一種分離純化含幾丁質結合結構域的融合蛋白的方法
【專利摘要】本發(fā)明將一種部分脫乙?；膸锥≠|衍生物應用于分離純化含幾丁質結合結構域(Chitin?Binding?Domain，CBD)的融合蛋白。其原理是通過NaOH堿液加熱處理，使幾丁質發(fā)生脫乙酰作用，此后再通過乙酸處理使其乙?；瑥亩玫讲糠置撘阴；膸锥≠|衍生物，將這種部分脫乙?；膸锥≠|衍生物應用于分離純化含幾丁質結合結構域的融合蛋白，可以很好地改善其對含有幾丁質結合域(Chitin?Binding?Domain，CBD)的融合蛋白的特異性吸附效果。
【專利說明】一種分離純化含幾丁質結合結構域的融合蛋白的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程產(chǎn)品下游分離純化領域，涉及將部分脫乙酰的幾丁質衍生物應用于特異性吸附分離純化含幾丁質結合結構域(Chitin Binding Domain,CBD)的融合蛋白。
【背景技術】
[0002]當采用基因工程技術表達一些外源性多肽或小分子蛋白時，表達產(chǎn)物往往會由于被宿主細胞內的蛋白酶降解而造成表達量大大降低。為了有效解決這一問題，目前普遍采用融合表達技術。所謂融合表達就是通過基因重組技術將外源小分子蛋白(多肽)拼接于融合伴侶(標簽)下游進行表達，然后通過酶切或化學切割釋放出目的小分子蛋白(多肽)的技術。在進行基因拼接融合時應保持目的小分子蛋白(多肽)編碼基因與融合伴侶(標簽)編碼基因閱讀框架一致。此外，在融合伴侶與目的蛋白(多肽)之間需要設計I個或I個以上的蛋白酶切位點(如腸激酶切割位點)或化學切割位點或可以自己切割的蛋白內含子(intein)，這樣就可以在融合蛋白表達出來之后通過酶切或化學切割或誘導自切割等手段釋放出目的小分子蛋白(多肽)。
[0003]采用融合伴侶(標簽)進行融合表達的優(yōu)點在于:⑴對分子量較小的外源目的小分子蛋白(多肽)進行融合表達可增強表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性，減少或避免宿主細胞蛋白酶對表達產(chǎn)物的降解；(2)某些融合伴侶(標簽)可以增強目的蛋白或多肽的可溶性；(3)方便目的蛋白的分離純化。
[0004]目前普遍使用在低等生物或細菌中，以可溶性狀態(tài)高表達的蛋白作為融合伴侶(標簽)以提高目的小分子蛋白(多肽)的表達量、可溶性及穩(wěn)定性，采用的融合伴侶(標簽)有曼氏血吸蟲谷胱甘肽-S-轉移酶(GST，28kDa)、大腸桿菌麥芽糖結合蛋白(MBP，40kDa)、蛋白二硫化物異構酶(NusA, 55kDa)、大腸桿菌二硫鍵異構酶(Dsb A,21kDa)等。
[0005]除了上述融合伴侶以外，環(huán)狀芽孢桿菌幾丁質結合結構域(Chitin BindingDomain, CBD, 5kDa)也是一種較為理想的分子融合伴侶，與之進行融合表達的產(chǎn)物便可以通過與幾丁質的特異性吸附進行分離純化。
[0006]然而，天然幾丁質是一種由N-乙酰氨基葡萄糖以β_1，4糖苷鍵組成的直鏈多聚體，性質比較穩(wěn)定，不溶于水、稀堿、稀酸以及大部分有機溶劑，直接應用于含幾丁質結合域融合蛋白的分離純化其吸附效果往往不夠理想。
[0007]由于天然幾丁質結構中含有大量的-OH和-ΝΗ2基團，可以對其進行化學修飾制備各種衍生物，以改善其理化性質。為此，本發(fā)明通過將幾丁質進行脫乙?；饔靡约耙阴；饔脤ζ浠罨?，將之應用于含幾丁質結合結構域的融合蛋白的吸附分離純化，大大改善了其對含有幾丁質結合結構域的融合蛋白的吸附效果。

【發(fā)明內容】

[0008]本發(fā)明將一種部分脫乙?；膸锥≠|衍生物應用于分離純化含幾丁質結合結構域(Chitin Binding Domain, CBD)的融合蛋白。其原理是通過NaOH堿液加熱處理,使幾丁質發(fā)生脫乙酰作用，此后再通過乙酸處理使其乙?；?，從而得到部分脫乙?；膸锥≠|衍生物，將這種部分脫乙?；膸锥≠|衍生物應用于分離純化含幾丁質結合結構域的融合蛋白，可以很好地改善了其對含有幾丁質結合結構域(Chitin Binding Domain, CBD)的融合蛋白的特異性吸附效果。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1、本發(fā)明構建的pTWINl-lun融合表達質粒圖譜。CBD:幾丁質結合結構域(Chitin Binding Domain, CBD)基因；intein splicing site 為 Ssp DnaB 蛋白內含子自切割位點；LUN為Iunasin編碼基因
