一種人第viii凝血因子的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種人第VIII凝血因子的制備方法，包括如下步驟：（1）從人血漿中分離冷沉淀，加入Tris-HCl溶解液溶解；（2）一次PEG沉淀：向溶解液中加入PEG1溶液，攪拌靜置后離心；（3）收集離心后的上清液，加入S/D溶液滅活；（4）二次PEG沉淀：將滅活后的所述上清液澄清過濾，濾液轉(zhuǎn)至低溫反應(yīng)罐，在攪拌條件下加入PEG2溶液，攪拌靜置后離心；（5）沉淀洗滌、采用溶解液溶解，溶解完全后離心，收集上清，過濾，配制、除菌分裝，凍干、軋蓋，干熱滅活得到產(chǎn)品。本發(fā)明所述方法采用二次PEG沉淀法簡化了生產(chǎn)工藝，降低了對大型設(shè)備的要求，占地面積小，操作簡單，成本低廉，提高了勞動(dòng)效率，提高了經(jīng)濟(jì)效益。
【專利說明】—種人第VI I I凝血因子的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，特別是涉及一種人第VIII凝血因子的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]凝血因子VIII制劑與白蛋白制劑、免疫球蛋白制劑在國外同為血漿蛋白制劑的三大支柱產(chǎn)品，在血友病中，80%的病人屬于甲型血友病，該類病人主要缺少正常人所擁有的人凝血因子VIII，因此，人凝血因子VIII是治療血友病的救命藥。目前國內(nèi)僅有少數(shù)幾家具有人凝血因子VIII的生產(chǎn)批文，主要是工藝操作繁瑣，質(zhì)量不易控制?，F(xiàn)有生產(chǎn)工藝生產(chǎn)人凝血因子VIII產(chǎn)品得率低，面對國內(nèi)人凝血因子VIII的短缺，現(xiàn)階段研發(fā)生產(chǎn)安全性高、比活性高的人凝血因子VIII具有積極意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種操作簡單，產(chǎn)品質(zhì)量可控的制備人凝血因子VIII的方法。
[0004]一種人第VIII凝血因子的制備方法，包括如下步驟:
[0005](1)從人血漿中分離出的冷沉淀為起始原料，用3倍的0.01-0.05mol/L的Tris-HCl溶解液溶解；反應(yīng)液溫度控制在24~26°C，加入肝素鈉作為保護(hù)劑，終濃度為.0.005-0.065% ；
[0006](2) 一次PEG沉淀:向溶解液中加入30%濃PEGl溶液，溶液中最終PEG濃度為2%-6%，調(diào)節(jié)溶液pH值至6.5~7.5，攪拌靜置后離心；
[0007](3)收集離心后的上清液，經(jīng)澄清過濾后，根據(jù)過濾后的體積加入S/D病毒滅活液，使溶液中Tween-80含量為11.0%、TNBP含量為3.3%，反應(yīng)液溫度控制在24-26°C，保溫6小時(shí)；
[0008](4) 二次PEG沉淀:將滅活后的所述反應(yīng)液澄清過濾，濾液轉(zhuǎn)至低溫反應(yīng)罐，準(zhǔn)確計(jì)量過濾液體積，在攪拌條件下加入40%PEG2溶液，溶液中PEG濃度為10%-16%，調(diào)節(jié)溶液pH值至5.4~6.0，攪拌靜置后離心；
[0009](5)沉淀洗滌:收集沉淀，用10%的甘氨酸溶液洗滌3次，洗滌完全后離心，收集沉淀；
[0010](6)用1%的甘氨酸溶液溶解，溶解液調(diào)pH至7.1~7.3，過濾，配制、除菌分裝，凍干、軋蓋，干熱滅活得到人凝血因子VIII成品。
[0011]本發(fā)明所述的人第VIII凝血因子的制備方法，其中步驟(1)冷沉淀的制備方法為:
[0012]生產(chǎn)用血漿符合《中華人民共和國藥典》2010版三部“血液制品生產(chǎn)用原料血漿”規(guī)定，血漿應(yīng)無凝塊，無纖維蛋白析出，非脂血，無溶血。采集后應(yīng)在4小時(shí)以內(nèi)凍結(jié)，-30°C保存不超過I年；
[0013]冰凍血漿在0_4°C融化，經(jīng)低溫高速離心，離心過程中血漿溫度控制2_8°C，收集沉淀；即為冷沉淀。
[0014] 本發(fā)明所述的人第VIII凝血因子的制備方法，其中步驟(2) PEGl溶液的配方為:PEG 為 30%、Na3Cit ? 2H20 為 1%，用 1.0mol/LHCl 溶液調(diào) PH 為 6.2 ~6.4。
