專利名稱：抗凝血酶多肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及已從水蛭Hirudinaria manillensis分離出的具有抗凝血酶活性的多肽的制備方法。
最普通的抗凝劑肽可能要數(shù)水蛭素一類。最初由醫(yī)用水蛭(Hirudo medicinalis)中分離出的水蛭素是人們非常熟悉且經(jīng)過充分鑒定的凝血酶的多肽類抑制劑(1，2)。更具體地說，它是通過離子反應(yīng)結(jié)合凝血酶，從而防止血纖維蛋白原裂解為血纖維蛋白，并進(jìn)而防止血纖維蛋白凝塊的形成。在動(dòng)物研究中已證實(shí)水蛭素能有效地預(yù)防靜脈血栓形成、血管旁路閉塞以及凝血酶誘導(dǎo)的彌漫性血管內(nèi)凝血。另外，水蛭素顯示出低毒性，很少或沒有抗原性，且其從循環(huán)中清除的時(shí)間極短。
已從另一種水蛭，水蛭Hirudinaria manillensis中分離出具有抗血活性的多肽(EP-A-0347376和WO90105143)。該水蛭被認(rèn)為是比醫(yī)用水蛭更為有利，因此可合成其氨基酸序列不同于水蛭素和其它已知的水蛭素變體之氨基酸序列的抗凝劑肽。
本發(fā)明人已對(duì)自Hirudinaria manillensis的一種制劑進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)了三種新的具有抗凝血酶活性的多肽。因此，本發(fā)明提供了包括如下氨基酸序列的多肽及其藥用的鹽
(i)P1Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Tyr Cys Leu1 510 15Cys Val Gly Gly Asn Leu Cys Gly Gly Gly Lys His Cys Glu Met20 25 30Asp Gly Ser Gly Asn Lys Cys Val Asp Gly Glu Gly Thr Pro Lys35 40 45Pro Lys Ser Gln Thr Glu Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Asp Glu50 55 60Yaa Ile Leu Asn Zaa;
65(ii)P2Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Tyr Cys Leu1 510 15Cys Val Gly Ser Asn Val Cys Gly Glu Gly Lys Asn Cys Glu Leu20 25 30Ser Ser Ser Gly Asn Gln Cys Val His Gly Glu Gly Thr Pro Lys35 40 45Pro Lys Ser Gln Thr Glu Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Asp Glu50 55 60Yaa Ile Leu Asn Zaa;或(iii)P3Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Tyr Cys Leu1 510 15Cys Val Gly Ser Asn Val Cys Gly Glu Gly Lys Asn Cys Glu Leu20 25 30Ser Ser Ser Gly Asn Gln Cys Val His Gly Glu Gly;
35 40
氨基酸殘基是按三聯(lián)密碼子表示的(Eur·J·Biochem.138，9-37，1984)。殘基Yaa代表Asp或Tyr，Zaa為-OH、-NH2或Gly-OH。鹽可以是酸加成鹽。它們可以是與氫鹵酸(如鹽酸)、硫酸、磷酸或焦磷酸等無機(jī)酸形成的鹽，也可以是與苯磺酸、對(duì)甲苯磺酸、甲磺酸、乙酸、乳酸、棕櫚酸、硬脂酸、蘋果酸、酒石酸、抗壞血酸或檸檬酸等有機(jī)酸形成的鹽。多肽也含有游離羧基，因此可以作為鈉鹽、鈣鹽、鉀鹽、鎂鹽、銨鹽或與生理上可耐受的有機(jī)含氮堿形成的鹽的形式存在。多肽也可以是內(nèi)鹽形式的。
因此，本發(fā)明的多肽主要由氨基酸序列(ⅰ)至(ⅲ)組成。從Hirudinaria manillensis分離出的天然多肽具有氨基酸序列(ⅰ)或(ⅱ)(其中Yaa為Asp，Zaa為-OH)或具有部分氨基酸序列(ⅲ)。可對(duì)本發(fā)明的多肽進(jìn)行分離和純化以用作抗凝血酶劑。
所產(chǎn)生的多肽前面可按有全部或部分前導(dǎo)序列。相對(duì)于獲得多肽的細(xì)胞來說，該前導(dǎo)序列可以是天然或外源前導(dǎo)序列。該前導(dǎo)序列能夠指導(dǎo)多肽從細(xì)胞中分泌。本發(fā)明的兩種天然多肽在表達(dá)時(shí)帶有后來被切掉的前導(dǎo)序列。因此，可呈現(xiàn)該前導(dǎo)序列的全部或一部分，該序列為Met Phe Ser Leu Lys Leu Phe Val Val Phe Leu Ala Val Cys Ile Cys Val Ser Glu Ala。
本發(fā)明的天然多肽或其鹽可通過自Hirudinaria manillensis水蛭的組織或分泌物中分離所說的多肽或其藥用鹽而制得。更具體地說，可按照WO90/05143中所述方法制備并對(duì)所得制劑進(jìn)行高壓液相層析而得到本發(fā)明的多肽。
也可按如下方法制備本發(fā)明的多肽或其鹽(a)提供宿主，在適于在宿主內(nèi)表達(dá)該多肽的條件下用含有編碼該多肽之DNA序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化之，(b)分離如此獲得的所說多肽或其藥用鹽。
該方法基本上是基本獲得編碼希望表達(dá)的多肽的核苷酸序列并在重組生物體內(nèi)表達(dá)之。培養(yǎng)經(jīng)過遺傳修飾的生物體即可產(chǎn)生顯示出全部生物學(xué)活性的所需產(chǎn)物。因此，本發(fā)明還提供了-一種包含了編碼本發(fā)明多肽之DNA序列的表達(dá)載體;
-一種被本發(fā)明的相容性表達(dá)載體轉(zhuǎn)化了的宿主;
-一個(gè)編碼本發(fā)明多肽的DNA序列。
本發(fā)明的多肽能夠在其中表達(dá)的宿主是通過用本發(fā)明的相容性表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主而制得的?？砂慈缦路椒ㄖ苽浔磉_(dá)載體(a)化學(xué)合成編碼本發(fā)明多肽的DNA序列;
(b)將該DNA插入表達(dá)載體。
還可按如下方法制備表達(dá)載體(a)從Hirudinaria manillensis水蛭的mRNA產(chǎn)生和分離編碼本發(fā)明多肽的cDNA;
(b)將分離的cDNA插入表達(dá)載體。
然后通過在適于多肽表達(dá)的條件下提供被轉(zhuǎn)化宿主而制得本發(fā)明的多肽。當(dāng)使用真核宿主時(shí)，可獲得被糖基化的多肽。可分離多肽本身或其藥用的鹽。按照這一方法，可獲得純的本發(fā)明多肽或其鹽。
可通過在任一端或兩端同時(shí)延長(zhǎng)氨基酸的方式對(duì)本發(fā)明的多肽進(jìn)行修飾。當(dāng)然，由該延長(zhǎng)序列組成的多肽必須仍然顯示出抗凝血酶活性。例如，可在任一末端或兩端提供一長(zhǎng)達(dá)30個(gè)氨基酸殘基的短序列。
可對(duì)本發(fā)明的多肽進(jìn)行一種或多種轉(zhuǎn)譯后修飾，如硫酸化、羧基酰胺化、?；蚨嚯逆湹幕瘜W(xué)改變。例如，可用肽酰甘氨酸α-酰胺化單加氧酶(PAM酶)對(duì)其羧基末端具有甘氨酸殘基的多肽進(jìn)行酶促酰胺化。
為了以DNA重組技術(shù)產(chǎn)生抗凝血酶多肽，制備了編碼本發(fā)明多肽的基因。DNA編碼序列一般不包括內(nèi)含子。分離和純化該DNA序列。將該基因插入到能夠促使重組產(chǎn)物產(chǎn)生的表達(dá)載體中。該DNA序列可以是cDNA序列，也可以是合成的DNA序列。合成基因通常是通過用化學(xué)方法合成完全對(duì)應(yīng)于所需基因的寡核苷酸，然后對(duì)這些寡核苷酸進(jìn)行裝配而制得的。
