一種西那普肽的多肽合成方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種西那普肽的多肽合成方法，包括如下步驟：以2-氯-三苯基氯樹脂起始原料，按照固相合成的方法依次連接具有保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，獲得保護(hù)21肽樹脂，其間依次脫去Fmoc-保護(hù)基團(tuán)，TFA切肽后，獲得粗品，粗品經(jīng)C18柱分離純化，凍干后，制得西那普肽精品。本發(fā)明的方法，工藝穩(wěn)定，原輔材料來源方便，生產(chǎn)周期短，收率高，質(zhì)量穩(wěn)定，生產(chǎn)成本低，接肽收率高，避免使用氟化氫等劇毒試劑，三廢污染少。每步接肽收率均在98.5%以上；切肽后收率為：98.3%，總收率為：47.9%，HPLC測定產(chǎn)品純度為：99.6%。
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及西那普肽的制備方法，尤其涉及固相多肽合成西那普肽的制備方法。 一種西那普肽的多肽合成方法

【背景技術(shù)】
[0002] 西那普肽，英文名：Surfaxin，Sinapultide，分子式：C126H238N 26022 ;CAS 登記號： 138531-07-4 ;分子量：2469. 5 ;碳、氫、氮比例：C :61. 28%，H :9. 71%，N :14. 75%。氨基酸序 列： H-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu -Leu-Leu-Lys-〇H ； 結(jié)構(gòu)式：

【權(quán)利要求】
1. 一種西那普肽的多肽合成方法，其特征在于，包括如下步驟：以2-氯-三苯基氯 樹脂起始原料，按照固相合成的方法依次連接具有保護(hù)基團(tuán)的氨基酸Fmoc-Lys (Boc)-0H、 Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys (Boc)-OH進(jìn)行縮合反應(yīng)，獲得保護(hù)二^ 肽樹脂，其間依次脫去 Fmoc-保護(hù)基團(tuán)，同步進(jìn)行脫側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)；切肽，獲得西那普肽粗品；純化后制得西那普 肽。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述按照固相合成的方法，獲得保護(hù) 二十一肽樹脂，包括如下步驟： 一、 制備 Fmoc-Lys (Boc)-樹脂 1) 取2-氯-三苯基氯樹脂用DMF浸泡，使樹脂充分溶脹，加 DIPEA，F(xiàn)moc-Lys (Boc) -0H， 反應(yīng)，再加甲醇，反應(yīng)； 2) 抽干，分別用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 二、 制備 Fmoc-Leu-Lys (Boc)-樹脂 1) 加脫帽試劑，反應(yīng)，抽干，分別用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 2) 取Fmoc-Leu-0H、HATU、H0At，用接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器，反應(yīng)； 3) 抽干，分別用DMF、甲醇和DMF洗滌三次，抽干； 三、 制備 Fmoc-Leu-Leu-Lys (Boc)-樹脂 1) 加脫帽試劑，反應(yīng)，抽干，分別用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 2) 取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器，反應(yīng)； 3) 抽干，分別用DMF、甲醇和DMF洗滌三次，抽干； 四、 制備 Fmoc-Leu-Leu-Leu-Lys (Boc)-樹脂 1) 加脫帽試劑，反應(yīng)，抽干，分別用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 2) 取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器，反應(yīng)； 3) 抽干，分別用DMF、甲醇和DMF洗滌三次，抽干； 五、 制備 Fmoc-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys (Boc)-樹脂 1) 加脫帽試劑，反應(yīng)，抽干，分別用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 2) 取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器，反應(yīng)； 3) 抽干，分別用DMF、甲醇和DMF洗滌三次，抽干； 六、 制備 Fmoc-Lys (Boc) -Leu-Leu-Leu-Leu-Lys (Boc)-樹脂 1) 加脫帽試劑，反應(yīng)，抽干，分別用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 2) 取 Fmoc-Lys (Boc) -OH、HATU、HOAt，用接肽試劑溶解，反應(yīng)； 3) 抽干，分別用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 七、 制備 Fmoc-Leu-Lys (Boc) -Leu-Leu-Leu-Leu-Lys (Boc)-樹脂 1) 加脫帽試劑，反應(yīng)，抽干，分別用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 2) 取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器，反應(yīng)； 3) 抽干，分別用DMF、甲醇和DMF洗滌三次，抽干； 八、 制備 Fmoc-Leu-Leu-Lys (Boc) -Leu-Leu-Leu-Leu-Lys (Boc)-樹脂 1) 