一種從冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的廢料中提取人纖維蛋白原的制備工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的廢料中提取人纖維蛋白原的制備工藝，其特征在于包括：冷沉淀溶解、2%氫氧化鋁凝膠吸附、調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度、串聯(lián)過濾、S/D病毒滅活、離子交換層析、EDTA除Ca2+、甘氨酸沉淀、第一次低溫乙醇沉淀、AT-Ⅲ抑制凝血酶、第二次低溫乙醇沉淀、納米膜過濾以及干熱滅活。本發(fā)明為了確保安全性，除了S/D及干熱滅活外，新增納米膜過濾除病毒；新增AT-Ⅲ滅活凝血酶及EDTA除Ca2+工藝，有效阻止在生產(chǎn)過程中纖維蛋白原激活成纖維蛋白；用甘氨酸沉淀去除制品中的纖維蛋白單體和多聚體，以獲得高純度的人纖維蛋白原；所得制劑產(chǎn)品安全可靠，復(fù)溶時(shí)間短，滿足臨床上救急之需，同時(shí)間接節(jié)約稀缺血漿資源具有重要意義。
【專利說明】-種從冷沉淀提取凝血因子WI的廢料中提取人纖維蛋白原 的制備工藝

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種從冷沉淀提取凝血因子W的廢料中提取人纖維蛋白原的制備工 藝，屬于生物制藥領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 纖維蛋白原（Fg)，由肝細(xì)胞合成和分泌，為機(jī)體止血生理中重要的凝血因子。貯 存穩(wěn)定性較好，但熱穩(wěn)定性差，在56°C可形成不可逆沉淀，正常人血漿中Fg濃度為2. 4? 4. 0g/L〇
[0003] Fg作為一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，其血液含量異常是缺血性心腦血管病等疾病的危 險(xiǎn)因子。Fg增加往往是機(jī)體的一種非特異反應(yīng)，常見于毒血癥、肺炎、膽囊炎、肺結(jié)核等感 染及腎病綜合征、風(fēng)濕熱、惡性腫瘤、腦血栓、心肌梗死等無菌性炎癥；另外如外科手術(shù)、放 射治療、妊娠期也可見Fg輕度增高。Fg減少較少見，但當(dāng)其低于1. Og/L時(shí)，機(jī)體可出現(xiàn)出 血征象。一種先天性纖維蛋白原缺乏癥是極為罕見的遺傳性疾病，通過常染色體隱性基因 遺傳，此患者肝臟不能合成Fg;繼發(fā)性纖維蛋白原減少的原因是由于纖維蛋白溶解酶溶解 纖維蛋白所致，如胎盤早期剝離，分娩時(shí)羊水進(jìn)入血管形成血栓，引起彌漫性血管內(nèi)凝血， 激活纖維蛋白溶解酶原，使血中纖維蛋白溶解酶活力增加，溶解纖維蛋白，消耗體內(nèi)原有的 Fg，使其含量減少；嚴(yán)重的肝實(shí)質(zhì)損害，如各種原因引起的肝壞死、慢性肝病晚期等也可出 現(xiàn)Fg的減少。
[0004] 臨床上Fg主要用于治療先天性、獲得性纖維蛋白原減少或缺乏癥，及嚴(yán)重肝臟損 傷、肝硬化、彌散性血管內(nèi)凝血、產(chǎn)后大出血和因大手術(shù)、外傷或內(nèi)出血等引起的凝血障礙。
[0005] 研究表明冷沉淀中富含纖維蛋白原等凝血因子類物質(zhì)，400ml全血得到的冷沉淀 中纖維蛋白原> 150mg。在血漿原料日趨緊缺的今天，通過冷沉淀來制備人纖維蛋白原，對(duì) 冷沉淀的綜合利用，節(jié)約稀缺血漿資源，提高市場競爭力具有重大意義。
