蛋白質(zhì)層析純化填料的清潔方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)的分離純化領(lǐng)域，涉及蛋白質(zhì)層析純化填料的清潔方法，其是用清潔有效量的質(zhì)量體積比濃度為0.02%-2%的苯扎溴銨水溶液清潔所述的蛋白質(zhì)層析純化填料，并優(yōu)選用質(zhì)量體積比濃度為0.05%-0.5%的苯扎溴銨水溶液清潔所述的蛋白質(zhì)層析純化填料。利用該方法清潔蛋白質(zhì)層析純化填料，可以在保證甚至提高清潔效果的基礎(chǔ)上大幅度的降低清潔過程對蛋白質(zhì)層析純化填料結(jié)合能力的破壞，從而延長蛋白質(zhì)層析純化填料的使用壽命。
【專利說明】蛋白質(zhì)層析純化填料的清潔方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)層析純化填料的清潔方法。
【背景技術(shù)】
[0002]層析(chromatography),也稱為色譜，是分離純化蛋白質(zhì)最重要的手段。根據(jù)分離純化原理的不同，蛋白質(zhì)層析種類可以分為離子交換層析(ion exchangechromatography, IEC)、凝膠層析(gel filtration chromatography, GFC)或分子排阻層析(size exclusion chromatography, SEC)、疏水層析(hydrophobic interactionchromatography, HIC)與親和層析(affinity chromatography, AC)等主要類別。
[0003]由于層析過程中引入的微生物、熱原(內(nèi)毒素)等物質(zhì)會污染層析獲得的蛋白質(zhì)，破壞、降解蛋白質(zhì)或影響蛋白質(zhì)作為藥物使用時(shí)的安全性；而蛋白質(zhì)本身又很容易污染微生物、熱原(內(nèi)毒素)等物質(zhì)引起層析系統(tǒng)的污染，進(jìn)而污染后續(xù)層析處理的蛋白質(zhì)，所以在每次層析填料使用后，下次層析填料使用前都優(yōu)選對層析填料進(jìn)行清潔處理，而在藥用蛋白質(zhì)的生產(chǎn)中在層析填料的每次使用后更是必須進(jìn)行清潔處理。
[0004]蛋白質(zhì)層析填料的清潔通常使用強(qiáng)酸(如0.1-lmol/L鹽酸或醋酸)、強(qiáng)堿(如0.2-2mol/L氫氧化鈉)、高濃度鹽(如l_5mol/L NaCl)、有機(jī)溶劑(如5-50%(v/v)乙醇)等清潔劑中的一種，也可以組合使用或順序使用它們中的幾種。但一方面這種使用不一定完全清除層析填料污染的雜質(zhì)，另一方面這種使用還有可能破壞層析填料，從而影響層析填料的壽命和/或結(jié)合能力。這一點(diǎn)對親和層析填料的影響尤其明顯，更尤其對以蛋白質(zhì)為配基的親和層析填料影響非常明顯。
[0005]當(dāng)親和層析填料中的配基為蛋白質(zhì)，例如抗體時(shí)，由于蛋白質(zhì)遇強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、強(qiáng)有機(jī)溶劑、高濃度鹽時(shí)極容易變`性，而親和層析純化的原理利用的又是親和層析填料配基與目標(biāo)蛋白質(zhì)之間基于各自構(gòu)型與活性的高度特異性結(jié)合，所以以蛋白質(zhì)為配基的親和層析填料不能用常規(guī)的強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、強(qiáng)有機(jī)溶劑、高濃度鹽處理，這也就造成了這類填料清潔處理的困難?；谶@一問題，在治療用單克隆抗體類藥物的層析純化過程中，使用了修飾蛋白A (Protein A)配基的MabSelect系列填料,其可以耐受0.1_0.5mol/L氫氧化鈉短時(shí)的清潔處理。但使用該系列填料層析純化單克隆抗體卻大大增加了層析純化的成本，且層析填料耐強(qiáng)堿處理的能力也只是得到了有限的提高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種蛋白質(zhì)層析純化填料的清潔方法，以在保證甚至提高清潔效果的基礎(chǔ)上大幅度的降低清潔過程對蛋白質(zhì)層析純化填料結(jié)合能力的破壞，從而延長蛋白質(zhì)層析純化填料的使用壽命。
