滇池金線鲃胱抑素基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】滇池金線鲃胱抑素基因及其應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。滇池金線鲃胱抑素的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示，編碼滇池金線鲃胱抑素的基因由SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列組成。其成熟滇池金線鲃胱抑素為SEQ?ID?NO:1所示核苷酸序列的第61–432位核苷酸，其氨基酸序列為如SEQ?ID?NO：2所示。滇池金線鲃胱抑素在制備組織蛋白酶B抑制劑中的應(yīng)用。有益效果是：由滇池金線鲃胱抑素編碼基因推導(dǎo)其氨基酸結(jié)構(gòu)，進(jìn)行原核表達(dá)，純化后的滇池金線鲃胱抑素具有強(qiáng)烈的抑制組織蛋白酶B的活性，該滇池金線鲃胱抑素具有體外生產(chǎn)方便、抑制組織蛋白酶B活性強(qiáng)大的特點(diǎn)。滇池金線鲃胱抑素在2μM濃度能抑制60％的組織蛋白酶B活性，8μM濃度滇池金線鲃胱抑素能抑制87％的組織蛋白酶B活性。
【專利說明】滇池金線鈀胱抑素基因及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明提供一種滇池金線鈀胱抑素基因及其應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】：
[0002] 滇池金線纟E Sinocyclocheilus grahami，俗稱金線魚，也被稱為菠羅魚、洞魚，屬 于鯉形目鯉科鈀亞科金線鈀屬。滇池金線鈀為云南特有高原珍稀半洞穴中小型冷水性魚 類，僅分布于滇池及其周邊的溶洞、涌泉和溪流中，其成年個(gè)體重一般為30?80g，曾是產(chǎn) 區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)魚種。其肉可入藥，有滋陰調(diào)元，暖腎填精的功效，主治虛老損傷、腎虛滑精等 癥。
[0003] 在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中，組織蛋白酶B起著重要的作用，組織蛋白酶B能夠直接 降解或激活纖溶酶原激活劑及基質(zhì)金屬蛋白酶等而間接降解許多細(xì)胞外基質(zhì)成分，從而參 與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程。此外它還可以促進(jìn)腫瘤血管的增生，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，而 且組織蛋白酶B轉(zhuǎn)錄、表達(dá)水平的高低與腫瘤的預(yù)后呈正相關(guān)。目前認(rèn)為對(duì)組織蛋白酶B 等半胱氨酸蛋白酶的抑制與抗腫瘤作用有關(guān)。
[0004] 將本發(fā)明的滇池金線鈀胱抑素氨基酸全序列及其編碼基因分別對(duì)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫 和基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了比對(duì)搜索，均未發(fā)現(xiàn)有任何相同序列信息。


【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種滇池金線鈀胱抑素，該滇池金線鈀胱抑素是一種單鏈 多肽，理論分子量13850. 80道爾頓，等電點(diǎn)7. 76,其氨基酸序列如SEQ ID N0 :2所示。
[0006] 本發(fā)明另一目的是提供一種編碼所述滇池金線鈀胱抑素的基因，該滇池金線鈀胱 抑素的基因由SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列組成。
[0007] 滇池金線鈀胱抑素基因的克隆方法如下：
[0008] 滇池金線鈀皮膚總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及設(shè)計(jì)引物并利用PCR方法篩 選滇池金線鈀胱抑素基因，其中正向擴(kuò)增引物長(zhǎng)度為22個(gè)核苷酸，序列為 5' - CAGCCGGCAGCCATGGACATCT-3'，反向擴(kuò)增引物長(zhǎng)度為22個(gè)核苷酸，序列為 5'-GTGAAATTAAGCGGATCTTCTG-3'，二者均基于EST測(cè)序數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)（數(shù)據(jù)未發(fā)表）；所獲陽性 單克隆進(jìn)行基因核苷酸序列測(cè)定，基因測(cè)序結(jié)果表明編碼滇池金線鈀胱抑素的基因由435 個(gè)核苷酸組成，自5'端至3'端序列（SEQ ID NO: 1)為：
