多特異性抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及二價(jià)多特異性抗體，尤其是結(jié)合人HER1、人HER2和人HER3的二價(jià)三特異性抗體、其制備和用途。
【專利說明】多特異性抗體
[0001] 本發(fā)明涉及新的二價(jià)多特異性抗體，尤其是三特異性或四特異性抗體，尤其是結(jié) 合人HER1、人HER2和人HER3的二價(jià)三特異性抗體、其制備和用途。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 改造的蛋白質(zhì)，如能夠結(jié)合兩個(gè)不同抗原的雙特異性抗體為本領(lǐng)域所知。可以使 用細(xì)胞融合、化學(xué)綴合或重組DNA技術(shù)產(chǎn)生此類雙特異性結(jié)合蛋白質(zhì)。
[0004] 最近過去的幾年，已經(jīng)開發(fā)了多種多樣的重組雙特異性抗體形式，例如通過 融合例如IgG抗體形式和單鏈結(jié)構(gòu)域的四價(jià)雙特異性抗體（參見例如Coloma, M. J.， 等，Nature Biotech.15 (1997) 159-163 ;TO 2001/077342 ;和 Morrison, S. L.，Nature Biotech.25(2007)1233-1234。
[0005] 還開發(fā)了若干能夠結(jié)合兩個(gè)或多個(gè)抗原的其他新的形式，其中不再保留抗體核 心結(jié)構(gòu)（IgA、IgD、IgE、IgG或IgM),如二抗體、三抗體或四抗體、微抗體（minibody)、若 干單鏈形式（scFv、Bis-scFv)(Holliger，P.，等，Nature Biotech. 23(2005) 1126-1136; Fischer, N.，和 L6ger，0?，Pathobiology 74 (2007) 3-14 ;Shen，J.，等，J. Immunol. Methods 318 (2007) 65-74 ;Wu，C.，等，Nature Biotech. 25 (2007) 1290-1297)。
[0006] 所有這些形式都使用接頭來將抗體核心（IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)與其他 結(jié)合蛋白質(zhì)（例如scFv)融合或者融合例如兩個(gè)Fab片段或scFv (Fischer, N.，和 L6ger，0?，Pathobiology 74 (2007) 3-14)。盡管接頭對(duì)改造雙特異性抗體具有優(yōu)勢(shì)是顯而 易見的，但是它們還可能在治療背景中引起問題。事實(shí)上，這些外來肽可能引發(fā)針對(duì)接頭本 身或蛋白質(zhì)與接頭之間的連接免疫應(yīng)答。此外，這些肽的柔性性質(zhì)使得它們更易于被蛋白 水解切割，可能導(dǎo)致差的抗體穩(wěn)定性、聚集和增加的免疫原性。此外，可能希望通過維持與 天然發(fā)生的抗體的高度相似性來保留通過Fc部分介導(dǎo)的效應(yīng)子功能，如例如補(bǔ)體依賴性 細(xì)胞毒性（CDC)或抗體依賴性細(xì)胞毒性（ADCC)。
[0007] 因此，理想的是，目標(biāo)應(yīng)該是開發(fā)這樣的雙特異性抗體，其與天然發(fā)生的抗體（像 IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)在一般結(jié)構(gòu)上非常相似，與人序列具有最小的偏差。
[0008] WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253 ;W02009/080254 和 Schaefer,等，PNAS 108 (2011) 11187-11192 涉及雙特異性二價(jià)抗體。
[0009] WO 2008/027236 ;W0 2 0 10 / 1 08 1 2 7 和 Bo s t r om, J.，等，Science 323 (2009) 1610-1614涉及使可變重鏈和輕鏈結(jié)構(gòu)域VH和VL多樣化以引入二元特異性 的方法。WO 2010/136172涉及三特異性或四特異性抗體，然而其是三價(jià)或四價(jià)的，WO 2007/146959涉及全細(xì)胞型（pan-cell)表面受體特異的治療。
[0010] 該技術(shù)不適合作為容易地開發(fā)針對(duì)具有IgG樣結(jié)構(gòu)和IgG樣分子量的三種或四種 抗原的重組多特異性抗體的基礎(chǔ)。迄今為止，產(chǎn)生這樣的二價(jià)三特異性或四特異性抗體是 不可能的，所述抗體與天然發(fā)生的二價(jià)抗體具有相似的結(jié)構(gòu)，但沒有其他融合的結(jié)合結(jié)構(gòu) 域。
[0011] 發(fā)明概沭
[0012] 本發(fā)明涉及多特異性抗體，其包含：
[0013] A) a)特異性結(jié)合第一抗原和第二抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈；和
[0014] b)特異性結(jié)合第三抗原的全長抗體的修飾輕鏈和修飾重鏈，其中可變域VL和VH 被彼此替換，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替換；
[0015] 或
[0016] B) a)特異性結(jié)合第一抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈；和
[0017] b)特異性結(jié)合第二抗原和第三抗原的全長抗體的修飾輕鏈和修飾重鏈，其中可變 域VL和VH被彼此替換，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替換；
[0018] 或
[0019] C) a)特異性結(jié)合第一抗原和第二抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈；和
[0020] b)特異性結(jié)合第三抗原和第四抗原的全長抗體的修飾輕鏈和修飾重鏈，其中可變 域VL和VH被彼此替換，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替換。
[0021] 在一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體的特征在于所述抗體是二價(jià)三特異性或四特異 性抗體。
[0022] 在一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體的特征在于所述抗體是三特異性的并包含
[0023] A) a)特異性結(jié)合第一抗原和第二抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈；和
[0024] b)特異性結(jié)合第三抗原的全長抗體的修飾輕鏈和修飾重鏈，其中可變域VL和VH 被彼此替換，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替換；
[0025] 或
[0026] B) a)特異性結(jié)合第一抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈；和
[0027] b)特異性結(jié)合第二抗原和第三抗原的全長抗體的修飾輕鏈和修飾重鏈，其中可變 域VL和VH被彼此替換，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替換。
[0028] 在一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體的特征在于
[0029] 在A)的情況下，第一抗原是人HER1，第二抗原是人HER3并且第三抗原是人HER2 ; 或
[0030] 在B)的情況下，第一抗原是人HER2,第二抗原是人HERl并且第三抗原是人HER3。
[0031] 在一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體的特征在于
[0032] 在A)的情況下，第一抗原是人HERl，第二抗原是人HER3并且第三抗原是人cMET ; 或
[0033] 在B)的情況下，第一抗原是人cMET，第二抗原是人HERl并且第三抗原是人HER3。
[0034] 在一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體的特征在于所述抗體是四特異性的并包含
[0035] a)特異性結(jié)合第一抗原和第二抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈；和
[0036] b)特異性結(jié)合第三抗原和第四抗原的全長抗體的修飾輕鏈和修飾重鏈，其中可變 域VL和VH被彼此替換，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替換。
[0037] 在一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體的特征在于在b)的修飾輕鏈和修飾重鏈中，可 變域VL和VH被彼此替換；并且其中恒定域CL和CHl被彼此替換。
[0038] 在一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體的特征在于在b)的修飾輕鏈和修飾重鏈中， (僅）可變域VL和VH被彼此替換，
[0039] 在一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體的特征在于在b)的修飾輕鏈和修飾重鏈中， (僅）恒定域CL和CHl被彼此替換。
[0040] 在一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體的特征在于
[0041] a)的全長抗體的重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域與b)的全長抗體的修飾重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域各 自在這樣的界面處相遇，所述界面在抗體CH3結(jié)構(gòu)域之間包含原始界面；
[0042] 其中改變所述界面，以促進(jìn)三特異性抗體或四特異性抗體的形成，
[0043] 其中所述改變的特征在于：
[0044] i)改變一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域，
[0045] 從而在三特異性抗體或四特異性抗體內(nèi)遇到另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的原始界 面的一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的原始界面內(nèi)，
[0046] 氨基酸殘基被具有更大側(cè)鏈體積的氨基酸殘基替換，由此在定位在另一條重鏈的 CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)的腔中的一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)產(chǎn)生隆凸，
[0047] 和
[0048] ii)改變另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域，
[0049] 從而在三特異性抗體或四特異性抗體內(nèi)遇到第一個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的原始界面的第 二個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的原始界面內(nèi)，
[0050] 氨基酸殘基被具有更小側(cè)鏈體積的氨基酸殘基替換，由此在第二個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的 界面內(nèi)產(chǎn)生腔，在所述第二個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)定位了第一個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)的隆 凸。
[0051] 在一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體的特征在于
[0052] 具有較大側(cè)鏈體積的所述氨基酸殘基選自精氨酸（R)、苯丙氨酸（F)、酪氨酸（Y)、 色氨酸（W)，并且具有較小側(cè)鏈體積的所述氨基酸殘基選自丙氨酸（A)、絲氨酸（S)、蘇氨酸 (T)、纈氨酸（V)。
[0053] 在一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體的特征在于通過引入半胱氨酸（C)作為在每個(gè) CH3結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)位置中的氨基酸來進(jìn)一步改變兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域，從而能夠在兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu) 域之間形成二硫鍵。
[0054] 本發(fā)明的其他實(shí)施方案是制備本發(fā)明的多特異性抗體的方法，
[0055] 其包括步驟
[0056] a)用包含這樣的核酸分子的載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，所述核酸分子編碼
[0057] A) a)特異性結(jié)合第一抗原和第二抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈；和
[0058] b)特異性結(jié)合第三抗原的全長抗體的修飾輕鏈和修飾重鏈，其中可變域VL和VH 被彼此替換，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替換；
[0059] 或
[0060] B) a)特異性結(jié)合第一抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈；和
[0061] b)特異性結(jié)合第二抗原和第三抗原的全長抗體的修飾輕鏈和修飾重鏈，其中可變 域VL和VH被彼此替換，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替換；
[0062] 或
[0063] C) a)特異性結(jié)合第一抗原和第二抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈；和
[0064] b)特異性結(jié)合第三抗原和第四抗原的全長抗體的修飾輕鏈和修飾重鏈，其中可變 域VL和VH被彼此替換，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替換。
[0065] b)在允許合成所述抗體分子的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞；和
[0066] c)從所述培養(yǎng)物中回收所述抗體分子。
[0067] 本發(fā)明進(jìn)一步包含編碼本發(fā)明的多特異性抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的核酸。
[0068] 本發(fā)明進(jìn)一步包含這樣的載體，其包含編碼本發(fā)明的多特異性抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的 核酸。
[0069] 本發(fā)明的其他實(shí)施方案是宿主細(xì)胞，其包含
[0070] _包含這樣的核酸分子的載體，所述核酸分子編碼
[0071] A) a)特異性結(jié)合第一抗原和第二抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈；
[0072] 和
[0073] b)特異性結(jié)合第三抗原的全長抗體的修飾輕鏈和修飾重鏈，其中可變域VL和VH 被彼此替換，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替換；
[0074] 或
[0075] B) a)特異性結(jié)合第一抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈；和
[0076] b)特異性結(jié)合第二抗原和第三抗原的全長抗體的修飾輕鏈和修飾重鏈，其中可變 域VL和VH被彼此替換，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替換；
[0077] 或
[0078] C) a)特異性結(jié)合第一抗原和第二抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈；和
[0079] b)特異性結(jié)合第三抗原和第四抗原的全長抗體的修飾輕鏈和修飾重鏈，其中可變 域VL和VH被彼此替換，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替換。
[0080] 本發(fā)明的其他實(shí)施方案是組合物，優(yōu)選本發(fā)明抗體的藥物組合物或診斷組合物。+
[0081] 本發(fā)明的其他實(shí)施方案是包含本發(fā)明的抗體和至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑 的藥物組合物。
[0082] 本發(fā)明的其他實(shí)施方案是用于治療需要治療的患者的方法，其特征在于向所述患 者施用治療有效量的本發(fā)明的抗體。
