專利名稱：促進(jìn)變性劑溶液中所含的重組蛋白形成分子內(nèi)二硫鍵的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及促進(jìn)二硫鍵形成的方法，特別涉及促進(jìn)變性劑溶液中所含的還原型重組蛋白形成分子內(nèi)二硫鍵的方法。
產(chǎn)生重組蛋白的方法是本領(lǐng)域內(nèi)所熟知的，即將編碼所需蛋白的DNA插入宿主微生物中，在能表達(dá)重組蛋白的條件下培養(yǎng)該微生物。然而，這些重組蛋白一般并非以易于回收并具有生物活性的形式產(chǎn)生。重組蛋白常以含有無生物活性的寡聚體和聚集體蛋白的“內(nèi)含體”的形式產(chǎn)生。這些內(nèi)含體必須進(jìn)行加工才能產(chǎn)生有生物活性的單體蛋白。
加工內(nèi)含體以回收有生物活性形式的蛋白質(zhì)有許多不同的方法。不溶性內(nèi)含體一般從微生物細(xì)胞中回收并溶于強(qiáng)變性劑或去污劑中。所得的溶液含有變性及還原形式的所需蛋白。為了得到有生物活性的蛋白，必須恢復(fù)天然分子特有的三級結(jié)構(gòu)。這一般涉及使變性蛋白重新折疊及氧化先前還原的巰基形成二硫鍵，從而維持重組蛋白的三級結(jié)構(gòu)使其具有生物活性。
獲得有生物活性的三級結(jié)構(gòu)的現(xiàn)有方法一般包括，除去變性劑或去污劑，使蛋白重新折疊成有生物活性的構(gòu)象。該方法一般包括一個(gè)氧化還原型巰基形成二硫鍵的步驟，所形成的二硫鍵有助于維持該分子的三級結(jié)構(gòu)。
蛋白的復(fù)性及正確二硫鍵的再形成是一個(gè)困難且不可預(yù)測的方法。如果除去變性劑并形成二硫鍵，可形成與天然或重組分子的生物活性不一致的三級結(jié)構(gòu)。有可能形成分子間二硫鍵而產(chǎn)生寡聚體和聚集體并破壞相互連接的分子的生物活性。也可能形成不正確的分子內(nèi)二硫鍵而使分子呈無生物活性的三級結(jié)構(gòu)。
回收重組蛋白和氧化巰基而在重組分子內(nèi)形成二硫鍵有許多不同的先有技術(shù)方法。美國專利第4，511，503號和4，518，526號(Olson等)及美國專利第4，511，502號和4，620，948號(Builder等)公開了一些方法，其中，將內(nèi)含體溶于強(qiáng)變性劑和還原劑中，從溶解蛋白的溶液中除去污染物，再用弱變性劑代替強(qiáng)變性劑，利用分子氧和催化劑(一般為金屬陽離子或連四硫酸鈉)，借助將巰基氧化成二硫鍵使蛋白質(zhì)得以重新折疊。然而，這些氧化巰基而形成正確的二硫鍵的方法的缺點(diǎn)是很慢，因?yàn)榉肿友醯米源髿?，一般需要使溶液暴露在大氣中放?至8天。此外，這些方法一般只有在強(qiáng)變性劑被稀釋、除去、或被弱變性劑取代以減小其對蛋白結(jié)構(gòu)的影響之后，才能形成二硫鍵。其它缺點(diǎn)包括反應(yīng)的不可預(yù)測性;當(dāng)溶液暴露在空氣中放置有可能滋生細(xì)菌或造成其它污染;隨著溶液長時(shí)間放置(一般在1星期以上)而形成寡聚體和聚集體;等等。
美國專利第4，530，787號(Shaked等)公開了一種以受控方式氧化含半胱氨酸的還原型微生物蛋白而產(chǎn)生合成蛋白如IL-2的方法，這種合成蛋白與其天然對應(yīng)物有同樣的二硫橋。氧化反應(yīng)以鄰亞碘酰基苯甲酸作為氧化劑。
美國專利第4，569，790號(Koths等)公開了一種方法，該方法利用鄰亞碘酰基苯甲酸選擇性地氧化重組IFN-β和IL-2蛋白而形成與天然分子一致的二硫鍵。
