專利名稱：人的透明帶蛋白質zp3的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種具有人ZP3活性或至少部分具有人ZP3抗原性的多肽或其功能性衍生物。
在受精過程中，哺乳動物配子間的最初相互作用是由精細胞與環(huán)繞在雌性配子周圍的透明帶(ZP)上的種類特異性受體結合而引起的。ZP是一種胞外基質，它是由稱為ZP1，ZP2和ZP3的三種糖蛋白組成，已鑒定出其中的ZP3是精子受體(reviewed in Wassarman，Development 108，1-17;1990)。
用豬和鼠ZP蛋白進行的大量體外和體內研究表明在以研究免疫避孕為目的的試驗方案中ZP3是一種重要的靶抗原候選物(Henderson et al.，J.Repord.Fert.83，325-343;1988以及其中的參考文獻)。最近通過用抗一鼠ZP3抗體篩選鼠卵巢cD-NA表達文庫而進行鼠ZP3cDNA的克隆和定性表明向該目的邁出了重要一步(Ringuette et al.，Developmental.Biology 127，287-295;1988)。因此，ZP3 cDNA探針可用于分離相應的基因組ZP3 cDNA(Chamberlin and Dean，Developmental Biology 131，207-214，1988;Kinloch et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，6409-6413，1989)。
用由鼠ZP3氨基酸序列產生的寡聚肽免疫接種雌鼠后導致長期不育的研究結果加強了ZP3由于避孕的潛在能力(Millar et al.，Science 246，935-938;1989)。
由于ZP3精子受體具種類特異性因而鼠多肽不適用于男性的免疫避孕。而且，來自非人源的多肽在男性體內引起不期望有的免疫應答。因此，研制一種基于人精子受體(一部)分的安全和有效的避孕疫苗需要人ZP3多肽的可得性及其有關它的更多資料。
當然從雌配子中分離足夠量的人ZP3多肽是不可能的。但是，我們已經成功地鑒定一個人基因且分析出它的序列。這項研究表明利用重組DNA技術或固相多肽合成方法而生產ZP3多肽和/或ZP3多肽片段具有可能性。因此，本發(fā)明包括一種至少編碼了部分的人ZP3多肽的新的DNA分子。所說的DNA分子至少包括圖2中顯示的部分序列。
本發(fā)明還包括至少由上面所述DNA分子的部分序列編碼的一種多肽。所述多肽至少包括顯示于圖2中的氨基酸序列的一部分。
當然，根據本發(fā)明得到的肽的功能性衍生物和該多肽的片段也包括在本發(fā)明范圍內。功能性衍生物是指包括其中一個或多個氨基酸被一種化學結構相類似的氨基酸取代的多肽。當然關鍵是這些多肽仍顯示人ZP3抗原性。即是說在施用后(可能與一種佐劑一起用)它仍能激發(fā)產生識別人ZP3的抗體。
本發(fā)明的多肽可以通過合成或重組DNA技術產生。生產合成多肽的方法在本領域內是已知的，不需要進一步詳細描述。
利用重組DNA技術生產多肽是一種已知的一般性方法，但也有很大可能性會導致稍微不同的結果。所表達的多肽是由一個DNA序列編碼或更精確地說是由一個核酸序列編碼的。該核酸序列(有選擇地)轉錄和轉譯成所要的多肽。為了達到目的，通過將該核酸序列克隆到一個載體上，用該載體轉化一種寄主細胞。該載體能自我復制或者可以整合到寄主DNA上。
不同寄主細胞產生不同的多肽。原核生物不具有進行糖基化所必需的細胞器。由原核生物產生的多肽鏈將不帶糖側鏈。真核生物具有進行糖基化的機構，但酵母細胞具有與哺乳動物細胞不同的糖基化作用類型。