因此，可從六個(gè)化學(xué)合成的寡核苷酸構(gòu)建基因，每一寡核苷酸均代表雙鏈DNA基因之一條鏈的大約三分之一。將這些寡核苷酸連接并退火即得到所需的基因。根據(jù)需要，可通過定點(diǎn)誘變對(duì)該基因序列進(jìn)行修飾，使一個(gè)或多個(gè)密碼子發(fā)生改變。為了有助于隨后的操作，通常在基因的每一末端構(gòu)建限制性酶切位點(diǎn)。
也可提供一種還編碼上面所述的前導(dǎo)序列的DNA序列。該前導(dǎo)序列能夠指導(dǎo)多肽自表達(dá)它的細(xì)胞中分泌。編碼前導(dǎo)肽的序列通常被融合至編碼多肽之DNA序列的5端。
當(dāng)需要在細(xì)菌宿主(如大腸桿菌)中進(jìn)行表達(dá)時(shí)，前導(dǎo)肽可以是Omp A前導(dǎo)肽。當(dāng)在昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)時(shí)，前導(dǎo)肽可以是水泡性口腔炎病毒G蛋白(VSVG蛋白)。編碼Omp A和VSV G蛋白前導(dǎo)序列的合適DNA序列為
Omp A前導(dǎo)序列ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GCA CTG GCT GGT 42TTC GCT ACC GTA GCG CAG GCC 63VSV G蛋白前導(dǎo)序列ATG AAG TGC CTT TTG TAC TTA GCC TTT TTA TTC ATT GGG GTG 42AAT TGC 48可提供編碼一融合蛋白的DNA序列，該融合蛋白能夠被切斷而釋放出本發(fā)明的多肽?？墒褂镁幋a載體多肽序列的DNA序列，該載體多肽序列則通過可斷裂的連接鍵與本發(fā)明多肽的N末端相融合?？蓴嗔训倪B接鍵可以是能被溴化氰裂解的連接鍵。
為了表達(dá)多肽而構(gòu)建了一表達(dá)載體，它包括編碼多肽的DNA序列且在加至合適的宿主中時(shí)能夠表達(dá)該多肽。還提供了合適的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯控制成分，包括DNA序列的啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)以及轉(zhuǎn)譯起始和終止密碼子。DNA序列是以正確讀碼的形式提供，以保證多肽在與載體相容的宿主中被表達(dá)。
表達(dá)載體通常包括一復(fù)制起點(diǎn)，并根據(jù)需要還包含一選擇標(biāo)記基因，如抗生素抗性基因。啟動(dòng)子是被可操縱地連接至編碼多肽的DNA序列上的。表達(dá)載體可以是核粒。在這種情況下，最好是將選自Ptrp和Plcc/lac的啟動(dòng)子可操縱地連接到DNA序列上。表達(dá)載體也可以是病毒。該病毒可以是重組桿狀病毒，其中將多角體啟動(dòng)子被可操縱地連接到編碼多肽的DNA序列上。
可以任何方便的方式制備能夠表達(dá)多肽的表達(dá)載體?？蓪⒕幋a多肽的DNA片段插入到表達(dá)載體(如核粒載體)的合適限制性酶切位點(diǎn)中。重組桿狀病毒可按以下方法制備(ⅰ)在多角體啟動(dòng)子下游的限制性位點(diǎn)將編碼多肽的基因克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體中;
(ⅱ)用步驟(ⅰ)的重組轉(zhuǎn)移載體和完整的野生型桿狀病毒DNA共轉(zhuǎn)染易受桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞。
同源重組發(fā)生后產(chǎn)生重組桿狀病毒，它攜帶了位于多角體啟動(dòng)子下游的多肽基因。桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體可在多角體ATG起始密碼子的下游具有一獨(dú)特的克隆位點(diǎn)。由所產(chǎn)生的重組桿狀病毒隨后表達(dá)的產(chǎn)物將是一種融合蛋白質(zhì)，其中多角體蛋白的N-末端部分被融合到多肽的N-末端上。如上所述，可在融合連接處提供可斷裂的連接鍵。
步驟(ⅱ)中所用的昆蟲細(xì)胞通常為草地粘蟲(Spodoptera frugiperda)細(xì)胞。野生型桿狀病毒通常為苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)核多角體病毒(AcNPV)。
將編碼多肽的表達(dá)載體提供給合適的宿主，用多肽基因轉(zhuǎn)化細(xì)胞。在適于使多肽在其中表達(dá)的條件下提供轉(zhuǎn)化的宿主。例如，對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)以保證發(fā)生表達(dá)?？墒褂萌魏蜗嗳菪运拗饕惠d體系統(tǒng)。
轉(zhuǎn)化的宿主既可以是原核宿主，也可以是真核宿主?？墒褂眉?xì)菌或酵母宿主，如大腸桿菌或釀酒酵母(S.cerevisiae)。可使用革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。優(yōu)選的細(xì)菌宿主是大腸桿菌B型菌株。也可使用昆蟲細(xì)胞，在這種情況下桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)比較合適。昆蟲細(xì)胞通常是草地粘蟲細(xì)胞。另外還可以轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的細(xì)胞?？商峁┊a(chǎn)生多肽的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，如除人之外的哺乳動(dòng)物。
被表達(dá)的多肽可被分離和純化?？傻玫骄哂腥我磺懊嫠龅陌被嵝蛄?ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)的多肽，所有這些序列均由轉(zhuǎn)譯起始密碼子編碼的Met殘基引導(dǎo)。或者如上所述，可獲得一融合蛋白質(zhì)，它包括與載體序列相融合的本發(fā)明多肽的氨基酸序列即上述的序列(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)。當(dāng)在融合蛋白質(zhì)的氨基酸序列(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)與載體序列之間提供一合適的連接鍵時(shí)，可通過用合適的試劑裂解連接鍵而釋放出具有氨基酸序列(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)的多肽。
本發(fā)明的多肽或其可藥用的鹽也可按如下方法制備(a)用化學(xué)方法合成所說的多肽，(b)分離由此獲得的多肽或其藥用鹽。
因此，可通過化學(xué)合成的方法按照所需多肽序列的順序由單個(gè)氨基酸和/或兩個(gè)或多個(gè)氨基酸預(yù)成的肽組構(gòu)該多肽?？梢允褂霉滔嗷蛞合喾椒??？筛鶕?jù)需要將所產(chǎn)生的多肽轉(zhuǎn)化為其藥用鹽。
在固相合成法中，所需多肽的氨基酸序列是從結(jié)合至不溶性樹脂上的C-末端氨基酸逐步組構(gòu)成的。當(dāng)所需的多肽產(chǎn)生后，將其從樹脂上裂解下來。當(dāng)使用液相合成法時(shí)，可同樣從C-末端氨基酸開始組構(gòu)所需的多肽。該氨基酸的羧基始終被合適的保護(hù)基所保護(hù)，并在合成結(jié)束時(shí)除去保護(hù)基。
無論是使用固相還是液相技術(shù)，加到反應(yīng)系統(tǒng)中的每一個(gè)氨基酸通常具有被保護(hù)的氨基以及活化的羧基。側(cè)鏈官能團(tuán)也被保護(hù)。在合成過程中的每一步驟之后均除去氨基保護(hù)基團(tuán)。而側(cè)鏈官能團(tuán)則通常是在合成結(jié)束后再除去。
可將多肽轉(zhuǎn)化為藥用鹽?？捎糜袡C(jī)或無機(jī)酸將其轉(zhuǎn)化為酸加成鹽。合適的酸包括乙酸、琥珀酸和鹽酸。另外也可將肽轉(zhuǎn)化為羧酸鹽如銨鹽或堿金屬鹽如鈉鹽或鉀鹽。