[0006] 現(xiàn)有技術(shù)中，傳統(tǒng)纖維蛋白原制備工藝于S/D滅活前一般不進(jìn)行凝膠吸附除雜 質(zhì)，如發(fā)明專利《人纖維蛋白原的生產(chǎn)方法》（申請(qǐng)公布號(hào)：101703763A)等，或者使用DEAE Sephadex A50凝膠吸附，如發(fā)明專利《由冷沉淀制備凝血因子W、纖維蛋白原和纖維結(jié)合蛋 白的方法》（申請(qǐng)公布號(hào)：102295696A)。目前僅發(fā)現(xiàn)發(fā)明專利《從血漿組分沉淀中提取人凝 血因子W和人纖維蛋白原的工藝》（申請(qǐng)公布號(hào)：103351432 A)使用氫氧化鋁凝膠，且氫氧 化鋁添加比例為3g/Kg。DEAE S印hadex A50凝膠在膨脹狀態(tài)時(shí)的機(jī)械強(qiáng)度較差，在柱層析 中體積和流速會(huì)發(fā)生變化。
[0007] 其次，傳統(tǒng)制備工藝一般只采用甘氨酸沉淀法或者低溫乙醇沉淀法純化層析后纖 維蛋白原液，如《從血漿組分沉淀中提取人凝血因子w和人纖維蛋白原的工藝》（申請(qǐng)公布 號(hào)：103351432 A)、《由冷沉淀制備凝血因子W、纖維蛋白原和纖維結(jié)合蛋白的方法》（申請(qǐng) 公布號(hào)：102295696A)采用二步甘氨酸沉淀法純化得纖維蛋白原；《纖維蛋白原的制備方 法》（申請(qǐng)公布號(hào)：102286095A)采用二步低溫乙醇沉淀法純化經(jīng)滅活后的血漿上清液。
[0008] 再則，在制備工藝中還應(yīng)該注意到溶解性和復(fù)溶時(shí)間等問題。溶解困難甚至溶解 后有大量變性蛋白析出，是由纖維蛋白原激活引起的。纖維蛋白原很容易激活，尤其是在 Ca2+和凝血酶存在的情況下，凝血酶將原本可水溶的纖維蛋白原激活成纖維蛋白單體，后 者經(jīng)聚合，并在Ca 2+存在下形成不溶于水的纖維蛋白，纖維蛋白再扭結(jié)成團(tuán)，形成纖維蛋白 膠，因此，工藝制備過程中容易造成過濾困難及制品復(fù)溶時(shí)間長。
[0009] 可見，現(xiàn)有的的人纖維蛋白原仍存在一些問題：（1)純度不高，產(chǎn)品雜質(zhì)含量偏 多，臨床使用易發(fā)生播散性血管內(nèi)凝血、皮疹、心動(dòng)過速、發(fā)熱等不良反應(yīng)；（2)溶解性低， 在使用時(shí)復(fù)溶時(shí)間過長，不便于使用，特別是在急救情況下。有些溶解后甚至?xí)写罅孔冃?蛋白析出。大部分產(chǎn)品復(fù)溶時(shí)間在20分鐘左右，有些甚至到達(dá)30分鐘左右；（3)得率不高， 特別是從冷沉淀中提取人纖維蛋白原。
[0010]目前，纖維蛋白原市場仍處于短缺狀況，開發(fā)出新的高純度和高溶解性的人纖維 蛋白原提取工藝顯得尤為必要。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的在于提供一種高純度、復(fù)溶時(shí)間短的從冷沉淀提取凝血因子W的廢 料中提取人纖維蛋白原的制備工藝。