對于本發(fā)明所述的多肽，優(yōu)選的表達系統(tǒng)是具有最“天然”的糖基化類型。為達到這個目的，哺乳動物細胞是最優(yōu)選的。
我們也已經鑒定了可能具有避孕能力的人ZP3多肽上的抗原決定族。這些抗原決定基至少包括下述序列之一的一部分
類似這些序列的小多肽更容易通過合成方法生產。這些多肽也可以用相同或不同“抗原決定基”連接在一起而形成一個較大的更具抗原性的多肽。
本發(fā)明所有多肽的一個目的是要利用這些多肽生產一種避孕疫苗。免疫接種可以是被動或主動免疫。
對于主動免疫接種，將本發(fā)明的多肽(可能與一種佐劑一起)施用于女性。給藥以后在女性體內產生一種免疫應答。在卵上產生識別人ZP3的抗體。這些抗體將特異性地與精子受體結合位點結合致使精子不能結合，或者該抗體通過位致障礙而阻止這種結合。被動免疫基本上以同樣方式進行。但不是以該抗原或它的模擬物接種，而是直接以該抗原的抗體給藥。因此必須得到抗本發(fā)明多肽的抗體。
這可以利用一種合適的哺乳動物的主動免疫接種而獲得。經過合適的時間期間后收集該哺乳動物的B-淋巴細胞且通過融合或轉化保持它的活性。這些方法是本領域內已知的。從保持活力的淋巴細胞培養(yǎng)物中分離抗體。
但是，利用動物來源的抗體存在一個問題。經過重復給藥后，被接種的婦女體內產生一種抗體應答。因此優(yōu)選的是利用人產生的抗體或是利用不引起免疫應答的抗體的較小區(qū)域。生產人抗體的方法如CDR-接技術是已知的(Jones et al.，Nature 321，522-525，1986)。生產對原始抗體的抗原仍具特異性的抗體片段的方法也是已知的(Udaka et al.，Molec.Immunol.27，25-35;1990)。避免對本發(fā)明多肽的抗體產生抗原性應答的另一種可能是利用人抗體或其片段或其衍生物。
人抗體可以通過體外利激分離的B-淋巴細胞產生，或者可以從用本發(fā)明的至少一種多肽免疫接種的女性中收集到的(是不滅活性)的B-淋巴細胞中分離得到。本發(fā)明的另一個目的是將ZP3多肽和它的抗體用作診斷測試盒。
現在已獲得了一些人ZP3的抗體。它屬于本領域內產生抗個體基因型抗體的技術，其中的抗體識別該抗體的抗原結合位點，因而是該抗原的一種“內部映像”。這些，抗個體基因型抗體作為疫苗和診斷目的也將是十分有用的。
在下面的實驗部分顯示人ZP3 DNA序列和人ZP3氨基酸序列的分離過程，以及表達具ZP3抗原性的一種重組多肽的方法，以及制備是這種免疫性的一種合成多肽的步驟。這些實施例僅是為了闡述發(fā)明而不應作為本發(fā)明范圍的限制。
實施例材料和方法所有重組DNA操作基本上是按照本身已知(Sambrook et al.，Molecular Cloning，a laboratory manual，2nd edition.CSH-laboratory press，1989)的方法進行的。
限制性酶和DNA修飾酶按照供應廠商的介紹使用。
一個人卵巢gtlo cDNA庫是從Stratagene購買的。
寡聚核苷酸的合成寡聚核苷酸是在Applied Biosystems 381A DNA合成儀上制備的，可直接用于克隆目的。
肽合成根據Fields和Noble描述的方法(Int.J.Pept.prot.Res.35，160-214;1990)采用固相肽合成法生產寡聚肽，合成下列的ZP3肽(氨基酶以3個字母的代碼表示)
抗體生產用各種抗原激發(fā)產生多克隆抗體-全人透明帶。將貯存于鹽中的人透明帶加熱溶解且與弗氏佐劑混合用于兔子免疫接種。在用豬ZP-旦白包被的ELISA平板上分析抗血清的滴定度。