[0083] 這是第一次提供了具有IgG樣結(jié)構(gòu)和IgG樣分子量的針對(duì)三個(gè)或四個(gè)抗原的多特 異性抗體。
[0084] 根據(jù)本發(fā)明，可以通過僅在兩條全長抗體臂的一對(duì)重鏈和輕鏈（HC/LC)中替換某 些結(jié)構(gòu)域（例如替換/交換VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域，或替換/交換CHl結(jié)構(gòu)域和CL結(jié)構(gòu)域； 或替換/交換VH和CHl結(jié)構(gòu)域以及VH和VL結(jié)構(gòu)域）來提高想要的多特異性抗體相比于 不想要的副產(chǎn)物的比例。如此，可以減少產(chǎn)生不想要的功能異常副產(chǎn)物的輕鏈與錯(cuò)誤重鏈 的不想要的錯(cuò)配（VH1與VH2和/或VH2與VH1的錯(cuò)配）（參見圖3)。
[0085] 附圖描沭
[0086] 圖1 :特異性結(jié)合第一抗原1的無CH4結(jié)構(gòu)域的全長抗體的圖示結(jié)構(gòu)，具有包含典 型順序的可變域和恒定域的兩對(duì)重鏈和輕鏈。
[0087]圖2a_d :本發(fā)明不同的三特異性或四特異性抗體的圖示結(jié)構(gòu)，所述抗體的特征在 于替換全長抗體輕鏈/重鏈中的VL/VH結(jié)構(gòu)域和/或CL/CH1結(jié)構(gòu)域，以防止輕鏈和重鏈錯(cuò) 配（CH3結(jié)構(gòu)域沒有或有額外的突起進(jìn)入孔的修飾）
[0088] 圖2a :三特異性抗體，其包含
[0089] a)特異性結(jié)合第一抗原和第二抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈（例如具有多樣化 的VH1和VL1);和
[0090] b)特異性結(jié)合第三抗原的全長抗體的修飾輕鏈和修飾重鏈（具有VH2和VL2)，其 中恒定域CL和CHl被彼此替換。
[0091] 圖2b :三特異性抗體，其包含
[0092] a)特異性結(jié)合第一抗原和第二抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈（例如具有多樣化 的VH1和VL1);和
[0093] b)特異性結(jié)合第三抗原的全長抗體的修飾輕鏈和修飾重鏈（具有VH2和VL2)，其 中可變域VL和VH被彼此替換并且恒定域CL和CHl被彼此替換；
[0094] 在兩條重鏈中具有示例性CH3修飾（"突起進(jìn)入孔"）
[0095] 圖2c :三特異性抗體，其包含
[0096] a)特異性結(jié)合第一抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈（具有VH1和VL1)和；
[0097] b)特異性結(jié)合第二抗原和第三抗原的全長抗體的修飾輕鏈和修飾重鏈（例如具 有多樣化的VH2和VL2)，其中可變域VL和VH被彼此替換；
[0098] 在兩條重鏈中具有示例性CH3修飾（"突起進(jìn)入孔"）
[0099] 圖2d :四特異性抗體，其包含
[0100] a)特異性結(jié)合第一抗原和第二抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈（例如具有多樣化 的VH1和VL1)和；和
[0101] b)特異性結(jié)合第三抗原和第四抗原的全長抗體的修飾輕鏈和修飾重鏈（例如具 有多樣化的VH2和VL2)，其中可變域VL和VH被彼此替換，和/或其中恒定域CL和CHl被 彼此替換。
[0102] 圖3 :A:二元親和力crossmab原理的圖示概述。交換技術(shù)用于重鏈、輕鏈組合，其 識(shí)別一條Fab臂上的一個(gè)抗原。
[0103] B:交換技術(shù)用于重鏈、輕鏈組合，其識(shí)別一條Fab臂上的兩個(gè)抗原。包括二硫化物 穩(wěn)定的突起進(jìn)入孔技術(shù)（重鏈I :S354C、T366W ;重鏈2:T366S、L368A、Y407V、Y349C)可以 用于任一種組合。
[0104] 圖4 :由于輕鏈和重鏈錯(cuò)配（產(chǎn)生錯(cuò)配的VHl與VH2和/或VH2與VH1)產(chǎn)生的不 想要的功能異常副產(chǎn)物的圖示結(jié)構(gòu)。
[0105] 圖5 :A:用于克隆重鏈構(gòu)建體的真核表達(dá)載體的圖不。
[0106] B:用于克隆輕鏈構(gòu)建體的真核載體的圖示。
[0107] 圖6 :A:VEGF-Her2-DAF測試表達(dá)的分析性HPLC的結(jié)果。蛋白A免疫沉淀材料的 (A、C、E)生物學(xué)重復(fù)1和（B、D、F)生物學(xué)重復(fù)2(K:H=轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的突起進(jìn)入孔比例）。
[0108] B: VEGF-Her2-DAF表達(dá)的SDS-PAGE。兩份相等的樣品代表蛋白A免疫沉淀材料的 技術(shù)重復(fù)的分析（NR，非還原條件；Red，還原條件）
[0109] C:分析性HPLC中與洗脫時(shí)間和大小相關(guān)的標(biāo)記蛋白。
[0110] 圖7 :A:VEGF-Her2-DAF-xAng2測試表達(dá)的分析性HPLC的結(jié)果。蛋白A免疫沉淀 材料的（A、C、E)生物學(xué)重復(fù)1和（B、D、F)生物學(xué)重復(fù)2(K:H =轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的突起進(jìn)入孔比 例）。
[0111] B: VEGF-Her2-DAF-xAng2表達(dá)的SDS-PAGE。兩份相等的樣品代表蛋白A免疫沉淀 材料的技術(shù)重復(fù)的分析（NR，非還原條件；Red，還原條件）。
[0112] 圖 8 :A:VEGF-Her2-DAF-xHerl-Her3DAF 測試表達(dá)的分析性 HPLC 的結(jié)果。（A, B)生 物學(xué)重復(fù)1和2。
[0113] B: VEGF-Her2-DAF-xHerl-Her3DAF 表達(dá)的 SDS-PAGE。（A, B)是在 A 中呈現(xiàn)的分析 性HPLC的重復(fù)分析（NR，非還原條件；Red,還原條件）。
[0114] 圖 9 :KiH Herl-Her3DAF-xHer2 表達(dá)的 SDS-PAGE(NR，非還原條件；Red，還原條 件）。
[0115] 圖10 :利用三特異性抗體KiH Herl-Her3DAF-xHer2的增殖測定。（A)A431與 30 ii g/mL三特異性抗體或?qū)φ誌gG抗體溫育。加入抗體5天后，進(jìn)行ATP釋放測定（Cell Titer Glow, Promega)。（B) A431與30 iig/mL所示抗體溫育。加入抗體5天后，進(jìn)行ATP釋 放測定（Cell Titer Glow, Promega)。
[0116] 圖 11 :利用三特異性抗體 KiH Herl-Her3DAF-xHer2 的增殖測定。MDA-MB-175VII 細(xì)胞與三特異性抗體KiH Herl-Her3DAF-XHer2或?qū)φ誌gG抗體的稀釋系列溫育。加入抗 體 5 天后，進(jìn)行 ATP 釋放測定（Cell Titer Glow, Promega)。
[0117] 圖 12 :KiH Herl-Her3DAF-xHer2 或各親本抗體的結(jié)合動(dòng)力學(xué)。（A、B、C) Ist 和 2nd注射表示ErbB受體胞外結(jié)構(gòu)域添加的順序。
[0118] 圖13 :在A431表皮樣癌細(xì)胞中三特異性Herl-Her3DAF-xHer2抗體對(duì)ADCC的誘 導(dǎo)。
[0119] 單個(gè)格子的像寬是170. 83 iim
[0120] 上列對(duì)應(yīng)于CMFDA標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞（通常在綠色通道中顯示）
[0121] 下列對(duì)應(yīng)于PKH26標(biāo)記的天然殺傷細(xì)胞（通常在紅色通道中顯示）
[0122] 發(fā)明詳沭
[0123] 本發(fā)明涉及多特異性抗體，其包含：
[0124] A) a)特異性結(jié)合第一抗原和第二抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈；和
[0125] b)特異性結(jié)合第三抗原的全長抗體的修飾輕鏈和修飾重鏈，其中可變域VL和VH 被彼此替換，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替換；
[0126] 或
[0127] B) a)特異性結(jié)合第一抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈；和
[0128] b)特異性結(jié)合第二抗原和第三抗原的全長抗體的修飾輕鏈和修飾重鏈，其中可變 域VL和VH被彼此替換，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替換；
[0129] 或
[0130] C) a)特異性結(jié)合第一抗原和第二抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈；和
[0131] b)特異性結(jié)合第三抗原和第四抗原的全長抗體的修飾輕鏈和修飾重鏈，其中可變 域VL和VH被彼此替換，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替換。
[0132] 在一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體的特征在于所述抗體是三特異性的并包含
[0133] A) a)特異性結(jié)合第一抗原和第二抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈；和
[0134] b)特異性結(jié)合第三抗原的全長抗體的修飾輕鏈和修飾重鏈，其中可變域VL和VH 被彼此替換，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替換；
[0135] 或
[0136] B) a)特異性結(jié)合第一抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈；和
[0137] b)特異性結(jié)合第二抗原和第三抗原的全長抗體的修飾輕鏈和修飾重鏈，其中可變 域VL和VH被彼此替換，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替換。
[0138] 在一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體的特征在于所述抗體是四特異性的并包含
[0139] a)特異性結(jié)合第一抗原和第二抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈；和
[0140] b)特異性結(jié)合第三抗原和第四抗原的全長抗體的修飾輕鏈和修飾重鏈，其中可變 域VL和VH被彼此替換，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替換。
[0141] 在一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體的特征在于在b)的修飾輕鏈和修飾重鏈中，可 變域VL和VH被彼此替換；并且其中恒定域CL和CHl被彼此替換。
[0142] 在一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體的特征在于在b)的修飾輕鏈和修飾重鏈中， (僅）可變域VL和VH被彼此替換。
[0143] 在一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體的特征在于在b)的修飾輕鏈和修飾重鏈中， (僅）恒定域CL和CHl被彼此替換。
[0144] 根據(jù)本發(fā)明，可以通過僅在一對(duì)重鏈和輕鏈（HC/LC)中替換某些結(jié)構(gòu)域提高想要 的多特異性抗體相比于不想要的副產(chǎn)物（由于輕鏈與特異性結(jié)合其他抗原的抗體的"錯(cuò) 誤"重鏈的錯(cuò)配，參見圖3)的比例。盡管兩個(gè)全長HC/LC對(duì)的第一對(duì)保持基本上不被改變， 但是兩個(gè)全長HC/LC對(duì)〇的第二對(duì)被以下替換修飾：
[0145] -龍鏈:可變輕鏈結(jié)構(gòu)域VL被特異性結(jié)合第二抗原的所述抗體的可變重鏈結(jié)構(gòu)域 VH替換，和/或恒定輕鏈可變域CL被特異性結(jié)合第二抗原的所述抗體的恒定重鏈結(jié)構(gòu)域 CHl替換，和
[0146] -差鏈:可變重鏈結(jié)構(gòu)域VH被特異性結(jié)合第二抗原的所述抗體的可變輕鏈結(jié)構(gòu)域 VL替換，和/或恒定重鏈可變域CHl被特異性結(jié)合第二抗原的所述抗體的恒定輕鏈結(jié)構(gòu)域 CL替換。
[0147] 因此，本發(fā)明所得的多特異性抗體是人工抗體，其包含
[0148] A)
[0149] a)特異性結(jié)合第一和第二抗原的抗體的輕鏈和重鏈；和
[0150] b)特異性結(jié)合第三抗原的抗體的輕鏈和重鏈，
[0151] 其中（特異性結(jié)合第三抗原的抗體的）所述輕鏈含有可變域VH，而不是VL
[0152] 和/或恒定域CHl，而不是CL
[0153] 其中（特異性結(jié)合第三抗原的抗體的）所述重鏈含有可變域VL，而不是VH
[0154] 和/或恒定域CL，而不是CHl ;
[0155] 或
[0156] B)
[0157] a)特異性結(jié)合第一抗原的抗體的輕鏈和重鏈；和
[0158] b)特異性結(jié)合第二和第三抗原的抗體的輕鏈和重鏈，
[0159] 其中（特異性結(jié)合第二和第三抗原的抗體的）所述輕鏈含有可變域VH，而不是VL
[0160] 和/或恒定域CHl，而不是CL
[0161] 其中（特異性結(jié)合第二和第三抗原的抗體的）所述重鏈含有可變域VL，而不是VH
[0162] 和/或恒定域CL，而不是CHl ;
[0163] 或
[0164] C)
[0165] a)特異性結(jié)合第一和第二抗原的抗體的輕鏈和重鏈；和
[0166] b)特異性結(jié)合第三和第四抗原的抗體的輕鏈和重鏈，
[0167] 其中（特異性結(jié)合第三和第四抗原的抗體的）所述輕鏈含有可變域VH，而不是VL
[0168] 和/或恒定域CHl，而不是CL
[0169] 其中（特異性結(jié)合第三和第四抗原的抗體的）所述重鏈含有可變域VL，而不是VH
[0170] 和/或恒定域CL，而不是CH1。
[0171] 在本發(fā)明的額外方面，可以通過修飾特異性結(jié)合三特異性或四特異性抗體內(nèi)的第 一和第二抗原的所述全長抗體的CH3結(jié)構(gòu)域來進(jìn)一步提高想要的二價(jià)多特異性抗體相比 于不想要的副產(chǎn)物的該提高比例。
[0172] 因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，可以通過"突起進(jìn)入孔"技術(shù)改變本發(fā)明 的所述三特異性或四特異性抗體的CH3結(jié)構(gòu)域（在重鏈和修飾的重鏈中），所述技術(shù)以若 干實(shí)例詳細(xì)描述于例如恥 96/027011，把(^￥37，18.，等，？1'(^6111￡叩.9(1996)617-621;和 Merchant, A. M.，等，Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681 中。在該方法中，改變兩個(gè) CH3 結(jié)構(gòu)域的相互作用表面，以增加含有這兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的兩條重鏈的異源二聚體化。（兩條 重鏈的）兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)可以是"突起"，而另一個(gè)是"孔"。二硫鍵的引入進(jìn)一步 穩(wěn)定了異源二聚體（Merchant, A.M?，等，Nature Biotech. 16(1998)677-681 ;Atwell，S.， 等，J. Mol. Biol. 270 (1997) 26 - 35)并增加了產(chǎn)量。
[0173] 因此，在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述三特異性或四特異性抗體進(jìn)一步的特征在于
[0174] a)的全長抗體的重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域與b)的全長抗體的修飾重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域各 自在這樣的界面處相遇，所述界面在抗體CH3結(jié)構(gòu)域之間包含原始界面；
[0175] 其中改變所述界面，以促進(jìn)三特異性抗體或四特異性抗體的形成，其中所述改變 的特征在于：
[0176] i)改變一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域，
[0177] 從而在三特異性抗體或四特異性抗體內(nèi)遇到另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的原始界 面的一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的原始界面內(nèi)，