美國專利第4，572，798號(Koths等)公開了一種方法，該方法利用Cu+2離子選擇性地氧化重組IFN-β和IL-2蛋白而形成與天然分子一致的二硫鍵。進(jìn)行氧化反應(yīng)的溶液中含有使蛋白保持溶解所需的最低量的變性劑。盡管據(jù)報(bào)道利用銅離子的反應(yīng)進(jìn)行得很快(約1小時(shí))，但該方法有一個(gè)缺點(diǎn)，即注入溶液中的銅離子可能會使銅離子和蛋白間產(chǎn)生一些不必要的相互作用。此外，銅離子起到催化劑的作用，由于迅速形成二硫鍵，可產(chǎn)生不正確的分子間二硫鍵而出現(xiàn)無生物活性的寡聚體和聚集體，也可產(chǎn)生不正確的分子內(nèi)二硫鍵而出現(xiàn)無生物活性的單體，這些單體對所要求的目的并不適用。
因此，需要一個(gè)能促進(jìn)變性劑溶液中所含的還原型重組蛋白形成分子內(nèi)二硫鍵的方法。該方法應(yīng)在較短時(shí)間內(nèi)氧化巰基，產(chǎn)生高產(chǎn)的、有生物活性的單體蛋白，并減少由于形成不正確的分子內(nèi)二硫鍵和形成分子間二硫鍵而產(chǎn)生的無生物活性分子。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是，提供一種促進(jìn)變性劑溶液所含的還原型重組蛋白形成分子內(nèi)二硫鍵的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是，提供一種促進(jìn)變性劑溶液中所含的還原型重組蛋白在約6-48小時(shí)的時(shí)間內(nèi)形成分子內(nèi)二硫鍵的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種方法，該方法利用可產(chǎn)生高產(chǎn)的、有生物活性的單體重組蛋白的方法促進(jìn)變性劑溶液中所含的還原型重組蛋白形成分子內(nèi)二硫鍵。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種方法，該方法利用可減少由于形成不正確的分子內(nèi)和分子間二硫鍵而產(chǎn)生的無生物活性的重組蛋白的方法，促進(jìn)變性劑溶液中所含的還原型重組蛋白形成分子內(nèi)二硫鍵。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供一種促進(jìn)變性劑溶液中所含的重組生長激素形成分子內(nèi)二硫鍵的方法。
這些目的及其它目的是這樣來達(dá)到的，利用變性劑溶解重組蛋白而產(chǎn)生還原型變性蛋白的溶液，將已溶解的重組蛋白與氧化劑胱氨酸反應(yīng)，胱氨酸的量足以氧化游離重組蛋白的巰基并形成分子內(nèi)二硫鍵。該反應(yīng)導(dǎo)致變性劑溶液中含有大部分有生物活性結(jié)構(gòu)的重組蛋白，它們具有天然蛋白特有的分子內(nèi)二硫鍵;只有極少量的由于形成不正確的分子內(nèi)和分子間二硫鍵而產(chǎn)生的無生物活性結(jié)構(gòu)的重組蛋白。
在較好的實(shí)施方案中，在從內(nèi)含體回收有生物活性蛋白的過程中產(chǎn)生的變性劑溶液中所含的巰基還原型重組蛋白與胱氨酸反應(yīng)，胱氨酸的量足以氧化重組蛋白巰基而形成分子內(nèi)二硫鍵。變性劑溶液一般為十二烷基硫酸鈉(SDS)、脲或鹽酸胍溶液。
在最好的實(shí)施方案中，使pH約為7-11并含有約0.1-3.0mg/ml還原型重組生長激素(rST)的0.1-2%SDS溶液，與約0.5-10摩爾胱氨酸/摩爾rST反應(yīng)約12-36小時(shí)，以氧化rST巰基而形成天然蛋白特有的分子內(nèi)二硫鍵。