[0007]為實(shí)現(xiàn)此目的，在基礎(chǔ)的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供蛋白質(zhì)層析純化填料的清潔方法，其是用清潔有效量的質(zhì)量體積比濃度為0.02%-2%的苯扎溴銨(苯扎溴銨也稱為“新潔爾滅”)水溶液清潔所述的蛋白質(zhì)層析純化填料。[0008] 本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)層析純化填料可以是任何類型可以用于純化蛋白質(zhì)的層析填料，優(yōu)選離子交換層析填料、凝膠或分子排阻層析填料、疏水層析填料和親和層析填料，更優(yōu)選親和層析填料，并最優(yōu)選以蛋白質(zhì)為配基的親和層析填料。
[0009]本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)可以是任何天然的或重組的蛋白質(zhì)；可以是結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，也可以是功能蛋白質(zhì)；可以是藥用的蛋白質(zhì)，也可以是非藥用的蛋白質(zhì)，但優(yōu)選藥用的蛋白質(zhì)。
[0010]本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)層析純化填料的清潔方法可以是在位清潔，也可以是拆卸層析純化填料后的離線清潔，但優(yōu)選在位清潔。在位清潔時(shí)可以用質(zhì)量體積比濃度為0.02%-2%的苯扎溴銨水溶液連續(xù)沖洗層析填料，沖洗體積優(yōu)選3-200個(gè)柱體積；也可以在將清潔液充滿所述的蛋白質(zhì)層析純化填料后，密閉裝填所述的蛋白質(zhì)層析純化填料的蛋白質(zhì)層析純化柱一段時(shí)間以達(dá)到清潔作用，密閉層析柱的時(shí)間優(yōu)選在0.5-10小時(shí)之間；還可以綜合以上兩種方法，以既可減少清潔液連續(xù)沖洗所述的蛋白質(zhì)層析純化填料的體積，也可縮短密閉層析柱后的清潔時(shí)間。
[0011]本發(fā)明清潔所述的蛋白質(zhì)層析純化填料的苯扎溴銨的濃度可以通過測試下文所述的蛋白質(zhì)層析純化填料的清潔效果，以及清潔前后蛋白質(zhì)層析純化填料的結(jié)合能力的變化確定，同時(shí)還要考慮苯扎溴銨在水中的溶解性、苯扎溴銨在清潔后是否會有殘留。由此確定的苯扎溴銨的質(zhì)量體積比濃度為0.02%-2%，更優(yōu)選質(zhì)量體積比濃度為0.05%-0.5%。
[0012]本發(fā)明的蛋白質(zhì)層析純化填料的清潔效果可以通過多種方法確定，例如從每次清潔完成后下次平衡層析柱時(shí)收集的層析柱流出液中取樣進(jìn)行無菌試驗(yàn)或內(nèi)毒素檢測試驗(yàn)。無菌試驗(yàn)或內(nèi)毒素檢測試驗(yàn)的方法可分別參照《中華人民共和國藥典2010年版(三部)》附錄XII A “無菌檢查法”與附錄XII E “細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”。
[0013]本發(fā)明的蛋白質(zhì)層析純化填料的結(jié)合能力的變化可以通過多種方法測定，例如可以分別測定蛋白質(zhì)層析純化前填料中配基的密度，以及蛋白質(zhì)層析純化結(jié)束并進(jìn)行蛋白質(zhì)層析純化填料的清潔后填料中配基的密度，由此計(jì)算得到配基密度變化的百分率，即得到蛋白質(zhì)層析純化填料結(jié)合能力變化的百分率。但這種方法比較繁瑣，更簡便的方法是測定每次清潔前后蛋白質(zhì)層析純化填料飽和吸附量的變化，由此計(jì)算得到蛋白質(zhì)層析純化填料飽和吸附量變化的百分率，即得到蛋白質(zhì)層析純化填料結(jié)合能力變化的百分率。而蛋白質(zhì)層析純化填料飽和吸附量的測定方法則屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的公知常識，在此不再贅述。
[0014]在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供蛋白質(zhì)層析純化填料的清潔方法，其使用質(zhì)量體積比濃度0.05%-0.5%的苯扎溴銨水溶液清潔所述的蛋白質(zhì)層析純化填料。
