min ；8.離心 12000r/min2min,備用。E.coli質(zhì)粒提取SI:50mM 葡萄糖，25mM Tris.Cl (ρΗ8.0), IOmM EDTA (ρΗ8.0) ；SI1:0.2M NaOH,1%SDS (用時(shí)以 2M NaOH 和 10%SDS 稀釋)；SIII:5M KAc，用冰乙酸調(diào)至 ρΗ4.8。I)離心收集菌體，用200 μ L SI懸浮，冰浴IOmin ；2)加入SII400 μ L，翻轉(zhuǎn)混勻，冰浴5min ；3)加入SII1300 μ L，迅速混勻，冰浴5min ；4) 12000r/min離心8min，取上清用等體積的異丙醇沉淀；5) 12000r/min離心8min，棄上清，用70%的乙醇洗沉淀，干燥，溶解；6)用RNase A2 μ L除RNA，用苯酚、氯仿/異戊醇分別抽提溶液；7)加入 1/10V 的 3Μ NaAc (ΡΗ5.2)，加入 2V 的無(wú)水乙醇沉淀，-20。clOmin ；8) 12000r/min離心8min，70%乙醇洗沉淀，干燥，適量的水溶解。DNA片段常規(guī)連接體系
權(quán)利要求
1.對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)高毒力殺蟲(chóng)蛋白Cry2Ah_like,Cry2Ah_likesp, Cry2Ah_likevp,其蛋白序列分別如 SEQ ID N01、SEQ ID N02、SEQ ID N03 所示。
2.編碼權(quán)利要求1所述殺蟲(chóng)蛋白的殺蟲(chóng)基因，名稱(chēng)為cry2Ah-like,cry2Ah_likesp,cry2Ah-likevp，其基因序列分別如 SEQ ID N04、SEQ ID N05、SEQ ID N06 所示。
3.含有權(quán)利要求2所述的殺蟲(chóng)基因的載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的載體，其分別為pET2Ah-like、pET2Ah-likesp和pET2Ah-likevp，其骨架載體為pET。
5.權(quán)利要求2所述殺蟲(chóng)基因在殺滅棉鈴蟲(chóng)、玉米螟中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，為將基因表達(dá)的蛋白制成藥劑殺滅棉鈴蟲(chóng)、玉米螟。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，為將基因轉(zhuǎn)化微生物或植物，使植物受體表達(dá)對(duì)棉鈴蟲(chóng)、玉米螟的抗性。 ·
全文摘要
本發(fā)明涉及“對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)高毒力殺蟲(chóng)基因cry2Ah-like及應(yīng)用”，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)高毒力殺蟲(chóng)蛋白Cry2Ah-like，Cry2Ah-likesp，Cry2Ah-likevp，其蛋白序列分別如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3所示。本發(fā)明提供的新的基因?qū)γ掴徬x(chóng)、玉米螟具有高毒力，豐富了殺蟲(chóng)基因資源，同時(shí)將基應(yīng)用于轉(zhuǎn)化微生物，使之表現(xiàn)出對(duì)相關(guān)害蟲(chóng)的毒性，并克服、延緩害蟲(chóng)對(duì)工程菌的抗藥性產(chǎn)生。
文檔編號(hào)C07K14/325GK103204912SQ20131015096
公開(kāi)日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2013年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月27日
發(fā)明者束長(zhǎng)龍, 張 杰, 耿麗麗, 宋福平, 彭琦, 黃大昉 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所