[0009] atggacatct gctttctgct cttcgtgtct tttctctccg tgtttcactt cagcagtgct 60
[0010] gaccagcctt tggaggaagc aatacttgta gcaagaaatg tggagctgct cggcggctgg 120
[0011] actctcgcca atcccgagag ggaagacgtt caagatgctg ctaaagaagc tgtagaggtg 180
[0012] ttcaacacga agtccaaagc aaagaaatac ttcaaactca tcaatgtcac atcggccagc 240
[0013] actcaggtga cgaataagat caactacaaa atagaagcca caattggaaa gacaaaatgc 300
[0014] cacaaatcag aaaatacaga tattcaggct tgtggcatgg caaaaaagca actgacatgt 360
[0015] aagtttgagg tgaccctcga cgcaatgact gatgaccatg aggtgcagaa gatgtcctgc 420
[0016] agaagatccg cttaa 435
[0017] 編碼滇池金線鈀成熟胱抑素為第61 - 432位核苷酸，其氨基酸序列（SEQ ID NO:2) 為：
[0018] Met Asp He Cys Phe Leu Leu Phe Val Scr Phe Leu Scr Val Phe His 1 5 10 15 Phe Scr vSer Ala Asp Gin Ro Leu Glu Glu Ala lie Leu Val Ala Arg 20 25 30 Asn Val Glu Leu Leu Gly Gly Trp Tto Leu Ala Asn Pro Gitt Arg Gltt 35 40 45 Asp Val Gin Asp Ala Ala Lys Glu Ala Val Glu Val Phe Asn Thr Lys 50 55 60 Scr Lys Ala Lys Lys Tyr Phe Lys Leu lie Asn Val Thr Scr Ala Scr 65 70 75 BO Thr Gin Val Thr Asn Lys He Asn Tyr Lys lie Glu Ala Thr He Gly 85 90 95 Lys Thr Lys Cys His Lys Scr Glu Asn Thr Asp lie Gin Ala Cys Gly 100 105 110 |-〇〇19] Mel Ala Lys Lys Gin Leu Thr Cys Lys Phe (lit) Val Tlir Leu Asp Ala 115 120 125 Met Thr Asp Asp His Glu ￥al GIb Lys Met Ser Cys Arg Arg Ser Ala 130 135 140
[0020] 滇池金線鈀胱抑素的原核表達(dá)、純化方法如下：
[0021] 構(gòu)建原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化入BL21感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)于含氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)基 中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，離心收集菌體，超聲破碎離心取上清，進(jìn)行親和層析獲得融合滇池 金線鈀胱抑素；經(jīng)超濾后用腸激酶進(jìn)行消化后，純化即得重組滇池金線鈀胱抑素，該胱抑素 具有強(qiáng)烈的抑制組織蛋白酶B活性。
[0022] 本發(fā)明另一目的是將滇池金線鈀胱抑素應(yīng)用在制備組織蛋白酶B抑制劑中。
[0023] 本發(fā)明中所用滇池金線鈀來源于中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所，為人工繁育。
[0024] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0025] 由滇池金線鈀胱抑素編碼基因推導(dǎo)其氨基酸結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行原核表達(dá)，純化后的滇 池金線鈀胱抑素具有強(qiáng)烈的抑制組織蛋白酶B的活性，該滇池金線鈀胱抑素具有體外生產(chǎn) 方便、抑制組織蛋白酶B活性強(qiáng)大的特點(diǎn)。
[0026] 本發(fā)明提供的滇池金線鈀胱抑素在2 μ Μ濃度能抑制60%的組織蛋白酶B活性， 8 μ Μ濃度滇池金線鈀胱抑素能抑制87%的組織蛋白酶B活性。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0027] 圖1顯示滇池金線鈀胱抑素對(duì)組織蛋白酶B抑制活性。