可將多肽或其藥用鹽與藥用的載體或其賦形劑一起用于藥用組合物中。該配方通常是通過靜脈注射使用(在這種情況下載體通常是具有相當(dāng)純度的無菌鹽水或水)。本發(fā)明的多肽是一種抗凝血酶，適用于治療主要是人類的血栓形成性疾病，如血液凝固。因此，該多肽可在血液透折、血液分離以及體外血液循環(huán)中用于治療和預(yù)防血栓形成和血栓栓塞(包括預(yù)防手術(shù)后的血栓形成)、用于急性休克治療(例如治療膿毒性或多創(chuàng)傷性休克)以及用于治療消耗性凝血病。在另一實(shí)施方案中，可將本發(fā)明的多肽或其鹽與纖維蛋白溶酶原激活劑(如組織纖維蛋白溶酶原激活劑)一起使用。
所用的劑量主要取決于具體的服用方式以及治療或預(yù)防的目的。個(gè)體劑量的大小以及給藥的方法可根據(jù)對(duì)個(gè)體疾病的具體情況的判斷而定。為此目的所需之測(cè)定相關(guān)血液因子的方法是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所熟知的，一般在注射情況下，治療有效量的本發(fā)明化合物的劑量范圍為每公斤體重約0.005-0.1mg，優(yōu)選每公斤體重約0.01-0.05mg。給藥是通過靜脈注射、肌肉注射或皮下注射的方式進(jìn)行。相應(yīng)地，根據(jù)給藥的方式不同，以單個(gè)劑量形式用于胃腸道外給藥的藥用組合物每份劑量含有約0.4-7.5mg的本發(fā)明化合物。除活性成分外，藥物組合物還含有為維持PH值在3.5-7之間所需緩沖液(如磷酸鹽緩沖液)以及用于調(diào)節(jié)等滲性所需的氯化鈉、甘露醇或山梨醇。這些組合物可以是冷凍干燥形式溶解形式的，含有抗菌活性防腐劑如0.2-0.3%4-羥基苯甲酸甲酯或乙酯的溶液可能更為有利。
局部應(yīng)用的組合物可以是水溶液、洗劑、凝膠、油性溶液、懸浮液或含脂(尤其是乳化的)軟膏。水溶液形式的組合物可通過例如將本發(fā)明的活性成分或其藥用鹽溶于PH為4-6.5的含水緩沖溶液中而制得，并可根據(jù)需要加入其它活性成分，如消炎劑和/或聚合粘合劑(如聚乙烯吡咯烷酮)和/或防腐劑。10ml溶液或10g凝膠中活性成分的濃度約為0.1-1.5mg，優(yōu)選0.25-1.0mg。
適于局部給藥的油性組合物是通過例如將本發(fā)明的活性成分或其藥用鹽懸浮于油中而制得的，并可根據(jù)需要加入脹溶劑(如硬脂酸鋁)和/或HLB值(“親水-系脂平衡”)低于10的表面活性劑，這類表面活性劑有甘油單硬脂酸酯、脫水山梨醇單目桂酸酯、脫水山梨醇單硬脂酸酯或脫水山梨醇單油酸酯。含脂軟膏是通過例如將本發(fā)明的活性成分或其鹽懸浮于可分散的脂肪基質(zhì)中制得的，并可根據(jù)需要加入HLB值低于10的表面活性劑。乳化軟膏是通過將本發(fā)明的活性成分或其鹽在柔軟的可分散脂肪基質(zhì)中進(jìn)行研磨并加入HLB低于10的表面活性劑而制得的。適于局部應(yīng)用的所有這些劑型的組合物也可含有防腐劑。10g基質(zhì)中活性成分的濃度約為0.1-1.5mg，優(yōu)選0.25-1.0mg。
除了上面所述的組合物以及與其類似而打算在人體或哺乳動(dòng)物體內(nèi)直接作醫(yī)藥應(yīng)用的藥用組合物外，本發(fā)明還涉及在人體外或哺乳動(dòng)物體外作醫(yī)藥應(yīng)用的藥用組合物和制劑。這類組合物和制劑主要是被用作血液的抗凝添加劑，而這種血液則正在經(jīng)受體外循環(huán)或處理(例如在人工腎中的體外循環(huán)或透析)、貯存或更換(例如血液分離)。這類制劑(如原液或以單一劑量形式存在的不同制劑)在組成上與前面所述的注射制劑相似。但是，活性成分的量或濃度則更為有利地取決于所要處理的血液量，或更準(zhǔn)確地說，是取決于其凝血酶的含量。在這一方面應(yīng)當(dāng)牢記即使在相對(duì)大量的情況下，能夠完全滅活約5倍重量凝血酶的本發(fā)明活性成分(游離形式)在生理上也是無害的，且即使在高濃度的情況下也能夠快速地從循環(huán)血液中清除出去，因此即使在輸血過程中也沒有過量的危險(xiǎn)。根據(jù)其具體用途，合適的劑量為每升血液約0.01-1.0mg活性成分，但仍可在無危險(xiǎn)的情況下超過這一上限。
以下的實(shí)施例將舉例說明本發(fā)明。
在附圖中

圖1是顯示實(shí)施例1中HPLC分析結(jié)果的層析圖。P1至P3代表得自實(shí)施例1制品的三個(gè)不同的峰，F(xiàn)T表示流出部分，4-AB表示4-氨基苯甲脒。
圖2顯示得自實(shí)施例2(b)胰蛋白酶消化的PE-P1(A)和PE-P2(B)的洗脫曲線。
圖3顯示編碼對(duì)應(yīng)于峰2(P2)之蛋白質(zhì)的大部分的6個(gè)寡核苷酸的核苷酸序列，其中第61位的氨基酸殘基為Asp，多肽鏈最后一個(gè)氨基酸殘基為Asn64。用黑體字顯示的序列代表BalⅠ位點(diǎn)，它已被用于進(jìn)一步的構(gòu)建。該圖的下半部分顯示了6個(gè)寡核苷酸的裝配模式。為了便于以后的操作而加進(jìn)了HindⅢ和Pst位點(diǎn)。
圖4顯示中間體質(zhì)粒M13-P2的構(gòu)建方案，它是所用其它P2構(gòu)建的BalⅠ-Bam H I DNA片段的來源。
圖5以圖解方式顯示新的重組M13(即OMP-P2)的構(gòu)建，它攜帶與Omp A前導(dǎo)肽相連的完整P2基因。前導(dǎo)肽序列以黑體表示，而BalⅠ平端和HindⅢ粘性末端則以下劃線表示。
圖6以圖解方式顯示pFC-P2的構(gòu)建，該質(zhì)粒是用于在大腸桿菌中生產(chǎn)P2蛋白。
圖7顯示用于在大腸桿菌中生產(chǎn)p2的質(zhì)粒pOMPA-p2的整體結(jié)構(gòu)。我們使用了常規(guī)的基因操作技術(shù)來制備這一新質(zhì)粒，其中p2基因處在雜合啟動(dòng)子PlPP/lac的轉(zhuǎn)錄控制之下。即使在這種情況下，OmpA前導(dǎo)肽仍能驅(qū)使p2向大腸桿菌周質(zhì)中分泌。
圖8顯示用于從昆蟲細(xì)胞中分泌p2的合成寡核苷酸的核苷酸序列及其裝配。以黑體字母表示的序列代表VSVG蛋白前導(dǎo)肽。
圖9顯示新的重組M13即VSV-P2的構(gòu)建，其中完整的p2基因與VSVG蛋白前導(dǎo)肽相連。
圖10以圖解方式顯示用作向桿狀病毒基因組轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移載體的pAC-p2的構(gòu)建，pACYM1是廣泛地用作向病毒轉(zhuǎn)夠的異源序列的受體的起始質(zhì)粒。
圖11顯示編碼p2鏈起始部分的合成寡核苷酸的核苷酸序列及其裝配。編碼額外的甲硫氨酸殘基的ATG密碼子以黑體表示。
圖12以圖解方式顯示pAcFT1的構(gòu)建，它被用于細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。
圖13顯示新的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pAcFT1-p2，它攜帶了與多角體的前18個(gè)氨基酸相連的完整p2序列。該質(zhì)粒已被用于向桿狀病毒基因組轉(zhuǎn)移異源序列。
圖14圖解顯示擴(kuò)增3′末端的RACE方法。在該圖中，“＊＊＊TTTT……”代表dT17連接子引物。在每一步驟中附圖簡(jiǎn)化為僅說明如何利用前一步驟中所形成的新產(chǎn)物。
圖15顯示擴(kuò)增5′末端的RACE方法。該圖中“＊＊＊TTTT…”和“＊＊＊”分別代表dT17連接子引物和連接子引物。其中每一步驟均簡(jiǎn)化為僅說明如何利用前一步驟所形成的新產(chǎn)物。
實(shí)施例1按照下面a)和b)中所述的方法，由WO90/05143所述的Hirudinaria manillensis水蛭制備抗凝血酶制劑。