[0015]本發(fā)明所述的人第VIII凝血因子的制備方法，其中步驟(4) PEG2溶液的配方為:PEG 為 40%、Na3Cit ? 2H20 為 1%，用 1.0mol/LHCl 溶液調(diào) PH 為 6.2 ~6.4。。
[0016]本發(fā)明所述的人第VIII凝血因子的制備方法，其中步驟(5)具體包括如下步驟:
[0017]配制甘氨酸洗滌液:取甘氨酸0.232kg、檸檬酸三鈉0.133kg、肝素鈉0.142kg、加注射用水1.4kg,用1.0moI/L HCl溶液調(diào)pH為6.65~6.75，配制好后降溫至-1.0~1.(TC備用;
[0018]沉淀洗滌:收集沉淀，第一次加9-12倍沉淀量的甘氨酸洗滌液，充分粉碎洗滌沉淀，離心收集沉淀；第二次加13-15倍沉淀量的洗滌液，充分粉碎洗滌沉淀，離心收集沉淀；第三次加18-20倍沉淀量的洗滌液，充分粉碎洗滌沉淀，離心收集沉淀。
[0019]本發(fā)明所述的人第VIII凝血因子的制備方法，其中步驟(6)具體包括如下步驟:
[0020]配制溶解液，取甘氨酸90g，含2個(gè)結(jié)晶水放入檸檬酸三鈉23.5g，加25~35°C注射用水溶解成10L，用1.0moI/L HCL溶液調(diào)pH至7.1~7.3 ;溫度控制在25~35°C之間；
[0021]用13~15倍溶解液溶解沉淀，緩緩攪拌至完全溶解；溶解后澄清過濾，收集上清，除菌分裝，凍干、軋蓋，干熱滅活得到人凝血因子VIII成品。
[0022]本發(fā)明所述方法制備得到的產(chǎn)品，制備得到的所述人凝血因子VIII效價(jià)為不低于35IU/ml,比活不低于10IU/g蛋白質(zhì)。
[0023]本發(fā)明人第VIII凝血因子的制備方法優(yōu)點(diǎn)在于:
[0024](I)本發(fā)明所述方法采用從人血漿中分離的冷沉淀為原料，替代從組分III沉淀中提取人第VIII凝血因子，冷沉淀較組分III沉淀易制備，且質(zhì)量可控。
[0025](2)本發(fā)明采用了濃度為10%的甘氨酸溶液洗滌，提高產(chǎn)品的比活性。
[0026](3)本發(fā)明采用二次PEG沉淀法替代乙醇純化和柱層析工藝，降低了對大型設(shè)備的要求，占地面積小，操作簡單，成本低廉，提高了經(jīng)濟(jì)效益。
【具體實(shí)施方式】
[0027]實(shí)施例1
[0028]一種人第VIII凝血因子的制備方法，包括如下步驟:
[0029]1、血漿要求:
[0030]A、所用血漿原料應(yīng)符合“血液制品生產(chǎn)用人血漿”規(guī)定；
[0031]B、血漿采集后應(yīng)在4小時(shí)以內(nèi)凍結(jié)；
[0032]C、冰凍血漿運(yùn)輸過程中不低于-20°C，冷凍保存溫度不得超過_30°C，有效期不超過12個(gè)月。
[0033]D、血漿應(yīng)無凝塊，無纖維蛋白析出，非脂血，無溶血。
[0034]2、冷沉淀制備:
[0035]稱取1000kg冰凍血漿(計(jì)1667人份血漿)，采用水浴法融化混合血漿，融化的血漿溫度控制在0-4°C，采用低溫高速離心機(jī)分離冷不容物，離心過程血漿流出液溫度控制在
2-8°C，流速控制在3± IL/臺/分，離心結(jié)束后收集8Kg冷沉淀。[0036]附冷沉淀原料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
[0037]a、冷沉淀原料為采用低溫離心分離法的血漿組分。所用血漿原料應(yīng)符合“血液制品生產(chǎn)用人血漿”規(guī)定；
[0038]b、冷沉淀應(yīng)盡能保持無菌和低溫冰凍保存，保存溫度不得超過-30°C，保存期應(yīng)不超過I年。
[0039]C、冷沉淀的檢定:
[0040]準(zhǔn)確稱取冷沉淀10g，用生理氯化鈉溶液稀釋至100ml，在I~3 °C攪拌充分溶解后離心或過濾，取上清液進(jìn)行以下項(xiàng)目檢測。
[0041]人凝血因子VIII效價(jià):每毫升不低于IOIU ；
[0042]細(xì)菌內(nèi)毒素:用經(jīng)批準(zhǔn)的試劑盒檢測，應(yīng)為陰性。
[0043]HBsAg:用經(jīng)批準(zhǔn)的試劑盒檢測，應(yīng)為陰性。
[0044]HIV抗體:用經(jīng)批準(zhǔn)的試劑盒檢測，應(yīng)為陰性。
[0045]HCV抗體:用經(jīng)批準(zhǔn)的試劑盒檢測，應(yīng)為陰性。