二硫鍵形成后，進(jìn)一步處理蛋白質(zhì)溶液以除去變性劑而恢復(fù)蛋白質(zhì)的生物活性。通常還需進(jìn)行另外的處理以除去任何殘存的污染物，產(chǎn)生一劑適合動物服用的配方。
本發(fā)明的其它目的、優(yōu)點(diǎn)和新穎特征在本發(fā)明的下列詳細(xì)描述中將是顯而易見的。


圖1表示SDS-PAGE凝膠，顯示利用本發(fā)明方法得到的還原型、氧化型及聚集型重組豬生長激素的相對量。
圖2、3、4及5表示AG11A8洗脫物在Superose12上的洗脫曲線，顯示利用本發(fā)明方法得到的單體重組豬生長激素(rPST)和高分子量污染物的相對量。
本文所用的術(shù)語“重組蛋白”包括具有天然蛋白氨基酸順序的蛋白質(zhì)及其類似物，以及具有取代、缺失、置換或修飾的順序的突變蛋白質(zhì)。還包括那些試圖防止形成不正確二硫鍵而以不含硫氨基酸置換氨基酸順序中的一個(gè)或幾個(gè)胱氨酸的蛋白質(zhì)。
本文所用的術(shù)語“重組生長激素”(rST)包括具有天然生長激素的氨基酸順序、基本與其相似的氨基酸順序或其簡略順序形式的蛋白質(zhì)及其類似物，以及具有取代、缺失、置換或修飾順序的突變蛋白質(zhì)。特別是，本文所用的rST包括與pST順序相同，但在其氨基末端有氨基酸缺失的蛋白質(zhì)。這種蛋白的例子包括△-7重組豬生長激素、△-4重組牛生長激素等，但并不限于此。還包括那些試圖防止形成不正確二硫鍵而以不含硫氨基酸置換氨基酸順序中的胱氨酸的蛋白質(zhì)。
本文所用的術(shù)語“變性劑”指那些離液序列高的化合物或物質(zhì)，它們以合適的濃度溶于水時(shí)，能夠通過改變蛋白的表面而改變其空間構(gòu)型或構(gòu)象，這種改變或者是改變水合狀態(tài)、溶劑環(huán)境，或者是改變?nèi)軇?表面相互作用。這樣一些變性劑的例子包括脲、鹽酸胍、硫氰酸鈉，以及去污劑如SDS。
術(shù)語“變性劑溶液”指含有上面定義的“變性劑”的溶液?！白冃詣┤芤骸钡亩x不包括高溫溶液、高酸度溶液，以及諸如此類的可使蛋白質(zhì)不可逆變性的溶液。
術(shù)語“二硫鍵”和“二硫鍵的形成”指分子內(nèi)二硫鍵和二硫鍵的形成，除非特別指出。
術(shù)語“分子內(nèi)二硫鍵”和“分子內(nèi)二硫鍵的形成”指天然蛋白特有的分子內(nèi)二硫鍵，除非特別指出。
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種促進(jìn)變性劑溶液中所含的還原型重組蛋白形成二硫鍵的方法。該方法包括將重組蛋白與胱氨酸反應(yīng)，胱氨酸的量足以氧化游離蛋白巰基而形成二硫鍵。使高百分比(一般為50-70%)的蛋白質(zhì)根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行反應(yīng)形成天然蛋白特有的二硫鍵。所得蛋白質(zhì)或者一形成二硫鍵便有生物活性，或者在從溶液中部分或全部除去變性劑后，借助正確的二硫配對而重新折疊成有生物活性的構(gòu)象。
本發(fā)明所用的重組蛋白變性劑溶液通過本領(lǐng)域熟知的方法獲得。典型的方法是，對重組微生物體產(chǎn)生的蛋白內(nèi)含體進(jìn)行處理，除去污染的蛋白質(zhì)、脂類及細(xì)胞碎片;將所得的較純的主要含重組蛋白的內(nèi)含體溶于變性劑中，形成含有變性的還原型重組蛋白的溶液。