【具體實(shí)施方式】：
[0028] 下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此，本 實(shí)施例中方法如無特殊說明的均按常規(guī)方法操作，所用試劑如無特殊說明的采用常規(guī)試劑 或按常規(guī)方法配置的試劑。
[0029] 實(shí)施例1 :滇池金線鈀胱抑素基因的克隆
[0030] 一、滇池金線鈀皮膚總RNA提取
[0031] A、將活體滇池金線鈀用水清洗干凈，放入液氮中速凍4小時(shí)，取皮膚組織，稱重， 取300mg皮膚組織，加入10ml總RNA提取緩沖液（Trizol溶液，美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn) 品），于20ml玻璃勻漿器中勻漿10分鐘；
[0032] B、加入等體積酚/氯仿溶液，振蕩混勻，室溫放置10分鐘，4°C，12000rpm離心10 分鐘，吸取上層水相液體；
[0033] C、在上清液中加入上清液1/2體積的異丙醇，室溫放置10分鐘，4°C下7500g離心 10分鐘，沉淀用75%乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即為滇池金線鈀皮膚總RNA。
[0034] 二、滇池金線鈀皮膚cDNA文庫合成
[0035] 米用 CL0NTECH 公司 CreatorTM SMART TM cDNA Library Construction Kit 質(zhì)粒 cDNA文庫構(gòu)建試劑盒，參照試劑盒說明書方法操作如下：
[0036] A、cDNA第一鏈合成（mRNA反轉(zhuǎn)錄），具體步驟如下：
[0037] 1、在0. 5ml無菌的離心管加入1μ 1滇池金線鈀皮膚總RNA、ly 1 SMART IV寡聚 核苷酸、1μ 1⑶s 111/3' PCR引物，加2μ 1去離子水使總體積達(dá)到5μ 1 ;
[0038] 2、混勻離心管中的試劑并短暫離心，72°C保溫2分鐘；
[0039] 3、將離心管在冰上孵育2分鐘；
[0040] 4、在離心管中加入以下試劑2.0 μ 15X第一鏈緩沖、1.0 μ 120mM二硫蘇糖醇、 1. 0μ 110mM dNTP 混合物、1. 0μ 1 PowerScript 反轉(zhuǎn)錄酶；
[0041] 5、混合離心管中試劑并短暫離心，在42°C保溫1小時(shí)；
[0042] 6、將離心管置于冰上中止第一鏈的合成；
[0043] 7、從離心管取2 μ 1所合成的cDNA第一鏈備用。
[0044] B、采用長(zhǎng)末端聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（LD-PCR)方法擴(kuò)增第二鏈，具體內(nèi)容如下：
[0045] 1、951：預(yù)熱？0?儀；
[0046] 2、將2μ 1 cDNA第一鏈（mRNA反轉(zhuǎn)錄）、80μ 1 去離子水、10μ 110XAdvantage2PCR 緩沖、2μ 150XdNTP混合物、2μ 15' PCR引物、2μ 1 CDS 111/3' PCR引物以及2μ 1大腸桿 菌聚合酶離心管進(jìn)行反應(yīng)；
[0047] 3、在PCR儀中按以下程序擴(kuò)增：
[0048] ① 95? 20 秒鐘
[0049] ②22個(gè)循環(huán)：
[0050] 95 °C 5 秒鐘
[0051] 68 °C 6 分鐘；
[0052] 4 ;循環(huán)結(jié)束后，將離心管中合成的cDNA雙鏈進(jìn)行后續(xù)過程。
[0053] 三、滇池金線鈀胱抑素編碼基因的擴(kuò)增
[0054] 1、951：預(yù)熱？0?儀；
[0055] 2、將2μ 1 cDNA雙鏈（上述產(chǎn)物）、75·5μ 1去離子水、10μ 1 PCR緩沖液、8μ 1 dNTP混合物（各2. 5μΜ)、2μ 1正向擴(kuò)增引物、2μ 1反向擴(kuò)增引物以及0. 5μ 1大腸桿菌 DNA聚合酶放入離心管中進(jìn)行反應(yīng)；其中正向擴(kuò)增引物長(zhǎng)度為22個(gè)核苷酸，序列為5'_ CAGCCGGCAGCCATGGACATCT-3'（SEQ ID NO :3)，反向擴(kuò)增引物長(zhǎng)度為22個(gè)核苷酸，序列為5' -GTGAAATTAAGCGGATCTTCTG-3' （SEQ ID N0:4)。
[0056] 3、在PCR儀中按以下程序擴(kuò)增：
[0057] (1)預(yù)變性
[0058] 95 °C 5 分秒鐘
[0059] (2) 25 個(gè)循環(huán)：
[0060] 95 °C 3〇 秒鐘
[0061] 56 °C 40 秒鐘
[0062] 72 °C 30 秒鐘
[0063] (3)后擴(kuò)增