[0015]在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供蛋白質(zhì)層析純化填料的清潔方法，其使用3-200個(gè)柱體積的苯扎溴銨水溶液清潔所述的蛋白質(zhì)層析純化填料。
[0016]在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供蛋白質(zhì)層析純化填料的清潔方法，其是用所述的苯扎溴銨水溶液連續(xù)沖洗所述的蛋白質(zhì)層析純化填料3-200個(gè)柱體積以達(dá)到清潔作用。
[0017]在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供蛋白質(zhì)層析純化填料的清潔方法，其是將所述的苯扎溴銨水溶液充滿所述的蛋白質(zhì)層析純化填料后，密閉裝填所述的蛋白質(zhì)層析純化填料的蛋白質(zhì)層析純化柱0.5-10小時(shí)以達(dá)到清潔作用。
[0018]在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供蛋白質(zhì)層析純化填料的清潔方法，其中所述的蛋白質(zhì)層析純化填料是親和層析純化填料。
[0019]在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供蛋白質(zhì)層析純化填料的清潔方法，其中所述親和層析純化填料是Sepharose4FF。
[0020]在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供蛋白質(zhì)層析純化填料的清潔方法，其中所述親和層析純化填料上偶聯(lián)的配基為蛋白質(zhì)。
[0021 ] 在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供蛋白質(zhì)層析純化填料的清潔方法，其中所述親和層析純化填料上偶聯(lián)的配基為抗體。
[0022]在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供蛋白質(zhì)層析純化填料的清潔方法，其中所述親和層析純化填料上偶聯(lián)的配基為蛋白A (Protein A)或蛋白G (Protein G)。
[0023]在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供蛋白質(zhì)層析純化填料的清潔方法，其中所述的蛋白質(zhì)層析純化填料純化的蛋白質(zhì)是干擾素或干擾素的抗體。
[0024]本發(fā)明中使用的術(shù)語“蛋白質(zhì)層析純化”是指利用色譜或?qū)游龅脑韺Φ鞍踪|(zhì)進(jìn)行分離純化的過程，一般是將蛋白質(zhì)層析純化填料裝填到專門的層析柱中進(jìn)行。一個(gè)蛋白質(zhì)層析純化流程一般包括平衡、上樣、沖洗、洗脫、清潔、再生等操作。其中平衡操作是將蛋白質(zhì)層析純化填料內(nèi)部的環(huán)境轉(zhuǎn)換到與上樣蛋白質(zhì)所處的環(huán)境一致的操作；上樣操作是讓蛋白質(zhì)通過蛋白質(zhì)層析純化填料，從而讓蛋白質(zhì)層析純化填料對不同的蛋白質(zhì)起到選擇性吸附作用的操作；沖洗操作是在蛋白質(zhì)上樣后繼續(xù)用溶液處理蛋白質(zhì)層析填料，直至蛋白質(zhì)純化填料的流出液中不含蛋白質(zhì)組分，溶液組成與平衡用溶液的組成相同的操作；洗脫操作是從蛋白質(zhì)層析純化填料上分開或一次洗下各種吸附蛋白質(zhì)的操作；再生操作是讓蛋白質(zhì)層析填料恢復(fù)蛋白質(zhì)吸附能力的操作。
[0025]本發(fā)明中使用的術(shù)語“填料”是指對蛋白質(zhì)進(jìn)行層析分離純化所使用的材料，也稱為膠、凝膠或介質(zhì)，結(jié)構(gòu)組成上包括基質(zhì)(matrix)、配基(ligand)或功能基團(tuán)(functionalgroup)、手臂(arm)等。
[0026]本發(fā)明中使用的術(shù)語“清潔”是指在蛋白質(zhì)層析純化填料每次純化蛋白質(zhì)后去除其中死結(jié)合或殘留的雜質(zhì)，尤其是微生物、熱原(內(nèi)毒素)類雜質(zhì)的過程。
[0027]本發(fā)明中使用的術(shù)語“清潔液”是指對所述的蛋白質(zhì)層析純化填料起到清潔作用的清潔劑的溶液。例如在現(xiàn)有技術(shù)中可以是強(qiáng)酸(如0.1-lmol/L鹽酸或醋酸)、強(qiáng)堿(如0.2-2mol/L氫氧化鈉)、高濃度鹽(如l_5mol/L NaCl)、有機(jī)溶劑(如5-50%(v/v)乙醇)等，在本發(fā)明中是苯扎溴銨的水溶液。