[0178] 氨基酸殘基被具有更大側(cè)鏈體積的氨基酸殘基替換，由此在定位在另一條重鏈的 CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)的腔中的一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)產(chǎn)生隆凸，
[0179] 和
[0180] ii)改變另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域，
[0181] 從而在三特異性抗體或四特異性抗體內(nèi)遇到第一個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的原始界面的第 二個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的原始界面內(nèi)，
[0182] 氨基酸殘基被具有更小側(cè)鏈體積的氨基酸殘基替換，由此在第二個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的 界面內(nèi)產(chǎn)生腔，在所述第二個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)定位了第一個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)的隆 凸。
[0183] 優(yōu)選地，具有更大側(cè)鏈體積的所述氨基酸殘基選自精氨酸（R)、苯丙氨酸（F)、酪 氨酸（Y)、色氨酸（W)。
[0184] 優(yōu)選地，具有更小側(cè)鏈體積的所述氨基酸殘基選自丙氨酸（A)、絲氨酸（S)、蘇氨 酸（T)、纈氨酸（V)。
[0185] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，通過引入半胱氨酸（C)作為在每個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)位置 中的氨基酸來進(jìn)一步改變兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域，從而能夠在兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域之間形成二硫鍵。
[0186] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述三特異性或四特異性抗體在"突起鏈"的CH3結(jié)構(gòu) 域中包含T366W突變，并且在"孔鏈"的CH3結(jié)構(gòu)域中包含T366S、L368A、Y407V突變。還可 以例如通過將Y349C突變引入到"突起鏈"的CH3結(jié)構(gòu)域中并且將E356C突變或S354C突 變引入到"孔鏈"的CH3結(jié)構(gòu)域中來使用CH3結(jié)構(gòu)域之間的額外鏈間二硫鍵（Merchant, A. M，等，Nature Biotech. 16(1998)677-681)。因此，在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述三特異性 或四特異性抗體在兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)中包含Y349C、T366W突變，而在兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu) 域中的另一個(gè)中包含E356C、T366S、L368A、Y407V突變，或者所述三特異性或四特異性抗體 在兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)中包含Y349C、T366W突變，而在兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域中的另一個(gè)中 包含S354C、T366S、L368A、Y407V突變（一個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域中的額外Y349C突變和另一個(gè)CH3 結(jié)構(gòu)域中的額外E356C或S354C突變形成了鏈間二硫鍵）（總是根據(jù)Kabat的EU索引進(jìn)行 編號(hào)）。還可以備選地或額外地使用如EP 1 870 459 Al描述的其他突起進(jìn)入孔技術(shù)。所 述三特異性或四特異性抗體的優(yōu)選實(shí)例是在"突起鏈"的CH3結(jié)構(gòu)域中的R409D ;K370E突 變和在"孔鏈"的CH3結(jié)構(gòu)域中的D399K ;E357K突變（總是根據(jù)Kabat的EU索引進(jìn)行編 號(hào)）。
[0187] 在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述三特異性或四特異性抗體在"突起鏈"的CH3結(jié)構(gòu) 域中包含T366W突變，而在"孔鏈"的CH3結(jié)構(gòu)域中包含T366S、L368A、Y407V突變，并且額 外地，在"突起鏈"的CH3結(jié)構(gòu)域中包含R409D ;K370E突變，而在"孔鏈"的CH3結(jié)構(gòu)域中包 含 D399K ;E357K 突變。
[0188] 在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述三特異性或四特異性抗體在兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域中 的一個(gè)中包含Y349C、T366W突變，而在兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域中的另一個(gè)中包含S354C、T366S、 L368A、Y407V突變，或者所述三特異性或四特異性抗體在兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)中包含 Y349C、T366W突變，而在兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域中的另一個(gè)中包含S354C、T366S、L368A、Y407V突 變，并且在"突起鏈"的CH3結(jié)構(gòu)域中額外地包含R409D ;K370E突變，而在"孔鏈"的CH3結(jié) 構(gòu)域中包含D399K ;E357K突變。
[0189] 在一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體的特征在于
[0190] 在A)的情況下，第一抗原是人HER1，第二抗原是人HER3,并且第三抗原是HER2 ; 或
[0191] 在B)的情況下，第一抗原是人HER2,第二抗原是人HER1，并且第三抗原是HER3。
[0192] 在一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體的特征在于包含SEQ ID NOs: 4、9、13和18的氨 基酸序列。
[0193] 在一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體是二價(jià)三特異性抗體并包含
[0194] a)特異性結(jié)合人HERl和人HER3的全長抗體的輕鏈和重鏈；和
[0195] b)特異性結(jié)合人HER2的全長抗體的修飾輕鏈和修飾重鏈，其中可變域VL和VH被 彼此替換，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替換。
[0196] 在一個(gè)實(shí)施方案中，特異性結(jié)合人HERl、人HER3和人HER2的此類二價(jià)三特異性抗 體包含SEQ ID NOs: 4、9、13和18的氨基酸序列。
[0197] 在一個(gè)實(shí)施方案中，特異性結(jié)合人HERl、人HER3和人HER2的此類二價(jià)三特異性抗 體包含SEQ ID N0s:4、9、13和18的氨基酸序列并且所述抗體的特征在于具有以下性質(zhì)：
[0198] i)抗體以通過表面等離振子共振在37°C測定的KD I. 7E_08[M]的親和力結(jié)合人 JERl (胞外結(jié)構(gòu)域E⑶）；和
[0199] ii)抗體以通過表面等離振子共振在37°C測定的KD 4. 4E_09[M]的親和力結(jié)合人 ffiR2(胞外結(jié)構(gòu)域E⑶）；和
[0200] iii)抗體以通過表面等離振子共振在37°C測定的KD 1.8E-09[M]的親和力結(jié)合 人HER2(胞外結(jié)構(gòu)域E⑶）；和
[0201] iv)抗體可以同時(shí)結(jié)合人Herl和人Her2或同時(shí)結(jié)合人Her3和人Her2 ;
[0202] 在一個(gè)實(shí)施方案中，特異性結(jié)合人HERl、人HER3和人HER2的此類二價(jià)三特異性抗 體包含SEQ ID N0s:4、9、13和18的氨基酸序列并且所述抗體的特征在于以下性質(zhì)中的一 種或多種：
[0203] i)濃度為50 ii g/mL的抗體抑制MDA-MB-175乳腺癌細(xì)胞的生長超過85% ;
[0204] ii)濃度為30 ii g/mL的抗體抑制A431表皮樣癌細(xì)胞（其表達(dá)HERl)的生長超過 50% ;和
[0205] iii)抗體在A431表皮樣癌細(xì)胞中誘導(dǎo)ADCC并且由此在2. 5小時(shí)內(nèi)清除了大概 100 %的癌細(xì)胞；
[0206] 在一個(gè)實(shí)施方案中，特異性結(jié)合人HERl、人HER3和人HER2的此類二價(jià)三特異性抗 體包含SEQ ID NOs: 4、9、13和18的氨基酸序列并且其中抗體在Asn297(根據(jù)Kabat進(jìn)行 編號(hào)）處被糖鏈糖基化，由此所述糖鏈內(nèi)巖藻糖的量是65%或更低（在另一實(shí)施方案中，所 述糖鏈內(nèi)巖藻糖的量在5% -65%之間，在一個(gè)實(shí)施方案中在20% -40%之間）。
[0207] 在一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體的特征在于在A)的情況下，第一抗原是人 HERl，第二抗原是人HER3并且第三抗原是人cMET ;或在B)的情況下，第一抗原是人cMET， 第二抗原是人HERl并且第三抗原是人HER3。
[0208] 在一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體的特征在于包含SEQ ID NOs:4、10、13和19的 氨基酸序列。
[0209] 術(shù)語"全長抗體"表示由兩條抗體重鏈和兩條抗體輕鏈組成的抗體（參見圖1)。 全長抗體的重鏈?zhǔn)沁@樣的多肽，其在N-端到C-端方向上由抗體重鏈可變域（VH)、抗體恒定 重鏈結(jié)構(gòu)域I (CHl)、抗體鉸鏈區(qū)（HR)、抗體重鏈恒定域2 (CH2)和抗體重鏈恒定域3 (CH3) 組成，縮寫為VH-CH1-HR-CH2-CH3 ;并且在IgE亞類的抗體的情況下，任選地還包括抗體重 鏈恒定域4 (CH4)。優(yōu)選地，全長抗體的重鏈?zhǔn)窃贜-端到C-端方向上由VH、CH1、HR、CH2和 CH3組成的多肽。全長抗體的輕鏈?zhǔn)窃贜-端到C-端方向上由抗體輕鏈可變域（VL)和抗體 輕鏈恒定域（CL)組成的多肽，縮寫為VL-CL。所述抗體輕鏈恒定域（CL)可以是K (kappa) 或入（lambda)。全長抗體鏈通過在CL結(jié)構(gòu)域和CHl結(jié)構(gòu)域之間（即輕鏈和重鏈之間）的 多肽間二硫鍵和全長抗體重鏈的鉸鏈區(qū)之間的多肽間二硫鍵連接在一起。典型的全長抗體 的實(shí)例是天然抗體像IgG (例如，IgGl和IgG2)、IgM、IgA、IgD和IgE)。本發(fā)明的全長抗體 可以來自單一物種，例如人，或者它們可以是嵌合的或人源化的抗體。
[0210] 本發(fā)明的全長抗體包含各自由VH和VL對(duì)形成的兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，這兩個(gè)抗原 結(jié)合位點(diǎn)均特異性結(jié)合a)任一個(gè)單個(gè)抗原或b)結(jié)合兩個(gè)不同抗原（參見下文）。所述全 長抗體的重鏈或輕鏈的C-端意指在所述重鏈或輕鏈的C-端的最后一個(gè)氨基酸。
[0211] 例如可以通過使全長抗體的可變重鏈和輕鏈結(jié)構(gòu)域VH和VL多樣化，從而引 入二元特異性來獲得特異性結(jié)合兩個(gè)不同抗原（例如第一抗原和第二抗原，或第三和 第四抗原）的全長抗體（或全長抗體的輕鏈和重鏈），技術(shù)描述于WO 2008/027236 ;W0 2010/108127 和 Bostrom, J.，等，Science323(2009) 1610-1614(其全部通過參考并入本 文）中。結(jié)合例如第一抗原和第二抗原的具有二元特異性的所得VH和VL現(xiàn)在可以用于 本發(fā)明多特異性的一條臂中，而另一條臂對(duì)第三抗原（或第三和第四抗原）特異。多樣化 的VL和VH可以同時(shí)或互斥地結(jié)合第一個(gè)表位和第二個(gè)表位，并可以選自例如VEGF/HER2、 VEGF-A/HER2、HER2/DR5、VEGF-A/PDGF、HERl/HER2、CD20/BR3、VEGF-A/VEGF-C、VEGF-C/ VEGF-D、TNFa /TGF-P、TNFa /IL-2、TNFa /IL-3、TNFa /IL-4、TNFa /IL-5、TNFa /IL6、 TNFa /IL8、TNFa /IL-9、TNFa /IL-10、TNFa /IL-Il、TNFa /IL-12、TNFa /IL-13、TNFa / IL-14、TNF a /IL-15、TNF a /IL-16、TNF a /IL-17、TNF a /IL-18、TNF a /IL-19、TNF a / IL-20、TNF a /IFN a、TNF a /CD4、VEGF/IL-8、VEGF/MET、VEGFR/MET 受體、HER2/Fc、HER2/ HER3 ;HER1/HER2、HER1/HER3、EGFR/HER4、TNFa /1L-3、TNFa /IL-4、IL-13/CD40L、IL4/ CD40L、TNF a /ICAM-1、TNFR1AL-IR、TNFR1/IL-6R 和 TNFR1/IL-18R。
[0212] 如本文所用的術(shù)語"結(jié)合位點(diǎn)"或"抗原結(jié)合位點(diǎn)"表示配體（例如抗原或其抗原 片段）實(shí)際結(jié)合的并且來自抗體的抗體分子的區(qū)域（或在二元特異性全長抗體的情況下， 是兩個(gè)配體，例如第一和第二抗原結(jié)合）?？乖Y(jié)合位點(diǎn)包括VH/VL的抗體重鏈可變域（VH) 對(duì)。
[0213] 特異性結(jié)合想要的抗原的抗原結(jié)合位點(diǎn)可以來自a)針對(duì)抗原的己知抗體或b) 通過例如使用抗原蛋白質(zhì)或核酸或其片段的從頭免疫方法或通過噬菌體展示獲得的新抗 體或抗體片段。如果想要結(jié)合例如第一和第二抗原的二元特異性抗體，那么結(jié)合所述第 一抗原的所得抗體的 VH 和 VL 必須如 WO 2008/027236 ;W0 2010/108127 和 Bostrom, J.， 等，Science 323 (2009) 1610-1614 (其全部通過參考并入本文）所述被修飾/多樣化。
[0214] 本發(fā)明的抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)含有六個(gè)互補(bǔ)性決定區(qū)（CDRs)，其在不同程度上有 助于結(jié)合位點(diǎn)對(duì)于抗原的親和力。存在三個(gè)重鏈可變域⑶Rs(CDRHl、⑶RH2和⑶RH3)和三 個(gè)輕鏈可變域⑶Rs (⑶RLl XDRL2和⑶RL3)。通過與氨基酸序列的匯編數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較來 確定CDR和構(gòu)架區(qū)（FRs)的程度，在所述數(shù)據(jù)庫中已根據(jù)序列之間的可變性而定義了那些 區(qū)域。本發(fā)明范圍內(nèi)還包括的是包含較少⑶Rs的功能抗原結(jié)合位點(diǎn)（即，其中通過三個(gè)、 四個(gè)或五個(gè)CDRs確定結(jié)合特異性）。
[0215] 抗體特異性指抗體對(duì)抗原特定表位的選擇性識(shí)別。天然抗體例如是單一特異性 的。雙特異性抗體是具有兩種不同抗原結(jié)合特異性的抗體。因此三特異性抗體是具有三種 不同抗原結(jié)合特異性的本發(fā)明抗體。本發(fā)明的四特異性抗體是具有四種不同抗原結(jié)合特異 性的抗體。
[0216] 其中抗體具有多于一種特異性時(shí)，所識(shí)別的表位可以結(jié)合單個(gè)抗原或結(jié)合多于一 個(gè)抗原。
[0217] 如本文所用的術(shù)語"單特異性"抗體表示具有一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的抗體，每個(gè)結(jié) 合位點(diǎn)結(jié)合相同抗原的相同表位。
[0218] 如在本申請(qǐng)中所用的術(shù)語"價(jià)"表示在抗體分子中存在的結(jié)合位點(diǎn)的特定數(shù)量。例 如天然抗體或本發(fā)明的全長抗體具有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)并且是二價(jià)的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本 發(fā)明的多特異性抗體是二價(jià)的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多特異性抗體是二價(jià)三特異 性的或二價(jià)四特異性的。