[0064] 72 °C 5 分鐘
[0065] 4、循環(huán)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物用TIANGEN公司的DNA產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行抽提回收， 步驟如下：
[0066] (1)將PCR產(chǎn)物與等體積的膜結(jié)合液顛倒混勻，然后將混和液轉(zhuǎn)入離心純化柱，室 溫靜置5分鐘，使DNA充分與硅膠膜結(jié)合，12000rpm離心分1鐘，倒掉收集管中的廢液；
[0067] (2)加入700 μ 1的漂洗液（含乙醇）于離心純化柱中，12000rpm離心1分鐘，倒 掉收集管中的廢液；
[0068] (3)重復(fù)步驟2 ;
[0069] (4) 12000rpm 離心 3 分鐘；
[0070] (5)將離心純化柱置于新的離心管中；
[0071] (6)加入30 μ 1超純水，在室溫下靜置5分鐘；
[0072] (7) 12000rpm離心1分鐘，管底溶液即為純化過的滇池金線鈀胱抑素編碼基因 PCR 產(chǎn)物。
[0073] 四、大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備
[0074] 1、挑取單個(gè)DH5a菌落，接種于3ml不含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過 夜，次日取上述菌液按比例1:100再接種于50mlLB培養(yǎng)基中，37°C振蕩2小時(shí)。當(dāng)0D600 值達(dá)到0. 35時(shí)，收獲細(xì)菌培養(yǎng)物；
[0075] 2、將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)50ml預(yù)冷的無菌聚丙烯管中，冰上放置lOmin，使培養(yǎng)物冷 卻；
[0076] 3、于4°C下4100rpm離心lOmin，吸出培養(yǎng)液，并將管倒置1 min以使殘留的培養(yǎng) 基流盡；
[0077] 4、每 50ml 初始培養(yǎng)液用 30ml 預(yù)冷的 0· lmol/L CaCl2-MgCl2溶液（80mmol/LMgCl2， 20mmol/L CaCl2)重懸細(xì)胞沉淀；
[0078] 5、于4°C下4100rpm離心lOmin，吸出上清液，并將管倒置1 min以使殘留的液體 流盡；
[0079] 6、每50ml初始培養(yǎng)物用2ml預(yù)冷的0. lmol/L CaCl2溶液重懸細(xì)胞沉淀，分裝后 備用。
[0080] 五、連接及連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
[0081] 1、在微量離心管中加入1μ 1 Takara pMD19-T simple載體、4μ 1滇池金線鈀胱抑 素編碼基因 PCR產(chǎn)物及5 μ 1的連接酶緩沖混合物；
[0082] 2、16°C反應(yīng) 3 小時(shí)；
[0083] 3、全量（10 μ 1)加入至100 μ 1 DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30分鐘；
[0084] 4、42 °C加熱90秒鐘后，再在冰中放置1分鐘；
[0085] 5、加入37°C溫浴過的LB培養(yǎng)基890 μ 1，37°C緩慢振蕩培養(yǎng)60分鐘；
[0086] 6、取200 μ 1涂布于含有X_Gal、IPTG、氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)16小 時(shí)以形成單菌落。
[0087] 六、滇池金線鈀胱抑素基因克隆篩選及鑒定
[0088] 挑取上述單菌落于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C緩慢振蕩培養(yǎng)4小時(shí)，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物及擴(kuò)增條件同前述滇池金線鈀胱抑素編碼基因的擴(kuò)增條件；將經(jīng)PCR 確證的陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取后，以美國(guó)Applied Biosystems3730A全自動(dòng)核苷酸序列 測(cè)定儀進(jìn)行核苷酸序列的測(cè)定；測(cè)序引物為BcaBESTTM Sequencing Primer M13-47(5' CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3'），基因測(cè)序結(jié)果自 5' 端至 3' 端序列（SEQ ID NO :1)為：