[0012] 本發(fā)明的主要技術(shù)構(gòu)思如下： 本發(fā)明于S/D病毒滅活前優(yōu)化添加2%氫氧化鋁凝膠進(jìn)行吸附； 本發(fā)明對(duì)經(jīng)層析后的蛋白液經(jīng)一步甘氨酸沉淀法除纖維蛋白單體、纖維蛋白復(fù)合物及 纖維蛋白裂解物后，再經(jīng)二步低溫乙醇法純化，去除雜質(zhì)蛋白，確保產(chǎn)品純度進(jìn)一步提高； 本發(fā)明新增添加 AT- III滅活凝血酶、EDTA去除Ca2+、離心去除纖維蛋白單體雜質(zhì)等步 驟，以獲得高純度、復(fù)溶時(shí)間短的人纖維蛋白原。
[0013] 本發(fā)明的制備工藝，它依次包括：冷沉淀溶解、2%氫氧化鋁凝膠吸附、調(diào)節(jié)離子強(qiáng) 度、串聯(lián)過濾、S/D病毒滅活、離子交換層析；離子交換層析得收集洗脫液，洗脫液經(jīng)超濾、 透析、過濾，用于凝血因子VIII的生產(chǎn)，再從冷沉淀提取凝血因子W的廢料即收集經(jīng)層析 柱流出來的液體中提取人纖維蛋白原；依次包括：EDTA除Ca 2+、甘氨酸沉淀、第一次低溫乙 醇沉淀、AT-III滅活凝血酶、第二次低溫乙醇沉淀、納米膜過濾以及干熱滅活。
[0014] 本發(fā)明是這樣來實(shí)現(xiàn)的，其具體工藝方案如下： (1) 、檢疫期檢疫合格的人血漿領(lǐng)取后,75%乙醇擦拭血漿袋表面，用注射用水沖洗，合 并到融漿罐中，用30?35°C以下循環(huán)水融化，血漿溫度控制不高于4°C;待融化后，離心，出 液溫度控制在(T4°C，收集冷沉淀； (2) 、將步驟（1)的制得物加入3IU/ml肝素鈉溶液中，攪拌至冷沉淀完全溶解，循環(huán)水 的溫度控制在20?28°C ;開始離心，收集上清液，稱重； (3) 、將步驟（2)的制得物上清液用0. 5mol/L HCL調(diào)節(jié)PH至6. 6?7. 2 ;加入2%氫氧 化鋁凝膠，攪拌；開始離心，收集上清液，稱重； (4) 、按"W (調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度緩沖液)=上清液重量/19"計(jì)算，稱取計(jì)算量的調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度 緩沖液至步驟（3)的制得物上清液中；調(diào)節(jié)上清液PH至6. 8?7. 5 ;用調(diào)節(jié)蛋白濃度緩沖液 調(diào)節(jié)蛋白濃度不大于15. Og/L ;用1. Oum的濾芯和0· 45um的濾芯串聯(lián)后過濾，收集過濾液， 稱重；調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度緩沖液的配制方法：48. 5g三羥甲基氨基甲燒，1. 7g氯化|丐，69. 0g氯化 鈉，28. lg甘氨酸，加適量注射用水充分溶解，補(bǔ)加注射用水至1L，調(diào)節(jié)PH為6. 8?7. 2 ;調(diào) 節(jié)蛋白濃度緩沖液的配制方法：量取0.05L調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度緩沖液，加注射用水至1L，調(diào)節(jié)PH 為 6. 4 ?6. 8 ; (5) 、按步驟（4)的制得物過濾液體積的1/10加入S/D溶液，攪拌均勻，溫度控制在 24?26°C，連續(xù)保溫6小時(shí)；0. 45um濾芯過濾；過濾液用100KD超濾膜濃縮至蛋白濃度 1. 5%，然后用蛋白液重量的2倍以上洗滌緩沖液恒體積超濾，得超濾液，稱重；洗滌緩沖液 的配制方法：2. 5g三羥甲基氨基甲烷，1. 5g氯化鈣，14. 