[0219] 本發(fā)明的全長抗體包括一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白種類的免疫球蛋白恒定區(qū)。免疫球 蛋白種類包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE同種型，并且在IgG和IgA的情形中，包括它們的 亞型。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的全長抗體具有IgG型抗體的恒定結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。
[0220] 如在本文使用，術(shù)語〃單克隆抗體〃或〃單克隆抗體組合物〃指單一氨基酸組成 的抗體分子制品。
[0221] 術(shù)語〃嵌合抗體〃指一種抗體，其包括來自一種來源或物種的可變區(qū)，即結(jié)合區(qū)， 以及源自不同來源或物種的恒定區(qū)的至少一部分，所述抗體通常通過重組DNA技術(shù)進(jìn)行制 備。優(yōu)選包括鼠可變區(qū)和人恒定區(qū)的嵌合抗體。本發(fā)明涵蓋的"嵌合抗體"的其它優(yōu)選形 式是那些，其中恒定區(qū)己經(jīng)相比初始抗體的恒定區(qū)而被修飾或改變以產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的特 性，特別是關(guān)于Clq結(jié)合和/或Fc受體（FcR)結(jié)合。也將這種嵌合抗體稱作"類別轉(zhuǎn)換抗 體"。嵌合抗體是被表達(dá)的免疫球蛋白基因的產(chǎn)物，該基因包括編碼免疫球蛋白可變區(qū)的 DNA區(qū)段和編碼免疫球蛋白恒定區(qū)的DNA區(qū)段。生產(chǎn)嵌合抗體的方法包括在本領(lǐng)域公知的 常規(guī)重組DNA和基因轉(zhuǎn)染技術(shù)。參見，例如，Morrison, S.L.,等人，Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984)6851-6855 和 US 5, 202, 238 和 US5, 204, 244。
[0222] 術(shù)語〃人源化抗體〃指這樣的抗體，其中的構(gòu)架或〃互補(bǔ)性決定區(qū)〃 (CDR)己經(jīng)被 修飾為包括與親本免疫球蛋白相比特異性不同的免疫球蛋白的CDR。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案 中,將鼠⑶R移植到人抗體的構(gòu)架區(qū)以制備〃人源化抗體"。參見例如，Riechmann, L.，等 人，Nature 332 (1988) 323-327;和 Neuberger, M.S.,等人，Nature 314 (1985) 268-270。本 發(fā)明涵蓋的"人源化抗體"的其它形式是那些，其中恒定區(qū)己經(jīng)相比于初始抗體的恒定區(qū) 而另外被修飾或改變以產(chǎn)生按照本發(fā)明的特性，特別是關(guān)于Clq結(jié)合和/或Fc受體（FcR) 結(jié)合。
[0223] 如在本文使用，術(shù)語"人抗體"旨在包括具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變 區(qū)和恒定區(qū)的抗體。人抗體是現(xiàn)有技術(shù)中公知的（van Dijk, M.A.,和van de Winkel, J. G.，Curr. Opin. Chem. Biol. 5(2001)368-374)。人抗體還可以在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（例如小鼠）中 產(chǎn)生，所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在免疫時(shí)能夠在缺乏內(nèi)源免疫球蛋白生成的條件下產(chǎn)生人抗體的全 部所有組成成分或選定部分（selection)。在此種種系突變小鼠中轉(zhuǎn)移人種系免疫球蛋白 基因陣列將導(dǎo)致在抗原攻擊時(shí)產(chǎn)生人抗體（參見例如Jakobovits, A.，等人，Proc. Natl. Acad.Sci. USA 90(1993)2551-2555 ; Jakobovits, A.，等人，Nature 362(1993)255-258; Bruggemann，M.，等人，Year Immunol.7(1993)33-40)。人抗體還可以在噬菌體展示文 庫中產(chǎn)生（Hoogenboom, H. R?，和 Winter, G.，J.，Mol. Biol. 227 (1992) 381-388 ;Marks，J. D.，等人，J. Mol. Biol. 222(1991)581-597)。Cole 等人，和 Boerner 等人的技術(shù)也可以 用于制備人單克隆抗體（Cole 等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, (1985)第 77 頁）和 Boerner, P.，等人，J. Immunol. 147 (1991) 86-95)。如己經(jīng)對(duì) 根據(jù)本發(fā)明的嵌合和人源化抗體所提及的，如在本文中使用的術(shù)語"人抗體"還包括這樣 的抗體，其在恒定區(qū)內(nèi)被修飾以產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的特性，特別是關(guān)于Clq結(jié)合和/或FcR結(jié) 合，例如通過〃類別轉(zhuǎn)換〃即改變或突變Fc部分（例如自IgGl到IgG4和/或IgGl/IgG4 突變）。
[0224] 如在本文使用，術(shù)語〃重組人抗體〃旨在包括通過重組方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分 離的所有人抗體，諸如分離自宿主細(xì)胞，諸如NSO或CHO細(xì)胞的抗體或分離自針對(duì)人免疫球 蛋白基因是轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物（例如小鼠）的抗體，或利用轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中的重組表達(dá)載體 表達(dá)的抗體。這種重組人抗體具有處于重排形式的可變區(qū)和恒定區(qū)。根據(jù)本發(fā)明的重組人 抗體己經(jīng)經(jīng)歷了體內(nèi)體細(xì)胞高變。因此，重組抗體的VH和VL區(qū)域的氨基酸序列是盡管源 自并涉及人種系VH和VL序列，但在體內(nèi)可能不天然存在于人抗體種系所有組成成分中的 序列。
[0225] 如本文使用，〃可變域"（輕鏈（VL)可變域，重鏈（VH)的可變域）意指直接參與 抗體與抗原結(jié)合的每對(duì)輕鏈和重鏈對(duì)?？勺?nèi)溯p鏈和重鏈的結(jié)構(gòu)域具有相同的一般結(jié)構(gòu)且 每個(gè)結(jié)構(gòu)域包括4個(gè)構(gòu)架（FR)區(qū)，所述構(gòu)架區(qū)的序列是普遍保守的，其通過3個(gè)〃高變區(qū) 〃（或互補(bǔ)性決定區(qū)，⑶Rs)相連接。構(gòu)架區(qū)采用￠-折疊構(gòu)象且⑶R可以形成連接￠-折 疊結(jié)構(gòu)的環(huán)。每條鏈中的CDR通過構(gòu)架區(qū)保持其三維結(jié)構(gòu)并與來自另一條鏈的CDR-起形 成抗原結(jié)合位點(diǎn)?？贵w重鏈和輕鏈CDR3區(qū)在根據(jù)本發(fā)明的抗體的結(jié)合特異性/親和力方 面發(fā)揮特別重要的作用并因此提供本發(fā)明的另一個(gè)目的。
[0226] 用于本文時(shí)，術(shù)語"高變區(qū)"或"抗體的抗原結(jié)合部分"指負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的抗體 的氨基酸殘基。高變區(qū)包括來自〃互補(bǔ)性決定區(qū)〃或〃⑶Rs〃的氨基酸殘基?！?gòu)架〃或 "FR"區(qū)是除本文中定義的高變區(qū)殘基之外的那些可變域區(qū)域。因此，抗體的輕鏈和重鏈 從N端到C端包括結(jié)構(gòu)域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。各條鏈上的CDR通過 此種構(gòu)架氨基酸分開。特別地，重鏈的⑶R3是最有助于抗原結(jié)合的區(qū)域。按照Kabat，E. A.,等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health,出版號(hào) 91_3242，Bethesda，MD(1991))的標(biāo)準(zhǔn) 定義確定⑶R和FR區(qū)域。
[0227] 如在本文使用，術(shù)語"結(jié)合"其特異結(jié)合7"特異性結(jié)合"指在體外測定法中， 優(yōu)選地在用純化的野生型抗原的等離振子共振測定（BIAcore，GE-HealthcareUppsala,瑞 典）中，抗體與抗原的表位的結(jié)合。結(jié)合的親和力由術(shù)語ka(來自抗體/抗原復(fù)合物的抗 體的締合的速率常數(shù)）、kD(解離常數(shù)）和Kd (kD/ka)定義。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合或特異 性結(jié)合表示l(T8m〇l/l或更低，優(yōu)選10_9M-10_13mol/l的結(jié)合親和力（KD)。
[0228] 因此，本發(fā)明的多特異性抗體優(yōu)選以l(T8m〇l/l或更低，優(yōu)選KT 9-l(T13m〇l/l的結(jié) 合親和力（Kd)特異性結(jié)合對(duì)其特異的每種抗原。
[0229] 術(shù)語〃表位〃包括能夠特異性結(jié)合抗體的任何多肽決定簇。在某些實(shí)施方案中， 表位決定簇包括分子的化學(xué)活性表面基團(tuán)，諸如氨基酸、糖側(cè)鏈、磷?；蚧酋；?，以及在 某些實(shí)施方案中，可以具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征，和/或特定的電荷特性。表位是被抗體結(jié) 合的抗原區(qū)域。
[0230] 在某些實(shí)施方案中，當(dāng)抗體在蛋白和/或大分子的復(fù)合體混合物中優(yōu)先識(shí)別其靶 抗原時(shí)，將該抗體稱為與抗原特異性結(jié)合。
[0231] 在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的多特異性抗體的特征在于所述全長抗體是人IgGl 亞類的或具有突變L234A和L235A的人IgGl亞類的。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的多特異 性抗體的特征在于所述全長抗體是人IgG2亞類的。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的多特異性 抗體的特征在于所述全長抗體是人IgG3亞類的。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的多特異性抗 體的特征在于所述全長抗體是人IgG4亞類的或具有額外突變S228P和L235E的人IgG4亞 類的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多特異性抗體的特征在于所述全長抗體是人IgGl亞類 的，具有額外突變S228P的人IgG4亞類的。
[0232] 現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的多特性抗體具有改善的特征，如生物或藥理學(xué)活性、藥物 動(dòng)力學(xué)性質(zhì)或毒性。它們可以用于例如治療疾病，如癌。
[0233] 如在本申請(qǐng)中使用，術(shù)語"恒定區(qū)"意指除了可變區(qū)之外的抗體的結(jié)構(gòu)域的總合。 恒定區(qū)不直接參與抗原的結(jié)合，但是顯示多種效應(yīng)子功能。取決于抗體重鏈的恒定區(qū)的氨 基酸序列，將抗體分為下述類別：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,并且這些中的一些可以被進(jìn)一 步分為亞類如IgGl、IgG2、IgG3和IgG4、IgAl和IgA2。對(duì)應(yīng)于不同種類的抗體的重鏈恒定 區(qū)分別被稱為a、S、e、Y和ii?？梢栽谒?種抗體種類中發(fā)現(xiàn)的輕鏈恒定區(qū)（CL)被 稱為 K (kappa)和入（lambda)。
[0234] 如本申請(qǐng)所使用，術(shù)語〃源自人來源的恒定區(qū)〃意指亞類IgGl、IgG2、IgG3 或IgG4的人抗體的恒定重鏈區(qū)和/或恒定輕鏈K或A區(qū)域。這樣的恒定區(qū)是現(xiàn) 有技術(shù)中公知的并且例如由Kabat，E. A.，描述（參見，例如Johnson, G.，和mi, T. T.，Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218 ;Kabat，E. A.，等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72(1975)2785-2788)。
[0235] 當(dāng)IgG4亞類的抗體顯示出減少的Fe受體（FcYRIIIa)結(jié)合時(shí)，其它IgG亞 類的抗體顯示出強(qiáng)烈的結(jié)合。然而，Pro238、Asp265、Asp270、Asn297(失去Fc糖類）、 Pr〇329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、ne253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434 和His435是這樣的殘基，其如果改變的話，還提供減少的Fe受體結(jié)合（Shields，R. L.， 等人，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604;Lund，J.，等人，F(xiàn)ASEB J.9(1995) 115-119; Morgan, A.，等人，Immunology 86 (1995) 319-324 ;EP 0307434)。
[0236] 在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗體與IgGl抗體相比具有減少的FcR結(jié)合。因 此，全長親本抗體涉及IgG4亞類的FcR結(jié)合或具有S228、L234、L235和/或D265中突變 的IgGl或IgG2亞類的FcR結(jié)合，和/或包含PVA236突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，在全長親 本抗體中的突變是S228P、L234A、L235A、L235E和/或PVA236。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在全 長親本抗體中的突變?cè)贗gG4中是S228P和L235E，并且在IgGl中是L234A和L235A。
[0237] 抗體的恒定區(qū)直接涉及ADCC (抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用）和 CDC(補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性）。補(bǔ)體激活（CDC)由補(bǔ)體因子Clq與大多數(shù)IgG抗 體亞類的恒定區(qū)結(jié)合而起始。Clq與抗體的結(jié)合由在所謂的結(jié)合位點(diǎn)的限定的蛋 白-蛋白相互作用所引起。這樣的恒定區(qū)結(jié)合位點(diǎn)是現(xiàn)有技術(shù)中已知的，并且例如 由 Lukas, T. J.，等人，J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560 ;Brunkhouse, R.和（]〇13四，]\ J.，Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917 ;Burton，D.R.，等人，Nature 288(1980)338-344; Thomason，J.E.，等人，Mol.Immunol.37 (2000) 995-1004; Idiocies, E.E.,等人，J. Immunol. 164(2000)4178-4184 ;Hearer，M.，等人，J.Virol. 75(2001) 12161-12168; Morgan, A.，等人，Immunology 86 (1995) 319-324;和 EP 0307434 所描述。此類恒定區(qū)結(jié) 合位點(diǎn)例如特征在于氨基酸L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329 (根據(jù) Kabat的EU索引編號(hào)）。
[0238] 當(dāng)指免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的殘基或位置時(shí)，一般使用"EU編號(hào)系統(tǒng)"或"EU索 引（根據(jù)Kabat)"（例如，在通過參考明確并入本文的Kabat, E.A?，等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版,Public Health Service, National Institutes of Health Publication No.91_3242，Bethesda,MD(1991)中報(bào)道了EU索引）。
