一種短瓣花環(huán)肽a的固相合成方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及短瓣花環(huán)肽A的制備方法，具體涉及一種短瓣花環(huán)肽A的固相合成方 法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 短瓣花環(huán)肽A(BrachysteminA)具有顯著地抑制腎系膜細(xì)胞株分泌IL-6，MCP-1 和IV型膠原蛋白的作用，因而在抗糖尿病性腎病和慢性腎病藥物或保健食品中具有潛在 的應(yīng)用價(jià)值，但是由于其在自然界中的含量有限，并且分離提純具有較大的難度，無(wú)法開展 相關(guān)的藥效學(xué)評(píng)估。
[0003] 程永現(xiàn)等人在《植物學(xué)報(bào)》（2001，43 (7) : 760-765)上首次報(bào)道了該天然產(chǎn)物的波 譜數(shù)據(jù)，并將其結(jié)構(gòu)確定為cyclo-Trc^-PhelLei^-Ala^ThrS-Prc^-AlaY-Gly8)，其后程永 現(xiàn)等人通過(guò)X-射線單晶衍射技術(shù)，將其結(jié)構(gòu)修正為cyclo-TrcZ-Prc^-AlaS-GlytLei^-Ala6 -Thr7-Phes) (J.Nat.Prod.，2011，74, 1392.)，并對(duì)該化合物的制備方法、結(jié)構(gòu)譜圖及生物活 性進(jìn)行了報(bào)道和保護(hù)（J.Nat.Prod.，2011，74, 1392 以及中國(guó)專利：201110004661. 8)。
[0004] 在現(xiàn)有的技術(shù)中該環(huán)八肽是從干燥粉碎的短瓣花地上部分中分離得到的，然而從 12公斤干燥粉碎的短瓣花地上部分中僅能2. 05g的該化合物，并且需要復(fù)雜的純化工藝， 大量的有機(jī)溶劑，耗費(fèi)較長(zhǎng)的時(shí)間，因此效率較低，不能放大生產(chǎn)，無(wú)法滿足研究及應(yīng)用的 需求。目前沒(méi)有其它關(guān)于短瓣花環(huán)肽A的制備技術(shù)。
[0005] 因此，有必要提供一種短瓣花環(huán)肽A的合成方法和應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種短瓣花環(huán)肽A的固相合成方法和應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明提供的短瓣花環(huán)肽A的固相合成方法使用了氨基酸的活化試劑，能夠?qū)?基酸中的羧基原位快速的轉(zhuǎn)化成高反應(yīng)活性的酰氯，減少了副反應(yīng)的發(fā)生，提高了反應(yīng)效 率。
[0008] 第一方面，本發(fā)明提供了一種短瓣花環(huán)肽A的固相合成方法，所述短瓣花環(huán)肽A的 結(jié)構(gòu)為環(huán)_(Pro1-Pro2-Ala3-Gly4-Leu5-Ala6-Thr7-Phe8)，包括如下步驟：
[0009] (1)合成直鏈八肽：
[0010] (1-1)提供Fmoc-AAi-樹脂，采用去保護(hù)劑脫除Fmoc保護(hù)基，得到氨基酸樹脂，其 中，F(xiàn)moc為荷基甲氧羰基，AAi為直鏈八肽C端的第一個(gè)氨基酸；
[0011] (1-2)在活化劑的存在下，將Fmoc-AAn-〇H單體氨基酸分別進(jìn)行酰氯化處理，得到 Fmoc-AAn-Cl單體氨基酸酰氯，其中，AAn為直鏈八肽C端的第η個(gè)氨基酸，η為2~8的自 然數(shù)，所述活化試劑為光氣、雙光氣和三光氣中的至少一種；
[0012] (1-3)堿性條件下，按照η取值分別為2到8的順序，分別將各Fmoc-AAn_Cl單體 氨基酸酰氯和樹脂上的氨基酸依次進(jìn)行縮合，每縮合一次后，先采用去保護(hù)劑處理縮合所 得氨基酸樹脂，脫除Fmoc保護(hù)基后再進(jìn)入下一次縮合反應(yīng)，待全部縮合完成后，得到直鏈 八肽樹脂，其中，第一次縮合采用步驟（1-1)的氨基酸樹脂；
[0013] (1-4)在切割劑的存在下，使直鏈八肽樹脂上的多肽和樹脂分離，得到所述直鏈八 肽；
[0014] 2)采用縮合試劑將所得直鏈八肽進(jìn)行環(huán)化后得到所述短瓣花環(huán)肽A。
[0015] 如本文所述的，"Fmoc-AAn-〇H"表示氨基酸單體的N端氨基由Fmoc封端保護(hù)。