a)丙酮萃取將乙醇干燥過的水蛭頭部(2920g)切成小塊，并用40∶60丙酮/水混合液(7.51)處理。于室溫下攪拌均勻后，將該混合物以2700rmp的轉(zhuǎn)速離心15分鐘。取出上清液，將沉淀物再懸浮于40∶60丙酮∶水的混合液中，攪拌30分鐘后將混合物以2700rpm的轉(zhuǎn)速離心15分鐘。將上清液與前次的上清液合并，并用冰醋酸(體積8.5升)酸化至PH4.5。該混合物以2700rpm離心15分鐘，取出上清液后通過加入30%氨水將溶液的PH調(diào)節(jié)至6.0。于35℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后濃縮溶液的PH降至1.8;離心除去沉淀的污染物，使用9倍過量的丙酮從混合物中沉淀出抗凝血酶粗品，將混合物離心，將沉淀物重新懸浮于丙酮中，并再次離心。然后將沉淀物凍干。
b)離子交換純化將抗凝血酶粗品重新溶于水中，對(duì)10mM乙酸銨緩沖液(PH4.0)透析，并加至在同一緩沖液中預(yù)平衡過的羧甲基瓊脂糖柱(CM Sepharose，Pharmacia，2.6×30cm)上。用100ml起始緩沖液洗柱后，用20mM乙酸銨(PH4.5)洗脫抗凝血酶活性部分，收集并合并之(1.3l)。為了進(jìn)一步純化，將合并的部分在Minitan裝置(Millipore)中濃縮至0.5l;濃縮溶液用NaOH中和后加至在20mM Tris-Hcl(PH7.0)中平衡過的Q瓊脂糖柱上。用起始緩沖液中的0-1M線性梯度Nacl對(duì)結(jié)合物質(zhì)進(jìn)行洗脫。合并含有抗凝血酶活性的部分，通過在Superdex S-200柱上用20mM Tris-Hcl(PH7.5)以4ml/分鐘的流速洗脫而將其濃縮并脫鹽。自凝膠過濾所獲得的活性合并物用Minitan裝置濃縮，并用弱陰離子交換層析(DEAE FPLC)法進(jìn)一步純化之。將活性材料上pnotein pak DEAE-5pW柱(Watcrs)，并用20mM Tris-Hcl(PH6.5)中的0-1M Nacl線性梯度以1.0ml/min的流速洗脫。合并活性部分，鑒定蛋白質(zhì)含量及其活性(此活性800ATU/mg)，并在Spedvac濃縮器(Savant)中冷凍干燥。
為了得到均質(zhì)多肽，接著將由此獲得的部分純化的材料(此活性800ATu/mg)按照下面c)和d)中所述的方法再進(jìn)行兩次附加的層析純化c)凝血酶-瓊脂糖按照Lundblad(＊)所述的方法進(jìn)一步純化市售的牛凝血酶(Sigma)。然后將其按照制選考推薦的方法吸附到活化的Sepharose CL 6B柱(Pharncacia)上。用50mM Tris-Hcl(PH8.3)平衡該柱(1.7mL)，并用得自DEAE-FPLC的凍干材料(在緩沖液中重新溶解)上柱。先用起始緩沖液，接著用含有3.0M Nacl的該緩沖液、最后用起始緩沖液三次洗柱，(每一種洗液均三倍于柱體積)。流速為0.3ml/分鐘，用25mMHcl中的10ml0.1M4-氨基苯甲脒洗脫結(jié)合的材料。合并活性部分，并在PD-10柱(Pharmacia)上在50mM Tris-Hcl(PH8.3)中交換緩沖液。
將用起始緩沖液洗柱洗脫的并仍具有抗凝血酶活性的未結(jié)合材料質(zhì)上柱，直至所有的活性均被結(jié)合并層析分離之。
(＊)Lundtlad，R、L.，1971，Biochemistry，102501-2506。
d)RP-HPLC在c4vydac柱(4.6×250mm.5μ)經(jīng)逆相高壓層析(RP-HPLC)對(duì)親和層析后獲得的物質(zhì)進(jìn)行最后的純化。用20mM磷酸鈉(PH7.5)作為第一洗脫液，然后改用50%的乙腈水溶液作洗脫液。于室溫下在45分鐘內(nèi)用5-55%洗脫液B的線性梯度以1.0ml/分鐘的流速洗脫抗凝血酶多肽。所得的層析圖示于圖1中。
手工收集蛋白質(zhì)峰(220nm處檢測(cè))，真空濃縮后在同樣條件下再次層析。
在C4HPLC之后對(duì)純的抗凝血酶多肽進(jìn)行蛋白質(zhì)含量、氨基酸組成、N-末端序列、C-末端序列檢測(cè)并通過體外試驗(yàn)(ATU/NIH試驗(yàn)和“凝血酶時(shí)間”試驗(yàn))鑒定其活性。發(fā)現(xiàn)三個(gè)蛋白質(zhì)峰均具有抗凝血酶活性。
對(duì)胰蛋白酶和V8蛋白酶消化所獲得的肽進(jìn)行N-末端序列分析，可測(cè)定出圖1中被標(biāo)為P1和P2的多肽的全部氨基酸序列。其序列在上面的(ⅰ)和(ⅱ)中給出。另一種多肽(P3)的部分氨基酸序列在上面的(ⅲ)中給出。
實(shí)施例2對(duì)吡啶乙基化(PE)的P1和P2進(jìn)行胰蛋白酶消化并作出其肽圖譜a)還原/烷基化合并在凝血酶-瓊脂糖上經(jīng)親和層析純化的活性部分(實(shí)施例1c)，并將PD-10柱上的緩沖液換成10mM Tris-Hcl(PH8.3)。將活性合并物(約50μg)在Speed-Vac離心機(jī)(Savant)上濃縮，然后在氮?dú)猸h(huán)境中用100μl在6M鹽酸胍/50mM Tris-Hcl(PH8.5)中的1%硫基乙醇溶液于暗處室溫下處理2小時(shí)。再加入4μl4-乙烯基-吡啶(純凈的)，并將混合物于同樣條件下再次保溫2小時(shí)。4首先在c4Vydac柱(4.6×250mm，5μm)上通過RP-HPLC從反應(yīng)混合物中回收吡啶乙基化的多肽，其中用在0.1%TFA中的5-65%乙腈線性梯度以1.0ml/分鐘的流速洗脫90分鐘。在這些條件下，抗凝血酶多肽混合物各組分離較差，因此必須在實(shí)例1d所述的條件下使用磷酸鈉/乙腈洗脫系統(tǒng)在同一柱上再次層析。
b)對(duì)PE-P1和PE-P2進(jìn)行胰蛋白酶消化和給制其肽圖譜。
在0.2M磷酸鈉存在下，用TPCK處理的胰蛋白酶(Sigma)在200μl1%碳酸氫銨(PH8.0)中的溶液消化己純化的PE-P1和PE-P2(分別為10和20μg)。按酶與底物的比率為1∶20(W/W)的量加入胰蛋白酶，于37℃保溫4小時(shí)。然后通過在Savant中冷凍干燥終止消化。
在μBondapak c18柱(3.9×300mm，10μ Waters)或C4-Vydac柱(4.6×250mm，5um)上分離經(jīng)胰蛋白酶消化所獲得的肽，其中用線性梯度為5-65%的乙腈的0.1%TFA溶液的1.0ml/分鐘的流速洗脫60分鐘(圖2)。手工收集洗脫峰，在Savant中濃縮，然后在477A型脈沖液相序列分析儀(Applied Biosystems)上進(jìn)行氨基酸分析和N-末端序列分析。
對(duì)胰蛋白酶消化的PE-P1(A)和PE-P2(B)進(jìn)行C4-HPLC肽序列分析所得的結(jié)果如下片段 氨基酸序列A 1-13 VSYTDCTESGQNY14-26 CLCVGGNLCGGGK27-36 HCEMDGSGNK37-47 CVDGEGTPKPK37-47(＊) CVDGEGX*PKPK48-64 SQTEGDFEEIPDEDILNB 1-13 VSYTDCTESGQNY14-26 CLCVGSNVCGEGK27-47 NCQLSSSGNQCVHGEGX*PKPK48-64 SQTEGDFEEIPDEDILN
(＊)X為通過氨基酸序列分析未測(cè)出的殘基;x經(jīng)氨基酸分析確定為T。
因此，P1和P2的完整氨基酸序列為P1Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Tyr Cys LeuCys Val Gly Gly Asn Leu Cys Gly Gly Gly Lys His Cys Glu MetAsp Gly Ser Gly Asn Lys Cys Val Asp Gly Glu Gly Thr Pro LysPro Lys Ser Gln Thr Glu Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Asp GluAsp Ile Leu AsnP2Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Tyr Cys LeuCys Val Gly Ser Asn Val Cys Gly Glu Gly Lys Asn Cys Gln LeuSer Ser Ser Gly Asn Gln Cys Val His Gly Glu Gly Thr Pro LysPro Lys Ser Gln Thr Glu Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Asp GluAsp Ile Leu Asn實(shí)施例3P2基因的化學(xué)合成基于大腸桿菌所優(yōu)選的密碼子5，設(shè)計(jì)核苷酸編碼序列。而且，在非常靠近合成基因5′末端處加進(jìn)-BalⅠ限制位點(diǎn)以便將該序列插入到不同的表達(dá)載體中，用實(shí)際上相同的合成基因在細(xì)菌和昆蟲細(xì)胞中表達(dá)重組P2蛋白。在使用昆蟲細(xì)胞的情況下，所使用的方法將以分泌產(chǎn)物或細(xì)胞質(zhì)產(chǎn)物的形式產(chǎn)生蛋白質(zhì)P2。
