本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及自身抗原及自身抗體的特異性結(jié)合物及其制備方法。具體涉及一種制備自身抗原特異性結(jié)合物的方法及其用制得的特異性結(jié)合物作為抗原篩選獲得具有抗自身抗體的抗體特性的化合物或抗體類似物及其方法備。

背景技術(shù)：

現(xiàn)有技術(shù)公開了有關(guān)自身免疫性疾病現(xiàn)狀，1904年，donatht和landsteiner首次在患者尿液中檢測到寒冷環(huán)境導(dǎo)致紅細(xì)胞破壞的抗體，并提出“自身抗體”這一概念，從此拉開了自身免疫性疾病(aid)研究的序幕。自身免疫性疾病是由于機(jī)體對(duì)自身抗原的免疫耐受被打破從而導(dǎo)致自我反應(yīng)的免疫細(xì)胞被激活以及自身抗體的產(chǎn)生。通常正常人具有自身免疫調(diào)節(jié)功能，其免疫反應(yīng)有保護(hù)性防御作用，即對(duì)自身組織、成分不發(fā)生反應(yīng)，—旦自身耐受的完整性遭到破壞，機(jī)體對(duì)自身細(xì)胞抗原(自身組織、器官、細(xì)胞等)發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生自身抗體，導(dǎo)致機(jī)體損傷，誘發(fā)疾病。

近年來，隨著自身抗體診斷技術(shù)的不斷發(fā)展，其在aid的診斷和預(yù)后的評(píng)估逐步得到重視。自身抗體作為aid的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測指標(biāo)，對(duì)具有家族史的高危人群進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的功能也在不斷的優(yōu)化中。2011年，towns發(fā)現(xiàn)抗gad65抗體有助于診斷早期1型糖尿病。隨后sui提出聯(lián)合應(yīng)用抗核抗體、抗sdna抗體及抗組蛋白抗體有助于早期診斷狼瘡性腎??；由于系統(tǒng)性自身免疫性疾病早期臨床表現(xiàn)并不典型，因此，利用檢測自身抗體對(duì)自身免疫性疾病進(jìn)行早期診斷及預(yù)測，對(duì)于疾病的臨床治療非常有利。

目前，自身免疫性疾病的治療原則包括去除病因防止自身抗體形成以及抑制免疫反應(yīng)。傳統(tǒng)的治療主要包括糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑。然而長期使用激素和免疫抑制劑可能伴有嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如增加心血管疾病、白內(nèi)障、骨折及感染的風(fēng)險(xiǎn)。因此，臨床治療中需要有效且副作用更小的手段；近年來，新的治療方法包括基因治療、小分子tlr抑制劑、干細(xì)胞自體移植以及單克隆抗體治療等不斷被提出。

統(tǒng)計(jì)顯示，全球已有超過25種單克隆抗體應(yīng)用于臨床，目前針對(duì)aid的單克隆抗體均為嵌合抗體或者利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備的人源化igg，可以通過抗體介導(dǎo)的細(xì)胞依賴的細(xì)胞毒作用(antibodydependentcellmediatedcytotoxicity,adcc)發(fā)揮作用。已知自身免疫性疾病是由于自體免疫系統(tǒng)失衡造成，自體免疫細(xì)胞主要包括b細(xì)胞以及t細(xì)胞。b細(xì)胞的主要功能是介導(dǎo)體液免疫，由于b細(xì)胞在自身免疫性疾病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要的作用，因此，清除b細(xì)胞，對(duì)于aid的治療會(huì)產(chǎn)生有利的影響；cd20是b細(xì)胞的特異性標(biāo)記，抗b細(xì)胞單克隆抗體(抗cd20)，是由鼠抗人cd20b細(xì)胞雜交瘤的可變區(qū)融合與人的igg和κ-恒定區(qū)所構(gòu)成；抗cd20單抗可以通過激活內(nèi)源性和外源性凋亡途徑觸發(fā)b細(xì)胞凋亡達(dá)到治療目的。此外，還有研究者針對(duì)t細(xì)胞的清除展開研究，顯示了cd3特異性抗體，與tcr-cd3復(fù)合物相結(jié)合，阻斷t細(xì)胞的功能，起到免疫抑制的作用；但是，上述單抗是對(duì)整體b細(xì)胞和t細(xì)胞的清除，同接受免疫抑制劑一樣，容易引發(fā)重癥感染。