[0016] 如本文所用，"去保護(hù)劑"是指可以將連接在氨基酸上的氨基保護(hù)劑去除的化學(xué)試 劑，所述的氨基保護(hù)劑為Fmoc。
[0017] 本文所述的光氣、雙光氣、三光氣分別為碳酰氯、氯甲酸三氯甲酯、雙（三氯甲基） 碳酸酯（BTC)。
[0018]優(yōu)選地，所述步驟（1-1)中，所述直鏈八肽C端的第一個(gè)氨基酸為丙氨酸（Ala)、甘 氨酸（Gly)或亮氨酸（Leu)。
[0019] 優(yōu)選地，所述步驟（1-1)中，所述直鏈八肽C端的第一個(gè)氨基酸為Gly。
[0020] 所述的直鏈八肽中，Pro中的氨基為仲氨基，反應(yīng)活性較其它氨基酸中的伯氨基 低，Phe中的手性碳容易在堿性條件下發(fā)生消旋，Thr中游離的羥基可能會(huì)參與環(huán)化反應(yīng)， 影響產(chǎn)品產(chǎn)率和純度；本發(fā)明優(yōu)選采用Ala、Gly或Leu作為多肽合成的第一個(gè)氨基酸；本 發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選采用Gly作為多肽合成的第一個(gè)氨基酸，無(wú)手性碳，在環(huán)化步驟中不存在 消旋的問(wèn)題，空間位阻較小，能夠提高反應(yīng)效率。
[0021] 優(yōu)選地，所述步驟（1-1)中，所述直鏈八肽C端的第3,4及5位氨基酸為Pro。
[0022] Pro通過(guò)產(chǎn)生beta-折疊，增加直鏈八肽發(fā)生分子內(nèi)反應(yīng)生成環(huán)肽的概率，降低發(fā) 生分子間反應(yīng)產(chǎn)生二聚體及三聚體等副產(chǎn)物的風(fēng)險(xiǎn)。
[0023] 優(yōu)選地，所述步驟（1-1)中，所述樹脂為具有羥基的樹脂。
[0024] 本文可以采用的Fmoc-AAf樹脂，可以按行業(yè)內(nèi)常規(guī)方法合成，也可直接購(gòu)買。
[0025] 本文所述的"Fmoc-AAi-樹脂"表示固相載體（樹脂）上的羥基與直鏈八肽C端的 第一個(gè)氨基酸的C端羧基縮合得到的具有1個(gè)氨基酸的固相載體，其中，該氨基酸的N端由 Fmoc保護(hù)。
[0026] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟（1-1)中，所述樹脂為Wang-樹脂、TCP樹脂、2-Cl-Trt樹 月旨，Rink樹脂或HMAP樹脂等。
[0027] 優(yōu)選地，所述步驟（1-1)中，所述樹脂為Wang-樹脂，取代值為0.1~1.0mmol/g。
[0028] 優(yōu)選地，所述步驟（1-1)中，所述Fmoc-AAi-樹脂先采用二氯甲烷進(jìn)行溶脹，然后 再進(jìn)行脫Fmoc保護(hù)處理，但不限于使用二氯甲烷。
[0029] 優(yōu)選地，所述步驟（1-1)中，所述去保護(hù)劑是哌啶和二甲基甲酰胺（DMF)的混合溶 液，其中，哌啶的體積分?jǐn)?shù)為20%，但不限于此。
[0030] 優(yōu)選地，所述步驟（1-2)中，所述米用活化劑制備各種Fmoc-AAn_Cl單體氨基酸酰 氯的步驟包括：
[0031] 將Fmoc-AAn-〇H單體氨基酸和活化劑溶于惰性溶劑中，0~30°C下加入第一有機(jī) 堿反應(yīng)3~10分鐘，得到Fmoc-AAn-Cl單體氨基酸酰氯；
[0032] 其中，以雙光氣、三光氣換算成光氣后的摩爾數(shù)計(jì)算，所述活化劑中總光氣的摩爾 數(shù)為所述Fmoc-ΑΑη-ΟΗ單體氨基酸的摩爾數(shù)的0. 99~2. 01倍。
[0033] 在此優(yōu)選條件下，所述步驟（1-2)中，所得Fmoc-AAn-Cl單體氨基酸酰氯溶解在反 應(yīng)產(chǎn)物中，所述反應(yīng)產(chǎn)物除含有Fmoc-AAn-Cl單體氨基酸酰氯外，還含有第一有機(jī)堿的鹽酸 鹽沉淀。
[0034] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟（1-2)中，所述活化劑為三光氣，所述三光氣的摩爾數(shù)為 所述Fmoc-ΑΑη-ΟΗ單體氨基酸的摩爾數(shù)的0. 33~0. 67倍。
[0035] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟（1-2)中，所述惰性溶劑為四氫呋喃（THF)、1，4-二氧六 環(huán)（二噁烷）、二甘醇二甲醚和1，3-二氯丙烷中的至少一種。