根據(jù)本發(fā)明，在溶解一定量的內(nèi)含體之前或之后，向變性劑溶液中加入胱氨酸(鄰二氨基丙酸一般也認(rèn)為是二半胱氨酸)，內(nèi)含體的量足以保證重組蛋白巰基完全氧化，一般約為0.5-10摩爾胱氨酸/摩爾重組蛋白，最好為約1-4摩爾胱氨酸/摩爾重組蛋白。內(nèi)含體的量可以隨反應(yīng)條件的不同而不同，這些條件有溫度、蛋白濃度、pH、變性劑或去污劑的濃度、變性劑或去污劑的類型、氧化反應(yīng)所需的時(shí)間等。
在含有重組蛋白的內(nèi)含體溶解后加入胱氨酸時(shí)，加入胱氨酸之前可降低變性劑的濃度。除去或降低變性劑濃度的方法是眾所周知的。例如，可通過透析、冷沉淀、層析等來降低變性劑的濃度或除去變性劑，但任何已知方法都可采用。
變性劑溶液中的變性劑可以是任何適合于從內(nèi)含體回收重組蛋白的變性劑，一般為十二烷基硫酸鈉(SDS)、脲或胍鹽如鹽酸胍。
變性劑的濃度依所用的變性劑的不同而變化SDS濃度范圍為約0.05-5%(重量);最好為約0.1-2%(重量);脲濃度范圍為約5-9M，最好為約6-8M;鹽酸胍濃度范圍為約4-9M，最好為約5-7M。
變性劑溶液中重組蛋白的濃度一般保持較低，約為0.05-10mg/ml，最好為0.2-4mg/ml，以減少分子間二硫鍵形成的可能性并由此減少寡聚體和團(tuán)聚體的形成?？偟鞍诐舛纫话慵s為1-30mg/ml，最好為約3-10mg/ml。
變性劑溶液的pH維持在約7-11，最好約在9-10，約9.8最好。在較低的pH下，氧化反應(yīng)速度大大降低。在大于11的較高的pH下，蛋白質(zhì)側(cè)鏈易受損傷，如可能發(fā)生脫酰氨基反應(yīng)。
胱氨酸氧化重組蛋白中的游離巰基所需的反應(yīng)時(shí)間將依賴于變性劑的濃度和反應(yīng)溫度;反應(yīng)時(shí)間還在較小的程度上依賴于胱氨酸濃度、重組蛋白濃度等。對約0-30℃之間的反應(yīng)溫度，在上面給定的試劑濃度下，所需反應(yīng)時(shí)間約為6-48小時(shí)，最好約為12-36小時(shí)才能保證二硫鍵的形成。該反應(yīng)時(shí)間與使蛋白溶液暴露在空氣中放置所需的3-8天形成對比。
用于本發(fā)明的重組蛋白可以是重組微生物產(chǎn)生的任何蛋白，用變性劑將其溶解則產(chǎn)生該蛋白的變性劑溶液。這些蛋白包括生長激素、促乳素、胎盤催乳激素等。
本發(fā)明最好應(yīng)用重組生長激素(rST)。rST可以是任何種屬的ST，但最好為牛、豬、鳥、羊或人的rST，最好是豬或牛的rST。
產(chǎn)生這些重組蛋白的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的例如，美國專利第4，604，359號和4，332，717號公開了產(chǎn)生人重組生長激素的方法;美國專利第4，431，739號公開了一種產(chǎn)生重組生長激素的方法;歐洲專利申請0104920公開了一種產(chǎn)生重組豬生長激素的方法;美國專利第4，443，395號公開了一種產(chǎn)生重組牛生長激素的方法;歐洲專利申請0103395公開了一種產(chǎn)生重組牛生長激素的方法;Schoner，Biotechnology，3(2)∶151-54公開了一種產(chǎn)生重組生長激素的方法;Buell，NucleicAcidRes.，13，1923-38(1985)公開了一種產(chǎn)生重組促生長因子C的方法。產(chǎn)生許多類似蛋白的其它方法在本領(lǐng)域是已知的。
在較好的實(shí)施方案中，從內(nèi)含體回收有生物活性的生長激素過程中產(chǎn)生的rST的SDS溶液與胱氨酸反應(yīng)，胱氨酸的量足以氧化rST中的巰基而形成二硫鍵。最好是，pH約為7-11并含有約3.0-10mg/ml還原型rST的0.1-2%SDS溶液與約0.5-10摩爾胱氨酸/摩爾rST反應(yīng)約12-36小?，以衍O痳ST巰基而形成天然生長激素特有的分子間二硫鍵。