5g氯化鈉，加適量注射用水充分溶 解，補(bǔ)加注射用水至1L，調(diào)節(jié)PH為6. 4?6. 8 ; (6) 、將步驟（5)的制得物超濾液用離子交換柱進(jìn)行層析純化，用洗滌液洗滌柱子直至 成基線，用洗脫液洗脫，收集洗脫液(洗脫液經(jīng)超濾、透析、過濾，用于凝血因子VIII的生 產(chǎn)）；收集經(jīng)層析柱流出來的液體，稱量；加入適量0. Olmol/L乙二胺四乙酸（EDTA)液體溶 解，輕微攪拌10小時(shí)，溫度控制在2?4°C，PH控制在7. 1?7. 3 ;離心，收集上清液；洗脫 緩沖液的配制方法：2. 4g三羥甲基氨基甲烷，0. 09g氯化鈣，40. 9g氯化鈉，加適量注射用水 充分溶解，補(bǔ)加注射用水至1L，調(diào)節(jié)PH為6. 4?6. 8 ; (7) 、在步驟（6)收集的液體中，添加適量甘氨酸，使終甘氨酸濃度為6%，溫度控制 在-1?-3°C，攪拌離心，收集沉淀；沉淀加入10倍量枸櫞酸鈉、氯化鈉緩沖液中，攪拌溶解 約30min進(jìn)行壓縮過濾，收集濾液，將濾液溫度降溫至0?1°C ;加-15°C以下的95%乙醇， 使乙醇終濃度為8 % (V/V)，溫度控制在-1?-3°C，加完乙醇后pH值為6. 95?7. 15 ;攪 拌30分鐘；離心，離心過程中出液溫度控制在-1?-3°C，收集離心后沉淀，稱重；枸櫞酸 鈉、氯化鈉緩沖液的配制方法：14g枸櫞酸鈉、9g氯化鈉，加適量注射用水充分溶解，補(bǔ)加注 射用水至1L，調(diào)節(jié)PH為7. 00?7. 10 ; (8) 、量取10倍量步驟（7)所述的枸櫞酸鈉、氯化鈉緩沖液，加入AT-III達(dá)ImU/ml，將 步驟（7)的制得物沉淀加入溶解液中，攪拌溶解約30min進(jìn)行壓縮過濾；收集濾液，將濾 液溫度降溫至〇?1°C ;加-15°C以下的95%乙醇，使乙醇終濃度為8% (V/V)，溫度控制 在-1?-3°C，加完乙醇后pH值為6. 95?7. 15 ;攪拌30分鐘；離心，離心過程中出液溫度 控制在-1?-3°C，收集離心后沉淀，稱重； (9) 、將步驟（8)的制得物沉淀加入5倍量枸櫞酸鈉、氯化鈉、鹽酸精氨酸緩沖液中， 攪拌溶解進(jìn)行壓縮過濾；收集濾液，計(jì)量；稀配，調(diào)整蛋白含量為2. 0?3. 0 %，調(diào)整pH為 7. 0±0. 1 ;納米膜過濾（35nm)，收集濾液；枸櫞酸鈉、氯化鈉、鹽酸精氨酸緩沖液中的配制 方法：15. 5 ±0. 5g枸櫞酸鈉、8. 5g氯化鈉、45g鹽酸精氨酸，加適量注射用水充分溶解，補(bǔ)力口 注射用水至1L，調(diào)節(jié)PH為6. 90?7. 10 ; (10) 、將步驟（9)的制得物濾液經(jīng)0. 2 μ m除菌濾芯過濾分裝；分裝好的制品傳入凍干 柜進(jìn)行冷凍干燥；出柜扎蓋；99?100°C、30分鐘干熱病毒滅活；送檢，檢驗(yàn)合格后包裝、入 庫； 所述百分?jǐn)?shù)除有限定之外，其余為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。
[0015] 本發(fā)明的積極效果： 1、在血漿原料日趨緊缺的今天，通過冷沉淀來制備人纖維蛋白原，對(duì)冷沉淀的綜合利 用，提高市場競爭力具有重大意義，另一方面也能間接節(jié)約稀缺血漿資源。