所有質(zhì)粒DNA的操作均按Maniatis等人所述的方法進(jìn)行。
用自動(dòng)DNA合成儀(Applyied Biosystems)制備6個(gè)合成的互補(bǔ)寡核苷酸，其序列示于圖3中。在酶促磷酸化之后，使用DNA連接酶裝配這6個(gè)寡核苷酸，并將所產(chǎn)生的雙鏈序列插入到M13噬菌體載體mp18中，得到圖4所示的質(zhì)粒M13-P2。為了使P2基因能夠插入M13載體，在合成的寡核苷酸中也加進(jìn)了HindⅢ和PstⅠ位點(diǎn)。通過對(duì)單鏈?zhǔn)删wDNA進(jìn)行序列分析(Sanger法)證實(shí)其具有正確的核苷酸序列。
重組質(zhì)粒M13-P2為實(shí)施例中所用的所有表達(dá)載體提供了P2基因來源。
實(shí)施例4在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)并從中分泌P2蛋白為了使重組產(chǎn)物向周質(zhì)分泌，有必要合成前蛋白質(zhì)形式的P2分子。更具體地說，負(fù)責(zé)有效分泌的稱為“前導(dǎo)肽”的氨基酸序列必須出現(xiàn)在P2的NH2末端8，9。而這一額外序列則在分泌過程中在體內(nèi)被特定的大腸桿菌前導(dǎo)肽酶切除，產(chǎn)生正確的成熟序列10。
文獻(xiàn)中敘述過多種分泌系統(tǒng)11，12。我們選擇了基于以前公開的大腸桿菌外膜蛋白(OmpA)之分泌信號(hào)的系統(tǒng)。因此，我們?cè)O(shè)計(jì)了兩個(gè)編碼OnpA前導(dǎo)肽的附加互補(bǔ)寡核苷酸，它們的前面是已知負(fù)責(zé)促使RNA、有效轉(zhuǎn)譯的OmpA Shine-Dalgarno序列14。
如圖5所示，其序列中也包括了編碼前10個(gè)氨基酸的P2基因的起始部分。BalⅠ位點(diǎn)的存在使得該合成片段能夠與P2編碼序列的其余部分相連，而上游HindⅢ位點(diǎn)的存在則使得它能夠與M13載體相連。因此，可將合成的HindⅢ-BalⅠ片段與M13-P2的BalⅠ-BamHⅠ片段相連并插入至M13mp18中，從而得到新的質(zhì)粒OMP-P2。圖5也圖解顯示了該新質(zhì)粒的構(gòu)建。
可從OMP-P2中切掉作為Hind Ⅲ-Ban HⅠ片段的P2基因，該片段編碼OmpA Shine-Dalgarno和前導(dǎo)肽以及其后的P2編碼序列?，F(xiàn)在該限制片段準(zhǔn)備插入到合適的表達(dá)載體中。從理論上講，可使用多種表達(dá)系統(tǒng)以在細(xì)菌中高水平地生產(chǎn)異源蛋白質(zhì)。我們的實(shí)驗(yàn)室過去曾成功地使用過基于Ptrp啟動(dòng)子的表達(dá)系統(tǒng)14。即使在使用選擇的啟動(dòng)子的情況下，給定多肽的表達(dá)水平同樣是不可預(yù)測(cè)的。
圖6所示的質(zhì)粒PFC33已在文獻(xiàn)中提到14。它攜帶了氨芐青霉素抗性基因和細(xì)菌啟動(dòng)子Ptrp，該啟動(dòng)子驅(qū)使前脫脂蛋白A1的表達(dá)。在用HindⅢ和BamHⅠ消化pFC33之后，分離出攜帶抗生素抗性基因和啟動(dòng)子的Hind ⅢBanHⅠ大片段，并將其連接到得自編碼P2基因之OMP-P2的Hind Ⅲ Ban H Ⅰ片段上。其構(gòu)建的具體步驟示于圖6中。我們分離出新質(zhì)粒pFC-P2，它是在大腸桿菌中生產(chǎn)P2的最終質(zhì)粒。
本發(fā)明的目的之一是利用B型大腸桿菌來表達(dá)和向周質(zhì)中分泌P2以及本發(fā)明的其它抗凝血酶多肽。事實(shí)上我們已發(fā)現(xiàn)，將質(zhì)粒pFC-P2插入大腸桿菌B型菌株中能夠高水平地產(chǎn)生P2。令人感興趣的是，使用不同型的大腸桿菌菌株并不能同樣有效地表達(dá)，因此似乎宿主菌株的類型是成功生產(chǎn)水蛭素的關(guān)鍵。
可得到幾個(gè)B型大腸桿菌菌株并將其用于生產(chǎn)P2。優(yōu)選的菌株是ATCC12407，ATCC11303，NCTC10537。下面是一個(gè)用質(zhì)粒pFC-P2轉(zhuǎn)化菌株NDTC10537并在隨后培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化株的實(shí)例。
利用Mandel和Higa15的氯化鈣法制備NCTC10537菌株的感受態(tài)細(xì)胞。用2μl質(zhì)粒DNA(濃度約為5μg/ml)轉(zhuǎn)化約200μl濃度為1×109細(xì)胞/ml的這些細(xì)胞的制劑。在含有100μg/ml氨芐青霉素的L-瓊脂平板上篩選轉(zhuǎn)化株。用木牙鑒將兩個(gè)較小的菌落在含有相同抗生素的L-瓊脂上劃線(每條線約1cm長(zhǎng))。于37℃保溫12小時(shí)后，通過將劃線部分接種至10mlLB培養(yǎng)基(含有濃度為150μg/ml的氨芐青霉素)中并于37℃保溫連夜而試驗(yàn)P2蛋白的產(chǎn)生。第二天將培養(yǎng)物按1∶100稀釋至M9培養(yǎng)基(含有相同濃度的氨芐青霉素)中，并于37℃保溫6小時(shí)。
將20ml該培養(yǎng)物于4℃以12000×g的轉(zhuǎn)速離心10分鐘。將細(xì)菌沉淀物重新懸浮于2ml33mM Tris-Hcl(pH8)中，然后加入等體積的第二溶液(33mMEDTA，40%蔗糖)，將整個(gè)混合物在溫和振蕩的條件下于37℃保溫10分鐘。離心后將有通透性的細(xì)胞重新懸浮于2ml冷水中并在冰中放置10分鐘。離心分離所得到的上清液，此即代表了細(xì)菌細(xì)胞的周質(zhì)部分。
利用基于凝血酶對(duì)合成底物S-223816切割能力之抑制作用的生色檢測(cè)法，我們已在產(chǎn)生P2的細(xì)胞的周質(zhì)部分中檢測(cè)到抗凝血酶活性，但未在對(duì)照的周質(zhì)部分中檢測(cè)到這一活性。
利用類似的方法，我們也為P2構(gòu)建出新的表達(dá)/分泌質(zhì)粒，其中的PlPP/lac啟動(dòng)子17代替了Ptrp啟動(dòng)子。這一被稱為pCMP-P2的不同質(zhì)粒示于圖7中。將該質(zhì)粒插入B型大腸桿菌菌株中之后也得到了高水平的活性P2。我們使用了GHrayb等人17所述的質(zhì)粒pIN-Ⅲ-OmpA3來作為構(gòu)建pOMP-P2的起始質(zhì)粒。有關(guān)培養(yǎng)以及用異丙基-β-D-硫代吡喃豐乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)的條件如以前所述17。
實(shí)施例5在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)并從中分泌蛋白質(zhì)P2為了從重組的昆蟲細(xì)胞中分泌出蛋白質(zhì)p2，我們將p2編碼序列與能夠被這些細(xì)胞有效識(shí)別的前導(dǎo)肽相連接。我們使用了水泡性口腔炎病毒(VSV)G蛋白18的前導(dǎo)肽。與上文所述者相似，已制備出后面接有p2基因起始部分的編碼VSVG蛋白前導(dǎo)肽的合成DNA序列，圖8給出了其核苷酸序列，在此情況下，我們也提供了利于將其連接到P2基因的其余部分以及表達(dá)載體上的限制性位點(diǎn)(Hiad Ⅲ，BamH Ⅰ和BalⅠ)。