-βGal-ZP3融合蛋白?；谒牟蝗苄詮某暡ㄌ幚淼募毦胁糠旨兓@種融合蛋白，再利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離。通過電吸印后將該蛋白質轉移至硝基纖維素膜上。將攜帶該雜交蛋白的區(qū)域剪切下，溶于DMSO中。按1∶1的比例將該溶液與弗氏佐劑混合，用于兔子免疫接種。
-CHO產生的ZP3。按照類似的方法利用中國倉鼠卵巢(CHO)細胞制備ZP3旦白。采用SDS-PAGE法分離濃縮的培養(yǎng)物介質。剪下40-60千道爾頓區(qū)域，用于免疫接種鼠。
-寡聚肽。通過物理方法將合成的肽連接到鑰孔
血藍蛋白(KLH)上，并注射于兔。對照兔僅用KLH接種。在用肽包被的ELISA微滴板上篩選血清。
人卵細胞熒光分析貯存于鹽中的未受精的人卵細胞(按IVF程序用精細胞保溫48小時后)用抗血清(用A緩沖液[PBS+5%BSA]稀釋1∶50)一起保溫。洗滌三次后，將卵與第二抗體(結合于FITC的豬抗兔或鼠，用緩沖液A稀釋1∶100)一起保溫，在37℃保溫1小時。再經過三個洗滌步驟后，用Nikon顯微鏡和曝光分析儀測量熒光。未染色(陰性)對照卵在一個長時間曝光后顯示黑暗，而陽性的已染色透明帶需較短曝光時間。
人精子-透明帶結合試驗用兔血清與人卵細胞(見上文)一起保溫，用緩沖液(BWW+3%BSA)洗滌三次，用緩沖液(對照)或抗體(未稀釋，37℃1小時)與人卵一起保溫，洗滌3次后，加入人正常精子微滴(107精子/ml，37℃，16小時)。通過重復吸移去除卵細胞上松散粘附的精子。固定已結合的精子，用含1%戊二醛和Hoechst(H33258，20g/ml)的BWW染色，用熒光顯微鏡計數已結合的精子數。
結果合成和構建一種鼠ZP3探針通過裝配8個合成的寡聚核苷酸(27-51聚基體)構建一個135bp的鼠ZP3探針。在含有鼠基因外顯子5和6部分(771-909位點，Ringuette et al.，Developmental Biology 127，287-295;1988)的該片段上安裝獨特一的5’BamHI和3’HindⅢ限制性位點，將該片段亞克隆于pGEM3(promega)。隨后驗證它的核苷酸序列。
人ZP3基因的克隆和定性用32p-標記的ZP3探針(上文描述的135bp片段)篩選一個人基因組EMBL3文庫。三個重迭的EMBL克隆顯子具有強烈的雜交反應，對此進行更詳細的定性。這些克隆的一個有限的形態(tài)圖描繪于

圖1中。將克隆I1和D1的限制性片段亞克隆于pGEM載體和MBmp18/19中，用于鑒定人基因的基因組特性。這一過程包括通過用32p-標記的從鼠ZP3序列得到的寡聚核苷酸進行Southern吸印試驗而對外顯子進行定位然后進行序列分析。如在圖1中證明的，該人基因是由分布在基因組DNA的約為20kb上的8個外顯子組成。已鑒定的所有外顯子以一致的剪接供體和剪接受體信號(未顯示)作為側面序列。從所有外顯子的序列分析結果可推導出ZP3基因的全部編碼序列(表示于圖2中)。該人ZP3基因編碼一個含372個氨基酸的多肽，計算得出其分子量為41437道爾頓。
人ZP3 cDNA的克隆用32p-標記的來自人ZP3外顯子1和5，7的片段篩選一個人卵巢cDNA文庫(gt10)。該文庫產生幾個部分cDNA鏈，它們僅含有ZP3編碼序列的3’端一半序列(外顯子5-8)。對3個單獨的cDNA克隆進行序列分析證實了先前曾測定的基因組ZP3序列，但外顯子7中的一個殘基不同(見圖2)。在基因組和cDNA中第1064位核苷酸分別為G和C殘基。在所編碼的氨基酸序列中，該殘基的不同導致在第345位上分別產生一個精氨酸或一個芳氨酸殘基。這種序列差異可能代表人ZP3基因和多肽的多態(tài)性。