[0016] 2、在離子交換層析提純纖維蛋白原的過程中，用適當(dāng)洗脫液（2. 4g三羥甲基氨基 甲烷，0. 09g氯化鈣，40. 9g氯化鈉，加適量注射用水充分溶解，補(bǔ)加注射用水至1L，調(diào)節(jié)PH 為6. 4?6. 8)洗脫下來的溶液，再經(jīng)超濾、透析、過濾等工序，可用于生產(chǎn)凝血因子W。
[0017] 本發(fā)明相比于傳統(tǒng)纖維蛋白原的制備工藝，創(chuàng)新點(diǎn)在于： 1、Ca2+存在情況下，可催化凝血酶原變成凝血酶，凝血酶將纖維蛋白原激活成纖維蛋 直，造成過濾困難及復(fù)溶時(shí)間長。為此，本發(fā)明第二次低溫乙醇沉淀前新增AT-III滅活凝血 酶及離子交換上樣流穿液添加 EDTA除去Ca2+工藝，并經(jīng)離心去除纖維蛋白單體等雜質(zhì)，以 獲得高純度、復(fù)溶時(shí)間短的人纖維蛋白原，能在室溫下快速溶解，滿足臨床上救急之需。本 發(fā)明工藝，人纖維蛋白原的復(fù)溶時(shí)間由傳統(tǒng)工藝的30min左右，縮短為15min之內(nèi)。
[0018] 2、為了確保產(chǎn)品安全性，于S/D滅活前優(yōu)化添加2%氫氧化鋁凝膠進(jìn)行吸附；除了 S/D及干熱滅活外，于稀配后、除菌分裝前新增納米膜DV35過濾除病毒。
[0019] 3、對(duì)經(jīng)層析后的蛋白液經(jīng)一步甘氨酸沉淀法除纖維蛋白單體、纖維蛋白復(fù)合物及 纖維蛋白裂解物后，再經(jīng)二步低溫乙醇法純化，去除雜質(zhì)蛋白，確保了產(chǎn)品純度進(jìn)一步提 高，降低不良反應(yīng)發(fā)生率。
[0020] 4、本發(fā)明通過試驗(yàn)得二步-15°C以下冷乙醇沉淀純化纖維蛋白原時(shí)，乙醇最優(yōu)終 濃度為8% (V/V)。
[0021] 本發(fā)明方法制備的產(chǎn)品與《中國藥典》（2010年版，三部）中描述的人纖維蛋白原 在關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)的對(duì)比如下表1。
[0022] 表 1

【權(quán)利要求】
1. 一種從冷沉淀提取凝血因子w的廢料中提取人纖維蛋白原的制備工藝，其特征在 于，它依次包括：冷沉淀溶解、2%氫氧化鋁凝膠吸附、調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度、串聯(lián)過濾、S/D病毒滅 活、離子交換層析；離子交換層析得收集洗脫液，洗脫液經(jīng)超濾、透析、過濾，用于凝血因子 VIII的生產(chǎn)，再從冷沉淀提取凝血因子W的廢料即收集經(jīng)層析柱流出來的液體中提取人纖 維蛋白原；依次包括：EDTA除Ca 2+、甘氨酸沉淀、第一次低溫乙醇沉淀、AT-ΠΙ滅活凝血酶、第 二次低溫乙醇沉淀、納米膜過濾以及干熱滅活。
2. -種從冷沉淀提取凝血因子W的廢料中提取人纖維蛋白原的制備工藝，它包括：冷 沉淀溶解、凝膠吸附、調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度、串聯(lián)過濾、S/D滅活、離子交換層析；離子交換層析得 收集洗脫液，洗脫液經(jīng)超濾、透析、過濾，用于凝血因子VIII的生產(chǎn)，再從冷沉淀提取凝血 因子W的廢料即收集經(jīng)層析柱流出來的液體中提取人纖維蛋白原；依次包括：甘氨酸沉 淀、低溫乙醇沉淀、納米膜過濾以及干熱滅活，其特征在于，低溫乙醇沉淀采用二次低溫乙 醇沉淀，在第二次低溫乙醇沉淀前設(shè)有AT-III滅活凝血酶；在離子交換上樣流穿液中添加 EDTA除去Ca2+工藝。