[0046]3、冷沉淀的溶解
[0047]將化凍后的冷沉淀切碎倒入3倍冷沉淀量0.02mol/L-HCL溶解液中(24L)，水浴升溫至24~26°C，攪拌溶解至少3小時(shí)后，以200ml/min加入3.3%肝素鈉溶液至肝素鈉終濃度為0.046%后，繼續(xù)攪拌0.5小時(shí)，溶解液體積為32L.。
[0048]4、一次PEG沉淀:沉淀溶解結(jié)束后，加入配制好的30%PEG1溶液3.1Kg,速度不超過500g/min，使最終PEG濃度為3.5 %;加入PEG后用0.5mol/L醋酸溶液調(diào)PH值至6.50 一
6.60，溫度:10~12°C攪拌30分鐘后，靜置1.0小時(shí)后離心。
[0049]5、S/D滅活:收集上清準(zhǔn)確計(jì)量過濾后的蛋白液體積34Kg，按1:10比例在攪拌下緩慢加入配制好的S/D溶液(Tween-80含量為11.0%、TNBP含量為3.3% )，使蛋白液中聚山梨酯80最終濃度為1%、磷酸三丁脂最終濃度為0.3%，升溫至24~26°C，保溫6小時(shí)；
[0050]6、二次PEG沉淀:滅活孵育結(jié)束后經(jīng)澄清過濾，濾液轉(zhuǎn)至低溫反應(yīng)罐，準(zhǔn)確計(jì)量過濾液體積37.3Kg，在攪拌過程中加入配置好的40%PEG2溶液18Kg，添加速度應(yīng)不大于500ml/分，使最終制品中PEG濃度為13% ;加入PEG后用0.5mol/L醋酸溶液調(diào)PH至5.70~
5.80 ;冷卻至10~12°C后攪拌0.5小時(shí)，靜置I小時(shí)后分離。
[0051]7、沉淀洗滌:收集沉淀125g，第一次加10倍沉淀量的洗滌液(配方:甘氨酸
0.232kg、檸檬酸三鈉0.133kg、肝素鈉0.142kg、加注射用水1.4kg，用1.0moI/L HCl溶液調(diào)pH為6.65~6.75,配制好后降溫至-1.0~1.(TC備用),充分粉碎洗漆沉淀，離心收集沉淀；第二次加15倍沉淀量的洗滌液，充分粉碎洗滌沉淀，離心收集沉淀；第三次加20倍沉淀量的洗滌液，充分粉碎洗滌沉淀，離心收集沉淀。
[0052]8、溶解用13倍溶解液(配制溶解液配方:取甘氨酸90g，含2個(gè)結(jié)晶水的檸檬酸三鈉23.5g，加25~35°C注射用水溶解成10L，用1.0moI/L HCL溶液調(diào)pH至7.1~7.3 ;溫度控制在25~35°C之間。)溶解沉淀，溶解完全后離心，收集上清1.25Kg，過濾；
[0053]9、配制:取溶解后制品測效價(jià)，按分裝規(guī)格加溶解液稀釋，最終控制在總體積為沉淀重15倍量。人凝血因子VIII效價(jià)最終為35IU/ml，用1.0moI/L HCl或1.0moI/L NaOH溶液調(diào)PH至7.0。)、除菌分裝，按IOml/瓶進(jìn)行分裝；共分裝252瓶。
[0054]10、凍干:在嚴(yán)格無菌操作規(guī)程，嚴(yán)格控制凍干期間升溫速度和真空度，保證制品有良好的外觀、合格的真空度，殘余水分不高于3.0%。、軋蓋；
[0055]11、干熱滅活:將凍干制品移入干熱滅活柜，溫度控制在:98-100°C，時(shí)間為:保溫30分鐘，干熱結(jié)束后，轉(zhuǎn)入待檢品庫，取樣送檢，得到人凝血因子VIII成品。
[0056]本發(fā)明所述方法中的數(shù)值不限于實(shí)施例1中應(yīng)用的具體數(shù)值，在生產(chǎn)中，在較小范圍內(nèi)的數(shù)值變化不影響試驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明中的百分?jǐn)?shù)除具體說明的以外，均為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。
[0057]成品檢測按照《中華人民共和國藥典》2010版三部“人凝血因子VIII” (P236-237頁)進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果如表1所示:制備得到的所述人凝血因子VIII效價(jià)為不低于35IU/ml,比活不低于10IU/g蛋白質(zhì)。
[0058]表1.成品檢測報(bào)告
[0059]
【權(quán)利要求】