在CHO細胞中表達重組ZP3
為了在CHO細胞中表達，縮短ZP3基因的大小以便能插入到哺乳動物表達載體中。已將各種ZP3 DNA片段裝配成一個“小基因”(表示于圖3中)。利用PCR技術(Horton er al.，Gene77，61-68，1989;Yon和Fried，Nucl.Acids Res.17，4895，1989)將外顯子1和2連接，并分別安裝5’EcoRI和3’XbaI位點。隨后，將該DNA片段與攜帶外顯子3和4以及部分5的基因組XbaI-SalI片段以及含有SalI-HindⅢ片段上的外顯子5-8的部分CDNA相連接。得到的2.7kb“小基因”含有一個位于外顯子2和3之間截短了的內含子以及位于ZP3外顯子3和4以及外顯子4和5之間的天然內含子。該ZP3構建物的編碼多肽的全部核苷酸信息通過序列分析完全得到驗證。
隨后將該ZP3“小基因”插入到一個哺乳動物表達載體中，在該載體中ZP3基因是由強大的SV40早期啟動子啟動的。另外，該載體含有用于基因表達后進行正確的RNA加工過程所需的β-球蛋白連接信號和SV40多聚腺苷化信號以及編碼氨基糖磷酸轉移酶(該酶的存在可以分離對G418具抗性的穩(wěn)定轉化體)的選擇性標記基因(Colbere-Garapin et al.，J.Mol.Biol.150，1-14，1981)。利用磷酸鈣沉淀技術(Graham and Van der Eb，Virology 52，456-467，1973;Wigler et al.，proc.Natl.Acad.Sci USA76.1373-1376，1979)用該ZP3表達性構建物轉染CHO細胞。分析所有對G418具抗性的轉化體(相當于300-500單獨的克隆)中重組ZP3基因的表達。如圖4中證實的，用一個32p標記的ZP3探針進行的從收集的轉化體分離的總RNA的Nortbern吸印分析結果表明已轉染的ZP3基因進行相對高水平的表達(與高水平表達的肌動朊基因相比，未顯示)。而且，證明小基因RNA正確地加工成為mRNA，該mRNA比人卵巢RNA中存在的天然轉錄產物稍微大一點(見圖4)。該大小的差異很可能是由于表達載體中存在的5’和3’側面序列引起的。
從對G418具抗性的CHO轉化體中分離攜帶外顯子1-5的部分cDNA而進一步證實重組基因的正確拼接和加工。該cDNA序列的資料類似于已轉染的DNA且支持了該內含子是從ZP3小基因轉錄產物中正確拼接得到的結論。
利用Western吸印分析檢測生長所有轉化體群的培養(yǎng)基中存在的重組ZP3多肽。用抗脫糖基化的豬ZP3的多克隆抗血清(Henderson et al.，Gamete Research 18，251-265，1987)能檢測培養(yǎng)基中的重組ZP3多肽。在未轉染的CHO細胞的培養(yǎng)基中不存在該信號。
在E.coli中表達重組體ZP3為了在大腸桿菌中表達，首先利用一個覆蓋了外顯子1-5的cDNA片段(采用PCR法從CHO轉化體中分離到)和從一個人卵巢cDNA文庫中分離到的部分的cDNA的克隆(含有外顯子5-8)構建一個完整長度的ZP3 cDNA。將四個ZP3 cDNA片段克隆至pEX-質粒(Biores)中的E.coli LacZ基因的框架內，從而可以產生一個β-半乳糖苷酶-ZP3融合多肽，如Stanley和Luzio報道的那樣(EMBOJ.3，1429-1434，1984)。在大腸桿菌中表達的融合多肽可用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和Western吸印分析法檢測。這些實驗的結果表示于圖5中。