一種提取牛血白細(xì)胞抗菌肽的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種牛血白細(xì)胞抗菌肽的提取方法，它包括以下具體步驟：（1）牛血采集；（2）收集白細(xì)胞；（3）萃取脫酸；（4）抗菌肽的純化。本發(fā)明方法實(shí)現(xiàn)了從牛血白細(xì)胞提取具有較強(qiáng)抗菌活性的多肽物質(zhì)，為生產(chǎn)抗菌肽提供了一個新的途徑和方法。本發(fā)明方法具有操作簡單、分離提取率高、成本低的特點(diǎn)，適用于較大量的從牛血中分離純化抗菌肽。
【專利說明】一種提取牛血白細(xì)胞抗菌肽的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于抗菌肽的提取方法，具體涉及一種牛血白細(xì)胞抗菌肽的提取方法。

【背景技術(shù)】
[0002]我國畜牧業(yè)的興起使得全國牛存欄和出欄量穩(wěn)居世界前列，而屠宰肉牛產(chǎn)生的牛血也接近百萬噸。受到技術(shù)條件、民族禁忌等的影響，我國的牛血除小部分被加工成飼料添加劑外，大部分被丟棄，既浪費(fèi)資源又污染環(huán)境。因此對牛血的進(jìn)一步深加工，提高其價值和利用率逐步成為牛血應(yīng)用的主旋律。提高牛血液等副產(chǎn)品的利用價值將成為一個值得關(guān)注的方向。
[0003]有關(guān)研究確認(rèn)，牛血中具有較強(qiáng)抗菌活性的多肽，因此開發(fā)研究一種從牛血中提取、純化抗菌肽的成熟方法，可以一舉多得。而目前在國內(nèi)外還未見有從牛血白細(xì)胞提取抗菌肽的技術(shù)方法和產(chǎn)品。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了克服現(xiàn)有【技術(shù)領(lǐng)域】存在的上述問題，本發(fā)明的目的在于，提供一種牛血白細(xì)胞抗菌肽的提取方法，解決目前國內(nèi)沒有從牛血白細(xì)胞中提取抗菌肽的技術(shù)方法和產(chǎn)品的問題。
[0005]本發(fā)明提供的牛血白細(xì)胞抗菌肽的提取方法，它包括以下具體步驟:
(1)牛血采集:從屠宰場采集新鮮牛血加入10%的抗凝劑，充分混勻后用200目濾布過濾，除去纖維和血凝塊及其他雜質(zhì)；
(2)收集白細(xì)胞:將收集的抗凝牛血在4°C下高速離心，棄去大部分的上層黃色澄清血漿和底層紅細(xì)胞，收集中間層即白細(xì)胞與血小板和部分血漿與紅細(xì)胞沉淀。按3:1的比例加入0.83%氯化銨溶液裂解紅細(xì)胞，攪拌30min后，4°C下高速離心，棄去上清液，收集沉淀即為白細(xì)胞；
(3)萃取:將白細(xì)胞中加入10%的醋酸，用料理機(jī)進(jìn)行攪打破碎，染色鏡檢白細(xì)胞是否破碎，若未破碎，重復(fù)進(jìn)行均質(zhì)破碎，至鏡檢無完整細(xì)胞。4°C超高速離心，收集上清液即為中性粒細(xì)胞胞漿內(nèi)的顆粒組份。4°C下攪拌過夜，萃取得醋酸提取物；
(4)脫酸:將以上方法萃取得到的醋酸提取物，經(jīng)4°C下高速離心，收集上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去醋酸和部分水分后，真空冷凍干燥得抗菌肽粗品，密封包裝后在_20°C保存。
[0006](5)抗菌肽的純化:將凍干抗菌肽粗品用0.5%甲醇溶解，再上樣于層析柱，同時打開柱的下端出口，收集特征峰洗脫液再真空冷凍干燥得抗菌肽，_20°C保存；
所述步驟(I)中，抗凝劑是10%檸檬酸鈉。
[0007]所述步驟(2)中，高速離心是3000r / min離心15min。
[0008]所述步驟(2)中，氯化銨溶液是0.83%氯化銨溶液。
[0009]所述步驟(3)中，超高速離心是IlOOOr / min離心40min。
[0010]所述步驟(4)中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)是指55°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30min。
[0011]所述步驟(5)中,層析柱是葡聚糖凝膠SephadexG25。
[0012]所述步驟(5)中，特征峰洗脫液是指在280nm處有吸收峰的洗脫液。
[0013]所述的提取方法中，真空冷凍干燥得溫度為-50--60°C，冷凍干燥的時間為24h-48h。

【具體實(shí)施方式】
[0014]下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明提供的牛血白細(xì)胞抗菌肽的提取方法，進(jìn)行詳細(xì)的說明。
實(shí)施例
[0015]參照本實(shí)施例的牛血白細(xì)胞抗菌肽的提取方法，它包括以下具體步驟
O牛血采集:從屠宰場采集新鮮牛血5L加入抗凝劑10%檸檬酸鈉溶液500ml，充分混勻后用200目濾布過濾，除去纖維和血凝塊及其他雜質(zhì)；
2)收集白細(xì)胞:將收集的抗凝牛血在4°C下3000r/ min離心15min,棄去大部分的上層黃色澄清血漿和底層紅細(xì)胞，收集中間層即白細(xì)胞與血小板和部分血漿與紅細(xì)胞沉淀。按3:1的比例加入0.83%氯化銨溶液裂解紅細(xì)胞，緩慢攪拌30min后，4°C下3000r / min離心15min，棄去上清液，收集沉淀即為白細(xì)胞，約150g左右；