將合成的Hind Ⅲ-BalⅠ片段連接到得自M13-P2且攜帶P2基因的純化Bal Ⅰ-BamH Ⅰ片段上，并插入到已預(yù)先用Hind Ⅲ和BamHⅠ切割的M13mp18中。產(chǎn)生新質(zhì)粒VSV-P2的這一構(gòu)建過程示于圖9中。我們已從VSV-P2中切掉BamHⅠ-BamHⅠDNA片段，該片段攜帶已融合到VSV前導(dǎo)肽中的P2基因，然后將其插入至載體pAcYM119中(如圖10所示)。所產(chǎn)生的質(zhì)粒被稱作pAc-p2。
為了在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，必須將VSV-P2編碼序列轉(zhuǎn)移到位于多角體啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄控制之下的桿狀病毒基因組中。為此，我們用野生型桿狀病毒DNA和轉(zhuǎn)移載體pAc-P2對(duì)昆蟲細(xì)胞進(jìn)行了共轉(zhuǎn)染。對(duì)于昆蟲細(xì)胞，我們選擇草地粘蟲細(xì)胞作為宿主細(xì)胞。詳細(xì)實(shí)驗(yàn)過程如下利用經(jīng)過改進(jìn)的Summers等20所述的方法，用感染性AcNPVDNA以及代表單個(gè)重組轉(zhuǎn)移載體的質(zhì)粒DNA的混合物轉(zhuǎn)染草地粘蟲細(xì)胞。將1μg病毒DNA與25-100μg質(zhì)粒DNA混合，并在20mMHEPES緩沖液(PH7.5)、1mM正磷酸氫二鈉、5mM氯化鉀、140mM氯化鈉和10mM葡萄糖(總體積1ml)存在下用終濃度為0.125M的氯化鈉沉淀之。
在35mm組織培養(yǎng)皿中將DNA懸液接種到106個(gè)草地粘蟲細(xì)胞的單層上，于室溫下1小時(shí)吸附到細(xì)胞上。然后更換1ml培養(yǎng)基。于28℃保溫3天后，收獲上清液，并用于在草地粘蟲細(xì)胞單層中產(chǎn)生噬斑。根據(jù)用光學(xué)顯微鏡檢測(cè)時(shí)無多角體存在而鑒定出含有重組病毒的噬斑，自這些噬斑中回收病毒，進(jìn)一步純化噬斑后將其用于生產(chǎn)多角體陰性病毒原種。
利用上述方法可分離出一種重組桿狀病毒，其基因組中攜帶了處于多角體啟動(dòng)子和VSVG蛋白前導(dǎo)肽控制之下的P2基因。我們利用這一病毒按照已知方法20感染草地粘蟲，復(fù)感染數(shù)為10。然后按照已公開的方法20，在10%胎牛血清存在下以旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)中或單層方式培養(yǎng)感染的細(xì)胞。在這兩種情況下，利用S-2238生色檢測(cè)法在感染細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液中均檢測(cè)到抗凝血酶活性。
實(shí)施例6在昆蟲細(xì)胞的胞質(zhì)中表達(dá)蛋白質(zhì)P2也可在草地粘蟲細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生和積累蛋白質(zhì)P2。由于這一方法利用了作為非分泌性病毒蛋白質(zhì)的多角體的表達(dá)信號(hào)，因此一般具有較好的異源蛋白質(zhì)產(chǎn)率。
我們用以獲得大量重組蛋白質(zhì)P2的方法是基于一融合多肽的表達(dá)，其中多角體的前18個(gè)氨基酸與P2的64個(gè)氨基酸相連。多角體NH2末端的存在使得表達(dá)能高水平進(jìn)行21。另外，我們?cè)诙嘟求w部分與P2序列之間加進(jìn)了一個(gè)甲硫氨酸殘基，它使得在用CNBr處理雜合蛋白時(shí)能夠釋放出P2部分。
與前述方法相似，我們制備了一個(gè)能夠使Bal Ⅰ-BamH Ⅰ片段(得自M13-P2)與合適的轉(zhuǎn)移載體相連的合適DNA片段。圖11所示的該新的合成片段也包括了便于繼后操作的BamHⅠ和BalⅠ位點(diǎn)。
已獲得一種不同的轉(zhuǎn)移載體pAcFT1，它攜帶了編碼多角體前18個(gè)氨基酸的核苷酸序列(圖12)。簡(jiǎn)單地說，pAcYM119的EcoRV-BamHⅠ片段已被含有自核苷酸-92至核苷酸+55之間的多角體基因序列的合成寡核苷酸所取代。該序列之后有一個(gè)方便的BamHⅠ位點(diǎn)，并可按照?qǐng)D13所示的方案將其用于插入完整的P2編碼序列。通過這一構(gòu)建過程，我們得到了一個(gè)新的質(zhì)粒pAcFT1-P2，用它將雜合基因轉(zhuǎn)移到桿狀病毒基因組中。
按照實(shí)施例5所述的方法得到重組桿狀病毒。按照常規(guī)方法20感染草地粘蟲細(xì)胞。培養(yǎng)感染的昆蟲細(xì)胞導(dǎo)致融合蛋白在細(xì)胞質(zhì)中的積累。該雜合蛋白是重組蛋白P2的來源。可按文獻(xiàn)中公開的幾種方法用CNBr切割該雜合蛋白22，23。應(yīng)用Olson等23所述的方法可得到正確的P2多肽序列。該分子顯示出抗凝血酶活性。
實(shí)施例7為了獲得P2蛋白的Tyr61變體，用下列寡核苷酸取代上面實(shí)施例3中所述及圖3中所示的寡核苷酸5和6
oligo 5-Tyr5'CGAAATCTCAGACTGAAGGTGACTTCGAAGAAATTCCGGACGAATACATCCTGAACTAGTAACTGCA 3'oligo 6-Tyr5'-GTTACTAGTTCAGGATGTATTCGTCCGGAATTTCTTCGAAGTCACCTTCA 3'在寡核苷酸5-Tyr中，下面劃線的TAC三聯(lián)密碼子編碼酪氨酸，它取代了原來存在的編碼天冬氨酸的GAC三聯(lián)密碼子。寡核苷酸6-Tyr已被相應(yīng)地校正以在兩條鏈之間獲得完全的互補(bǔ)性。在昆蟲細(xì)胞或大腸桿菌中表達(dá)和/或分泌變體的繼后步驟與實(shí)施例4-6中所述者相同。
實(shí)施例8為了得到P2蛋白的甘氨酸加長(zhǎng)衍生物，用下示寡核苷酸序列取代上面實(shí)施例3中所述且示于圖3中的寡核苷酸5和6寡核苷酸5-Gly5'CGAAATCTCAGACTGAAGGTGACTTCGAAGAAATTCCGGACGAAGACATCCTGAAC-GGTTAGTAACTGCA 3'寡核苷酸6-Gly5' GTTACTAACCGTTCAGGATGTCTTCGTCCGGAATTTCTTCGAAGTCACCTTCA 3'在寡核苷酸5-Gly中，下面劃線且編碼甘氨酸的三聯(lián)密碼子GGT被插入終止密碼子之前。為了在兩條鏈之間獲得完全的互補(bǔ)性，對(duì)寡核苷酸6-Gly進(jìn)行了相應(yīng)的校正。以后的在昆蟲細(xì)胞或大腸桿菌中表達(dá)和/或分泌Gly加長(zhǎng)衍生物的步驟與實(shí)施例4-6中所述者相同。
實(shí)施例9P1和P2的cDNA克隆(a)按照Cathala等人的方法24，由水蛭Hirudinaria manillensis頭制備出總RNA。
(b)按如下方法完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在冰上分別裝入10μg得自水蛭頭的總RNA、1μgdT17連接子引物、8μl5mMdnTP混合物、8μlAMV緩沖液(5x)，并加水至40μl，混合后將所得混合物于65℃加熱2分鐘，然后在冰上淬火。加入10單位核糖核酸酶(RNAsin)(Promega)和20單位的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(Bochringer Mannheim)于42℃保溫2小時(shí)。然后用苯酸氯仿萃取反應(yīng)混合物。並用異丙醇沉淀。
(c)然后進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。每次PCR反應(yīng)的一般程序是將下列PCR反應(yīng)混合物于95℃變性5分鐘5μl逆轉(zhuǎn)錄RNA，10μl10xPCR緩沖液(Cetus/Perkin Elmer)，16μl脫氧三磷酸核苷(dNTPs)混合物每種dNTP各125mM)2μlMgcl2(0.1M)，各25-500微微摩爾(pmole)引物。