[0010]圖2、CBD_Ssp DnaB intein-lunasin融合蛋白的基因編碼序列。CBD:幾丁質結合結構域基因序列；Ssp DnaB intein:可自切割的蛋白內含子基因序列；lunasin:lunasin
編碼基因
[0011]圖 3、融合蛋白 CBD-Ssp DnaB intein-lunasin 在培養(yǎng)基中表達的 15% SDS-PAGE電泳圖。泳道M:分子量標準蛋白質(kDa)，分子量分別為116.0, 66.2，45.0, 35.0, 25.0, 18.4，14.4(自上而下)；泳道1:未經(jīng)乳糖誘導的發(fā)酵液菌體破菌上清；泳道2:經(jīng)0.2% (w /V)乳糖誘導表達的發(fā)酵液菌體破菌上清
[0012]圖 4、融合蛋白 CBD-Ssp DnaB intein-lunasin 的 Western Blot 鑒定分析圖譜。一抗為兔抗Iunasin抗體，二抗為羊抗兔抗體。泳道1:大腸桿菌宿主菌E.coli BL21(DE3)發(fā)酵液菌體破菌上清(對照組);泳道2:工程菌pTWINl-lun / E.coli BL21(DE3)經(jīng)0.2%(w / v)乳糖誘導表達的發(fā)酵液菌體破菌上清
[0013]圖5、本發(fā)明制備的部分脫乙?；膸锥≠|衍生物層析柱純化產(chǎn)物的Tricine / SDS-PAGE電泳圖。泳道M:分子量標準蛋白質(kDa)，分子量分別為100，30，25，20，15，10, 5,3.4(自上而下)；泳道1_4:部分脫乙?；膸锥≠|衍生物層析柱純化產(chǎn)物
[0014]圖6、本發(fā)明制備的部分脫乙?；膸锥≠|衍生物柱層析及RP-HPLC純化后的Iunasin質譜鑒定圖
【具體實施方式】
[0015]實施例1部分脫乙?；膸锥≠|衍生物柱材的制備
[0016]取30g幾丁質(阿拉丁試劑(上海)有限公司)于1000mL燒杯中，加200mL雙蒸水浸泡過夜；傾倒掉雙蒸水，加入500mL2mol / L HCl浸泡2h，抽濾，之后水洗至中性；再加500mL I mol / L NaOH浸泡，并將燒杯至于100°C水浴鍋中水煮lh，抽濾，再水洗至中性；再加500mL0.01mol / LNaOH浸泡，將燒杯至于50°C水浴鍋中水煮lh，抽濾，水洗至中性；再加500mL0.01mol / LCH3COOH,將燒杯至于50°C水浴鍋中水煮0.5h，抽濾，水洗至中性。最后將經(jīng)過處理的幾丁質置于真空干燥器中進行真空干燥處理，真空干燥器溫度不宜超過80°C，完全干燥之后將幾丁質置于研缽中進行研磨，常溫真空干燥保存，備用。
[0017]實施例2含幾丁質結合結構域(Chitin Binding Domain, CBD)的融合蛋白的設計與克隆[0018]根據(jù)Iunasin 多肽的氨基酸序列，采用 OPTIMIZER (http: / / genomes.urv.es/OPTIMIZER)和 Gene Designer (http: / / www.DNA20.com)軟件以及大腸桿菌偏愛的密碼子設計了 Iunasin多肽的基因編碼序列，并在其兩側添加了 Sap I和Pst I酶切位點。通過重疊延伸PCR方法得到了兩側含Sap I和Pst I酶切位點的Iunasin多肽編碼基因序列，并 TA-克隆到 pMD?19-T Simple Vector (TaKaRa Biotech (大連)公司產(chǎn)品)中，Sap I 和Pst I雙酶切后，再亞克隆到pTWINl載體(New England Biolabs公司產(chǎn)品)中，得到重組質粒pTWINl-lun (圖1),其中融合表達基因依次包括幾丁質結合結構域(Chitin BindingDomain, CBD)基因、Ssp DnaB蛋白內含子基因以及Iunasin編碼基因(圖2)。該融合表達質粒轉化大腸桿菌宿主E.coli BL21(DE3)菌感受態(tài)細胞得到pTWINl-lun / E.coliBL21(DE3)基因工程菌。