1.一種人第VIII凝血因子的制備方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)從人血漿中分離出的冷沉淀為起始原料，用3倍的0.01-0.05mol/L的Tris-HCl溶解液溶解，溶解液溫度控制在24~26°C，加入肝素鈉作為保護(hù)劑，終濃度為0.005-0.065% ； (2)—次PEG沉淀:向所述溶解液中加入30%濃PEGl溶液，溶液中最終PEG濃度為2%-6%，調(diào)節(jié)溶液pH值至6.5~7.5，攪拌靜置后離心； (3)收集離心后的上清液，經(jīng)澄清過濾后,根據(jù)過濾后的體積加入S/D病毒滅活液，使溶液中Tween-80含量為11.0%、TNBP含量為3.3%，反應(yīng)液溫度控制在24-26°C，保溫6小時(shí)； (4)二次PEG沉淀:將滅活后的所述反應(yīng)液澄清過濾，濾液轉(zhuǎn)至低溫反應(yīng)罐，準(zhǔn)確計(jì)量過濾液體積，在攪拌條件下加入40%PEG2溶液，溶液中PEG濃度為10%-16%，調(diào)節(jié)溶液pH值至5.4~6.0，攪拌靜置后離心； (5)沉淀洗滌:收集沉淀，用10%的甘氨酸溶液洗滌3次，洗滌完全后離心，收集沉淀； (6)用1%的甘氨酸溶液溶解，溶解液調(diào)pH至7.1~7.3，過濾，配制、除菌分裝，凍干、軋蓋，干熱滅活得到人凝血因子VIII成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人第VIII凝血因子的制備方法，其特征在于:步驟(1)冷沉淀的制備方法為: 采集的血漿應(yīng)無凝塊，無纖維蛋白析出，非脂血，無溶血，采集后應(yīng)在4小時(shí)以內(nèi)凍結(jié)，-30°C保存不超過I年；將所述冰凍血漿在0-4°C融化，經(jīng)低溫高速離心，離心過程中血漿溫度控制2-8°C，收集沉淀，即為冷沉淀。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人第VIII凝血因子的制備方法，其特征在于:步驟(2)PEGl溶液的配方為:PEG為30%、Na3Cit ? 2H20為1%，用1.0mol/LHCl溶液調(diào)PH為6.2~6.4。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人第VIII凝血因子的制備方法，其特征在于:步驟(4)PEG2溶液的配方為:PEG為40%、Na3Cit ? 2H20為1%，用1.0mol/LHCl溶液調(diào)PH為6.2~6.4。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的人第VIII凝血因子的制備方法，其特征在于:步驟(5)具體包括如下步驟: 配制甘氨酸洗滌液:取甘氨酸0.232kg、檸檬酸三鈉0.133kg、肝素鈉0.142kg、加注射用水1.4kg，用1.0moI/L HCl溶液調(diào)pH為6.65~6.75，配制好后降溫至-1.0~1.(TC備用； 沉淀洗滌:收集沉淀，第一次加9-12倍沉淀量的甘氨酸洗滌液，充分粉碎洗滌沉淀，離心收集沉淀；第二次加13-15倍沉淀量的洗滌液，充分粉碎洗滌沉淀，離心收集沉淀；第三次加18-20倍沉淀量的洗滌液，充分粉碎洗滌沉淀，離心收集沉淀。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人第VIII凝血因子的制備方法，其特征在于:步驟(6)具體包括如下步驟: 配制溶解液:取甘氨酸90g，放入含2個(gè)結(jié)晶水的檸檬酸三鈉23.5g，加25~35°C注射用水溶解成10L，用1.0moI/L HCL溶液調(diào)pH至7.1~7.3 ;溫度控制在25~35°C之間； 用13~15倍溶解液溶解沉淀，緩緩攪拌至完全溶解；溶解后澄清過濾，收集上清，除菌分裝，凍干、軋蓋，干熱滅活得到人凝血因子VIII成品。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6所述方法制備得到的產(chǎn)品，其特征在于:制備得到的所述人凝血因子VIII效價(jià)為不低于35IU/ml，比活不低于10IU/g蛋白質(zhì)。
【文檔編號】C07K1/30GK103613658SQ201310573675
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月15日
【發(fā)明者】陳正旺, 胡輝恒, 邵恒波, 汪模正 申請人:同路生物制藥股份有限公司