加水至100μl;
然后加入215單位Tag聚合酶(Cetus/Perkin-Elmer)，并用80μl的礦物油敷蓋。反應(yīng)在Cetus/Perkin-Elmer DNA熱循環(huán)器中反復(fù)進(jìn)行。
循環(huán)方案為3分鐘 94℃2分鐘 60℃2分30秒 72℃ 循環(huán)1次1分鐘 94℃2分鐘 60℃3分30秒 72℃ 循環(huán)30次1分鐘 94℃2分鐘 60℃5分鐘 72℃ 循環(huán)1次7分鐘 72℃放置于 25℃殘余的Tag聚合物用苯酸-氯仿滅活，并用乙醇沉淀;樣品于-20℃保存。為了獲得P1和P2cDNA的完整序列，進(jìn)行三輪PCR擴(kuò)增。下面顯示了每一引物的序列。經(jīng)改變個(gè)別核苷酸在寡核苷酸序列中引入簡(jiǎn)并性的位置在引物序列下示出(N表示所有四種核苷酸均可利用)。劃線顯示為有助于擴(kuò)增產(chǎn)物克隆而加入的限制位點(diǎn)。
dT17連接子引物
5' GAC TCG AGT CGA CAT CGA TTT TTT TTT TTT TTT TT 3'XhoI SalI連接子引物5' GAC TCG AGT CGA CAT CG 3'XhoI SalI引物3-85' ATC GAA GCT TTA TAC CGA TTG TAC NGA 3'HindIII C A C CT引物52-565' CTA AGG ATC CTT CTT CGA AGT CNC C 3'BamHI C A A引物32-375' ATC GGA ATT CAG TTC TGG AAA TCA GTG CGT 3'EcoRI引物5′Ⅰ
5' CTA AGA ATT CTT CGC AAC TTA TAT GCG TT 3'EcoRI引物5′Ⅱ5' ATC GGA ATT CTT AAT TCA ATA TAT CTT CAT 3'EcoRI第一輪擴(kuò)增用500mole跨越P2氨基酸序列3-8位及56-52位殘基的完全變性的引物作為PCR反應(yīng)的反相引物。
cDNA3′末端的擴(kuò)增(RACE方法)，參見Frohman等人的文章25根據(jù)第一輪擴(kuò)增中測(cè)定的P2核苷酸序列，設(shè)計(jì)出從第32至37位殘基的基因特異性引物。將該引物與dT連接子引物一起用于擴(kuò)增cDNA(圖14)。
cDNA5′末端的擴(kuò)增(RAcE方法)，參見Frohmen等人的文章25。
參照以前描述的方法對(duì)得自水蛭頭的10μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，不同的是用1μg基因特異性引物(5′Ⅰ)取代dT17連接子引物(參見圖15)。然后用異丙醇沉淀反應(yīng)混合物，并按以下用量用末端脫氧核苷轉(zhuǎn)移酶(TdT)使第一鏈cDNA產(chǎn)物的5′-末端多聚腺苷酸化22μlcDNA1μl6mMdATP
6μl5×TdT緩沖液(BRL)1.1μlTdT(BRL)將樣品于37℃保溫10分鐘，然后于65℃加熱16分鐘。然后用蒸餾水將反應(yīng)混合物稀釋至500μl。
利用10pmole dT17連接子引物、25pmole連接子引物和25pmole位于第一基因特異性引物上游用于轉(zhuǎn)錄的第二基因特異性引物(5′Ⅱ，圖15)，擴(kuò)增10μl多聚腺苷酸化的產(chǎn)物。
d)PCR產(chǎn)物的分析在各引物的限制性位點(diǎn)處切割擴(kuò)增的產(chǎn)物。對(duì)消化產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化，并亞克隆到已用同樣的限制酶預(yù)先消化過的puc13載體中。用限制性酶切分析法鑒定攜帶有用插入子的質(zhì)粒。按照制造商推薦的方法，用序列酶〔Seguenase(USB)〕對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行序列分析。如此獲得的P1和P2的cDNA序列以及由之推測(cè)的氨基酸序列如下。前導(dǎo)序列以下面劃線標(biāo)示。
P1 cDNAtca aaa ATG TTC TCT CTC AAG TTG TTC GTT GTC TTC CTG GCT GTTMet Phe Ser Leu Lys Leu Phe Val Val Phe Leu Ala ValTGC ATC TGC GTG TCT CAA GCA GTG AGC TAC ACT GAT TGT ACG GAACys Ile Cys Val Ser Gln Ala Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr GluTCA GGC CAG AAT TAT TGT CTA TGC GTG GGA GGT AAT CTC TGC GGTSer Gly Gln Asn Tyr Cys Leu Cys Val Gly Gly Asn Leu Cys GlyGGA GGC AAA CAT TGT GAA ATG GAC GGT TCT GGA AAT AAA TGC GTCGly Gly Lys His Cys Glu Met Asp Gly Ser Gly Asn Lys Cys ValGAT GGG GAA GGT ACT CCG AAG CCT AAG AGC CAG ACT GAA GGC GATAsp Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Lys Ser Gln Thr Glu Gly AspTTC GAA GAA ATC CCA GAT GAA GAT ATA TTG AAT TAAPhe Glu Glu Ile Pro Asp Glu Asp Ile Leu Asn End
P2 cDNAaaa ATG TTC TCT CTC AAG TTG TTC GTT GTC TTC CTG GCT GTT TGCMet Phe Ser Leu Lys Leu Phe Val Val Phe Leu Ala Val CysATC TGC GTG TCT CAA GCA GTG AGC TAC ACT GAT TGT ACG GAA TCAIle Cys Val Ser Gln Ala Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr Glu SerGGT CAG AAT TAT TGT CTA TGC GTG GGA AGT AAT GTC TGC GGT GGAGly Gln Asn Tyr Cys Leu Cys Val Gly Ser Asn Val Cys Gly GluGGC AAA AAT TGT CAA CTG AGC AGT TCT GGA AAT CAG TGC GTC CATGly Lys Asn Cys Gln Leu Ser Ser Ser Gly Asn Gln Cys Val HisGGG GAA GGT ACT CCG AAG CCT AAG AGC CAG ACT GAA GGC GAT TTCGly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Lys Ser Gln Thr Glu Gly Asp PheGAA GAA ATC CCA GAT GAA GAT ATA TTG AAT TAA cgaacgcatataagtGlu Glu Ile Pro Asp Glu Asp Ile Leu Asn EndtgcgaataattctgattttaagacattcccatcgcagctatggctatttacagtatattattataaataaagaattgaacgtttacgttgattgtaReferences1)Markwardt，F(xiàn).1970，Methods in Enzymology，19，p.9242)Markwardt，F(xiàn).1985，Biomed.Biochim.Acta.44，p.10073)Markwardt，F(xiàn).Hauptmann，J.，Nowak，G.，Klessen，C.，and Walsmann，P.1982.Thromb.Haemostasis 47，p.226.