3)萃取:將白細(xì)胞中加入15g醋酸，用料理機(jī)進(jìn)行攪打破碎，染色鏡檢白細(xì)胞是否破碎，若未破碎，重復(fù)進(jìn)行均質(zhì)破碎，至鏡檢無完整細(xì)胞。4°C IlOOOr / min離心40min，收集上清液即為中性粒細(xì)胞胞漿內(nèi)的顆粒組份。4°C下攪拌過夜，萃取得醋酸提取物；
4)脫酸:將以上方法萃取得到的醋酸提取物，經(jīng)4°C下IlOOOr/ min離心40min，收集上清液，并于55°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30min除去醋酸和部分水分后，-80°C真空冷凍干燥得抗菌肽粗品，密封包裝后在一 20°C保存；
5)抗菌肽的純化:將凍干抗菌肽粗品用0.5%甲醇溶解，再上樣于層析柱葡聚糖凝膠S印hadexG25，同時打開柱的下端出口，用部分收集器收集洗脫液，將在280nm處有吸收的溶液收集，再真空冷凍干燥得0.55g抗菌肽，_20°C保存。
[0016]本發(fā)明方法實(shí)現(xiàn)了從牛血中提取具有較強(qiáng)抗菌活性的多肽物質(zhì)，為生產(chǎn)抗菌肽提供了一個新的途徑和方法；采用本發(fā)明方法生產(chǎn)的抗菌肽，屬于天然提取物，具有天然、無毒、無污染、無殘留、無副作用、高效抗菌等特點(diǎn)，是一種新型的綠色抗微生物藥物；采用本發(fā)明方法提取的抗菌肽，具有廣譜抗菌、抗病毒、不產(chǎn)生耐藥性、有免疫調(diào)節(jié)作用等功能；本發(fā)明方法操作方便，所需設(shè)備簡單，分離提取率高；實(shí)施本發(fā)明方法的原料牛血來源豐富，價格低廉，可以滿足大規(guī)模深化加工的需要，具有很強(qiáng)的開發(fā)應(yīng)用推廣價值。原料牛血屬于屠宰加工的廢棄物或副產(chǎn)物，血漿和血球蛋白仍然作為優(yōu)質(zhì)蛋白源利用，可制備高蛋白飼料或食用蛋白，本發(fā)明方法可使廢棄物得到高值化的利用。
【權(quán)利要求】
1.一種牛血白細(xì)胞抗菌肽的提取方法，其特征在于:它包括以下具體步驟: (1)牛血采集:從屠宰場采集新鮮牛血加入10%的抗凝劑，充分混勻后用200目濾布過濾，除去纖維和血凝塊及其他雜質(zhì)； (2)收集白細(xì)胞:將收集的抗凝牛血在4°C下高速離心，棄去大部分的上層黃色澄清血漿和底層紅細(xì)胞，收集中間層即白細(xì)胞與血小板和部分血漿與紅細(xì)胞沉淀；沉淀物中加入3倍體積氯化銨溶液裂解紅細(xì)胞，4°C下高速離心，棄去上清液，收集沉淀即為白細(xì)胞； (3)萃取:將白細(xì)胞中加入10%的醋酸，用料理機(jī)進(jìn)行攪打破碎，染色鏡檢白細(xì)胞是否破碎，若未破碎，重復(fù)進(jìn)行均質(zhì)破碎，至鏡檢無完整細(xì)胞；4°C超高速離心，收集上清液即為中性粒細(xì)胞胞漿內(nèi)的顆粒組份；4°C下攪拌過夜，萃取得醋酸提取物； (4)脫酸:將以上方法萃取得到的醋酸提取物，經(jīng)4°C下高速離心，收集上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去醋酸和部分水分后，真空冷凍干燥得抗菌肽粗品，密封包裝后在_20°C保存； (5)抗菌肽的純化:將凍干抗菌肽粗品用0.5%甲醇溶解，再上樣于層析柱，同時打開柱的下端出口，收集特征峰洗脫液再真空冷凍干燥得抗菌肽，_20°C保存。
2.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，步驟(I)所述的抗凝劑是10%檸檬酸鈉。
3.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，步驟(2)所述的高速離心是3000r/min 離心 15min。
4.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，步驟(2)所述氯化銨溶液是0.83%氯化銨溶液。
5.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，步驟(3)所述的超高速離心是IlOOOr / min 離心 40min。
6.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，步驟(4)所述的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)是55°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30min。
7.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，步驟(5)所述的層析柱是葡聚糖凝膠SephadexG25。
8.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，步驟(5)所述的特征峰洗脫液是指在280nm處有吸收峰的洗脫液。
9.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述的真空冷凍干燥得溫度為-50—60°C，冷凍干燥的時間為24h-48h。
【文檔編號】C07K1/14GK104513291SQ201410774955
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2014年12月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月16日
【發(fā)明者】寧發(fā)子, 鄧小玲 申請人:重慶都好生物科技有限公司