1型糖尿病(t1dm)又稱胰島素依賴型糖尿病，是由于機(jī)體產(chǎn)生異常自身免疫應(yīng)答引起胰島β細(xì)胞損傷，胰島素分泌減少的一類疾病。由于多數(shù)患者都在兒童或青少年期發(fā)病，一旦發(fā)病就意味著患者終身需要胰島素治療，其疾病防控的意義毋庸置疑。

研究顯示，糖尿病自身抗體是1型糖尿病人在發(fā)病的過程中出現(xiàn)的一類抗自身抗原的免疫球蛋白，主要包括胰島細(xì)胞胞漿自身抗體(ica)，谷氨酸脫羧酶抗體(gada)，胰島素瘤相關(guān)抗原2自身抗體(ia-2a)，胰島素自身抗體(iaa)。wenzlau等通過對(duì)223例新發(fā)t1dm患者的研究發(fā)現(xiàn)，ia-2a、gada、iaa和znt8a四抗聯(lián)合檢測的陽性率為98.2％。這些抗體的出現(xiàn)為診斷1型糖尿病提供依據(jù)，同時(shí)也使得產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞被破壞，使胰島素產(chǎn)生減少，胰島素絕對(duì)量的降低，使患者不得不用外源性胰島素維持體內(nèi)血糖的穩(wěn)定；胰島素是β細(xì)胞特異性的抗原，所以iaa被認(rèn)為是針對(duì)β細(xì)胞的特異性的抗體。

目前該類免疫介導(dǎo)型糖尿病尚無很好的預(yù)防措施，較為廣泛的治療方法是使用免疫抑制性藥物，包括抗cd3抗體、抗cd20抗體以及兩者的共同應(yīng)用，這是針對(duì)整個(gè)免疫系統(tǒng)的免疫抑制，會(huì)使得全部的t細(xì)胞或者b細(xì)胞減少，這勢必會(huì)影響機(jī)體正常的免疫保護(hù)功能。近年來，關(guān)于抗抗體治療的方法逐漸得到重視。wangx研究發(fā)現(xiàn)，特異性識(shí)別gad65ab的b96.11表位的人單克隆抗體的應(yīng)用可明顯推遲nod小鼠自身免疫型糖尿病的發(fā)生。這類采用抗gada獨(dú)特型的單克隆抗體，抑制自身抗原gad65與自身抗體的結(jié)合，從而對(duì)糖尿病的發(fā)病能夠起到預(yù)防。preety等在2014年的美國糖尿病科學(xué)年會(huì)上表示，針對(duì)nod小鼠注射多克隆的正常小鼠igm能夠阻斷胰島素自身抗體的產(chǎn)生，從而達(dá)到預(yù)防疾病的目的。

此外，已有文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)nod小鼠給予抗自身抗體的抗血清，可以明顯降低該小鼠糖尿病的發(fā)病率，延緩發(fā)病進(jìn)程，減輕發(fā)病的程度。但是以上血清成分并不單一，且fc段具有免疫原性?；谏鲜鲈?，為了更好地獲得治療性的單一的抗抗體，本申請(qǐng)的發(fā)明人擬構(gòu)建抗自身抗體fab抗體庫，為進(jìn)一步獲得治療性抗體打下基礎(chǔ)。