[0089] atggacatct gctttctgct cttcgtgtct tttctctccg tgtttcactt cagcagtgct 60
[0090] gaccagcctt tggaggaagc aatacttgta gcaagaaatg tggagctgct cggcggctgg 120
[0091] actctcgcca atcccgagag ggaagacgtt caagatgctg ctaaagaagc tgtagaggtg 180
[0092] ttcaacacga agtccaaagc aaagaaatac ttcaaactca tcaatgtcac atcggccagc 240
[0093] actcaggtga cgaataagat caactacaaa atagaagcca caattggaaa gacaaaatgc 300
[0094] cacaaatcag aaaatacaga tattcaggct tgtggcatgg caaaaaagca actgacatgt 360
[0095] aagtttgagg tgaccctcga cgcaatgact gatgaccatg aggtgcagaa gatgtcctgc 420
[0096] agaagatccg cttaa 435
[0097] 滇池金線鈀胱抑素基因核苷酸序列長(zhǎng)度為435個(gè)堿基，序列類型：核酸，鏈數(shù)：?jiǎn)?鏈，拓?fù)鋵W(xué)：直鏈狀，序列種類：cDNA，來源：滇池金線鈀皮膚。
[0098] 編碼滇池金線鈀胱抑素為第61 - 432位核苷酸，其氨基酸序列（SEQ ID N0:2) 為：
[0099] Mei Λπρ 11c Cys Phc Leu Leu Phc Val Scr Plic Leu Scr Val Phc His 15 10 15 Pl]c Scr Ala (?η Pw Leu fflu (llu Aki 20 25 30 Asn VaJ Olu Leu Leu 〇]y (lly Trp I'hr Leu Ala Asn Pro GIu Am Glu 35 40 45 Asp V'al Cihi Asp Ala Ala Lys (1!u Ala Va! (-Hu Va! Phe Asn Thr Lys 50 55 60 Scr Lys Ala Lys Lys Tyr Phc Lys Leu Ilc Asn Val Π?γ Ser Ak-t Scr 65 70 75 80 Tlir Gin ValThr Asn Lys lie Asn'ryr Lys lie filu Ah Tk lie Gly 35 90 m Lys Π?γ Lys Cys His Lys vSer Glu Aso Thr Asp Ilc Gin Ala Cys Gly
[0100] 腦 105 110 MeL Ala Lys Lys Gin Leu Thr Cys Lys Phe G!u ValThr Leu Asp Akt 115 120 125 Met Thr Asp Asp His Glu Val Gin Lys Met vSer Cys Arg Arc Ser Ala 130 135 140
[0101] 實(shí)施例2 :滇池金線鈀胱抑素的原核表達(dá)、純化
[0102] 一、滇池金線鈀胱抑素原核表達(dá)載體的構(gòu)建
[0103] 根據(jù)編碼滇池金線鈀胱抑素的基因設(shè)計(jì)引物，正向嵌套引物序列兩條，加入Κρη I 限制性內(nèi)切酶切位點(diǎn)和腸激酶酶切位點(diǎn)，F(xiàn)1序列為5'-GGTACCGACGACGACGACAAG-3'（SEQ ID N0:5);F2序列為5'-ACAAGGACCAGCCTTTGGAGGAAGC-3'（SEQIDN0 :6);反向引物R序列為 5'-AAGCTTTTAAGCGGATCTTCTGCAGG-3'（SEQ ID N0:7)，加入 Hind III 酶切位點(diǎn)，經(jīng) PCR、膠 回收后，進(jìn)行雙酶切；PCR、膠回收操作步驟同前實(shí)施例1中的步驟三。
[0104] 在PCR管中配制下列酶切體系：
[0105] PCR產(chǎn)物/壞狀獲體 50 μ? ddH20 30 μΙ _Μ Buffer 10 μ? Κρη I 5 μΙ{15 U ) Hind 111 5 μΙ(15 U ) 總體積 wo μ
[0106] 37°C酶切10小時(shí)，在反應(yīng)管中加入6Χ溴酚蘭載樣緩沖液20μ1，混勻后于1.0% 瓊脂糖凝膠中電泳，根據(jù)條帶大小回收目的片段，操作步驟同前實(shí)施例1中的步驟三。
[0107] 在PCR管中配制下列連接體系：
[0108] 栽體 DNA 50 ng 插入片段DNA 300 ug 連接酶10X緩沖液 2μ1
[0109] T4DNA 連接酶 2U 加 i：核酸f悔水個(gè)：20ul
[0110] 15°C連接18小時(shí)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞并篩選陽性克隆，操作 步驟同前實(shí)施例1中的步驟三。
