本發(fā)明歸屬于農(nóng)業(yè)畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域，提供了一種抗菌肽rw-p及其制作方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

抗生素作為飼料添加劑應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)已經(jīng)有半個(gè)多世紀(jì)，但是隨著抗生素的大量使用，尤其是濫用，其英法德問(wèn)題也越來(lái)越嚴(yán)重。細(xì)菌抗生素耐藥型問(wèn)題和抗生素在動(dòng)物產(chǎn)品內(nèi)的殘留都嚴(yán)重影響著與牧業(yè)的發(fā)展，同時(shí)也威脅著人類(lèi)的健康。因此尋找新型綠色的抗生素替代品作為新型的飼料添加劑應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)是現(xiàn)代畜牧業(yè)發(fā)展亟待解決的問(wèn)題。

抗菌肽(antimicrobialpeptides,amps)是存在生物體免疫系統(tǒng)中的一類(lèi)小分子多肽，是機(jī)體抵御病原微生物入侵的第一道屏障。由于其分子量小，具有廣譜的抗菌活性，特殊的膜作用方式細(xì)菌不易產(chǎn)生耐藥性，由氨基酸組成在動(dòng)物體內(nèi)無(wú)殘留等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)已經(jīng)成為醫(yī)藥衛(wèi)生、食品、畜牧生產(chǎn)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。但是在抗菌肽的研究過(guò)程中，科學(xué)家也遇到了一些難題，其中細(xì)胞毒性就是制約抗菌肽應(yīng)用的重要障礙之一。尋找設(shè)計(jì)高抗菌活性低細(xì)胞毒性抗菌肽的方法是能否實(shí)現(xiàn)其替代抗生素應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。目前對(duì)于抗菌肽的研究，很多集中在天然抗菌肽的改造上，但是通過(guò)此種方法得到的抗菌肽衍生物通常并沒(méi)有很好的抗菌活性，同時(shí)，由于其氨基酸序列與體內(nèi)原有抗菌肽的序列相似，其在體內(nèi)的穩(wěn)定性不好，容易被機(jī)體內(nèi)的酶代謝，失去活性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于以上不足之處，本發(fā)明是為了提供一種抗菌肽rw-p及其制作方法和應(yīng)用，打破原有的α-螺旋結(jié)構(gòu)，提高抗菌肽的靈活性，降低抗菌肽細(xì)胞毒性。

本發(fā)明所采用的技術(shù)如下：一種抗菌肽rw-p，其序列如seqidno.2所示。

本發(fā)明還具有如下技術(shù)特征：

1、一種抗菌肽rw-p的制作方法，如下：

1)首先，選擇帶正電荷的精氨酸arg和芳香族的色氨酸t(yī)rp作為基本結(jié)構(gòu)單元，通過(guò)重復(fù)xxyy序列三次得到12個(gè)氨基酸殘疾序列如seqidno.1所示的α-螺旋抗菌肽rw，其中，x為精氨酸，y為色氨酸；

2)然后，將得到的α-螺旋抗菌肽進(jìn)行定點(diǎn)的氨基酸殘基替代，分別將rw抗菌肽第5位的精氨酸和第8位的色氨酸替代為脯氨酸pro，將原有的完整的α-螺旋結(jié)構(gòu)打破得到抗菌肽rw-p，序列如seqidno.2所示；

3)設(shè)計(jì)的抗菌肽采用固相化學(xué)合成法合成，經(jīng)反相高效液相色譜純化和電噴霧質(zhì)譜法的鑒定，得到純度大于95％的多肽純品。