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1.一種制備包括如下氨基酸序列的多肽及其藥用鹽的方法(i)P1Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Tyr Cys Leu1 5 10 15Cys Val Gly Gly Asn Leu Cys Gly Gly Gly Lys His Cys Glu Met20 25 30Asp Gly Ser Gly Asn Lys Cys Val Asp Gly Glu Gly Thr Pro Lys35 40 45Pro Lys Ser Gln Thr Glu Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Asp Glu50 55 60Yaa Ile Leu Asn Zaa；65(ii)P2Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Tyr Cys Leu1 5 10 15Cys Val Gly Ser Asn Val Cys Gly Glu Gly Lys Asn Cys Gln Leu20 25 30Ser Ser Ser Gly Asn Gln Cys Val His Gly Glu Gly Thr Pro Lys35 40 45Pro Lys Ser Gln Thr Glu Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Asp Glu50 55 60Yaa Ile Leu Asn Zaa；or(iii)P3Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Tyr Cys Leu1 5 10 15Cys Val Gly Ser Asn Val Cys Gly Glu Gly Lys Asn Cys Gln Leu20 25 30Ser Ser Ser Gly Asn Gln Cys Val His Gly Glu Gly；35 40其中Yaa為Asp或Tyr，Zaa為-oH、-NH2或Gty-oH，該方法包括A)-在使多肽表達(dá)的條件下提供-宿主，該宿主被包括編碼所說多肽之DNA序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化；和-分離由此獲得的多肽或其藥用鹽；或B)-用化學(xué)方法合成所說的多肽；和-分離由此獲得的多肽或其藥用鹽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中方法A)中的宿主是細(xì)菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞系、昆蟲細(xì)胞系或動(dòng)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中方法A)中的宿主是B型大腸桿菌菌株或草地粘蟲(Spodoptera frugiperda)細(xì)胞系。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中方法B)中的多肽是以固相合成法合成的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中多肽具有權(quán)利要求1所示的任何一種氨基酸序列，且各序列前均帶有Met殘基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中多肽具有權(quán)利要求1所示的任何一種氨基酸序列，且前面均接有全部或部分前導(dǎo)肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中多肽具有權(quán)利要求1所示的任何一種氨基酸序列，且前面接有全部或部分下示前導(dǎo)肽序列Met Phe Ser Leu Lys Leu Phe Val Val Phe Leu Ala Val Cys Ile Cys Val Ser Gln Ala.
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中多肽為一融合蛋白，其中權(quán)利要求1所示的任一氨基酸序列與一載體序列相融合。
9.一種制備權(quán)利要求1所限定的多肽或其藥用鹽的方法，該多肽具有氨基酸序列(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)，其中Yaa代表Asp，Zaa代表-OH，該方法包括從水蛭Hirudinaria manillensis的組織或分泌物中分離所說的多肽或其藥用鹽。
10.一種制備藥用組合物的方法，其特征在于將權(quán)利要求1限定的多肽與合適的藥用載體和/或稀釋劑相混合。
11.一種表達(dá)載體，它包括編碼權(quán)利要求1和5-8中任一項(xiàng)限定之多肽的DNA序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的載體，其為質(zhì)粒。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的載體，其為病毒。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的載體，其為病毒為重組桿狀病毒，其中多角體啟動(dòng)子可操縱地連接到所說的DNA序列上。
15.根據(jù)權(quán)利要求11-14中任一項(xiàng)所述的載體，其中所說的DNA序列進(jìn)一步編碼一前導(dǎo)肽，該前導(dǎo)肽能夠指導(dǎo)該多肽自表達(dá)該多肽的細(xì)胞中分泌。
16.根據(jù)權(quán)利要求11-15中任一項(xiàng)所述的載體，其中所說的DNA序列編碼一種融合蛋白，它能夠被切割而釋放出多肽。
17.一種被權(quán)利要求11-16中任一項(xiàng)的相容性表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的宿主，其為細(xì)菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞系、昆蟲細(xì)胞系或動(dòng)物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的宿主，其為B型大腸桿菌菌株或草地粘蟲(Spodoptera frugiperda)細(xì)胞系。
20.編碼權(quán)利要求1和5-8中任一項(xiàng)所限定的多肽的DNA序列。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的DNA序列，其為合成的DNA序列。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的DNA序列，其為cDNA。
23.根據(jù)權(quán)利要求20-22中任一項(xiàng)所述的DNA序列，它進(jìn)一步編碼-前導(dǎo)肽，該前導(dǎo)肽能夠指導(dǎo)所說的多肽從表達(dá)該多肽的細(xì)胞中分泌。
24.根據(jù)權(quán)利要求20-23中任一項(xiàng)所述的DNA序列，它編碼一融合蛋白，該融合蛋白能夠被切割而釋放所說的多肽。
25.一種制備權(quán)利要求1和5-8中任一項(xiàng)所限定之多肽能夠在其中表達(dá)之宿主的方法，該方法包括用根據(jù)權(quán)利要求11-16中任一項(xiàng)的相容性表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所說的表達(dá)載體按如下方法制備(a)用化學(xué)方法合成編碼該多肽的DNA序列;(b)將該DNA序列插入表達(dá)載體。
27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述的表達(dá)載體按以下方法制備(a)從水蛭Hirudinaria manillensis的mRNA產(chǎn)生并分離編碼所說多肽的cDNA;以及(b)將分離的cDNA插入表達(dá)載體中。
28.根據(jù)權(quán)利要求20所述的DNA序列，它基本上由下列序
29.根據(jù)權(quán)利要求20所述的DNA序列，它基本上要由下列序列組成
30.根據(jù)權(quán)利要求20所述的DNA序列，它基本上由下列序列組成
31.根據(jù)權(quán)利要求29或30所述的DNA序列，其中所列的序列緊接在以下序列之后
全文摘要
本發(fā)明涉及制備自水蛭Hirudinaria manillensis中分離的抗凝血酶多肽的方法。該抗凝血酶多肽可自水蛭Hirudinaria manillensis的組織或分泌物中分離，也可用重組DNA方法合成。
文檔編號(hào)C07K14/145GK1066272SQ9210114
公開日1992年11月18日 申請(qǐng)日期1992年2月27日 優(yōu)先權(quán)日1991年2月28日
發(fā)明者P·瑟米恩托斯, P·D·T·督伯特, G·尼狄, E·薩徹里 申請(qǐng)人:法米塔利亞·卡洛·埃巴有限責(zé)任公司