[0239] 術(shù)語"抗體依賴性細(xì)胞毒作用（ADCC)"指在存在效應(yīng)細(xì)胞時(shí)，由根據(jù)本發(fā)明的抗 體裂解人靶細(xì)胞。ADCC優(yōu)選地通過用根據(jù)本發(fā)明的抗體在存在效應(yīng)細(xì)胞時(shí)處理表達(dá)抗原的 細(xì)胞的制備物進(jìn)行測量，所述效應(yīng)細(xì)胞如新鮮分離的PBMC或來自血沉棕黃層的純化的效 應(yīng)細(xì)胞，如單核細(xì)胞或天然殺傷（NK)細(xì)胞或永久生長的NK細(xì)胞系。
[0240] 術(shù)語〃補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性（⑶C) 〃指由補(bǔ)體因子Clq與大多數(shù)IgG抗體亞類的 Fc部分結(jié)合而起始的過程。Clq與抗體的結(jié)合由在所謂的結(jié)合位點(diǎn)的限定的蛋白_蛋白相 互作用所引起。這些Fc部分結(jié)合位點(diǎn)是現(xiàn)有技術(shù)已知的（見上）。這些Fc部分結(jié)合位點(diǎn) 例如特征在于氨基酸 L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331 和 P329 (根據(jù) Kabat 的EU索引編號(hào)）。亞類IgGl、IgG2和IgG3的抗體通常顯示包括Clq和C3結(jié)合的補(bǔ)體激 活，而IgG4不激活補(bǔ)體系統(tǒng)并且不結(jié)合Clq和/或C3。
[0241] 單克隆抗體的細(xì)胞介導(dǎo)的效應(yīng)子功能可以通過改造它們的寡糖組分而得以增強(qiáng)， 如在 Umana, P.，等人，Nature Biotechnol. 17(1999) 176-180 和 US 6, 602, 684 中所述。 IgGl型抗體是最常用的治療性抗體，其是在每個(gè)CH2結(jié)構(gòu)域的Asn297具有保守的N-連接 的糖基化位點(diǎn)的糖蛋白。與Asn297附著的兩個(gè)復(fù)合雙觸角寡糖嵌入在CH2結(jié)構(gòu)域之間， 形成了與多肽骨架的廣泛接觸，并且它們的存在對(duì)于抗體介導(dǎo)效應(yīng)子功能諸如抗體依賴 性細(xì)胞毒作用（ADCC)是必要的（Lifely，M.，R.，等人，Glycobiology 5(1995)813-822; Jefferis, R.，等人，Immunol. Rev. 163 (1998) 59-76 ;Wright, A.，和 Morrison, S. L.，Trends Biotechnol. 15(1997)26-32)。Umana，P.，等人 Nature Biotechnol. 17(1999) 176-180 和TO 99/54342顯示，￠(1, 4)-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶III (〃Gn TIII〃），一種催化平 分型（bisected)寡糖形成的糖基轉(zhuǎn)移酶，在中國倉鼠卵巢（CHO)細(xì)胞中的過量表 達(dá)，顯著增加了抗體的體外ADCC活性。在Asn297糖類的組成上的改變或其消除也 影響 Fe Y R 和 Clq 的結(jié)合（Umana, P.，等人，Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180 ; Davies，J.，等人，Biotechnol. Bioeng.74 (2001) 288-294 ;Mimura，Y.，等人，J. Biol. Chem. 276(2001)45539-45547 ;Radaev，S.，等人，J.Biol. Chem. 276(2001) 16478-16483 ; Shields，R.L.，等人，J. Biol. Chem.276 (2001) 6591-6604 ;Shields，R.L.，等人，丄 Biol.Chem. 277 (2002) 26733-26740 ;Simmons，L.C.，等人，J.Immunol. Methods 263(2002)133-147)〇
[0242] 增強(qiáng)單克隆抗體的細(xì)胞介導(dǎo)的效應(yīng)子功能的方法例如在WO 2005/018572、TO 2006/116260, WO 2006/114700, WO 2004/065540, WO 2005/011735, WO 2005/027966, WO 1997/028267、US 2006/0134709、US 2005/0054048、US 2005/0152894、WO 2003/035835 和 WO 2000/061739中進(jìn)行報(bào)道。
[0243] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，三特異性或四特異性抗體在Asn297被糖鏈 糖基化（如果其包含IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亞類的Fc部分，優(yōu)選地IgGl或IgG3亞類的 Fc部分），由此在所述糖鏈中的巖藻糖的量是65%或更低（根據(jù)Kabat的編號(hào)）。在另一個(gè) 實(shí)施方案中，巖藻糖在所述糖鏈中的量在5%和65 %之間，優(yōu)選在20%和40%之間。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，所述糖鏈中的巖藻糖的量在〇%之間。根據(jù)本發(fā)明的"Asn297"意為在Fc 區(qū)域的約位置297定位的氨基酸天冬酰胺?；诳贵w的微小序列變化，Asn297也可以定位 在位置297上游或下游的一些氨基酸上（通常不超過±3個(gè)氨基酸），即在位置294和300 之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的糖基化的抗體IgG亞類是人IgGl亞類的，具有突 變L234A和L235A的人IgGl亞類的，或IgG3亞類的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在所述糖鏈中 N-羥乙酰神經(jīng)氨酸（NGNA)的量是1 %或更低和/或N-端a -1，3-半乳糖的量是1 %或更 低。糖鏈優(yōu)選地顯示出與在CHO細(xì)胞中重組表達(dá)的抗體的Asn297連接的N-連接的聚糖的 特征。
[0244] 術(shù)語〃糖鏈顯示出與在CHO細(xì)胞中重組表達(dá)的抗體的Asn297連接的N-連接的聚 糖的特征"指在根據(jù)本發(fā)明的全長親本抗體的Asn297的糖鏈具有與在未修飾的CHO細(xì)胞 中表達(dá)的相同抗體,例如如在WO 2006/103100中報(bào)道的那些抗體相同的結(jié)構(gòu)和糖殘基序 列，除了巖藻糖殘基之外。
[0245] 如在本申請(qǐng)中使用，術(shù)語〃NGNA〃意指糖殘基N-羥乙酰神經(jīng)氨酸。
[0246] 人IgGl或IgG3在Asn297發(fā)生糖基化，如核心巖藻糖基化的雙觸角復(fù)合寡糖 糖基化，末端為多至兩個(gè)Gal殘基。IgGl或IgG3亞類的人恒定重鏈區(qū)由Kabat，E. A.， 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版。Public Health Service，National Institutes of Health 出版號(hào)? 91-3242, Bethesda, MD. (1991)，以及 由 Briiggemann, M.，等人，J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361 ;Love, T. W.，等人，Methods Enzymol. 178(1989)515-527中詳細(xì)報(bào)道。根據(jù)末端Gal殘基的量，將這些結(jié)構(gòu)稱為G0， Gl ( a -1，6-或 a -1，3_)或 G2 聚糖殘基（Raju, T. S.，Bioprocess Int. 1 (2003) 44-53)?？?體 Fc 部分的 CHO 型糖基化例如由 Routier, F. H.，Glycoconjugate J. 14 (1997) 201-207 描 述。在未進(jìn)行糖修飾的CHO宿主細(xì)胞中重組表達(dá)的抗體通常在Asn297進(jìn)行巖藻糖基化，量 為至少85%。全長親本抗體的修飾的寡糖可以是雜合的或復(fù)合的。優(yōu)選地，所述平分型、還 原/未巖藻糖基化的寡糖是雜合的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述平分型、還原/未巖藻糖基 化的寡糖是復(fù)合的。
[0247] 根據(jù)本發(fā)明〃巖藻糖的量〃意為與在Asn297附著的所有糖結(jié)構(gòu)的總和（例如， 復(fù)合、雜合和高甘露糖結(jié)構(gòu)）相比的在Asn297的糖鏈中所述糖的量，所述糖的量通過 MALDI-T0F質(zhì)譜測量并且計(jì)算為平均值。巖藻糖的相對(duì)量是在N-糖苷酶F處理的樣品中由 MLDI-TOF鑒定的包含巖藻糖的結(jié)構(gòu)相對(duì)于所有糖結(jié)構(gòu)（例如，分別為復(fù)合、雜合和低聚和 高甘露糖結(jié)構(gòu)）的百分比。
[0248] 根據(jù)本發(fā)明的抗體由重組方法產(chǎn)生。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是編碼根據(jù)本 發(fā)明抗體的核酸，并且另一個(gè)方面是包含編碼根據(jù)本發(fā)明抗體的核酸的細(xì)胞。用于重 組生產(chǎn)的方法是現(xiàn)有技術(shù)中公知的并且包括在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中的蛋白表達(dá)，以 及隨后的抗體分離和通常純化為藥學(xué)可接受純度。對(duì)于將前述抗體在宿主細(xì)胞中的 表達(dá)，將編碼各個(gè)修飾的輕鏈和重鏈的核酸通過標(biāo)準(zhǔn)方法插入表達(dá)載體中。在適合的 原核或真核宿主細(xì)胞如CHO細(xì)胞、NSO細(xì)胞、SP2/0細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、COS細(xì)胞、PER. C6細(xì)胞、酵母或大腸桿菌細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，并且將所述抗體從細(xì)胞（上清液或裂解后 的細(xì)胞）中回收。用于重組生產(chǎn)抗體的一般方法是現(xiàn)有技術(shù)中公知的，并且例如在 Makrides，S. C.，Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202 ;Geisse，S.，等人，Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282 ；Kaufman, R. J. , Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161 ；fferner, R. G. , Drug Res. 48 (1998) 870-880 的綜述文章中描述。
[0249] 根據(jù)本發(fā)明的三特異性或四特異性抗體適當(dāng)?shù)貜呐囵B(yǎng)基中通過常規(guī)免疫球蛋白 純化方法分離，所述純化方法如，例如蛋白A瓊脂糖、羥基磷灰石層析法、凝膠電泳、透析或 親和層析法。編碼單克隆抗體的DNA和RNA容易地使用常規(guī)方法進(jìn)行分離和測序。雜交瘤 細(xì)胞可以充當(dāng)DNA和RNA的來源。一旦被分離，可以將DNA插入表達(dá)載體中，所述表達(dá)載體 接著被轉(zhuǎn)染到本不產(chǎn)生免疫球蛋白的宿主細(xì)胞如J1EK293細(xì)胞、CHO細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞中， 從而在宿主細(xì)胞中獲得重組單克隆抗體的合成。
[0250] 所述三特異性或四特異性抗體的氨基酸序列變體（或突變體）通過將適合的核苷 酸變化引入到抗體DNA中，或通過核苷酸合成進(jìn)行制備。然而，這樣的修飾可以僅在例如如 上述的非常有限的范圍內(nèi)進(jìn)行。例如，修飾不改變上述抗體特征如IgG同種型和抗原結(jié)合， 但是可以提高重組生產(chǎn)的產(chǎn)率、蛋白穩(wěn)定性或有利于純化。
[0251] 如在本申請(qǐng)中使用，術(shù)語〃宿主細(xì)胞〃意指可以被改造以產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的抗體 的任何種類的細(xì)胞體系。在一個(gè)實(shí)施方案中，將J1EK293細(xì)胞和CHO細(xì)胞用作宿主細(xì)胞。如 在本文中使用，表述〃細(xì)胞"、〃細(xì)胞系〃和〃細(xì)胞培養(yǎng)物〃可交替使用，且全部這些名稱都 包括后代。因此，措詞"轉(zhuǎn)化體"和"轉(zhuǎn)化的細(xì)胞"包括原代受試細(xì)胞和由其來源的培養(yǎng) 物，而不考慮轉(zhuǎn)移數(shù)。還應(yīng)理解由于有意或無意的突變，所有的后代的DNA內(nèi)容可能并不精 確一致。包括在最初轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中篩選的具有相同功能或生物學(xué)活性的變異后代。在期望 不同的指定時(shí)，將從上下文中顯而易見。
[0252] 在NSO細(xì)胞中的表達(dá)記載在，例如，Barnes, L. M.，等人，Cytotechnology 32 (2000) 109-123 ;Barnes, L. M.，等人，Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270 中。瞬時(shí)表 達(dá)記載在，例如，Durocher, Y.，等人，Nucl. Acids. Res. 30(2002)E9中?？勺冇虻目寺∮?載在 Orlandi, R.，等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837 ;Carter，P.，等 人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289 ;和 Norderhaug, L.，等人，J. Immunol. Methods204 (1997) 77-87 中。優(yōu)選的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)（HEK 293)記載在 Schlaeger, E. -J?，和 Christensen, K?的 Cytotechnology 30 (1999)71-83 和 Schlaeger，E.-J?的 J. Immunol. Methods 194(1996) 191-199 中。
[0253] 適合用于原核生物的控制序列，例如包括啟動(dòng)子，任選地操縱子序列，和核糖體結(jié) 合位點(diǎn)。已知真核細(xì)胞利用啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和多腺苷酸化信號(hào)。
[0254] 當(dāng)核酸被置于與另一條核酸序列具有功能性關(guān)系的位置時(shí)，該核酸為"有效連接 的"。例如，前序列或分泌前導(dǎo)序列的DNA與多肽的DNA為有效連接的，當(dāng)前者作為參與多 肽的分泌的前蛋白表達(dá)時(shí)；啟動(dòng)子或增強(qiáng)子與編碼序列為有效連接的，如果前者影響序列 的轉(zhuǎn)錄；或核糖體結(jié)合位點(diǎn)與編碼序列為有效連接的，如果前者被置于的位置能促進(jìn)翻譯。 一般的，"有效連接的"意為連接的DNA序列為相鄰的，在分泌前導(dǎo)序列的情況下為相鄰的且 符合讀框的。但是增強(qiáng)子不需要為相鄰的。使用合適的限制性位點(diǎn)的連接來實(shí)現(xiàn)連接。如 果這樣的位點(diǎn)不存在，則依照常規(guī)做法使用合成的寡核苷酸銜接頭或接頭。
[0255] 通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，包括堿/SDS處理、CsCl顯帶法（CsCl banding)、柱層析法、瓊脂糖 凝膠電泳和其它本領(lǐng)域公知的技術(shù)，進(jìn)行抗體的純化從而消除細(xì)胞組分或其它污染物，例 如其它細(xì)胞核酸或蛋白。參見Ausubel, F等人（編輯），Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York(1987)。不同的方法是 充分建立的并且廣泛用于蛋白純化，如用微生物蛋白進(jìn)行的親和層析法（例如，蛋白A或 蛋白G親和層析法），離子交換層析法（例如陽離子交換（羧甲基樹脂）、陰離子交換（氨 基乙基樹脂）和混合模式的交換）、親硫吸附（例如，用￠-巰基乙醇和其它SH配體）、 疏水相互作用或芳香吸附層析法（例如用苯基瓊脂糖、氮雜-arenophilie樹脂或間氨 基苯基硼酸），金屬螯合親和層析法（例如用Ni (II)-和Cu(II)-親和力材料）、大小排 阻層析法和電泳方法（如凝膠電泳、毛細(xì)管電泳）（Vi jayalakshmi, M. A.，Appl. Biochem. Biotech. 75(1998)93-102)。