加脫帽試劑，反應(yīng)，抽干，分別用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 2) 取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器，反應(yīng)； 3) 抽干，分別用DMF、甲醇和DMF洗滌三次，抽干； 九、制備 Fmoc-Leu-Leu-Leu-Lys (Boc) -Leu-Leu-Leu-Leu-Lys (Boc)-樹脂 1) 加脫帽試劑，反應(yīng)，抽干，分別用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 2) 取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器，反應(yīng)； 3) 抽干，分別用DMF、甲醇和DMF洗滌三次，抽干； 十、制備 Fmoc-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys (Boc) -Leu-Leu-Leu-Leu-Lys (tBu)-樹月旨 1) 加脫帽試劑，反應(yīng)，抽干，分別用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 2) 取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器，反應(yīng)； 3) 抽干，用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 十一>制備 Fmoc-Lys (Boc) -Leu-Leu-Leu-Leu-Lys (Boc) -Leu-Leu-Leu-Leu-Lys (Boc)- 樹脂 1) 加脫帽試劑，反應(yīng)，抽干，用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 2) 取Fmoc-Lys (Boc) -OH、HATU、HOAt，用接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器，反應(yīng)； 3) 抽干，用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 十二> 制備 Fmoc-Lue-Lys (Boc) -Leu-Leu-Leu-Leu-Lys (Boc) -Leu-Leu-Leu-Leu-Lys (B 〇c)_樹脂 1) 加脫帽試劑，反應(yīng)，抽干，分別用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 2) 取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器，反應(yīng)； 3) 抽干，用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 十三> 制備 Fmoc-Leu-Lue-Lys (Boc) -Leu-Leu-Leu-Leu-Lys (Boc) -Leu-Leu-Leu-Leu-L ys (Boc)-樹脂 1) 加脫帽試劑，反應(yīng)，抽干，分別用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 2) 取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器，反應(yīng)； 3) 抽干，用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 十四 > 制備 Fmoc-Leu-Lue-Lue-Lys (Boc) -Leu-Leu-Leu-Leu-Lys (Boc) -Leu-Leu-Leu-L eu -Lys(Boc)-樹脂 1) 加脫帽試劑，反應(yīng)，抽干，分別用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 2) 取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器，反應(yīng)； 3) 抽干，用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 十五 >制備 Fmoc-Leu-Lue-Leu-Lue-Lys (Boc) -Leu-Leu-Leu-Leu-Lys (Boc) -Leu-Leu-L eu_ Leu-Lys(Boc)-樹脂 1) 加脫帽試劑，反應(yīng)，抽干，分別用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 2) 取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器，反應(yīng)； 3) 抽干，用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 十六> 制備 Fmoc-Lys (Boc) -Leu-Lue-Leu-Lue-Lys (Boc) -Leu-Leu-Leu-Leu-Lys (Boc)-Leu- Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-樹脂 1)加脫帽試劑，反應(yīng)，抽干，用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 2) 取 Fmoc-Lys (Boc) -OH、HATU、HOAt，用接肽試劑溶解，反應(yīng)； 3) 抽干，用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 十七、制備 Fmoc-Lue-Lys (Boc) Leu-Lue-Leu-Lue-Lys (Boc) -Leu-Leu-Leu-Leu-Lys (Bo c) -Leu -Leu-Leu-Leu-Lys (Boc)-樹月旨 1) 加脫帽試劑，反應(yīng)，抽干，分別用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 2) 取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器，反應(yīng)； 