[0111] 二、滇池金線鈀胱抑素的誘導(dǎo)表達(dá)
[0112] 1、37°C 搖床培養(yǎng)至 0D600 到(λ 4-1 (建議 0D600 為(λ 6);
[0113] 2、加入100mM IPTG儲(chǔ)液至終濃度0. 4mM，繼續(xù)培養(yǎng)2-3小時(shí)；
[0114] 3、將搖瓶置于冰上5分鐘，5000g4°C離心5分鐘收集菌體；
[0115] 4、重懸細(xì)胞于0. 25倍體積預(yù)冷的20mM磷酸鈉，20mM咪唑（pH7. 4)中，離心；
[0116] 5、除去上清，菌體保存于_70°C冰箱或繼續(xù)純化。
[0117] 三、滇池金線鈀胱抑素的純化
[0118] 1、超聲破碎提取蛋白
[0119] 以20mM磷酸鈉，20mM咪唑（pH7. 4)重懸細(xì)胞后，于冰浴中進(jìn)行超聲波破碎，功率 100-200W，每次超聲3s，間歇7s，總時(shí)間15min，離心取上清即可用于親和層析；
[0120] 2、親和層析柱的準(zhǔn)備
[0121] 組裝層析柱后，用蒸餾水沖洗以去除末端的氣泡，關(guān)閉層析柱流出口，保持層析柱 下端有部分水存在，重懸Ni Sepharose6Fast Flow填料后，連續(xù)單次將其裝入層析柱，打開 層析柱出口，將恒流泵設(shè)置為所需流速后，完成至少3個(gè)柱體積的洗脫、備用；
[0122] 3、親和層析
[0123] 以150cm/h的線性流速用5到10個(gè)柱體積的結(jié)合緩沖液（20mM磷酸鈉，20mM咪 唑，pH7. 4)平衡層析柱，加入前述樣品，用結(jié)合緩沖液洗柱子，直至280nm處吸收回復(fù)至基 線處，用洗脫緩沖液（20mM磷酸鈉，0. 5M NaCl，0. 5M咪唑，pH7.4)進(jìn)行線性梯度洗脫，收集 60% -100%洗脫組分，即為滇池金線鈀胱抑素融合蛋白；
[0124] 4、超濾
[0125] 使用截留分子量3kD的超濾離心管進(jìn)行超濾，于常溫下4000rpm離心30min，加入 等體積ddH 20后重復(fù)離心步驟兩次，收集離心管上方的液體進(jìn)行后續(xù)操作；
[0126] 5、腸激酶切割及純化
[0127] 取上述蛋白5mg，加入重組腸激酶20U，10X反應(yīng)緩沖液100 μ 1，總體積1ml ;25°C 反應(yīng)12小時(shí)后，進(jìn)行親和層析，收集層析柱不能結(jié)合的組分，再次進(jìn)行超濾，即得純度超過 99 %的滇池金線鈀胱抑素。
[0128] 實(shí)施例3 :滇池金線鈀胱抑素的應(yīng)用
[0129] 檢測(cè)滇池金線鈀胱抑素的組織蛋白酶B抑制活性。
[0130] 以生色底物
[0131] Z-Arg-Arg-pNA(Benzyloxycarbonyl-L-arginyl-L-arginine-p-nitroani-lide) 為反應(yīng)底物，將牛組織蛋白酶B(0. 2ng/反應(yīng)）與反應(yīng)緩沖液（0. 1M乙酸鈉，pH5. 5,含ImM DTT，2mM EDTA和4mM半胱氨酸）、不同濃度的滇池金線鈀胱抑素（終濃度2 - 8 μ Μ)，混合后 置于室溫5min，加入Z-Arg-Arg-pNA至終濃度為400 μ M，37°C孵育30min后檢測(cè)410nm處 吸光度（記為Abo I)，設(shè)置加入重組滇池金線鈀胱抑素的作為對(duì)照（記為Abo C)，計(jì)算抑 制率，計(jì)算方法為（Abo C-Abo I)/Abo CX100%。
[0132] 結(jié)果如圖1顯示，滇池金線鈀胱抑素具有強(qiáng)大的組織蛋白酶B抑制活性，在2uM濃 度時(shí)可抑制60 %的組織蛋白酶B活性，8 μ Μ濃度時(shí)滇池金線鈀胱抑素可抑制87 %的組織 蛋白酶Β活性，而且這種抑制作用十分迅速，在3分鐘內(nèi)2 μ Μ滇池金線鈀胱抑素即可抑制 50%的組織蛋白酶Β活性，實(shí)驗(yàn)證明其可以作為組織蛋白酶抑制劑使用。 SEQUENCE LISTING 〈110>中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所 〈120>滇池金線鈀胱抑素及其基因和應(yīng)用 〈130>滇池金線鈀胱抑素及其基因和應(yīng)用 <160> 7 <170> Patentln version 3. 