[0256] 本發(fā)明的一個(gè)方面是包括根據(jù)本發(fā)明的抗體的藥物組合物。本發(fā)明的另一個(gè)方面 是根據(jù)本發(fā)明的抗體在制造藥物組合物中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個(gè)方面是用于制造包括根 據(jù)本發(fā)明的抗體的藥物組合物的方法。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供包括與藥物載體一起 配制的根據(jù)本發(fā)明的抗體的組合物，例如藥物組合物。
[0257] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是本發(fā)明的多特異性抗體，用于治療癌癥。
[0258] 本發(fā)明的另一方面是所述藥物組合物，用于治療癌癥。
[0259] 本發(fā)明的另一方面是本發(fā)明的抗體在制造用于治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。
[0260] 本發(fā)明的另一個(gè)方面是通過向需要此類治療的患者施用根據(jù)本發(fā)明的抗體以治 療罹患癌癥的患者的方法。
[0261] 如此處所使用的，"藥用載體"包括任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌和抗 真菌劑、等滲和吸收延遲劑、和生理上相容的類似物。優(yōu)選地，載體適用于靜脈內(nèi)的、肌內(nèi) 的、皮下的、腸胃外的、脊柱的或表皮的施用（例如通過注射或輸注）。
[0262] 本發(fā)明的組合物可通過本領(lǐng)域公知的多種方法施用。熟練技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，施 用的途徑和/或模式將根據(jù)想要的結(jié)果而變化。為了以某種施用途徑施用本發(fā)明的化合 物，可能必須使用物質(zhì)包被化合物、或?qū)⑺鑫镔|(zhì)和化合物共同施用以避免其失活。例如可 在合適的載體中對(duì)受試者施用化合物，所述載體例如脂質(zhì)體或稀釋劑?？伤幱玫南♂寗┌?括鹽水和水性緩沖溶液。藥用載體包括無菌水溶液或分散體，和用于臨時(shí)配制無菌可注射 用的溶液或分散體的無菌粉末。這些用于藥用活性物質(zhì)的介質(zhì)和活性劑的用途為本領(lǐng)域公 知的。
[0263] 如本文所用的短語"腸胃外給藥"和"經(jīng)腸胃外給藥"，表示不同于腸和局部施用 的施用方式，通常是通過注射，包括但不限于：靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心臟 內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、硬膜外和胸骨內(nèi) 注射和輸注。
[0264] 如在本文中使用，術(shù)語癌癥指增生性疾病，如淋巴瘤、淋巴細(xì)胞性白血病、肺癌、非 小細(xì)胞肺（NSCL)癌、支氣管肺泡細(xì)胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭或頸癌、皮膚或眼內(nèi)黑 素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛區(qū)癌、胃癌（stomach cancer)、胃癌（gastric cancer)、 結(jié)腸癌、乳腺癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌、陰道癌、夕卜陰癌、霍奇金病、食管 癌、小腸癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、 前列腺癌、膀胱癌、腎癌或輸尿管癌、腎細(xì)胞癌、腎孟癌、間皮瘤、肝細(xì)胞癌、膽癌、中樞神經(jīng) 系統(tǒng)（CNS)腫瘤、脊柱軸腫瘤、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、施萬細(xì) 胞瘤、室管膜瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、腦膜瘤、鱗狀上皮細(xì)胞癌、垂體腺瘤和Ewings肉瘤，包括 上述癌癥任何的難治性形式，或一種或多種上述癌癥的組合。
[0265] 這些組合物還可以含有佐劑，如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。通過前述滅菌 操作，以及通過納入多種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑例如對(duì)羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸 等，均可以確保防止微生物的存在。還可能期望在組合物中納入等滲劑，如糖、氯化鈉等。另 夕卜，可注射藥物形式的延遲吸收可以通過納入延遲吸收的活性劑如單硬脂酸鋁和明膠來實(shí) 現(xiàn)。
[0266] 無論所選的施用路徑如何，可以以適宜水合物形式使用的本發(fā)明的化合物和/或 本發(fā)明的藥物組合物通過本領(lǐng)域公知的常規(guī)方法配制為可藥用劑型。
[0267] 根據(jù)本發(fā)明藥物組合物中活性成分的實(shí)際劑量水平可有變動(dòng)，以獲得有效量的活 性成分，從而對(duì)于特定的患者、組合物和給藥方式實(shí)現(xiàn)期望的治療反應(yīng)，而對(duì)患者沒有毒 性。所選的劑量水平將取決于多種藥代動(dòng)力學(xué)因素，包括所采用的本發(fā)明特定組合物的活 性、給藥路徑、給藥時(shí)間、所采用特定化合物的排泄速率、治療持續(xù)時(shí)間、與所采用特定組合 物組合使用的其他藥物、化合物和/或材料、所治療患者的年齡、性別、體重、病情、總體健 康和既往病史、以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域眾所周知的類似因素。
[0268] 組合物必需是無菌和流動(dòng)的，其程度使得組合物可以通過注射器遞送。除了水之 夕卜，載體優(yōu)選地是等滲緩沖鹽溶液。
[0269] 例如，可以通過使用包衣如卵磷脂，分散劑的情況下通過維持所需的顆粒大小，通 過使用表面活性劑，來維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。在許多情況下，優(yōu)選地在組合物中納入等滲劑， 例如糖，多元醇如甘露醇或山梨糖醇，和氯化鈉。
[0270] 如本文所用的術(shù)語"轉(zhuǎn)化"指將載體/核酸轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中的過程。如果沒有 強(qiáng)大的細(xì)胞壁屏障的細(xì)胞用作宿主細(xì)胞，那么例如通過Graham,和Van der Eh, Virology 52 (1978) 546fT描述的磷酸鈣沉淀方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。然而，也可使用用于將DNA導(dǎo)入細(xì)胞中的 其他方法，例如通過核注射或通過原生質(zhì)體融合。如果使用原核細(xì)胞或含有實(shí)質(zhì)細(xì)胞壁結(jié) 構(gòu)的細(xì)胞，例如，一種轉(zhuǎn)染方法是如Cohen，F(xiàn).N，等，PNAS 69(1972)7110et seq所述的使用 氯化鈣的鈣處理。
[0271] 如本文使用，"表達(dá)"指將核酸轉(zhuǎn)錄為mRNA的過程和/或隨后將轉(zhuǎn)錄的mRNA (也稱 作轉(zhuǎn)錄本）翻譯成肽、多肽或蛋白質(zhì)的過程。轉(zhuǎn)錄本和編碼的多肽統(tǒng)稱為基因產(chǎn)物。如果 多核苷酸是源自基因組DNA，那么在真核細(xì)胞中的表達(dá)可包括mRNA的剪接。
[0272] "載體"是核酸分子，特別是自主復(fù)制的，其將插入的核酸分子轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中 和/或在宿主細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移。該術(shù)語包括主要用作將DNA或RNA插入細(xì)胞（例如染色體整 合）的載體、主要用作復(fù)制DNA或RNA的復(fù)制載體、和用作DNA或RNA轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的表 達(dá)載體。還包括提供一種以上所述功能的載體。
[0273] "表達(dá)載體"是多核苷酸，其在被引入到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞時(shí)，能夠被轉(zhuǎn)錄并翻譯成 多肽。"表達(dá)體系"通常指包括能夠用作產(chǎn)生理想的表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)載體的適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì) 胞。
[0274] 本發(fā)明的又一方面是多特異性抗體，其包含
[0275] A) a)特異性結(jié)合第一抗原和第二抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈；和
[0276] b)特異性結(jié)合第三抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈，其中所述重鏈的N端通過肽接 頭與所述輕鏈的C端連接；
[0277] 或
[0278] B) a)特異性結(jié)合第一抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈；和
[0279] b)特異性結(jié)合第二抗原和第三抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈，其中所述重鏈的N 端通過肽接頭與所述輕鏈的C端連接；
[0280] 或
[0281] C) a)特異性結(jié)合第一抗原和第二抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈；和
[0282] b)特異性結(jié)合第三抗原和第四抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈，其中所述重鏈的N 端通過肽接頭與所述輕鏈的C端連接。
[0283] 如本發(fā)明中所用的術(shù)語"肽接頭"表示具有氨基酸序列的肽，其優(yōu)選為合成來源 的。本發(fā)明的這些肽用于將第二種全長抗體（其特異性結(jié)合第二抗原）的輕鏈的C端通過 肽接頭連接到重鏈的N端。第二種全長抗體重鏈和輕鏈內(nèi)的肽接頭是具有至少30個(gè)氨基 酸長度，優(yōu)選32-50個(gè)氨基酸長度的氨基酸序列的肽。在一個(gè)中，肽接頭是具有32-40個(gè)氨 基酸長度的氨基酸序列的肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述接頭是（GxS)n，其中G =甘氨酸，S =絲氨酸，（X = 3, n = 8、9或10并且m = 0、l、2或3)或（x = 4并且n = 6, 7或8并且 m = 0、1、2或3)，優(yōu)選x = 4，n = 6或7并且m = 0、1、2或3，更優(yōu)選X = 4, n = 7并且m =2。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述接頭是（G4S)6G2。
[0284] 在實(shí)施例表1中給出了此類多特異性抗體的一個(gè)實(shí)施方案：三特異性Herl/ Her3-scFab-IGFlR，其包含 SEQ ID N0s:4、ll 和 13 的氨基酸序列。
[0285] 提供以下實(shí)施例、序列表和圖，以幫助理解本發(fā)明，其真正范圍在所附權(quán)利要求中 給出。應(yīng)理解，可以在所示方法中進(jìn)行修飾，但不背離本發(fā)明的精神。
[0286] 氨某酸序列描沭
[0287] SEQ ID NO: I :HC/ 突起 /Her2/VEGF
[0288] SEQ ID N0:2:HC/孔/Her2/VEGF
[0289] SEQ ID N0:3:HC/突起/Herl/Her3
[0290] SEQ ID N0:4:HC/孔/Herl/Her3
[0291] SEQ ID NO: 5: HC/ 孔 /xAng2
[0292] SEQ ID N0:6:HC/突起/xAng2
[0293] SEQ ID N0:7:HC/孔/xIGFIR
[0294] SEQ ID N0:8:HC/孔/xHer3
[0295] SEQ ID N0:9:HC/孔/xHer2
[0296] SEQ ID N0:10:HC/孔/xcMet
[0297] SEQ ID N0:11:HC/孔/scFabIGFlR
[0298] SEQ ID N0:12:HC/孔/xHerl/Her3
[0299] SEQ ID NO:13:LC/Herl/Her3
[0300] SEQ ID N0:14:LC/Her2/VEGF
[0301] SEQ ID N0:15:LC/xAng2
[0302] SEQ ID N0:16:LC/xIGFlR
[0303] SEQ ID N0:17:LC/xHer3
[0304] SEQ ID N0:18:LC/xHer2
[0305] SEQ ID N0:19:LC/xcMet
[0306] SEQ ID N0:20:LC/xHerl/Her3
[0307] 在下文中，列出了本發(fā)明的實(shí)施方案：
[0308] 1.多特異性抗體，其包含：
[0309] A) a)特異性結(jié)合第一抗原和第二抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈；和
[0310] b)特異性結(jié)合第三抗原的全長抗體的修飾輕鏈和修飾重鏈，其中可變域VL和VH 被彼此替換，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替換；
[0311] 或
[0312] B) a)特異性結(jié)合第一抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈；和
[0313] b)特異性結(jié)合第二抗原和第三抗原的全長抗體的修飾輕鏈和修飾重鏈，其中可變 域VL和VH被彼此替換，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替換；
[0314] 或
[0315] C) a)特異性結(jié)合第一抗原和第二抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈；和
[0316] b)特異性結(jié)合第三抗原和第四抗原的全長抗體的修飾輕鏈和修飾重鏈，其中可變 域VL和VH被彼此替換，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替換。
[0317] 2.實(shí)施方案1的多特異性抗體，其特征在于所述抗體是二價(jià)三特異性或四特異性 抗體。
[0318] 3.實(shí)施方案1的多特異性抗體，其特征在于所述抗體是三特異性的并包含
[0319] A) a)特異性結(jié)合第一抗原和第二抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈；和
[0320] b)特異性結(jié)合第三抗原的全長抗體的修飾輕鏈和修飾重鏈，其中可變域VL和VH 被彼此替換，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替換；
[0321] 或
[0322] B) a)特異性結(jié)合第一抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈；和
[0323] b)特異性結(jié)合第二抗原和第三抗原的全長抗體的修飾輕鏈和修飾重鏈，其中可變 域VL和VH被彼此替換，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替換。
[0324] 4.實(shí)施方案3的多特異性抗體，其中
[0325] 在A)的情況下，第一抗原是人HER1，第二抗原是人HER3并且第三抗原是人HER2 ; 或
[0326] 在B)的情況下，第一抗原是人HER2,第二抗原是人HERl并且第三抗原是人HER3。
[0327] 5.實(shí)施方案1的多特異性抗體，其中所述抗體是二價(jià)三特異性抗體并且包含
[0328] a)特異性結(jié)合人HERl和人HER3的全長抗體的輕鏈和重鏈；
[0329] 和
[0330] b)特異性結(jié)合人HER2的全長抗體的修飾輕鏈和修飾重鏈，其中可變域VL和VH被 彼此替換，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替換。
[0331] 6.實(shí)施方案5的多特異性抗體，其中所述抗體的特征在于包含SEQ ID N0:4、9、13 和18的氨基酸序列。
[0332] 7.實(shí)施方案3的多特異性抗體，其中
[0333] 在A)的情況下，第一抗原是人HERl，第二抗原是人HER3并且第三抗原是人cMET ; 或
[0334] 在B)的情況下，第一抗原是人cMET，第二抗原是人HERl并且第三抗原是人HER3。
[0335] 8.實(shí)施方案1的多特異性抗體，其特征在于所述抗體是四特異性的并包含
[0336] a)特異性結(jié)合第一抗原和第二抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈；和
[0337] b)特異性結(jié)合第三抗原和第四抗原的全長抗體的修飾輕鏈和修飾重鏈，其中可變 域VL和VH被彼此替換，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替換。
[0338] 9.實(shí)施方案1_5、7和8任一項(xiàng)的多特異性抗體，其中在b)的修飾輕鏈和修飾重鏈 中，可變域VL和VH被彼此替換；并且其中恒定域CL和CHl被彼此替換。