關(guān)于噬菌體抗體庫技術(shù)：1985年，smith等首次報(bào)道了將ecori核酸內(nèi)切酶基因克隆到絲狀噬菌體fd外殼蛋白基因iii中，與外殼蛋白融合表達(dá)并呈現(xiàn)在噬菌體表面上，宣告了噬菌體展示技術(shù)的誕生。噬菌體抗體庫技術(shù)是在噬菌體展示技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。將抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)基因通過pcr擴(kuò)增后，克隆到載體pcomb3，與噬菌體外殼蛋白iii相連接形成的融合蛋白，然后通過特定的步驟在膜上組裝成有活性的fab抗體。噬菌體抗體庫技術(shù)是將噬菌體展示技術(shù)應(yīng)用于抗體庫技術(shù)所取得的一大進(jìn)展。這種噬菌體顆粒可以特異識(shí)別抗原，而且可以感染宿主菌進(jìn)行再擴(kuò)增，經(jīng)過多步“吸附-洗脫-擴(kuò)增”過程可富集出特異性的抗體。相對(duì)于單克隆抗體而言，它用細(xì)菌克隆取代b細(xì)胞克隆表達(dá)抗體，不需要經(jīng)過細(xì)胞融合，可制備出針對(duì)任何抗原的抗體分子。而且利用該技術(shù)制備的多數(shù)為抗體片段，缺乏fc段，穿透性強(qiáng)，體內(nèi)循環(huán)半衰期短及免疫原性低，易于攜帶放射性核素或細(xì)胞毒性藥物進(jìn)行導(dǎo)向診斷和治療。目前，治療性抗體已在腫瘤、器官移植排斥反應(yīng)、病毒感染、血液性疾病等的臨床診斷和治療中，顯示出了廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的在現(xiàn)狀，擬提供獲得人工自身抗體或者其類似物及其方法，用于自身免疫性疾病的篩查、診斷和預(yù)后判斷；獲得抗自身抗體的抗體或者其類似物及其方法，用于與自身抗體特異性結(jié)合，中和自身抗體并誘導(dǎo)機(jī)體防御系統(tǒng)殺滅能產(chǎn)生和攜帶自身抗體的細(xì)胞。具體的，本發(fā)明提供一種制備克隆化自身抗體及其類似物的新方法和一種制備特異性的抗自身抗體的抗體及其類似物的方法，利用這些方法得到的抗自身抗體的抗體可以應(yīng)用于1型糖尿病等的自身免疫性疾病的治療以及其他臨床和實(shí)驗(yàn)室的研究。

本發(fā)明提供了一種制備自身抗原特異性結(jié)合物的方法；

進(jìn)一步提供用制得的特異性結(jié)合物作為抗原篩選獲得具有抗自身抗體的抗體特性的化合物或抗體類似物及其制備方法。

具體的，本發(fā)明提供了一種應(yīng)用噬菌體抗體庫技術(shù)制備具有天然自身抗體特征的化合物的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)應(yīng)用自身抗原在天然噬菌體抗體庫中進(jìn)行篩選；

(2)獲取表達(dá)具有天然自身抗體特征的化合物的噬菌體單個(gè)克隆；

(3)通過擴(kuò)增分離純化得到具有天然自身抗體特征的化合物。

本發(fā)明中，制備的自身抗體或者具有天然自身抗體特征的化合物，包括抗胰島素自身抗體化合物且不限于此類自身免疫疾病自身抗體及其類似物。

本發(fā)明中，進(jìn)一步提供了一種構(gòu)建抗自身抗體的抗體及其類似物的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)用天然自身抗體或制得的自身抗體及其類似物作為抗原；

(2)構(gòu)建抗自身抗體的抗體及其類似物的噬菌體抗體庫；

(3)用上述自身抗體或者其其類似物作為抗原在所述的抗體庫中篩選獲得抗自身抗體的抗體或者其類似物的噬菌體單個(gè)克??；

(4)通過擴(kuò)增分離純化得到抗自身抗體的抗體或者其類似物。

本發(fā)明中，所述的制備的自身抗體的抗體或者其類似物，包括抗人胰島素自身抗體的抗體或者其類似物但不限于此類自身免疫性疾病的抗抗體或者其類似物。

本發(fā)明中，按上述應(yīng)用噬菌體抗體庫技術(shù)制備具有天然自身抗體特征的化合物的方法獲得表達(dá)自身抗體或者其類似物的噬菌體。

本發(fā)明中，按上述構(gòu)建抗自身抗體的抗體及其類似物的方法獲得表達(dá)抗自身抗體的抗體或者其類似物的噬菌體。

更具體的，為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案包括以下步驟：

1.制備克隆化自身抗體

(a)用人胰島素作為抗原包被免疫淘篩管；

(b)應(yīng)用成熟的人天然噬菌體fab抗體庫進(jìn)行淘選；

(c)將步驟(b)中淘選出的多克隆抗體進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測；

(d)將步驟(c)中多克隆抗體涂板后分離單個(gè)克隆進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測；

(e)將步驟(d)中與抗原結(jié)合能力強(qiáng)的抗體擴(kuò)增純化；

(f)將步驟(e)中純化的抗體與抗原進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，結(jié)合能力高的為胰島素自身抗體。