二硫鍵形成后，進(jìn)一步處理蛋白質(zhì)溶液以除去任何殘存的污染蛋白、加溶劑、氧化劑、還原劑、蛋白寡聚體和聚集體等。加溶劑一般通過透析、層析或其它適合的手段除去，而污染的蛋白寡聚體和聚集體則通過層析與rST分離。然后進(jìn)一步處理氧化的rST產(chǎn)生一劑適合動物服用而促進(jìn)生長的配方。這些方法在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的。
前面已對本發(fā)明進(jìn)行了一般描述，下面給出的實(shí)例為本發(fā)明的特定實(shí)施方案并說明其實(shí)施及優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)例是以說明的方式給出的，并不打算以任何方式限制說明書或后面的權(quán)利要求書。特別是，用于實(shí)驗(yàn)的內(nèi)含體從產(chǎn)生△-7豬生長激素的轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)菌株制備。從大腸桿菌寄主菌株HB101中分離內(nèi)含體，HB101已用編碼△-7pST的第一質(zhì)粒(pL-mu-△-7pST)和編碼溫度敏感性λ噬菌體阻遏蛋白的第二質(zhì)粒(pCI857)轉(zhuǎn)化。許多其它微生物菌株都可產(chǎn)生含有各種類型重組蛋白的內(nèi)含體，它們都可用于本發(fā)明。同樣，培養(yǎng)這些微生物產(chǎn)生內(nèi)含體的方法在本領(lǐng)域內(nèi)也是熟知的。
實(shí)例1在0.1mM硫酸銅、0.1mM L-胱氨酸，0.1mM胱胺存在下或無氧化劑存在下(對照)將由上述大腸桿菌HB101菌株產(chǎn)生的、含△-7豬生長激素的洗滌過的內(nèi)含體以1g內(nèi)含體/40ml緩沖液的比例溶于1%SDS/碳酸鹽緩沖液(21mM Na2CO3、25mMNaHCO3，pH9.8)中。該樣品在15ml Corex管中保溫，室溫下輕輕攪拌。保溫6小時(shí)后，從每個(gè)樣品中各取等份試樣，用30mM碘乙酰胺捕獲游離巰基，并在非還原性SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行電泳以測定還原型與氧化型和聚集型rpST的相對量。這種用SDS-PAGE測定還原型、氧化型和聚集型重組蛋白相對量的方法前人已對重組凝乳酶原作過描述(Schoemaker，et al.，The EMBO Journal，4(3)，775-780(1985))。對rpST，由△-7rpST的46位和157位胱氨酸的氧化而形成的大二硫環(huán)的形成，伴隨著SDS-PAGE中相對于還原單體的遷移率的增加(比較圖1中條帶3和4的位置)。由于形成分子間二硫鍵而形成的聚集物遷移很慢(圖1中的條帶1)。剩下的樣品在室溫下保溫共48小時(shí)。使0.75ml等分試樣通過用碳酸鹽緩沖液平衡的1×10cmAG11A8柱除去SDS，洗脫液通過篩析-FPLC(Superose12)柱以測定所回收的rPST單體的量。結(jié)果示于圖1和圖2。
參見圖1，銅和胱氨酸都促使內(nèi)含體來源的rpST的氧化速度增加，這可從rpST還原型單體(低遷移率)量的減少和氧化型單體(高遷移率)量的增加而觀察到。出人意料的是胱胺對氧化速度無影響。銅促進(jìn)高分子量聚集體的積累，這可在凝膠的上部看到。這說明盡管銅是良好的氧化劑，但它促進(jìn)大量的分子間二硫鍵形成而產(chǎn)生無生物活性的寡聚體和聚集體。相反，胱氨酸不能促進(jìn)高分子量聚集體的形成。