[0019]實施例3大腸桿菌搖瓶表達CBD-Ssp DnaB intein-lunasin蛋白及產(chǎn)物鑒定 [0020]挑取陽性克隆pTWINl-lun / E.coli BL21(DE3)單菌落至 50ml LBA(LB 培養(yǎng)基中加入25 μ 120% (w / V) Amp)液體種子培養(yǎng)基中，37 °C，220rpm振蕩培養(yǎng)12h之后，種子培養(yǎng)基以1% (V / V)接種量接種于200ml表達培養(yǎng)基中(含80μ1微量元素培養(yǎng)基，100μ120% (w / v)Amp) (1L表達培養(yǎng)基中含甘油25g ;酵母粉15g ;蛋白胨15g ;(NH4)3PO4.3H204g ；KH2P048g ；K2HPO4.3H207g ；MgS04.7H201g ; IL 微量元素培養(yǎng)基中含HC15ml ；CaCl2.2H209g ；CoCl2.6H206g ；CuCl2.2H202.125g ；FeCl3.6H20135g ；H3B030.75g ；MnCl2.4H205g ；Na2MoO4.2H2012g ;Zn05g)，37 °C，220rpm 振蕩培養(yǎng)至 OD600nm = 0.6-0.7，此時加入2ml20% (w / v)乳糖至終濃度為0.2% (w / v)，繼續(xù)37°C，220rpm進行誘導表達3h。CBD-Ssp DnaB intein-lunasin蛋白表達情況如圖3所示。同時，采用兔抗Iunasin多克隆抗體作為一抗，對搖瓶表達產(chǎn)物作Western Blot分析檢測，結果顯示表達的蛋白能與兔抗Iunasin多克隆抗體發(fā)生特異性反應(圖4),說明該蛋白條帶為CBD-Ssp DnaBintein-lunasin 融合蛋白。
[0021]實施例4融合蛋白CBD-Ssp DnaB intein-lunasin在7L發(fā)酵罐中誘導表達
[0022]從高產(chǎn)菌株的平板上挑取單菌落接種至50ml LBA液體培養(yǎng)基中，37°C，220rpm培養(yǎng)12h，此為一級種子液；取2ml —級種子液轉接至200ml LBA液體培養(yǎng)基中，37°C，220rpm培養(yǎng)10h，此為二級種子液。將培養(yǎng)好的200ml 二級種子液，按4%轉接量轉接至7L發(fā)酵罐(瑞士比歐生物工程公司)中，其中含5L已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，IL發(fā)酵培養(yǎng)基中含甘油25g ;酵母粉 15g ;蛋白胨 15g ； (NH4)3PO4.3H204g ；KH2P048g ；Κ2ΗΡ04.3H207g ；MgS04.7H201g ；NaOH調節(jié)pH至7.8。此外，當發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后需向5L發(fā)酵培養(yǎng)基添加微量元素培養(yǎng)基 2ml (1L 微量元素培養(yǎng)基含 HC15ml ；CaCl2.2H209g ；CoCl2.6H206g ；CuCl2.2Η202.125g ；FeCl3.6Η2013.5g ；H3B030.75g ；MnCl2.4H205g ；Na2Mo04.2H2012g ；Zn05g), 8mL20% (w / v)Amp(Kim M,Elvin C, Brownlee A, et al.2007,52(I):230-236.)。
[0023]當OD6tltlnm達到3時，向發(fā)酵罐中添加50ml20% (w / v)乳糖至終濃度為0.2 %(w / V),以誘導目的蛋白表達。同時開始流加碳源(50% (w / V)甘油,0.1% (w / V)MgSO4.7H20,10 % (w / v)乳糖)，通過流加碳源以及調整攪拌速度和通氣量，使溶氧水平維持在40%-60%，此過程約消耗碳源160ml。通過25% (w / w) NH4OH將pH控制在
7.5-8.0。整個發(fā)酵過程持續(xù)約7.5h。在乳糖誘導表達2，3，3.5，4.5h時，取50ml發(fā)酵液離心(5000rpm，4°C，IOmin)，測量細胞濕重、OD600nm等數(shù)據(jù)繪制生長曲線，15% SDS-PAGE分析發(fā)酵過程中蛋白的表達情況。