[0028]本發(fā)明中使用的術(shù)語“清潔有效量”是指能較為徹底的清除掉蛋白質(zhì)層析純化填料上死結(jié)合或殘留的雜質(zhì)所需的清潔液的體積。
[0029]本發(fā)明中使用的術(shù)語“在位清潔”是指不將蛋白質(zhì)層析純化填料從所在的層析柱上拆卸下來，而直接用清潔液在層析柱上清潔所述的蛋白質(zhì)層析純化填料的過程。
[0030]本發(fā)明中使用的術(shù)語“柱體積”是指將蛋白質(zhì)層析純化填料裝填到層析柱上后，在實(shí)際層析操作中蛋白質(zhì)層析純化填料所占有的體積。
[0031]應(yīng)當(dāng)指出，上述解釋的本發(fā)明中使用的一些術(shù)語的含義及上述未解釋的本發(fā)明中使用的其它術(shù)語的含義均是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。之所以對本發(fā)明中使用的這些術(shù)語的含義作出解釋，是為了便于審查員，及本發(fā)明相關(guān)的技術(shù)人員、市場銷售人員、法律人員理解本發(fā)明，因此這些對本發(fā)明中使用的術(shù)語的含義的解釋不應(yīng)當(dāng)理解為對本發(fā)明的限制。【具體實(shí)施方式】
[0032]通過如下的實(shí)施例對本發(fā)明的實(shí)施作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不局限于如下的實(shí)施例。 [0033]實(shí)施例1:不同清潔液對偶聯(lián)單克隆抗體配基的親和層析填料的清潔對比試驗(yàn)(一)
[0034]用NHS活化的S印harose4FF填料(貨號17-0906-01或17-0906-02)裝填四根內(nèi)徑為IOmm的層析柱,每根裝填I(lǐng)ml填料。然后根據(jù)填料制造商GEHealthcare在產(chǎn)品說明書中提供的偶聯(lián)條件將商品化的干擾素α的單克隆抗體(PBL公司制造，北京市吉泰新繹生物科技有限公司代理銷售，貨號21100-2)分別偶聯(lián)到已裝填四根層析柱的NHS活化的Sepharose4FF 填料上。
[0035]對各層析柱分別用50mmol/L PB, 0.2mol/L NaCl，pH7.0溶液平衡，以上常規(guī)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下制備與保存，而未經(jīng)無菌操作、處理與保存的濃度為lmg/ml的干擾素a Ib樣品(按《中華人民共和國藥典2010年版(三部)》附錄IV C規(guī)定的“SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法”法測定純度大于95%;按《中華人民共和國藥典2010年版(三部)》附錄XII A規(guī)定的“無菌檢查法”測定其中菌落數(shù)大于80000CFU/ml ;按《中華人民共和國藥典2010年版(三部)》附錄XII E規(guī)定的“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”測定其中內(nèi)毒素含量大于10000Eu/ml，同樣的檢測項(xiàng)目在下文的測試中方法相同)，直至檢測器檢測到上樣流穿液中出現(xiàn)蛋白質(zhì)時(shí)停止上樣(最直接的指標(biāo)是上樣流穿液的紫外吸收值開始明顯增加)。根據(jù)上樣流速、上樣時(shí)間與上樣濃度計(jì)算干擾素alb樣品的總上樣量。上樣結(jié)束并經(jīng)與平衡溶液相同的溶液沖洗后分別用100mmol/L甘氨酸-鹽酸,0.2mol/L NaCl, pH3.0溶液洗脫上樣的干擾素a lb。洗脫結(jié)束后對各層析柱分別用0.02% (m/v)苯扎溴銨水溶液連續(xù)沖洗200個(gè)柱體積，用20%(v/v)乙醇水溶液、0.2mol/L醋酸水溶液、0.2mol/L氫氧化鈉水溶液連續(xù)沖洗10個(gè)柱體積(要求這些溶液中熱原(內(nèi)毒素)含量小于0.5Eu/ml，菌落數(shù)小于lCFU/ml)，然后再對各層析柱分別用除菌除熱原(內(nèi)毒素)的純化水(要求其中熱原(內(nèi)毒素)含量小于0.5Eu/ml，菌落數(shù)小于lCFU/ml)沖洗3個(gè)柱體積。