3. -種從冷沉淀提取凝血因子W的廢料中提取人纖維蛋白原的制備工藝，它包括：冷 沉淀溶解、凝膠吸附、調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度、串聯(lián)過濾、S/D滅活、離子交換層析；離子交換層析得 收集洗脫液，洗脫液經(jīng)超濾、透析、過濾，用于凝血因子VIII的生產(chǎn)，再從冷沉淀提取凝血 因子W的廢料即收集經(jīng)層析柱流出來的液體中提取人纖維蛋白原；依次包括：甘氨酸沉 淀、低溫乙醇沉淀、納米膜過濾以及干熱滅活，其特征在于，對(duì)經(jīng)離子交換層析后的蛋白溶 液經(jīng)一步甘氨酸沉淀法除纖維蛋白單體、纖維蛋白復(fù)合物及纖維蛋白裂解物后，再經(jīng)二步 低溫乙醇法純化，去除雜質(zhì)蛋白。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的一種從冷沉淀提取凝血因子W的廢料中提取人纖維蛋白 原的制備工藝，其特征在于，在S/D滅活前的凝膠吸附為添加2%氫氧化鋁凝膠進(jìn)行吸附。
5. -種從冷沉淀提取凝血因子W的廢料中提取人纖維蛋白原的制備工藝，它包括：冷 沉淀溶解、凝膠吸附、調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度、串聯(lián)過濾、S/D病毒滅活、離子交換層析；離子交換層 析得收集洗脫液，洗脫液經(jīng)超濾、透析、過濾，用于凝血因子VIII的生產(chǎn)，再從冷沉淀提取 凝血因子W的廢料即收集經(jīng)層析柱流出來的液體中提取人纖維蛋白原；依次包括：甘氨酸 沉淀、低溫乙醇沉淀、納米膜過濾以及干熱滅活，其特征在于， (1) 、在S/D病毒滅活前的凝膠吸附為添加2%氫氧化鋁凝膠進(jìn)行吸附； (2) 、對(duì)經(jīng)離子交換層析后的蛋白溶液經(jīng)一步甘氨酸沉淀法除纖維蛋白單體、纖維蛋白 復(fù)合物及纖維蛋白裂解物后，再經(jīng)二步低溫乙醇法純化，去除雜質(zhì)蛋白； (3) 、在離子交換上樣流穿液中添加 EDTA除去Ca2+工藝；在第二次低溫乙醇沉淀前設(shè)有 AT- III滅活凝血酶。
6. 根據(jù)1一5任一權(quán)利要求所述的一種從冷沉淀提取凝血因子VDI的廢料中提取人纖維 蛋白原的制備工藝，其特征在于，S/D滅活前串聯(lián)過濾使用的濾芯尺寸為1. Oum和0. 45um的 濾芯。
7. 根據(jù)1一5任一權(quán)利要求所述的一種從冷沉淀提取凝血因子VDI的廢料中提取人纖 維蛋白原的制備工藝，其特征在于，收集經(jīng)離子交換層析柱的上樣流穿液，稱量；加入適量 0. Olmol/L乙二胺四乙酸（EDTA)液體溶解，輕微攪拌10小時(shí)，溫度控制在2?4°C，PH控 制在7. 1?7. 3 ;離心，收集上清液。
8. 根據(jù)1一5任一權(quán)利要求所述的一種從冷沉淀提取凝血因子VDI的廢料中提取人纖維 蛋白原的制備工藝，其特征在于，第二次低溫乙醇沉淀前，于溶解液中加入AT-III滅活凝血 酶達(dá)ImU/ml，沉淀加入溶解液中，攪拌溶解約30min進(jìn)行過濾；在過濾過程中保持出液溫度 為-5?-7°C，收集濾液，將濾液溫度降溫至0?1 °C。
9. 根據(jù)1一5任一權(quán)利要求所述的一種從冷沉淀提取凝血因子VDI的廢料中提取人纖維 蛋白原的制備工藝，其特征在于，除菌分裝前稀配后納米膜過濾采用35nm的納米膜，收集 濾液。