參見圖2，圖2A顯示對照(無氧化劑)實(shí)驗(yàn)的Superose12洗脫曲線;圖2B顯示硫酸銅(0.1mM)實(shí)驗(yàn)的洗脫曲線;圖2C顯示L-胱氨酸(0.1mM)實(shí)驗(yàn)的洗脫曲線;圖2D顯示胱胺(0.1mM)實(shí)驗(yàn)的洗脫曲線。洗脫曲線是在從柱中洗脫蛋白質(zhì)時(shí)測定280納米處的紫外吸收(A280)而獲得的。6-12分鐘的洗脫峰表示污染蛋白及重組蛋白的無生物活性的寡聚體和聚集體。15分鐘的洗脫峰為待回收和純化的重組蛋白單體。比較15分鐘洗脫峰中所要的蛋白，洗脫曲線表明L-胱氨酸的峰明顯大于對照、硫酸銅及胱胺的峰，大約大30-50%。因此，盡管在銅存在下氧化速度增加，但許多物質(zhì)參與共價(jià)聚集，導(dǎo)致所回收的單體的量減少。
實(shí)例2在0.1mML-胱氨酸存在下，將由上述大腸桿菌HB101菌株產(chǎn)生的含△-7豬生長激素的洗滌過的內(nèi)含體以1克內(nèi)含體/40ml緩沖液的比例溶于1%SDS/碳酸鹽緩沖液(21mMNa2CO3、25mMNaHCO3、pH9.8)。利用無L-胱氨酸的SDS緩沖液制備對照樣品。樣品在室溫下(22℃)攪拌6小時(shí)，接著除去游離的SDS，在該步驟中，游離的SDS通過在5℃下保溫溶液17小時(shí)進(jìn)行冷沉淀。以15，000xg離心15分鐘除去沉淀。保溫結(jié)束時(shí)，通過AG11A8層析除去蛋白結(jié)合的SDS，樣品如例1所述在Superose 12上進(jìn)行單體rpST分析。
參見圖3，樣品在不加0.1mML-胱氨酸(3A)和加有0.1mML-胱氨酸(3B)保溫后，其AG11A8洗脫物的Superose12洗脫曲線表明，L-胱氨酸實(shí)驗(yàn)的洗脫峰比對照峰大30-50%。因此，胱氨酸增加那些用冷沉淀除去游離SDS的樣品中單體的回收率。除去SDS后，樣品再保溫48小時(shí)則不能進(jìn)一步增加對照及胱氨酸樣品經(jīng)AG11A8層析后單體的回收率。
實(shí)例3將由上述大腸桿菌HB101菌株產(chǎn)生的含△-7豬生長激素的洗滌過的內(nèi)含體以1g內(nèi)含體/40ml緩沖溶液的比例溶于1%SDS/碳酸鹽緩沖液(21mM Na2CO3、25mM NaHCO3，pH9.8)中。游離SDS如實(shí)例2所述在5℃下保溫17小時(shí)進(jìn)行冷沉淀。以15，000xg離心15分鐘除去沉淀。然后加入胱氨酸，得到含0.1mM L-胱氨酸的溶液。在室溫下再保溫24小時(shí)后，通過AG11A8層析除去SDS，樣品如實(shí)例1所述，在Superose 12上對單體rpST進(jìn)行分析。結(jié)果示于圖4。
參見圖4，樣品在不加0.1mML-胱氨酸(4A)和加有0.1mML-胱氨酸(4B)保溫后，其AG11A8洗脫物的Superose12洗脫曲線表明，L-胱氨酸實(shí)驗(yàn)的洗脫峰比對照峰大30-50%。胱氨酸可促進(jìn)AG11A8層析所回收的單體量的增加，但這里的回收量似乎與冷保溫過程中加有胱氨酸的實(shí)驗(yàn)(實(shí)例2)無明顯區(qū)別。
實(shí)例4重復(fù)實(shí)例3，不同的是采用0.025mM胱氨酸。結(jié)果示于圖5。
參見圖5，加0.025mML-胱氨酸(5A)和不加氧化劑(5B-對照)時(shí)的AG11A8洗脫物的Superose12洗脫曲線表明，L-胱氨酸的洗脫峰明顯大于對照峰。在這些條件下，濃度為0.025mM的胱氨酸大大增加rpST的回收率(大于30%)，但0.025mM胱氨酸比0.1mM胱氨酸效力略小一些。