[0036] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟（1-2)中，所述第一有機(jī)堿的加入量為Fmoc-AAn-〇H單體 氨基酸摩爾量的3. 5~6倍。
[0037] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟（1-2)中，所述第一有機(jī)堿為三甲基吡啶、二異丙基乙 胺、批陡、二甲基吡啶或2-甲基喹啉。
[0038] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟（1-2)中，將Fmoc-AAn-〇H單體氨基酸和活化劑溶于惰性 溶劑中，在冰浴或0~4°C下加入第一有機(jī)堿反應(yīng)1~30分鐘。
[0039] 更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟（1-2)中，將Fmoc-AAn-〇H單體氨基酸和活化劑溶于惰 性溶劑中，在冰浴或〇~4°C下加入第一有機(jī)堿反應(yīng)3~10分鐘。
[0040] 在冰浴或0~4°C的條件下進(jìn)行氨基酸酰氯化反應(yīng)，再進(jìn)入下一步的縮合反應(yīng)，有 利于抑制Pro、Thr、Ala、Leu和Phe的消旋反應(yīng)。
[0041] 優(yōu)選地，所述步驟（1-3)中，每次縮合反應(yīng)中，各Fm〇C-AAn-0H單體氨基酸酰氯和 樹脂上的氨基酸進(jìn)行縮合的步驟包括：
[0042] 將待縮合的Fmoc-AAn-〇H單體氨基酸酰氯、第二有機(jī)堿和氨基酸樹脂溶于第二有 機(jī)溶劑中，惰性氣體鼓泡條件下反應(yīng)0. 5~2小時(shí)，完成一次縮合反應(yīng)；
[0043] 其中，所述Fmoc-AAn-〇H單體氨基酸酰氯的摩爾數(shù)為氨基酸樹脂取代值總摩爾數(shù) 的2~8倍；所述第二有機(jī)堿為N，N-二異丙基乙胺（DIEA)、N-甲基嗎啉和三乙胺中的至少 一種。
[0044] 如本發(fā)明所述的，"氨基酸樹脂取代值總摩爾數(shù)"的計(jì)算方法為：比如，某氨基酸樹 脂的取代值為〇. 36mmol/g，某反應(yīng)稱取2g該氨基酸樹脂，則氨基酸樹脂取代值總摩爾數(shù)= 0. 36mmol/g*2g= 0. 72mmol〇
[0045] 如本發(fā)明所述的，"氨基酸樹脂總?cè)〈?與"氨基酸樹脂取代值總摩爾數(shù)"可以互 換。
[0046] 優(yōu)選地，所述步驟（1-3)中，所述待縮合的Fmoc-AAn-〇H單體氨基酸酰氯為步驟 (1-2)所得的含F(xiàn)moc-AAn-Cl單體氨基酸酰氯的反應(yīng)產(chǎn)物。
[0047] 本發(fā)明采用的第二有機(jī)堿的堿性大于第一有機(jī)堿的堿性，第二有機(jī)堿能使得酰氯 化反應(yīng)中第一有機(jī)堿生成的鹽酸鹽沉淀溶解，這樣，前一步酰氯化反應(yīng)后無(wú)需進(jìn)行純化分 離，而是直接進(jìn)行下一步的縮合反應(yīng)，簡(jiǎn)化了反應(yīng)步驟。
[0048] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟（1-3)中，所述第二有機(jī)堿的用量為所述Fmoc-AAn-〇H單 體氨基酸酰氯摩爾量的6~8倍。
[0049] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟（1-3)中，所述第二有機(jī)溶劑為二甲基甲酰胺（DMF)和 N-甲基吡咯烷酮（NMP)中的至少一種。
[0050] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟（1-3)中，所述惰性氣體為氮?dú)夂蜌鍤庵械闹辽僖环N。
[0051] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟（1-3)中，所述縮合反應(yīng)的反應(yīng)溫度為室溫。
[0052] 由于Pro的氨基為腫胺，反應(yīng)活性較低，且易發(fā)生消旋，常用的多肽酰胺鍵縮合試 劑縮合的效率較低；本發(fā)明采用的光氣、雙光氣和三光氣中的至少一種作為氨基酸的活化 試劑，能夠?qū)被嶂械聂然豢焖俚霓D(zhuǎn)化成高反應(yīng)活性的氨基酸酰氯；所得氨基酸酰