2、如上所述的一種抗菌肽rw-p，在制備治療革蘭氏陰性菌感染性疾病藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明具有如下有益效果及優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明從抗菌肽的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系入手，提出了一種全新設(shè)計(jì)高活性低毒性抗菌肽的方法。本方法只采用簡(jiǎn)單的幾種氨基酸組成，以重復(fù)的序列單元，遵照蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的折疊法則，設(shè)計(jì)得到高抗菌活性的α-螺旋抗菌肽，基于高抗菌活性α-螺旋抗菌肽的基礎(chǔ)上，引入脯氨酸，打破原有的α-螺旋結(jié)構(gòu)，降低細(xì)胞毒性，提高抗菌肽的治療指數(shù)和安全性，為設(shè)計(jì)高效低毒的抗菌肽作為新型的飼料添加劑應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)提高了可行性的方法，奠定了理論基礎(chǔ)。本發(fā)明的抗菌肽rw-p的螺旋含量降低，同時(shí)保持了rw的高抗菌活性。通過(guò)本方法得到的抗菌肽rw-p具有進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)成為抗生素替代品的潛質(zhì)。

本方法設(shè)計(jì)得到的抗菌肽rw無(wú)論是通過(guò)計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)還是在模擬細(xì)胞膜疏水環(huán)境中的圓二色譜結(jié)果都表現(xiàn)出α-螺旋結(jié)構(gòu)，表明α-螺旋抗菌肽設(shè)計(jì)成功。最小抑菌濃度測(cè)定結(jié)果表明rw對(duì)幾種測(cè)定的革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌都具有強(qiáng)抑菌活性。但最小溶血濃度和細(xì)胞毒性的測(cè)定結(jié)果顯示，rw也同時(shí)表現(xiàn)出強(qiáng)細(xì)胞毒性；計(jì)算機(jī)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和圓二色譜結(jié)果顯示，在rw中引入脯氨酸后，原有的α-螺旋結(jié)構(gòu)被打破，rw-p的螺旋比例下降。生物活性測(cè)定結(jié)果顯示，rw-p保持了原肽rw的高抑菌活性，同時(shí)顯著降低了細(xì)胞毒性，提高了治療指數(shù)。

附圖說(shuō)明

圖1為抗菌肽rw的計(jì)算機(jī)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖；

圖2為抗菌肽rw-p的計(jì)算機(jī)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖

圖3為抗菌肽rw的圓二色譜圖；

圖4為抗菌肽rw-p的圓二色譜圖；

圖5為抗菌肽rw和rw-p的溶血活性對(duì)比圖；

圖6為抗菌肽rw和rw-p對(duì)鼠巨噬細(xì)胞raw264.7的細(xì)胞毒性對(duì)比圖。

具體實(shí)施方法

實(shí)施例1

1抗菌肽的設(shè)計(jì)

1.1α-螺旋抗菌肽的設(shè)計(jì)

根據(jù)抗菌肽的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系，選擇帶正電荷的精氨酸和疏水性的芳香族氨基酸色氨酸為基本的氨基酸組成，以xxyy(其中，x為精氨酸，y為色氨酸)為結(jié)構(gòu)單元，將此單元重復(fù)鏈接三次，設(shè)計(jì)得到抗菌肽rw，其氨基酸序列為：

1.2打破α-螺旋結(jié)構(gòu)的抗菌肽設(shè)計(jì)

應(yīng)用定點(diǎn)氨基酸殘基替代方法，在抗菌肽rw中間位置的結(jié)構(gòu)單元將第5位的精氨酸和第8位的色氨酸替代為脯氨酸，得到抗菌肽rw-p，其氨基酸序列為：

2抗菌肽的合成和鑒定

設(shè)計(jì)得到的抗菌肽使用多肽合成儀，通過(guò)固相合成法合成，經(jīng)電噴霧質(zhì)譜法鑒定和反相高效液相色譜純化，得到目標(biāo)化合物，用于后續(xù)結(jié)構(gòu)和活性測(cè)定。

3抗菌肽結(jié)構(gòu)和生物活性測(cè)定

3.1計(jì)算機(jī)軟件預(yù)測(cè)抗菌肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)

應(yīng)用在線的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件i-tasser，輸入氨基酸序列預(yù)測(cè)抗菌肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