在熱振蕩誘導后所有四個LacZ-ZP3構建物產生融合多肽，盡管程度比LacZ基因小得多。如在考馬斯亮藍染色的凝膠(見圖5A)上觀察到的，該雜文多肽的分子量與被表達的ZP3部分相一致。這一結果進一步由用抗β-半乳糖苷酶抗體(未顯示)和ZP3的341-360位氨基酸片段與KLH結合后產生的兔抗血清進行的Western吸印分析試驗所證實(圖5B)。該抗血清僅識別攜帶這一氨基酸區(qū)域的融合多肽，即.ZP3-A和ZP3-D。抗KLH的抗血清產生結果相似于圖5B中的染色背景(未顯示)。另外，抗全人透明帶的抗血清識別βGal-ZP3融合多肽(未顯示)。
ZP3抗體與人卵細胞結合進行人卵細胞熒光分析試驗以鑒定各種ZP抗體與人透明帶的結合特性。三個不同實驗的結果描繪于圖6中?？筀LH的血清和一種正常鼠血清沒有產生染色熒光而用抗各種ZP成分的所有抗血清的試驗可觀察到強到中等水平的熒光。從提供的資料可推導出抗ZP3(93-110)，ZP3(172-190)，ZP3(327-344)，ZP3(341-360)和ZP3(362-372)的抗血清能識別人卵母細胞。
在精子-卵識別過程中ZP抗體的作用在人精子-透明帶結合試驗中分析ZP3抗體的避孕能力。該試驗的結果表示于圖7中?？谷送该鲙У目贵w顯示可抑制75%的精子-透明帶結合。抗KLH的一種抗血清不干擾精子-卵的結合。相反，ZP3-肽抗體的混合物(肽ZP3(93-110)，ZP3(172-190)，ZP3(341-360)和ZP3(362-3721)顯示出35%的精子結合相對抑制率?？笴HO細胞產生的重組ZP3的抗體減少55%的精子結合。
附圖的描述圖1.
EMBL克隆I1，D1，和E1(CA)的限制性圖譜以及人ZP3基因的基因組結構。用黑色的方塊表示外顯子。限制性位點S，SalI;B，BamHI。
圖2人ZP3的核苷酸和氨基酸序列。在基因組和cDNA的1064位點上分別存在一個G或C殘基。這種明顯的多態(tài)性產生一個Thr或Arg氨基酸殘基。箭頭表示外顯子的接合點。外顯子數表示于圓圈中。下面劃線的為聚腺苷化信號。
圖3用于插入于哺乳動物表達載體中的大小減少的ZP3基因。將下面的三個片段裝配成一個2.7kbZP3“小基因”A，采用PCR法將外顯子1和外顯子2結構互相連接后產生的一個EcoRI-XbaI片段;B，含有外顯子3，4和部分外顯子5的一個基因組XbaI-SalI片段;C，含有外顯子5-8的一個SalI-HindⅢZP3cDNA片段(已安裝了人為制造的3’BamHⅠ和HindⅢ位點)。將這三個片段克隆于用EcoRI和HindⅢ切開的pGEM載體(promega)，隨后作為一個2.7kb的EcoRI-BamHI片段被放置于一個哺乳動物表達載體的SV40啟動子后面。
圖4在由ZP3DNA轉染的CHO群體中得到的總RNA(15g)和由人卵巢得到的多聚(A)+RNA(5g)中檢測ZP3mRNA。泳道1，CHO;泳道2，CHOZP3轉化體;泳道3，人卵巢。用pGEM3總的ZP3 cDNA作為探針。
圖5在攜帶具有人ZP3cDNA插入物的pEX質粒的大腸桿菌pop2136菌株中生產βGal-ZP3融合多肽。
A.考馬斯亮藍染色聚丙烯酰胺凝膠(10%)以及B。用抗ZP3-341-360的抗血清(1∶150稀釋)進行的Western吸印試驗。從左至右將下列樣品裝載于凝膠上(-，誘導前;+誘后2小時)對照pEX;pEX-ZP3A(KpnI-BamHI片段;總cDNA);pEX-Ep3B(KpnI-SalI片段;在編碼1-241位氨基酸的外顯子5處截斷的cDNA);pEX-ZP3C(KpnI-SphI片段;在編碼1-102位氨基酸的外顯子1的末端被截斷的cDNA)，pEX-ZP3D(SmaI-BamHI片段;編碼257-372位氨基酸的外顯子5+外顯子6，7和8的3’端一半序列)。分子量(M)標準物在最左端(以KDal表示)。在30℃生長細菌直至OD600＝0.5-1，隨后在42℃誘導2小時。取等分試樣，離心，分析總細胞裂解物。