[0024]實施例5融合蛋白CBD-Ssp DnaB intein-lunasin的親和層析、柱上自切割及目的多肽Lunasin的釋放
[0025]融合蛋白CBD-Ssp DnaB intein-lunasin粗提物的制備:將實施例4發(fā)酵液經(jīng)5000rpm，4°C離心10分鐘，收集菌體，稱量菌體重量，Ig菌體加入IOml破菌緩沖液(20mMTris-HCl, 500mM NaCl, I mM EDTA2Na.2H20, 0.1% (v / v) Triton X-100，pH8.5)，將菌體完全溶解，采用JY92-2D超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)200watts破菌10min(10s超聲破碎，IOs間停，30個循環(huán))，破菌完成后，13000rpm, 4°C離心30min,收集破菌上清，然后用0.22 μ m的超濾膜過濾除去細胞碎片。
[0026]幾丁質衍生物親和層析及柱上自切割:將實施例1制備的幾丁質衍生物裝柱(55_X90mm)，用 10 倍柱體積的平衡緩沖液(20mM Tris-HCl, 500mM NaCl，ImMEDTA2Na.2H20，pH8.5)平衡后，在4 °C條件下，將除去細胞碎片的破菌上清以0.5ml /min的流速常壓上樣；上樣完成后靜置吸附12h左右，在4°C，用10倍柱體積的平衡緩沖液4ml / min洗雜蛋白，再用3倍柱體積的pH調節(jié)緩沖液(20mM Tris-HCl, 500mM NaCl, ImMEDTA2Na.2H20, pH6.5)調節(jié)柱內pH為6.5，之后將幾丁質衍生物柱于16°C靜置40h，誘導融合蛋白發(fā)生自剪切，最后用3倍柱體積的洗脫緩沖液(20mM Tris-HCl, 500mM NaCI，ImMEDTA2Na.2H20，pH6.5)進行洗脫，流速為 Iml / min，分部收集，Tricine / SDS-PAGE 分析后，合并含目的多肽Iunasin的收集液。
[0027]反相高效液相色譜(RP-HPLC)進一步純化:為了制得純度大于95 %的Iunasin樣品，可將經(jīng)過幾丁質衍生物親和層析收集的含目的多肽Iunasin的樣品經(jīng)過RP-HPLC進一步純化。采用Bio-Rad公司DuoF1w制備型高效液相色譜系統(tǒng),色譜柱為KromasilC18(10X250mm)色譜柱， 流動相A相為含0.1% TFA的H2O, B相為含0.1% TFA的CH3CN。洗脫梯度:15% -65% B 相，60min ；65% -100% B 相，5min ;流速為 Iml / min。在 39% -41%B相濃度時，出現(xiàn)Iunasin目的蛋白峰,收集并進行Tricine / SDS-PAGE分析。
[0028]實施例6目的產(chǎn)物質譜分析及生物活性檢測
[0029]經(jīng)部分脫乙?；膸锥≠|衍生物親和層析及制備型RP-HPLC反相色譜分離純化制得的純度大于95%的Iunasin樣品進行質譜分析(中科院上海蛋白質組研究中心上海中科新生命生物技術有限公司完成)，結果顯示測試值與計算機預測的理論分子量完全一致(圖 6)。
[0030]米用MTT 法(Hwang H, Biswas R, Chung P S, et al.Journal of Photochemistryand Photobiology B:Biology, 2013,128:70-77.)對制得的純度大于 95 % 的 Iunasin樣品進行活性分析，結果顯示制備的Iunasin對人結腸癌細胞HCT-116及人乳腺癌細胞MDA-MB-231具有細胞抑制作用，其50%抑制作用(IC5tl)的濃度分別為64.25 μ M和56.73 μ Μ，且呈劑量依賴性。對正常人晶狀體上皮細胞SRA01 / 04沒有毒性作用。
【權利要求】
1.一種將部分脫乙?；膸锥≠|衍生物應用于分離純化含幾丁質結合結構域(ChitinBinding Domain, CBD)的融合 蛋白的方法。
【文檔編號】C07K1/22GK103980344SQ201410139080
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年4月9日 優(yōu)先權日:2014年4月9日
【發(fā)明者】譚樹華, 張怡 申請人:中國藥科大學