實(shí)例5將2.5kg由上述大腸桿菌HB101菌株產(chǎn)生的含有△-7豬生長激素的洗滌過的內(nèi)含體溶于140l0.5%SDS/碳酸鹽緩沖液(pH9.8)中，將這批樣品分為兩等分，A部分在20℃下緩慢攪拌進(jìn)行空氣氧化，B部分加入0.1mM胱氨酸進(jìn)行氧化。氧化過程中，每隔一段時(shí)間取樣通過小樹脂柱除去SDS。柱洗脫物在Superose12柱上進(jìn)行單體pST分析。結(jié)果示于表1。
參見表1，所得結(jié)果說明，胱氨酸的加入大大提高了氧化速度。在胱氨酸加入不到24小時(shí)內(nèi)，有生物活性的pST單體的回收率便達(dá)到其最大值。
實(shí)例6將6.75kg由上述大腸桿菌HB101菌株產(chǎn)生的含△-7豬生長激素的洗滌過的內(nèi)含體，在20℃下用約9小時(shí)溶于270l0.5%SDS/碳酸鹽緩沖液(pH9.8)中。將溶解液于～4℃冷卻約15個(gè)小時(shí)，以沉淀游離的SDS。利用Sharples離心機(jī)離心除去沉淀的SDS后，使SDS-pST在空氣中氧化約21小時(shí)，然后加入0.1mM胱氨酸(以便與對照的單體回收效果作比較)。在樣品通過AG11A8樹脂柱除去SDS后，利用Superose12柱分析單體回收率。結(jié)果示于表1。
參見表1，所得結(jié)果表明，胱氨酸可提高氧化速度，所以，胱氨酸加入后不到6小時(shí)，單體便達(dá)到其最大值。
雖然在這些條件下，加胱氨酸保溫總是使單體回收率增加，但是，如果與那些不加胱氨酸而在各種不同條件下氧化最適的一段時(shí)間(一周以上)的樣品相比，凈回收率可能并未增加。利用胱氨酸的優(yōu)點(diǎn)主要在于它能在變性劑特別是SDS中加速rpST的氧化。加胱氨酸保溫提取物，將使氧化時(shí)間從長于一周減少到短于兩天。這便增加了產(chǎn)量，也阻止了由于長時(shí)間氧化而引起的其它問題(如細(xì)菌污染)。而且，胱氨酸很便宜，在所要求的濃度下，不會過多增加生產(chǎn)成本。
顯然，在上述思想的指導(dǎo)下，有可能對本發(fā)明作許多修改和變化。因此，應(yīng)該明白，在所附的權(quán)利要求書的范圍內(nèi)，本發(fā)明的實(shí)施可不限于具體描述的內(nèi)容。
表1胱氨酸對氧化反應(yīng)和單體產(chǎn)率的影響溶解開始 GPC單體(ppm)＊后的時(shí)間A部分(不加胱氨酸)B部分(加胱氨酸)4小時(shí)3113921天4155152天4304883天454425(？)4天445492＊樣品在通過樹脂柱除去SDS前用碳酸鹽緩沖液以1∶25稀釋。
表2胱氨酸對氧化反應(yīng)和單體產(chǎn)率的影響GPC單體(ppm)＊＊溶解后天數(shù)(不加胱氨酸)(加胱氨酸)0.3368-1364-2＊383 423540341064154287395423840439812410-＊第一個(gè)樣品在加入胱氨酸6小時(shí)后進(jìn)行分析。
＊＊樣品在通過樹脂柱除去SDS前用碳酸鹽緩沖液以1∶2.5稀釋。
權(quán)利要求
1.一種促進(jìn)變性劑溶液中所含的還原型重組蛋白形成分子內(nèi)二硫鍵的方法，其特征在于，該方法包括將重組蛋白與胱氨酸反應(yīng)，胱氨酸的量足以氧化重組蛋白的游離巰基而形成分子內(nèi)二硫鍵。
2.權(quán)利要求1的方法，其特征在于變性劑溶液為0.05-5%(重量)SDS溶液、5-9M脲溶液或4-9M鹽酸胍溶液。
3.權(quán)利要求1的方法，其特征在于變性劑溶液為0.1-2%(重量)SDS溶液。