采用本發(fā)明的方法生產(chǎn)胰島素抗體：

(1)獲得的抗體能夠與胰島素抗原發(fā)生特異性結(jié)合；

(2)抗體的fab段，包含重鏈的v區(qū)和ch1區(qū)和完整的輕鏈。

2.制備特異性抗自身抗體的抗體

(a)用nod小鼠血清igg(含自身抗體)，免疫與nod背景相同的icr小鼠，測定效價(jià)后，獲取小鼠脾臟細(xì)胞rna；

(b)rt-pcr擴(kuò)增抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因；

(c)將步驟(b)中擴(kuò)增的輕鏈基因與載體連接后共同轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主菌，細(xì)菌涂板；

(d)將步驟(c)中涂板的單個(gè)克隆進(jìn)行抽質(zhì)粒、酶切和測序鑒定；

(e)將步驟(c)中輕鏈和載體連接的產(chǎn)物與重鏈連接后共同轉(zhuǎn)化入宿主菌，細(xì)菌涂板；

(f)將步驟(c)中涂板的單個(gè)克隆進(jìn)行抽質(zhì)粒、酶切和測序鑒定；

(g)將上述自身抗體作為抗原采用噬菌體抗體篩選技術(shù)，利用吸附－洗脫－擴(kuò)增的方法，獲得抗自身抗體的抗體；

(h)將步驟(g)獲得的抗抗體與自身抗體進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)，結(jié)合能力高的為抗胰島素自身抗體的抗體。

采用本發(fā)明的方法制得的抗胰島素抗體的抗體特性包括：

(1)獲得的抗體能夠與胰島素抗體發(fā)生特異性結(jié)合；

(2)抗體的fab段，包含重鏈的v區(qū)和ch1區(qū)和完整的輕鏈；

(3)是獨(dú)特型抗體，針對(duì)抗體的可變區(qū)形成抗體，特異性強(qiáng)。

本發(fā)明的實(shí)施例中通過下述方法制備具有自身抗體或類似抗自身抗體的抗體的化合物：

首先，通過將胰島素作為自身抗原，利用噬菌體篩選技術(shù)通過吸附-洗脫-擴(kuò)增的過程富集抗胰島素自身抗體或者其類似物；

其次，將含有自身抗體的igg免疫icr背景小鼠，獲取脾臟rna，逆轉(zhuǎn)錄為cdna；

進(jìn)一步，按美scripps研究所鼠源抗體庫構(gòu)建的引物設(shè)計(jì)，將上述獲取的cdna基于pcr的基因合成方法(pcr-basedgenesynthesis)合成抗體fab輕鏈(k鏈)和重鏈(fd段)基因的序列，引物序列如seqidno.1所示；

seqno1.

用于擴(kuò)增鼠源性iggfab段基因的引物

然后，構(gòu)建含有抗體fab輕鏈(k鏈)和重鏈(fd段)的基因與pcomb3噬菌粒載體的表達(dá)載體，k鏈基因和fd段基因與載體之間分別通過saci/xbai和xhoi/spei雙酶切后插入，輕鏈及重鏈fd的表達(dá)均受lacz啟動(dòng)子控制。

接下來，將上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)入xl1-blue菌中，通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法，將帶有抗體fab輕鏈(k鏈)和重鏈(fd段)的基因與pcomb3噬菌粒載體整合到xl1-blue菌中，篩選和培養(yǎng)出帶有上述融合基因的轉(zhuǎn)基因菌株，所述菌株在輔助噬菌體的作用下能夠產(chǎn)生fab抗體；并且，該抗體經(jīng)elisa和測序鑒定，所述的抗體具有正確的生物學(xué)活性；

最后重復(fù)上述噬菌體篩選技術(shù)通過吸附-洗脫-擴(kuò)增的過程富集抗胰島素自身抗體的抗體。

本發(fā)明制得的抗胰島素抗體的抗體具有下述特性：

獲得的抗體能夠與胰島素抗體發(fā)生特異性結(jié)合；抗體的fab段，包含重鏈的v區(qū)和ch1區(qū)和完整的輕鏈；獲得的抗體是獨(dú)特型抗體，針對(duì)抗體的可變區(qū)形成抗體，特異性強(qiáng)。