[0339] 10.實(shí)施方案權(quán)利要求1_5、7和8任一項(xiàng)的多特異性抗體，其中在b)的修飾輕鏈 和修飾重鏈中，（僅）可變域VL和VH被彼此替換。
[0340] 11.實(shí)施方案1_5、7和8任一項(xiàng)的多特異性抗體，其中在b)的修飾輕鏈和修飾重 鏈中，（僅）恒定域CL和CHl被彼此替換。
[0341] 12.實(shí)施方案1-11任一項(xiàng)的多特異性抗體，其特征在于
[0342] a)的全長抗體的重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域與b)的全長抗體的修飾重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域各 自在這樣的界面處相遇，所述界面在抗體CH3結(jié)構(gòu)域之間包含原始界面；
[0343] 其中改變所述界面，以促進(jìn)三特異性抗體或四特異性抗體的形成，
[0344] 其中所述改變的特征在于：
[0345] i)改變一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域，
[0346] 從而在三特異性抗體或四特異性抗體內(nèi)遇到另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的原始界 面的一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的原始界面內(nèi)，
[0347] 氨基酸殘基被具有更大側(cè)鏈體積的氨基酸殘基替換，由此在定位在另一條重鏈的 CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)的腔中的一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)產(chǎn)生隆凸，
[0348] 和
[0349] ii)改變另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域，
[0350] 從而在三特異性抗體或四特異性抗體內(nèi)遇到第一個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的原始界面的第 二個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的原始界面內(nèi)，
[0351] 氨基酸殘基被具有更小側(cè)鏈體積的氨基酸殘基替換，由此在第二個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的 界面內(nèi)產(chǎn)生腔，在所述第二個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)定位了第一個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)的隆 凸。
[0352] 13.實(shí)施方案12的多特異性抗體，其特征在于
[0353] 具有較大側(cè)鏈體積的所述氨基酸殘基選自精氨酸（R)、苯丙氨酸（F)、酪氨酸（Y)、 色氨酸（W)，并且具有較小側(cè)鏈體積的所述氨基酸殘基選自丙氨酸（A)、絲氨酸（S)、蘇氨酸 (T)、纈氨酸（V)。
[0354] 14.實(shí)施方案12或13的多特異性抗體，其特征在于
[0355] 通過引入半胱氨酸（C)作為在每個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)位置中的氨基酸來進(jìn)一步改 變兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域，從而能夠在兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域之間形成二硫鍵。
[0356] 15.用于制備實(shí)施方案1-14的多特異性抗體的方法，
[0357] 其包括步驟
[0358] a)用包含這樣的核酸分子的載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，所述核酸分子編碼
[0359] A) a)特異性結(jié)合第一抗原和第二抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈；和
[0360] b)特異性結(jié)合第三抗原的全長抗體的修飾輕鏈和修飾重鏈，其中可變域VL和VH 被彼此替換，和/或其中恒定域CL和CHl
[0361] 被彼此替換；
[0362] 或
[0363] B) a)特異性結(jié)合第一抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈；和
[0364] b)特異性結(jié)合第二抗原和第三抗原的全長抗體的修飾輕鏈和修飾重鏈，其中可變 域VL和VH被彼此替換，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替換；
[0365] 或
[0366] C) a)特異性結(jié)合第一抗原和第二抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈；和
[0367] b)特異性結(jié)合第三抗原和第四抗原的全長抗體的修飾輕鏈和修飾重鏈，其中可變 域VL和VH被彼此替換，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替換。
[0368] b)在允許合成所述抗體分子的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞；和
[0369] c)從所述培養(yǎng)物中回收所述抗體分子。
[0370] 16.核酸，其編碼實(shí)施方案1-14的多特異性抗原結(jié)合蛋白質(zhì)。
[0371] 17.載體，其包含編碼實(shí)施方案1-14的多特異性抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的核酸。
[0372] 18.宿主細(xì)胞，其包含實(shí)施方案17的載體。
[0373] 19.實(shí)施方案1-14的抗體的組合物，優(yōu)選藥物組合物或診斷組合物。
[0374] 20.藥物組合物，其包含實(shí)施方案1-14的抗體和至少一種藥學(xué)上可接受的賦形 劑。
[0375] 21.實(shí)施方案1-14任一項(xiàng)的抗體，用于治療癌癥。
[0376] 22.實(shí)施方案1-14任一項(xiàng)的抗體用于制備治療癌癥的藥物的用途。
[0377] 23.用于治療需要治療的患者的方法，其特征在于向所述患者施用治療有效量的 實(shí)施方案1-14的抗體。
[0378] 24.用于治療患有癌癥的患者的方法，其特征在于通過向所述患者施用治療有效 量的實(shí)施方案1-14的抗體。 實(shí)施例
[0379] 材料和方法
[0380] 重組DNA技術(shù)
[0381] 將標(biāo)準(zhǔn)方法用于操作 DNA,如在 Sambrook, J.，等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual ；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, New York，1989中所述。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書來使用分子生物學(xué)試劑。
[0382] DNA和蛋白質(zhì)序列分析以及序列數(shù)據(jù)管理
[0383] 在 Kabat，E. A.，等,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第 5 片反 Public Health Service, National Institutes of Health Publication No 91-3242, Bethesda(1991)中給出關(guān)于人免疫球蛋白輕鏈和重鏈的核苷酸序列的一般信 息。根據(jù)EU編號(hào)對(duì)抗體鏈的氨基酸進(jìn)行編號(hào)（Edelman，G.M.，等，PNAS 63(1969)78-85; Rabat, E. A.,等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 片反 NIH Publication No 91-3242 (1991))〇GCG's(Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin) 軟件包版本10. 2和Infomax's Vector NTI Advance suite版本8.0用于序列產(chǎn)生、作圖、 分析、注釋和舉例說明。
[0384] DNA 測序
[0385] DNA序列通過在 sequiServe (Vaterstetten，德國）和 Geneart AG (Regensburg，德 國）進(jìn)行的雙鏈測序來確定。
[0386] 基因合成
[0387] 需要的基因區(qū)段由GeneartAG(Regensburg，德國）從合成的寡核苷酸和PCR產(chǎn)物 通過自動(dòng)的基因合成進(jìn)行制備。將側(cè)翼為單一限制性內(nèi)切核酸酶切割位點(diǎn)的基因區(qū)段克隆 到pGA18(ampR)質(zhì)粒中。從轉(zhuǎn)化的細(xì)菌純化質(zhì)粒DNA，并且通過UV光譜法測定濃度。通過 DNA測序證實(shí)亞克隆的基因片段的DNA序列。
[0388] 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0389] 將Roche表達(dá)載體用于構(gòu)建編碼所有的重鏈和輕鏈的表達(dá)質(zhì)粒。所述載體由下述 元件構(gòu)成：
[0390] _作為選擇標(biāo)記的潮霉素抗性基因，
[0391] -EB 病毒（Epstein-Barr virus, (EBV))的復(fù)制起點(diǎn)，oriP，
[0392] -載體pUC18的復(fù)制起點(diǎn)，其允許該質(zhì)粒在大腸桿菌中復(fù)制，
[0393] _內(nèi)酰胺酶基因，其在大腸桿菌中賦予氨芐青霉素抗性，
[0394] -來自人巨細(xì)胞病毒（HCMV)的即時(shí)早期增強(qiáng)子和啟動(dòng)子，
[0395] -人1-免疫球蛋白多腺苷酸化（"poly A")信號(hào)序列。
[0396] 通過基因合成制備包含重鏈或輕鏈的免疫球蛋白基因以及具有CH-CL交叉的 crossmab構(gòu)建體并將其克隆到所述pGA18(ampR)質(zhì)粒中。通過定向克隆，使用cds上游的 5'BamHI和定位在CHl結(jié)構(gòu)域中的3'KpnI限制性位點(diǎn)構(gòu)建可變重鏈構(gòu)建體。按照基因合成 安排可變輕鏈構(gòu)建體（包含VL和CL)并通過定向克隆使用cds上游的5' BamHI和定位在 終止密碼子下游的3' XbaI限制性位點(diǎn)進(jìn)行構(gòu)建。通過基因合成全長編碼序列（VL-CH1或 VH-CL-CH2-CH3)或利用編碼序列中的獨(dú)特限制性位點(diǎn)按照部分基因合成來構(gòu)建Crossmab 抗體。在交叉的輕鏈（VL-CHl)的情況下，僅安排覆蓋具有5'BamHI和3'XbaI限制性位點(diǎn) 的完整cds的基因合成。對(duì)于重鏈構(gòu)建體，重鏈載體的CH2結(jié)構(gòu)域中的獨(dú)特3'XhoI限制性 位點(diǎn)也可以用于具有5'BamHI限制性位點(diǎn)的定向克隆。將最終的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 細(xì)胞中，分離表達(dá)質(zhì)粒DNA(Minipr?。┎⑦M(jìn)行限制性酶分析和DNA測序。將正確的克隆在 150ml LB-Amp培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再次分離質(zhì)粒DNA (Maxiprep)并通過DNA測序證實(shí)序列完整 性。
[0397] 免疫球蛋白變體在HEK293細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)
[0398] 根據(jù)生產(chǎn)商的說明書（Invitrogen, USA)，使用 FreeStyle? 293Expression System通過人胚腎293-F細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染來表達(dá)重組免疫球蛋白變體。對(duì)于小規(guī)模測試 表達(dá)，將30ml的0.5x IO6 HEK293F細(xì)胞/ml在轉(zhuǎn)染前一天接種。第二天，質(zhì)粒DNA (Iiig DNA/ml 培養(yǎng)體積）與 I. 2ml Opti-MEM? I Reduced Serum Medium(Invitrogen, C arlsbad，CA, USA)混合，隨后加入 40u I 的 293Fectin? Transfection Reagent (Invitr ogen，Carlsbad，CA, USA)。將混合物在室溫下溫育15分鐘并逐滴加入細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染一天 后，將 300ul L-谷氛酸胺（200mM，Sigma-Aldrich，Steinheim，Germany)和 600ul 含有 L-天冬酰胺的feed7、HyPep 1510、銨-Fe (III)檸檬酸鹽、乙醇胺、痕量元素、D-葡萄糖、 不含RDMI的FreeStyle培養(yǎng)基注入每個(gè)燒瓶。轉(zhuǎn)染三天后，使用自動(dòng)化細(xì)胞活力分析儀 (Vi-CELL? XR，Beckman Coulter，F(xiàn)ullerton，CA，USA)和葡萄糖計(jì)（Accil-CHEK? Sensor comfort, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)測定培養(yǎng)基中的細(xì)胞濃 度、活力和葡萄糖濃度。此外，將300 ill的L-谷氨酰胺、300 ill非必需氨基酸溶液（PAN? Biotech, Aidenbach, Germany)、300 u 1 丙酮酸鈉（lOOmM, Gibco, Invitrogen)、I. 2ml feed7 和ad 5g/L葡萄糖（D-(+)-葡萄糖溶液45% ,Sigma)注入每個(gè)燒瓶。最后，轉(zhuǎn)染六天后， 通過在環(huán)境溫度下，X3R Multifuge (Heraeus, Buckinghamshire, England)中 3500rpm 離心 15分鐘收集抗體，上清液通過Steriflip過濾裝置（0.22mm Millipore Express PLUS PES 膜，Mi 11 ipore，Bedford，M)無菌過濾并貯存在-20°C，直至進(jìn)一步使用。
[0399] 雙特異性抗體和對(duì)照抗體的純化
[0400] 通過使用 Protein A-Sepharose?(GE Healthcare,瑞典）的親和層析法和 SuperdeX200大小排阻層析法，將二價(jià)三特異性或四特異性抗體和對(duì)照抗體從細(xì)胞培養(yǎng) 物上清液中純化出來。簡言之，將無菌過濾的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液施加到HiTrapProteinA HP (5ml)柱上，所述柱用 PBS 緩沖液（IOmM Na2HPO4, ImM KH2PO4, 137mM NaCl 和 2. 7mM KC1, pH 7.4)平衡。將未結(jié)合的蛋白用平衡緩沖液洗出。將抗體和抗體變體用0. IM檸檬酸鹽緩沖 液，pH 2. 8洗脫，并將包含蛋白的級(jí)分用0. Iml IM Tris，pH 8. 5中和。合并洗脫的蛋白級(jí) 分，用Amicon超離心濾器裝置（MWC0:30K，Millipore)將其濃縮到3ml的體積，并負(fù)載到用 20mM組氨酸，140mM NaCl，pH 6.0 平衡的 Superdex200HiLoad 120ml 16/60 凝膠過濾柱（GE Healthcare，瑞典）上。將具有低于5%的高分子量聚集體的包含純化的雙特異性抗體和對(duì) 照抗體的級(jí)分合并并以I. 〇mg/ml的等分試樣存在_80°C。
[0401] 蛋白質(zhì)定量
[0402] 使用具有預(yù)先填充的 Poros? A 蛋白 A 柱（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)的自動(dòng)化 Ultimate 3000 系統(tǒng)（Dionex, Idstein, Germany)通過親和層析 法定量蛋白質(zhì)。所有樣品裝載到緩沖液A(0.2M Na2HPO4* [2H20]，pH 7.4)中并在緩沖液 B(0. IM檸檬酸，0. 2M NaCl，pH2. 5)中洗脫。為了測定蛋白質(zhì)濃度，1.62的消光系數(shù)用于所 有樣品。
[0403] 純化蛋白質(zhì)的分析