4.權(quán)利要求1的方法，其特征在于重組蛋白為生長激素、促乳素或胎盤催乳激素。
5.權(quán)利要求4的方法，其特征在于重組生長激素為牛、豬、鳥、羊或人的重組生長激素。
6.權(quán)利要求5的方法，其特征在于重組生長激素為豬或牛的重組生長激素。
7.權(quán)利要求1的方法，其特征在于變性劑溶液中重組蛋白的濃度為約0.05-10mg/ml。
8.權(quán)利要求1的方法，其特征在于變性劑溶液中胱氨酸的濃度為約0.5-10摩爾胱氨酸/摩爾重組蛋白。
9.權(quán)利要求1的方法，其特征在于變性劑溶液的pH維持在約7-11。
10.權(quán)利要求1的方法，其特征在于使胱氨酸與重組蛋白反應(yīng)約6-48小時(shí)。
11.權(quán)利要求1的方法，其特征在于使胱氨酸與重組蛋白反應(yīng)約12-36小時(shí)。
12.一種促進(jìn)變性劑溶液中所含的還原型重組生長激素(rST)形成分子內(nèi)二硫鍵的方法，其特征在于，該方法包括將rST與胱氨酸反應(yīng)，胱氨酸的量足以氧化rST的游離巰基而形成分子內(nèi)二硫鍵。
13.權(quán)利要求12的方法，其特征在于變性劑溶液為0.05-5%(重量)SDS溶液、5-9M脲溶液、或4-9M鹽酸胍溶液。
14.權(quán)利要求12的方法，其特征在于變性劑溶液為0.1-2%(重量)SDS溶液。
15.權(quán)利要求12的方法，其特征在于rST為牛、豬、鳥、羊或人的rST。
16.權(quán)利要求15的方法，其特征在于rST為豬或牛的rST。
17.權(quán)利要求12的方法，其特征在于變性劑溶液中rST的濃度為約0.05-10mg/ml。
18.權(quán)利要求12的方法，其特征在于變性劑溶液中胱氨酸的濃度為約0.5-10摩爾胱氨酸/摩爾rST。
19.權(quán)利要求12的方法，其特征在于變性劑溶液的pH維持在約7-11。
20.權(quán)利要求12的方法，其特征在于使胱氨酸與rST反應(yīng)約6-48小時(shí)。
21.權(quán)利要求12的方法，其特征在于使胱氨酸與rST反應(yīng)約12-36小時(shí)。
22.一種促進(jìn)0.05-5%(重量)SDS變性劑溶液中的0.05-10mg/ml還原型重組生長激素(rST)形成分子內(nèi)二硫鍵的方法，其特征在于，該方法包括將rST與約0.5-10摩爾胱氨酸/摩爾rST反應(yīng)約6-48小時(shí)，以氧化rST的游離巰基而形成分子內(nèi)二硫鍵。
23.權(quán)利要求22的方法，其特征在于變性劑溶液為0.1-2%(重量)SDS溶液。
24.權(quán)利要求22的方法，其特征在于rST為牛、豬、鳥、羊或人的rST。
25.權(quán)利要求23的方法，其特征在于rST為豬或牛的rST。
26.權(quán)利要求22的方法，其特征在于變性劑溶液中rST的濃度為約1-3mg/ml。
27.權(quán)利要求22的方法，其特征在于變性劑溶液的pH維持在約7-11。
28.權(quán)利要求22的方法，其特征在于使胱氨酸與rST反應(yīng)約12-36小時(shí)。
全文摘要
提供了一種促進(jìn)變性劑溶液中所含的還原型重組蛋白形成分子內(nèi)二硫鍵的方法。將用變性劑溶解的重組蛋白與氧化劑胱氨酸反應(yīng)，胱氨酸的量足以氧化游離巰基而形成分子內(nèi)二硫鍵。
文檔編號C07K14/575GK1033073SQ8810707
公開日1989年5月24日 申請日期1988年10月14日 優(yōu)先權(quán)日1987年10月14日
發(fā)明者詹姆斯·E·西利, 楊雷德 申請人:皮特曼-穆爾有限公司