圖說明

圖1是制備自身抗體的方法示意圖。

圖2是抗人胰島素自身抗體的噬菌體抗體庫構(gòu)建流程。

圖3是pcomb3載體示意圖及其單酶切結(jié)果。

圖4是pcr擴(kuò)增的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因。

圖5是pcomb3和輕鏈雙酶切結(jié)果。

圖6是輕鏈庫連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細(xì)菌菌落生長情況。

圖7是輕鏈庫雙酶切鑒定結(jié)果。

圖8是抗體庫的菌落生長情況。

圖9是多克隆涂板分離單個(gè)克隆elisa結(jié)果。

圖10是純化的自身抗體與抗原elisa結(jié)果。

圖11是自身抗體純化sds-page結(jié)果(還原和非還原)。

圖12是單克隆抗抗體噬菌體elisa的篩選結(jié)果。

圖13是特異性抗抗體elisa檢測。

圖14是抗抗體與抗體z-dock結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式作詳細(xì)說明：本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，旨在進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明所要保護(hù)的范圍。

下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

本發(fā)明實(shí)驗(yàn)采用的實(shí)驗(yàn)材料包括：

菌株及載體：xl1-blue(北京寶科維有限公司)；輔助噬菌體(北京寶科維有限公司)；pcomb3載體(北京寶科維有限公司)；

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：icr雌性小鼠(中國科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)；nod雌性小鼠(中國科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)；

培養(yǎng)基：luria-bertani(lb)液體培養(yǎng)基：1％(w/v)胰蛋白胨(oxiod)，0.5％(w/v)酵母抽提物(安琪酵母公司)，1％(w/v)氯化鈉(genebase)，ph7.0，121℃滅菌20min；對(duì)于其固體培養(yǎng)基，在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分中再加入1.5％瓊脂粉(genebase)；

soc液體培養(yǎng)基：0.5％(w/v)酵母抽提物(angelyeast)，0.05％(w/v)氯化鈉(genebase)2％(w/v)蛋白胨(bd)，2.5mmkcl，10mmmgcl2，20mm葡萄糖(genebase)，121℃滅菌20min；對(duì)于其固體培養(yǎng)基，在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分中再加入1.5％瓊脂粉(genebase)；

分子生物學(xué)試劑及材料：限制性內(nèi)切酶：saci、xbai、xhoi、spei、nhei、noti(newenglandbiolabs)；dna聚合酶：primestarhsdnapolymerase(takara)；dna連接酶：t4dnaligase(promega)；dna引物：生工生物工程(上海)股份有限公司；

噬菌體篩選純化相關(guān)試劑及材料：hrp標(biāo)記的鼠抗flag抗體(sigma)；mops(生工生物工程(上海)股份有限公司)；peg8000(生工生物工程(上海)股份有限公司)；超濾管：截留量100kda(millipore)；蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒(bio-rad)；

變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑：丙烯酰胺(genebase)、過硫酸銨(amresco)、trisbase(genebase)、鹽酸(國藥集團(tuán))、temed(genebase)、甘氨酸(genebase)、電泳緩沖液、考馬斯亮藍(lán)染色液(碧云天)；

小鼠免疫相關(guān)材料和試劑:佐劑：freund'sadjuvant(sigma)；抗體：驢抗小鼠hrp標(biāo)記單抗(jackson)；tmb底物(sigma)、1m硫酸(國藥)、pbs溶液、pbst+1％bsa溶液；

實(shí)驗(yàn)儀器:pcr儀：tanoan公司:恒溫培養(yǎng)箱：dnp-9162(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司):恒溫水浴鍋：dk-8d(上海一恒科學(xué)儀器有限公司):冰箱：4℃、-20℃(haier):低溫冰箱：-80℃mdfu53v(sanyo):搖床：thz-03mzr(shenergybiocolor):常溫臺(tái)式離心機(jī)：5415d(eppendorf):冷凍臺(tái)式離心機(jī)：ct15re(hitachi):冷凍落地式離心機(jī)：5810r(eppendorf):超速離心機(jī)：optimal-80xp(beckman):生物安全柜：hr40-iia2(haier):電泳儀：esp300(tanon):酶標(biāo)儀：imarkmicroplatereader(bio-rad)。