沖洗臨結(jié)束前收集層析柱流出液樣品進(jìn)行內(nèi)毒素含量測定，得清潔后流出液內(nèi)毒素含量；并對用苯扎溴銨清潔的層析柱收集流出液樣品進(jìn)行苯扎溴銨的高效液相色譜法含量測定(按照《中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志》2008年第25卷第8期第707-708頁發(fā)表的文章“HPLC測定消毒液中苯扎溴銨”中報(bào)道的方法進(jìn)行測定，具體條件為:Agilent XDB-C18 柱(4.6mmX 150mm, 5 μ m)，以 0.02mol/L 庚烷磺酸鈉溶液(含 0.1%三乙胺，用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.45±0.1)-乙腈(35: 65)為流動相,流速1.0ml/min,進(jìn)樣體積5 μ 1，檢測波長262nm，柱溫30°C。結(jié)果苯扎溴銨濃度在2.5~50 μ g/ml內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9999);此方法經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證檢測限小于0.00025mg/ml)。以上平衡、上樣、沖洗、洗脫、清潔等層析操作的線性流速均為150cm/h。
[0036]重復(fù)前段所述的操作9次，按同樣的方法取樣進(jìn)行測定與計(jì)算。
[0037]以下表1列出了各層析柱10次操作的情況與操作中取樣檢測、計(jì)算的結(jié)果。
[0038]表1不同清潔液對偶聯(lián)單克隆抗體配基的親和層析填料的清潔對比試驗(yàn)結(jié)果(一)
[0039]
【權(quán)利要求】
1.一種蛋白質(zhì)層析純化填料的清潔方法，其特征是用清潔有效量的質(zhì)量體積比濃度為0.02%-2%的苯扎溴銨水溶液清潔所述的蛋白質(zhì)層析純化填料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的清潔方法，其特征是所述的苯扎溴銨水溶液的質(zhì)量體積比濃度為 0.05%-0.5%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的清潔方法，其特征是用所述的苯扎溴銨水溶液連續(xù)沖洗所述的蛋白質(zhì)層析純化填料3-200個(gè)柱體積以達(dá)到清潔作用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的清潔方法，其特征是在將所述的苯扎溴銨水溶液充滿所述的蛋白質(zhì)層析純化填料后，密閉裝填所述的蛋白質(zhì)層析純化填料的蛋白質(zhì)層析純化柱0.5-10小時(shí)以達(dá)到清潔作用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的清潔方法，其特征是所述的蛋白質(zhì)層析純化填料是親和層析純化填料。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的清潔方法，其特征是所述的親和層析純化填料是Sepharose4FF。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的清潔方法，其特征是所述的親和層析純化填料上偶聯(lián)的配基為蛋白質(zhì)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的清潔方法，其特征是所述的親和層析純化填料上偶聯(lián)的配基為抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的清潔方法，其特征是所述的親和層析純化填料上偶聯(lián)的配基為蛋白A或蛋白G。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9之一所述的清潔方法，其特征是所述的蛋白質(zhì)層析純化填料純化的蛋白質(zhì)是干擾素或干擾素的抗體。
【文檔編號】C07K1/22GK103554217SQ201310547434
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月6日
【發(fā)明者】周敏毅, 楊大軍, 余軍陽, 韓志剛, 杜伊達(dá), 程永慶 申請人:北京三元基因工程有限公司