10. 根據(jù)1一5任一權(quán)利要求所述的一種從冷沉淀提取凝血因子VDI的廢料中提取人纖 維蛋白原的制備工藝，其特征在于，制備工藝如下： (1) 、收集冷沉淀； (2) 、將步驟（1)的冷沉淀加入3IU/ml肝素鈉溶液中，攪拌至冷沉淀完全溶解，循環(huán)水 的溫度控制在20?28°C ;開始離心，收集上清液，稱重； (3) 、將步驟（2)的制得物上清液用0. 5mol/L HCL調(diào)節(jié)PH至6. 6?7. 2 ;加入2%氫氧 化鋁凝膠，攪拌；開始離心，收集上清液，稱重； (4) 、按"調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度緩沖液W=上清液重量/19"計(jì)算，稱取計(jì)算量的調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度緩 沖液至步驟（3)的制得物上清液中；調(diào)節(jié)上清液PH至6. 8?7. 5 ;用調(diào)節(jié)蛋白濃度緩沖液 調(diào)節(jié)蛋白濃度不大于15. Og/L ;用1. Oum的濾芯和0· 45um的濾芯串聯(lián)過濾，收集過濾液，稱 重； (5) 、按步驟（4)的制得物過濾液體積的1/10加入S/D溶液，攪拌均勻，溫度控制在 24?26°C，連續(xù)保溫6小時(shí)；0. 45um濾芯過濾；過濾液用100KD超濾膜濃縮至蛋白濃度 1. 5%，然后用蛋白液重量的2倍以上洗滌緩沖液恒體積超濾，得超濾液，稱重； (6) 、將步驟（5)的制得物超濾液用離子交換柱進(jìn)行層析純化，用洗滌液洗滌柱子直至 成基線，用洗脫液洗脫，收集洗脫液，洗脫液經(jīng)超濾、透析、過濾，用于凝血因子VIII的生 產(chǎn)； 再從冷沉淀提取凝血因子W的廢料即收集經(jīng)層析柱流出來的液體中提取人纖維蛋白 原；經(jīng)層析柱流出來的液體稱量；加入適量〇. Olmol/L乙二胺四乙酸（EDTA)液體溶解，輕 微攪拌10小時(shí)，溫度控制在2?4°C，PH控制在7. 1?7. 3 ;離心，收集上清液； (7) 、在步驟（6)收集的液體中，添加適量甘氨酸，使終甘氨酸濃度為6%，溫度控制 在-1?-3°C，攪拌離心，收集沉淀；沉淀加入10倍量枸櫞酸鈉、氯化鈉緩沖液中，攪拌溶解 約30min進(jìn)行壓縮過濾，收集濾液，將濾液溫度降溫至0?1°C ;加-15°C以下的95%乙醇， 使乙醇終濃度為8 % (V/V)，溫度控制在-1?-3°C，加完乙醇后pH值為6. 95?7. 15 ;攪 拌30分鐘；離心，離心過程中出液溫度控制在-1?-3°C，收集離心后沉淀，稱重； (8) 、量取10倍量步驟（7)所述的枸櫞酸鈉、氯化鈉緩沖液，加入AT-III滅活凝血酶達(dá) ImU/ml，將步驟（7)的制得物沉淀加入溶解液中，攪拌溶解約30min進(jìn)行壓縮過濾，收集濾 液，將濾液溫度降溫至〇?1°C ;加-15°C以下的95%乙醇，使乙醇終濃度為8% (V/V)，溫 度控制在-1?_3°C，加完乙醇后pH值為6. 95?7. 15 ;攪拌30分鐘；離心，離心過程中出 液溫度控制在-1?_3°C，收集離心后沉淀，稱重； (9) 、將步驟（8)的制得物沉淀加入5倍量枸櫞酸鈉、氯化鈉、鹽酸精氨酸緩沖液中， 攪拌溶解進(jìn)行壓縮過濾；收集濾液，計(jì)量；稀配，調(diào)整蛋白含量為2. 0?3. 