抗菌肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖見(jiàn)附圖1-2。從圖中可以看出抗菌肽rw表現(xiàn)出標(biāo)準(zhǔn)的α-螺旋結(jié)構(gòu)。當(dāng)將兩個(gè)氨基酸替代為脯氨酸后，抗菌肽的α-螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，僅部分片段呈螺旋結(jié)構(gòu)。3.2圓二色譜法測(cè)定抗菌肽的結(jié)構(gòu)

分別用10mmpbs(ph7.4)和50％三氟乙醇(tfe)溶液模擬水環(huán)境和輸水的細(xì)胞膜環(huán)境。將抗菌肽溶解于相應(yīng)的溶液中(約150mm)用于結(jié)構(gòu)測(cè)定。圓二色光譜儀的參數(shù)測(cè)定分別為：石英樣品池的光程0.1cm，掃描測(cè)定波長(zhǎng)范圍為195-250nm，分辨率0.5nm，帶寬1.0nm，掃描速度為10nm/min，在室溫下進(jìn)行測(cè)定。圓二色譜用平均殘基摩爾橢圓度表示，單位為度·厘米²/分摩爾(degree·cm²·mdol^-1)。

經(jīng)圓二色譜測(cè)定，抗菌肽在不同溶液中的二級(jí)結(jié)構(gòu)見(jiàn)附圖3-4?？咕膔w在模擬細(xì)胞膜輸水環(huán)境的tfe中，在208nm和222nm處表現(xiàn)出兩個(gè)負(fù)的特征肩峰譜帶，這是典型的α-螺旋結(jié)構(gòu)特征，但此譜帶特征并未在抗菌肽rw-p中出現(xiàn)，表明脯氨酸的引入破壞了原有的α-螺旋結(jié)構(gòu)。

3.3抗菌肽的最小抑菌濃度

配制一定濃度的肽溶液用于生物活性測(cè)定。將待測(cè)菌種接種于新鮮的mh(b)肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，最后將所得菌液的菌落數(shù)調(diào)整為約10⁵cfu/ml用于接種。取無(wú)菌的96-孔培養(yǎng)板，以0.01％乙酸(含0.2％bsa)作為稀釋液，采用微量肉湯稀釋法測(cè)定抗菌肽的最小抑菌濃度。將抗菌肽儲(chǔ)存液加入到96-孔培養(yǎng)板的稀釋液中，進(jìn)行2倍的梯度倍比稀釋?zhuān)缓蠼臃N菌液。其中以不加抗菌肽組作為陽(yáng)性對(duì)照，以不接種細(xì)菌組作為陰性對(duì)照已確定所有實(shí)驗(yàn)操作是在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行的。將培養(yǎng)板于37℃培養(yǎng)箱中孵育18-20h，無(wú)肉眼可見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度即為該測(cè)定藥物對(duì)檢測(cè)菌的最小抑菌濃度。

抗菌肽的最小抑菌濃度見(jiàn)表1。從表中可以看出，抗菌肽rw和rw-p對(duì)測(cè)定的5中菌株都表現(xiàn)出極強(qiáng)的抗菌活性，最小抑菌濃度分別為2μm或4μm。表明脯氨酸的替代并未影響抗菌肽的抑菌活性。

表1抗菌肽的最小抑菌濃度的細(xì)胞選擇指數(shù)

3.4抗菌肽的溶血活性及細(xì)胞選擇指數(shù)

使用肝素鈉抗凝管采集新鮮的人的血液1ml，1000×g離心5min，棄除上清，收集紅細(xì)胞。將收集到的紅細(xì)胞用pbs緩沖溶液洗滌三遍，棄上清，重懸血細(xì)胞定容至10ml。首先取無(wú)菌96-孔培養(yǎng)板，在其中加入pbs緩沖溶液，再加入待測(cè)抗菌肽，作2倍的梯度倍比稀釋?zhuān)缓蠹尤氲润w積的血細(xì)胞溶液，37℃孵育1h，使用96-孔培養(yǎng)板離心機(jī)，1000×g離心5min，收集上清。使用酶標(biāo)儀在570nm處測(cè)定吸光度值。本試驗(yàn)以0.1％tritonx-100組作為100％溶血的陽(yáng)性對(duì)照，以不加抗菌肽組作為陰性對(duì)照，計(jì)算抗菌肽在不同濃度的溶血活性。