實(shí)施例1利用噬菌體庫篩選胰島素抗體

用溶于100μlpbs的胰島素抗原(10ug)包被，4℃過夜，用pbs洗滌并用3％mpbs封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，37℃1h，用pbs洗滌加入100μl滴度為10¹²噬菌體抗體，37℃孵育，用pbst洗滌后加入對(duì)數(shù)生長期tg1，37℃孵育，加入800μl三乙胺，將洗脫液轉(zhuǎn)移至1個(gè)新試管中，并立刻tris-hcl(ph7.4)中和并混勻，將tg1、洗脫液以及tg1合并至一管，37℃孵育，加入終濃度2％的葡萄糖和100ug/μl的氨芐青霉素，37℃搖床1h，加入輔助噬菌體，37℃孵育30min，加入抗性后，30℃搖床過夜擴(kuò)增，上述細(xì)菌回收進(jìn)行第二輪篩選，循環(huán)往復(fù)4輪(實(shí)驗(yàn)步驟如圖1所示)。

實(shí)施例2nod小鼠igg免疫icr小鼠獲得脾臟rna

(1)免疫小鼠：將純化得到的nod血清igg溶于pbs溶液(2mg/ml)，伴以等體積的佐劑，隨機(jī)取6周齡雌性icr小鼠若干，共三組，第一、二組分別接種nod及icr200ug/只，第三組(陰性對(duì)照)注射pbs溶液0.2ml/只，每周取血制備血清樣本凍存，每隔14天強(qiáng)化免疫一次；

(2)測定免疫效價(jià)：在96孔板上包被抗原(50ug/孔)，4℃過夜，使用pbst+1％bsa溶液37℃封閉1小時(shí)，使用pbst溶液清洗3次，加入上述三組血清樣本(使用10被稀釋度梯度稀釋，n＝3)，37℃孵育1小時(shí)，使用pbst溶液清洗3次，加入山羊抗鼠hrp標(biāo)記單抗(稀釋度1∶5000)，37℃孵育1小時(shí)，使用pbst溶液清洗7次，加入tmb底物反應(yīng)，10分鐘后使用1m硫酸終止反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀在od450處運(yùn)用終點(diǎn)計(jì)量法檢測數(shù)值；

(3)脾細(xì)胞rna獲?。杭訌?qiáng)免疫后的3天，取免疫效果好的2只小鼠立即處死，迅速取出脾臟，分離脾細(xì)胞。pbs漂洗2次，棄上清，并進(jìn)行淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，按每管5x10⁶個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)入1.5mldepc水處理過的eppendorf管中。加入1mltrizol，室溫下在搖床上搖動(dòng)15min使細(xì)胞裂解，加入200μl氯仿，劇烈振蕩ep管使溶液呈乳白色，室溫靜置5min。4℃，12000rpm離心15min，以去除蛋白；此時(shí)分為三層：水相，中間相，有機(jī)相；小心吸取上層水相，轉(zhuǎn)移至另一新1.5mlep管中，加入500μl異丙醇輕輕混勻，-20℃靜置過夜使rna充分沉淀；4℃12000rpm離心10min，小心倒掉上清，保留沉淀；在沉淀中加入1ml冰預(yù)冷的75％乙醇(depc水配置)，輕輕洗滌，懸浮白色沉淀，4℃，7500rpm離心15min，小心倒掉上清，再用小離心機(jī)離心，用20ul移液器將乙醇吸掉倒扣在干凈的吸水紙上，5min左右，使rna恰好干燥。將干燥后的rna溶于適量的depc水中，使rna溶解至澄清，測定樣品的濃度：nanodrop測量儀檢測產(chǎn)物濃度；立即進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄或?qū)悠贩盅b、保存于-80℃。

實(shí)施例3對(duì)載體pcomb3進(jìn)行單酶切鑒定

用saci、xbai、xhoi、spei、nhei、noti分別酶切pcomb3載體，證實(shí)載體序列的正確性(如圖8所示)。

實(shí)施例4抗體fab輕鏈(k鏈)和重鏈(fd段)的基因

在無rna酶的1.5mlep管中加入2ugrna和1μloligo(dt)/(0.5μg/μl)，加水至總體積12μl，輕輕混勻，65℃預(yù)變性5min，結(jié)束后立即冰上放置；加入5×reactionbuffer、ribolockri和revertaid后42℃孵育60min，70℃孵育5min，然后立即冰上冷卻；以cdna第1鏈為模板，分別加入輕鏈k和重鏈fd段的3’端及5’端各自pcr引物，在taqdna聚合酶作用下擴(kuò)增輕鏈和重鏈片段。反應(yīng)條件：94℃for10s,(94℃for30sec,59℃for35sec,72℃for1min)×35cycles,72℃for5min。反應(yīng)產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳分離得到約700bp的片段(如圖4所示)。