0 %，調(diào)整pH為 7· 0±0· 1 ;35nm納米膜過濾，收集濾液； (10)、將步驟（9)的制得物濾液經(jīng)0. 2 μ m除菌濾芯過濾分裝；分裝好的制品傳入凍干 柜進(jìn)行冷凍干燥；出柜扎蓋；99?100°C、30分鐘干熱病毒滅活；送檢，檢驗(yàn)合格后包裝、入 庫； 所述百分?jǐn)?shù)除有限定之外，其余為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的一種從冷沉淀提取凝血因子W的廢料中提取人纖維蛋白 原的制備工藝，其特征在于，步驟（4)所述的調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度緩沖液的配制方法：48. 5g三羥 甲基氨基甲烷，1. 7g氯化鈣，69. 0g氯化鈉，28. lg甘氨酸，加適量注射用水充分溶解，補(bǔ)力口 注射用水至1L，調(diào)節(jié)PH為6. 8?7. 2 ;所述調(diào)節(jié)蛋白濃度緩沖液的配制方法：量取0. 05L調(diào) 節(jié)離子強(qiáng)度緩沖液，加注射用水至1L，調(diào)節(jié)PH為6. 4?6. 8。
12. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的一種從冷沉淀提取凝血因子W的廢料中提取人纖維蛋白 原的制備工藝，其特征在于步驟（5)所述的洗滌緩沖液的配制方法：2. 5g三羥甲基氨基甲 烷，1. 5g氯化鈣，14. 5g氯化鈉，加適量注射用水充分溶解，補(bǔ)加注射用水至1L，調(diào)節(jié)PH為 6. 4 ?6. 8。
13. 據(jù)權(quán)利要求10所述的一種從冷沉淀提取凝血因子爾的廢料中提取人纖維蛋白 原的制備工藝，其特征在于步驟（6)所述的洗脫液的配制方法：2. 4g三羥甲基氨基甲烷， 0. 09g氯化鈣，40. 9g氯化鈉，加適量注射用水充分溶解，補(bǔ)加注射用水至1L，調(diào)節(jié)PH為 6. 4 ?6. 8。
14. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的一種從冷沉淀提取凝血因子W的廢料中提取人纖維蛋白 原的制備工藝，其特征在于，步驟（7)所述的枸櫞酸鈉、氯化鈉緩沖液的配制方法：14g枸櫞 酸鈉、9g氯化鈉，加適量注射用水充分溶解，補(bǔ)加注射用水至1L，調(diào)節(jié)PH為7. 00?7. 10。
15. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的一種從冷沉淀提取凝血因子W的廢料中提取人纖維蛋白 原的制備工藝，其特征在于，步驟（9)所述的枸櫞酸鈉、氯化鈉、鹽酸精氨酸緩沖液的配制方 法：15. 5 ±0. 5g枸櫞酸鈉、8. 5g氯化鈉、45g鹽酸精氨酸，加適量注射用水充分溶解，補(bǔ)加注 射用水至1L，調(diào)節(jié)PH為6. 90?7. 10。
【文檔編號(hào)】C07K14/755GK104231072SQ201410524351
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年10月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月9日
【發(fā)明者】楊篤才, 梁小明, 廖昕晰, 匡青芬, 黃璠 申請(qǐng)人:江西博雅生物制藥股份有限公司