抗菌肽細(xì)胞選擇指數(shù)為抗菌肽引起5％溶血時(shí)的肽濃度與抗菌肽對(duì)不同測(cè)定菌株最小抑菌濃度幾何平均數(shù)的比值。如在128μm抗菌肽的溶血率仍小于5％，使用256μm測(cè)定計(jì)算選擇指數(shù)。

抗菌肽溶血活性隨抗菌肽濃度的變化見(jiàn)附圖4-5。從圖中可以看出抗菌肽rw-p較rw的溶血活性顯著降低，在最高測(cè)定濃度(128μm)，rw-p的溶血率仍小于5％。兩個(gè)抗菌肽的細(xì)胞選擇指數(shù)見(jiàn)表1，rw-p的選擇指數(shù)是rw的27倍。

3.5抗菌肽的細(xì)胞毒性

細(xì)胞的準(zhǔn)備：液氮中保存的鼠巨噬細(xì)胞raw264.7復(fù)蘇，培養(yǎng)于含有10％fbs和1％的青霉素和鏈霉素的dulbecco’smodifiedeagle’smedium(dmem)培養(yǎng)液中，在37℃、5％co2飽和濕度條件下培養(yǎng)傳代，每隔1天換一次培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80％～90％融合后，用pbs液洗滌細(xì)胞2次，加入0.25％的胰酶消化液，消化3～5min，至細(xì)胞間連接疏松，表明消化適度，迅速將胰蛋白酶倒掉，加入含10％胎牛血清的完全培養(yǎng)液5ml終止消化并反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞使細(xì)胞脫壁，分散為單細(xì)胞懸液備用；

藥物處理：在96孔板中采用2倍系列梯度倍比稀釋法稀釋待測(cè)抗菌肽樣品，然后在各孔中加入等體積的細(xì)胞懸液，使各孔中細(xì)胞的濃度約為2×10⁴cells/孔。以不加抗菌肽和細(xì)胞組作為陰性對(duì)照，加細(xì)胞而不加抗菌肽組作為陽(yáng)性對(duì)照，將96孔板置于5％co2，37℃培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)20-24h；

讀數(shù)：培養(yǎng)結(jié)束后，在每孔中加入40μlmtt繼續(xù)孵育4h，然后再加入150μl二甲基亞砜dmso，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，將96孔板取出，使用酶標(biāo)儀在492nm處測(cè)定吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

抗菌肽的細(xì)胞毒性結(jié)果見(jiàn)附圖6。從圖中可以看出，抗菌肽rw具有強(qiáng)細(xì)胞毒性，細(xì)胞存活率隨著抗菌肽濃度的升高顯著下降，在4μm時(shí)細(xì)胞存活率已降至50％以下。相比較抗菌肽rw-p的細(xì)胞毒性降低顯著，其在32μm時(shí)細(xì)胞存活率仍在70％左右。

綜合以上結(jié)果可以得出，通過(guò)本方法可以快速有效地設(shè)計(jì)出高活性低毒性的抗菌肽，為抗菌肽作為新型飼料添加劑替代抗生素應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，提高了可行性，本研究中得到的抗菌肽rw-p具有肽鏈短、活性高、毒性低等特點(diǎn)，具有開(kāi)發(fā)應(yīng)用的潛力。

＜110＞東北農(nóng)業(yè)大學(xué)

＜120＞一種抗菌肽rw-p及其制作方法和應(yīng)用

＜160＞2

＜210＞1

＜211＞12

＜212＞prt

＜213＞人工序列

＜400＞1

argargtrptrpargargtrptrpargargtrptrp

1510

＜210＞2

＜211＞12

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＜213＞人工序列

＜400＞2

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