實(shí)施例5制備含有抗體fab輕鏈(k鏈)和重鏈(fd段)的基因與pcomb3噬菌粒載體的表達(dá)載體

用saci和xbai雙酶切上述輕鏈和pcomb3載體(如圖5所示)，將得到的約700bp片段連接到同樣酶切的pcomb3載體中，得到載體pcomb3+k；載體pcomb3和輕鏈k的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化xl1-blue菌，涂板后平板上布滿大量細(xì)菌克隆(如圖6所示)，用xhoi和spei雙酶切重鏈fd段和含有k基因的質(zhì)粒pcomb3+k(如圖7所示)，將得到的約700bpfd片段連接到同樣酶切的載體pcomb3+k中，得到載體pcomb3+k+fd(如圖2所示)，將載體pcomb3+k和重鏈fd的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化xl1-blue菌，涂板后平板上布滿大量細(xì)菌克隆(如圖8所示)。

實(shí)施例6抗體庫的擴(kuò)增

上述產(chǎn)物回收連接后，化學(xué)法轉(zhuǎn)化入宿主菌，將菌液轉(zhuǎn)入10mlsb培養(yǎng)基(含20ug/mlamp)，再37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)1h，加入100mlsb培養(yǎng)基(含100ug/mlamp和10ug/mltet)，再37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)1h，加輔助噬菌體vcsml3溶液，37℃振蕩培養(yǎng)2h，加入kan至終濃度為70ug/ml，37℃，250rpm，振蕩培養(yǎng)過夜，將過夜培養(yǎng)的菌液4℃，4000rpm離心15min，上清轉(zhuǎn)入另一無菌離心管中，加入peg8000/nacl，使兩者終濃度分別為40g/l和30g/l，置于恒溫振蕩器上振蕩5min以促溶，再冰浴30min使噬菌體沉。4℃，9000rpm離心20min，棄上清，2mlpbs重懸噬菌體沉淀，瞬時(shí)離心，上清即為fab噬菌體抗體庫，-20℃保存。

實(shí)施例7篩選特異性單克隆抗體

按實(shí)施例1的方法進(jìn)行抗體篩選，在第四輪篩選富集到的噬菌體中，隨機(jī)挑選96個(gè)噬菌體克隆進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)其與胰島素抗原行elisa測定，篩選到5個(gè)噬菌體克隆顯示出與抗原的高結(jié)合性(如圖9所示)。

實(shí)施例8特異性胰島素單克隆抗體的elisa檢測

利用胰島素作為包被蛋白，bsa為對(duì)照抗原，結(jié)果顯示，僅i389和i34抗胰島素抗體與胰島素的結(jié)合呈劑量依賴關(guān)系，即隨著抗體濃度的下降，od405也隨之下降(如圖10所示)。

實(shí)施例9自身抗體純化sds-page電泳

不連續(xù)tricine-sds-聚丙烯酰胺凝膠在bio-red公司的垂直電泳裝置中進(jìn)行電泳分離，條件為60v電泳1小時(shí)后改為100v電泳至溴酚藍(lán)條帶跑出凝膠，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色液染色顯示，在還原條件下，在相對(duì)分子量55kd處出現(xiàn)特異性條帶；在非還原條件下，在相對(duì)分子量約為25kd處出現(xiàn)特異性條帶；陰性對(duì)照未出現(xiàn)任何條帶(如圖11所示)。

實(shí)施例10抗自身抗體的抗體的elisa檢測

用胰島素抗體作為抗原，按實(shí)施例1的方法進(jìn)行篩選，在第四輪篩選富集到的噬菌體中，隨機(jī)挑選96個(gè)噬菌體克隆進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)其與胰島素抗原行elisa測定，篩選到4個(gè)噬菌體克隆顯示出與抗原的高結(jié)合性(如圖12所示)。