[0404] 通過使用在氨基酸序列基礎(chǔ)上計(jì)算的摩爾消光系數(shù)測定280nm處的光密度（OD) 來測定純化蛋白質(zhì)樣品的蛋白質(zhì)濃度。在存在和缺少還原劑（5mM 1,4-二硫蘇糖醇）和 利用考馬斯亮藍(lán)染色的情況下通過SDS-PAGE分析雙特異性抗體和對(duì)照抗體的純度和分子 量。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書（4-20% Tris-Glycine gels)使用NuPAGE? Pre-Cast凝膠 系統(tǒng)（Invitrogen，USA)。在 25°C，使用 200mM KH2P04,250mM KCl，pH 7.0 運(yùn)行緩沖液中的 Superdex 200分析性大小排阻柱（GE Healthcare, Sweden)通過高效SEC分析雙特異性抗 體和對(duì)照抗體樣品的聚集體含量。以0. 5ml/min的流速將25 ii g蛋白質(zhì)注射到柱上并在50 分鐘內(nèi)等度洗脫。在通過Peptide-N-糖苷酶F(Roche Molecular Biochemicals)酶促處 理去除N-聚糖后通過NanoElectrospray Q-TOF質(zhì)譜驗(yàn)證還原性雙特異性抗體輕鏈和重鏈 的氨基酸骨架的完整性。
[0405] 用于小規(guī)模分析的免疫沉淀
[0406] 對(duì)于所有樣品，在補(bǔ)充有 5 % Tween? 20 (PBS-T，pH 7. 4, Fluka Analytical, Steinheim, Germany)的PBS中將30 Ii g的蛋白質(zhì)稀釋到相等的總反 應(yīng)體積。力卩入 126 i! I Dynabeads? 蛋白 A(0. 24i! g 人 IgG/i! I Dynabeads 結(jié)合 力，Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)并將溶液在室溫和20rpm下溫育90-120分鐘，以允許 人IgG Fc結(jié)合連接磁珠的蛋白A (I. 4ml總反應(yīng)體積）。珠用Iml PBS-T洗滌三次，在0. 4x g下離心30秒，以在管底收集溶液。丟棄上清液并將Dynabeads與30 ill的IOOmM檸檬酸 鹽，pH 3 (水枸櫞酸，Sigma)溫育以洗脫蛋白質(zhì)。然后，用3 ill的2M Tris，pH 9 (Fisher Scientific)中和溶液。
[0407] 分析性 HPLC
[0408] 使用具有 TSK-GEL G3000SW 凝膠過濾柱（7. 5mm ID X 30cm, TosoHaas Corp. , Montgomeryvilie, PA, USA)的 Agilent HPLC 1100(Agilent Technologies, Paulo Alto, CA, USA)分析抗體。將18 ill的洗脫蛋白質(zhì)裝載到緩沖液A(300mM NaCl，pH 7. 5中的 0.05M K2HPO4AH2PO4)中的柱上并根據(jù)大小進(jìn)行分離。
[0409] 還原性和非還原性SDS-PAGE
[0410] 7iU的洗脫蛋白質(zhì)與2x樣品緩沖液（NllPAGE? LDS樣品緩沖 液，Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)混合并且另外的7 ii 1與含有10 %還原劑 (NllPAGE? Sample Reducing Agent，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)的 2x 樣品緩沖 液混合。將樣品加熱到70° 10分鐘并裝載到pre-cast NuPAGE? 4-12% BisTris Gel (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)上。在 200V 和 125mA 下運(yùn)行凝膠 45 分鐘。然后，用 Millipore 水洗漆凝膠三次并用 SimplyBlue? SafeStain (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 染色。在Millipore水中將凝膠脫色過夜。
[0411] 細(xì)胞系
[0412] 在補(bǔ)充有4mM L-谷氨酰胺、0? ImM非必需氨基酸和10%熱滅活胎牛血清（Gibco) 的RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco)中維持A431。在補(bǔ)充有GlutaMax的DMEM/F12培養(yǎng)基（Gibco) 中維持MDA-MB 175VII細(xì)胞。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)方案繁殖細(xì)胞系。
[0413] 表面等離振子共振
[0414] 所有實(shí)驗(yàn)在Biacore TlOO (GE Healthcare)上進(jìn)行。使用TlOO對(duì)照和評(píng)估軟件包 (GE Healthcare, v2. 03)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。測定形式是CM5芯片上的'多循環(huán)動(dòng)力學(xué)'測定。 通過胺偶聯(lián)的抗人IgG-Fc抗體（GE Healthcare BR-1008-39)捕獲待分析的抗體。DAF和 pertuzumab用作參考對(duì)照。使用濃度系列，分別注射7個(gè)增加濃度的每種抗原（人Herl、 Her2和Her3胞外結(jié)構(gòu)域）。在37°C下結(jié)合各MAbs〈HerX>的HerX的動(dòng)力學(xué)表征：通過用 具有雙重參考（against c = OnM并且FCl =空白表面）的Langmuirl: 1結(jié)合模型通過 Biacore評(píng)估軟件擬合結(jié)合和解離相的表面等離振子共振信號(hào)的觀察時(shí)間過程來評(píng)估標(biāo)準(zhǔn) 動(dòng)力學(xué)。運(yùn)行緩沖液是PBS-T。稀釋緩沖液是含有BSA的PBST (c = lmg/mL)。
[0415] 以大約c = InM的濃度，流速5iil/min，時(shí)間72sec在流動(dòng)室2、3和4上捕獲 MAbs〈HerX>。分析物樣品：將50 iil/min流速的7個(gè)增加濃度的HerX注射180sec結(jié)合時(shí) 間（c = 1.23-900nM,稀釋因子3)。解離時(shí)間：1800sec。一式兩份分析每個(gè)濃度。
[0416] 利用120sec的接觸時(shí)間和50 ii 1/min的流速，使用3M MgC12 (由vendor推薦） 在每個(gè)循環(huán)后進(jìn)行最后的再生。同時(shí)結(jié)合的分析：利用各ISOsec的接觸時(shí)間，使用雙重注 射模式連續(xù)注射Her2/Her3、Her3/Her2或Herl/Her2。如動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)中所觀察，在飽和時(shí) 針對(duì)每種抗原選擇抗原濃度。作為對(duì)照，第二次注射相同的抗原不升高應(yīng)答水平，證明達(dá)到 了平衡。選擇25°C的溫度，以將解離最小化。測定每種組合的三個(gè)重復(fù)。流速30mL/min， 兩次注射的雙重注射，每次180sec。
[0417] 設(shè)計(jì)本發(fā)明的多種多特異性抗體以評(píng)估概念（參見下文表1)。通常，它們包括在 CH3結(jié)構(gòu)域中的突起進(jìn)入孔修飾（如可以在各序列中看到的）。
[0418] 表1 :本發(fā)明多特異性抗體的設(shè)計(jì)：數(shù)字表示序列表中的序列號(hào)（X表示在輕鏈和 重鏈中，CHl和CL已經(jīng)交換）。
【權(quán)利要求】
1. 多特異性抗體，其包含： A) a)特異性結(jié)合第一抗原和第二抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈；和 b)特異性結(jié)合第三抗原的全長抗體的修飾輕鏈和修飾重鏈，其中可變域VL和VH被彼 此替換，和/或其中恒定域CL和CH1被彼此替換； 或 B) a)特異性結(jié)合第一抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈；和 b)特異性結(jié)合第二抗原和第三抗原的全長抗體的修飾輕鏈和修飾重鏈，其中可變域VL和VH被彼此替換，和/或其中恒定域CL和CH1被彼此替換； 或 C) a)特異性結(jié)合第一抗原和第二抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈；和 b)特異性結(jié)合第三抗原和第四抗原的全長抗體的修飾輕鏈和修飾重鏈，其中可變域VL和VH被彼此替換，和/或其中恒定域CL和CH1被彼此替換；并且 其中所述抗體是二價(jià)、三特異性或四特異性抗體。
2. 權(quán)利要求1的多特異性抗體，其特征在于所述抗體是三特異性的并包含 A) a)特異性結(jié)合第一抗原和第二抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈；和 b)特異性結(jié)合第三抗原的全長抗體的修飾輕鏈和修飾重鏈，其中可變域VL和VH被彼 此替換，和/或其中恒定域CL和CH1被彼此替換； 或 B) a)特異性結(jié)合第一抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈；和 b)特異性結(jié)合第二抗原和第三抗原的全長抗體的修飾輕鏈和修飾重鏈，其中可變域VL和VH被彼此替換，和/或其中恒定域CL和CH1被彼此替換。
3. 權(quán)利要求2的多特異性抗體，其中 在A)的情況下，第一抗原是人HER1，第二抗原是人HER3并且第三抗原是人HER2 ;或 在B)的情況下，第一抗原是人HER2,第二抗原是人HER1并且第三抗原是人HER3。
4. 權(quán)利要求1的多特異性抗體，其中所述抗體是二價(jià)三特異性抗體并且包含 a) 特異性結(jié)合人HER1和人HER3的全長抗體的輕鏈和重鏈； 和 b) 特異性結(jié)合人HER2的全長抗體的修飾輕鏈和修飾重鏈，其中可變域VL和VH被彼此 替換，和/或其中恒定域CL和CH1被彼此替換。
5. 權(quán)利要求4的多特異性抗體，其中所述抗體的特征在于包含SEQIDN0:4、9、13和 18的氨基酸序列。
6. 權(quán)利要求3的多特異性抗體，其中 在A)的情況下，第一抗原是人HER1，第二抗原是人HER3并且第三抗原是人cMET;或 在B)的情況下，第一抗原是人cMET，第二抗原是人HER1并且第三抗原是人HER3。
7. 權(quán)利要求1的多特異性抗體，其特征在于所述抗體是四特異性的并包含 a) 特異性結(jié)合第一抗原和第二抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈；和 b) 特異性結(jié)合第三抗原和第四抗原的全長抗體的修飾輕鏈和修飾重鏈，其中可變域 VL和VH被彼此替換，和/或其中恒定域CL和CH1被彼此替換。
8. 權(quán)利要求1_4、6和7任一項(xiàng)的多特異性抗體，其中在b)的修飾輕鏈和修飾重鏈中， 可變域VL和VH被彼此替換；并且其中恒定域CL和CH1被彼此替換。
9. 權(quán)利要求1_4、6和7任一項(xiàng)的多特異性抗體，其中在b)的修飾輕鏈和修飾重鏈中， (僅）可變域VL和VH被彼此替換。
10. 權(quán)利要求1_4、6和7任一項(xiàng)的多特異性抗體，其中在b)的修飾輕鏈和修飾重鏈中， (僅）恒定域CL和CH1被彼此替換。
11. 權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的多特異性抗體，其特征在于 a)的全長抗體的重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域與b)的全長抗體的修飾重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域各自在 這樣的界面處相遇，所述界面在抗體CH3結(jié)構(gòu)域之間包含原始界面； 其中改變所述界面，以促進(jìn)三特異性抗體或四特異性抗體的形成，其中所述改變的特 征在于： i) 改變一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域， 從而在三特異性抗體或四特異性抗體內(nèi)遇到另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的原始界面的 一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的原始界面內(nèi)，氨基酸殘基被具有更大側(cè)鏈體積的氨基酸殘基替 換，由此在定位在另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)的腔中的一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的界 面內(nèi)產(chǎn)生隆凸， 和 ii) 改變另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域， 從而在三特異性抗體或四特異性抗體內(nèi)遇到第一個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的原始界面的第二個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的原始界面內(nèi)， 氨基酸殘基被具有更小側(cè)鏈體積的氨基酸殘基替換，由此在第二個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的界面 內(nèi)產(chǎn)生腔，在所述第二個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)定位了第一個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)的隆凸。
12. 權(quán)利要求11的多特異性抗體，其特征在于 具有較大側(cè)鏈體積的所述氨基酸殘基選自精氨酸（R)、苯丙氨酸（F)、酪氨酸（Y)、色氨 酸（W)，并且具有較小側(cè)鏈體積的所述氨基酸殘基選自丙氨酸（A)、絲氨酸（S)、蘇氨酸（T)、 纈氨酸（V)。
13. 權(quán)利要求11或12的多特異性抗體，其特征在于 通過引入半胱氨酸（C)作為在每個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)位置中的氨基酸來進(jìn)一步改變兩 個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域，從而能夠在兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域之間形成二硫鍵。
14. 用于制備權(quán)利要求1-13的多特異性抗體的方法， 其包括步驟 a) 用包含這樣的核酸分子的載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，所述核酸分子編碼 A) a)特異性結(jié)合第一抗原和第二抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈；和 b) 特異性結(jié)合第三抗原的全長抗體的修飾輕鏈和修飾重鏈，其中可變域VL和VH被彼 此替換，和/或其中恒定域CL和CH1被彼此替換； 或 B) a)特異性結(jié)合第一抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈；和 b)特異性結(jié)合第二抗原和第三抗原的全長抗體的修飾輕鏈和修飾重鏈，其中可變域VL和VH被彼此替換，和/或其中恒定域CL和CH1被彼此替換； 或 c)a)特異性結(jié)合第一抗原和第二抗原的全長抗體的輕鏈和重鏈；和b)特異性結(jié)合第三抗原和第四抗原的全長抗體的修飾輕鏈和修飾重鏈，其中可變域 VL和VH被彼此替換，和/或其中恒定域CL和CH1被彼此替換。 b) 在允許合成所述抗體分子的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞；和 c) 從所述培養(yǎng)物中回收所述抗體分子。
15. 核酸，其編碼權(quán)利要求1-13的多特異性抗原結(jié)合蛋白質(zhì)。
16. 載體，其包含編碼權(quán)利要求1-13的多特異性抗原結(jié)合蛋白質(zhì)的核酸。
17. 宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求16的載體。
18. 權(quán)利要求1-13的抗體的組合物，優(yōu)選藥物組合物或診斷組合物。
19. 藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-13的抗體和至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑。
20. 權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的抗體，其用于治療癌癥。
21. 權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的抗體用于制備治療癌癥的藥物的用途。
22. 用于治療需要治療的患者的方法，其特征在于向所述患者施用治療有效量的權(quán)利 要求1-13的抗體。
23. 用于治療患有癌癥的患者的方法，其特征在于通過向所述患者施用治療有效量的 權(quán)利要求1-13的抗體。
【文檔編號(hào)】C07K16/22GK104379604SQ201380027168
【公開日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2013年5月22日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月24日
【發(fā)明者】R·卡斯托爾迪, A·哈斯, C·克萊因, W·舍費(fèi)爾, C·蘇斯特曼 申請(qǐng)人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司