3) 抽干，用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 十八、制備 Fmoc-Lue-Lue-Lys (Boc) Leu-Lue-Leu-Lue-Lys (Boc) -Leu-Leu-Leu-Leu-Ly s (Boc) -Leu -Leu-Leu- Leu-Lys (Boc)-樹脂 1) 加脫帽試劑，反應(yīng)，抽干，分別用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 2) 取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器，反應(yīng)； 3) 抽干，用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 十九> 制備 Fmoc-Lue-Lue-Lue-Lys (Boc) Leu-Lue-Leu-Lue-Lys (Boc) -Leu-Leu-Leu-Le u_ Lys (Boc)-Leu-Leu-Leu- Leu-Lys (Boc)-樹月旨 1) 加脫帽試劑，反應(yīng)，抽干，分別用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 2) 取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器，反應(yīng)； 3) 抽干，用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 二十> 制備 Fmoc-Lue-Lue-Lue-Lue-Lys (Boc) Leu-Lue-Leu-Lue-Lys (Boc) -Leu-Leu-Le u- Leu-Lys (Boc) -Leu -Leu-Leu-Leu-Lys (Boc)-樹月旨 1) 加脫帽試劑，反應(yīng)，抽干，分別用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 2) 取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器，反應(yīng)； 3) 抽干，用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 二十一、制備 Fmoc-Lys (Boc) -Lue-Lue-Lue-Lue-Lys (Boc) -Leu-Lue-Leu-Lue-Lys (Boc )-Leu- Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys (Boc)-樹月旨 1) 加脫帽試劑，反應(yīng)，抽干，用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 2) 取 Fmoc-Lys (Boc) -OH、HATU、HOAt，用接肽試劑溶解，反應(yīng)； 3) 抽干，用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 4) 加脫帽試劑，反應(yīng)，抽干，用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 所述接肽試劑為：DIPEA : DMF=1 : 10,體積比； 所述脫帽試劑為：PIP : DMF=24. 5 : 75. 5,體積比； 所述接肽反應(yīng)溫度為：〇_5°C ;接肽時間為：55分鐘； 所述脫帽反應(yīng)溫度為：21_23°C ;脫帽時間18分鐘。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述2-氯-三苯基氯樹脂取代度為： 0·45-0. 55mmol/g〇
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述脫去Fmoc-保護(hù)基團(tuán)所用的脫帽試劑 為卩1?:01^=24.5:75.5，體積比。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述進(jìn)行縮合反應(yīng)所用的接肽試劑為 DIPEA : DMF=1 : 10,體積比。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述切肽所用的切肽試劑為：TFA/ TIS=932ml/68ml〇
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述切肽包括如下步驟： 將所述保護(hù)二十一膚樹脂：Fmoc_Lys (Boc) -Lue-Lue-Lue-Lue-Lys (Boc) -Leu-Lue-Leu -Lue-Lys (Boc) -Leu-Leu-Leu-Leu-Lys (Boc) -Leu-Leu-Leu-Leu-Lys (Boc)-樹脂加入預(yù)冷 至-10至-7°C的切肽試劑中，反應(yīng)，收集切肽后的粗品； 所說的切肽試劑為：TFA/TIS=932ml/68ml ; 所說的切肽反應(yīng)溫度為：13_16°C ; 所說的切肽反應(yīng)時間為：65分鐘。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述純化具體實現(xiàn)為：將所述二十一肽粗 品經(jīng)C18柱分離純化、除鹽，凍干后，制得西那普肽。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述純化具體實現(xiàn)為：將西那普肽粗品 溶于乙酸中，過濾，濾液經(jīng)C18柱純化，流速為800-900ml/min ;檢測波長為：230nm ;用液相 色譜儀跟蹤收集所需要的流出液，樣品峰合并后除鹽，除溶劑、凍干，獲得成品；所述流動相 為：0· 122Mol/L磷酸三乙胺/乙腈=6. 9/3. 1。
【文檔編號】C07K1/06GK104098656SQ201410332391
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月14日
【發(fā)明者】劉湘艷, 王文琪, 崔頎, 周逸明 申請人:上海蘇豪逸明制藥有限公司, 周逸明, 崔頎