實(shí)施例11特異性單克隆抗體的elisa檢測

利用實(shí)施例5獲得的胰島素抗體作為包被蛋白，結(jié)果顯示，僅i3349抗胰島素抗體的抗體與i389胰島素抗體的結(jié)合呈劑量依賴關(guān)系，即隨著抗體濃度的下降，od405也隨之下降，另外，抗胰島素抗體與1型糖尿病病人血清e(cuò)lisa檢測呈陽性反應(yīng)(如圖13所示)。

實(shí)施例12

抗胰島素抗體與自身抗體經(jīng)過zdock預(yù)測結(jié)合狀態(tài)及結(jié)合位點(diǎn)如圖14所示。

seqno1.

用于擴(kuò)增鼠源性iggfab段基因的引物

sequencelisting

<110>復(fù)旦大學(xué)

<120>具有自身抗體或類似抗自身抗體的抗體的化合物及其制備方法

<160>20

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>30

<212>dna

<213>重鏈可變區(qū)3'端引物-igg1

<400>1

aggcttactagtacaatccctgggcacaat30

<210>2

<211>27

<212>dna

<213>重鏈可變區(qū)3'端引物-igg2a

<400>2

gttctgactagtgggcactctgggctc27

<210>3

<211>30

<212>dna

<213>重鏈可變區(qū)3'端引物-igg3

<400>3

gggggtactagtcttgggtattctaggctc30

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>重鏈可變區(qū)5'端引物-hc1

<400>4

aggtccagctgctcgagtctgg22

<210>5

<211>22

<212>dna

<213>重鏈可變區(qū)5'端引物-hc2

<400>5

aggtccagctgctcgagtcagg22

<210>6

<211>22

<212>dna

<213>重鏈可變區(qū)5'端引物-hc3

<400>6

aggtccagcttctcgagtctgg22

<210>7

<211>22

<212>dna

<213>重鏈可變區(qū)5'端引物-hc4

<400>7

aggtccagcttctcgagtcagg22

<210>8

<211>22

<212>dna

<213>重鏈可變區(qū)5'端引物-hc5

<400>8

aggtccaactgctcgagtctgg22

<210>9

<211>22

<212>dna

<213>重鏈可變區(qū)5'端引物-hc6

<400>9

aggtccaactgctcgagtcagg22

<210>10

<211>22

<212>dna

<213>重鏈可變區(qū)5'端引物-hc7

<400>10

aggtccaacttctcgagtctgg22

<210>11

<211>22

<212>dna

<213>重鏈可變區(qū)5'端引物-hc8

<400>11

aggtccaacttctcgagtcagg22

<210>12

<211>21

<212>prt

<213>重鏈可變區(qū)5'端引物-hc9

<400>12

alaglyglythrilealailecysthrilecysthrcysglyalagly

151015

thrcystrpglygly

20

<210>13

<211>34

<212>dna

<213>k鏈可變區(qū)3'端引物-ck

<400>13

gcgccgtctagaattaacactcattcctgttgaa34

<210>14

<211>32

<212>dna

<213>k鏈可變區(qū)5'端引物-lc1

<400>14

ccagttccgagctcgttgtgactcaggaatct32

<210>15

<211>32

<212>dna

<213>k鏈可變區(qū)5'端引物-lc2

<400>15

ccagttccgagctcgtgttgacgcagccgccc32

<210>16

<211>32

<212>dna

<213>k鏈可變區(qū)5'端引物-lc3

<400>16

ccagttccgagctcgtgctcacccagtctcca32

<210>17

<211>32

<212>dna

<213>k鏈可變區(qū)5'端引物-lc4

<400>17

ccagttccgagctccagatgacccagtctcca32

<210>18

<211>29

<212>dna

<213>k鏈可變區(qū)5'端引物-lc5

<400>18

ccagatgtgagctcgtgacccagactcca29

<210>19

<211>32

<212>dna

<213>k鏈可變區(qū)5'端引物-lc6

<400>19

ccagatgtgagctcgtcatgacccagtctcca32

<210>20

<211>29

<212>dna

<213>k鏈可變區(qū)5'端引物-lc7

<400>20

ccagttccgagctcgtgacacagtctcca29