圖6不同抗體(見材料和方法部分)與人卵細胞的結合情況。用一個曝光分析儀測量用FITC標記的第二抗體的量，表示為對照的百分數(100%＝黑暗，0%＝卵細胞的熒光)。1對照;2抗人透明帶的抗血清;3抗KLH的抗血清;4-8抗ZP3(93-110)，ZP3(172-190)，ZP3(327-344)，ZP3(341-360)和ZP3(362-372)的抗血清;9抗β-Gal-ZP3的抗血清;10用重組CHO產生的ZP3免疫接種的3只小鼠的血清混合物;113只對照小鼠的血清混合物。列出了以對照的百分數表示的平均曝光時間和標準平均誤差。
圖7用抗-ZP3抗體(見材料和方法部分)抑制精子-透明帶的結合。1對照;2抗KLH的抗血清;3抗人透明帶的抗血清;4抗ZP3(93-110)，ZP3(172-190)，ZP3(341-360)和ZP3(362-372)的抗血清混合物;5由重組CHO產生的ZP3免疫接種的3只小鼠的血清混合物。列出了總透明帶上結合的精子的平均數以及標準平均誤差。
權利要求
1.具有人ZP3活性或至少部分具有人ZP3抗原性的純多肽或其功能性衍生物。
2.根據權利要求1所說的多肽，其特征在于它是由重組方法產生的。
3.根據權利要求1或2所說的多肽，其特征在于至少包括下列序列的一部分
4.根據權利要求1、2或3所述的多肽，其特征在于該多肽至少部分糖基化。
5.根據權利要求3或4所述的多肽，其特征在于該多肽至少包括下列序列之一
6.具有人ZP3活性或至少部分具有人ZP3抗原性的多肽，其特征在于該多肽至少包括下列序列的一部分
7.至少編碼了權利要求1-6的多肽一部分的核苷酸序列。
8.根據權利要求7所述的核苷酸序列，其特征在于該序列至少包括下列序列的一部分或其功能性衍生物
9.一種含有權利要求7或8所說的核苷酸序列的載體。
10.一種含有權利要求9的核苷酸序列，或權利要求7或8的一個序列的寄主細胞。
11.一種藥物組合物，其特征在于含有權利要求1-6的任一項的多肽。
12.一種免疫避孕疫苗，其特征在于含有權利要求1-6中的任一項的一種多肽和一種佐劑。
13.一種免疫避孕疫苗，其特征在于含有識別權利要求1-6中任一項的多肽的一種抗體。
14.生產權利要求1-4中任一項的一種多肽的方法，其特征在于用含有編碼這樣一種多肽的核苷酸序列的載體轉化一種寄主細胞，并在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所說的寄主細胞，從培養(yǎng)物中分離該多肽。
15.生產抗權利要求1-6中任一項的多肽的一種抗體的方法，其特征在于用所說的多肽和一種佐劑注射一種合適的動物，在合適的時間期間后收集所說動物的B-淋巴細胞，篩選生產抗體的細胞，維持其活性，然后培養(yǎng)這些細胞，從培養(yǎng)物中分離抗體。
全文摘要
本發(fā)明包括具有人ZP3活性或人ZP3抗原性的一種新的多肽或其功能性衍生物。本發(fā)明還包括所說多肽的抗原決定基，該多肽或其抗原決定基的抗體，以及用于避孕的疫苗和在一種合適寄主中表達該多肽的方法。
文檔編號C07K16/00GK1060499SQ91109289
公開日1992年4月22日 申請日期1991年8月26日 優(yōu)先權日1990年8月27日
發(fā)明者M·V·杜因 申請人:阿克佐公司