3 <210> 1 <211> 435 <212> DNA <213> Sinocyclocheilus grahami <400> 1 atggacatct gctttctgct cttcgtgtct tttctctccg tgtttcactt cagcagtgct 60 gaccagcctt tggaggaagc aatacttgta gcaagaaatg tggagctgct cggcggctgg 120 actctcgcca atcccgagag ggaagacgtt caagatgctg ctaaagaagc tgtagaggtg 180 ttcaacacga agtccaaagc aaagaaatac ttcaaactca tcaatgtcac atcggccagc 240 actcaggtga cgaataagat caactacaaa atagaagcca caattggaaa gacaaaatgc 300 cacaaatcag aaaatacaga tattcaggct tgtggcatgg caaaaaagca actgacatgt 360 aagtttgagg tgaccctcga cgcaatgact gatgaccatg aggtgcagaa gatgtcctgc 420 agaagatccg cttaa 435 〈210〉 2 〈211〉 144 〈212〉 PRT <213> Sinocyclocheilus grahami 〈400> 2 Met Asp lie Cys Phe Leu Leu Phe Val Ser Phe Leu Ser Val Phe His 15 10 15 Phe Ser Ser Ala Asp Gin Pro Leu Glu Glu Ala lie Leu Val Ala Arg 20 25 30 Asn Val Glu Leu Leu Gly Gly Trp Thr Leu Ala Asn Pro Glu Arg Glu 35 40 45 Asp Val Gin Asp Ala Ala Lys Glu Ala Val Glu Val Phe Asn Thr Lys 50 55 60 Ser Lys Ala Lys Lys Tyr Phe Lys Leu lie Asn Val Thr Ser Ala Ser 65 70 75 80 Thr Gin Val Thr Asn Lys lie Asn Tyr Lys lie Glu Ala Thr lie Gly 85 90 95 Lys Thr Lys Cys His Lys Ser Glu Asn Thr Asp lie Gin Ala Cys Gly 100 105 110 Met Ala Lys Lys Gin Leu Thr Cys Lys Phe Glu Val Thr Leu Asp Ala 115 120 125 Met Thr Asp Asp His Glu Val Gin Lys Met Ser Cys Arg Arg Ser Ala 130 135 140 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> synthetic sequence 〈400> 3 cagccggcag ccatggacat ct 22 <210> 4 〈211〉 22 〈212〉 DNA <213> synthetic synthetic 〈400〉 4 gtgaaattaa gcggatcttc tg 22 〈210〉 5 〈211〉 21 〈212〉 DNA <213> synthetic synthetic 〈400〉 5 ggtaccgacg acgacgacaa g 21 〈210〉 6 〈211〉 25 〈212〉 DNA <213> synthetic synthetic 〈400〉 6 acaaggacca gcctttggag gaagc 25 〈210〉 7 〈211〉 26 <212> DNA <213> synthetic synthetic <400> 7 aagcttttaa gcggatcttc tgcagg 26
【權(quán)利要求】
1. 滇池金線鈀胱抑素，其特征在于滇池金線鈀胱抑素是一種單鏈多肽，理論分子量 13850. 80道爾頓，等電點(diǎn)7. 76,其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
2. 編碼滇池金線鈀胱抑素的基因，其特征在于滇池金線鈀胱抑素的基因由SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列組成。
3. 編碼滇池金線鈀胱抑素的基因，其成熟滇池金線鈀胱抑素為SEQ ID NO: 1所示核苷 酸序列的第61 - 432位核苷酸，其氨基酸序列為如SEQ ID NO :2所示。
4. 權(quán)利要求1所述的滇池金線鈀胱抑素在制備組織蛋白酶B抑制劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07K14/81GK104098690SQ201410335924
【公開日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2014年7月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月15日
【發(fā)明者】潘曉賦, 宋玉竹, 張遠(yuǎn)旭, 楊君興, 劉銳, 劉倩 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所