專利名稱：血調(diào)節(jié)肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有血調(diào)節(jié)活性并能用來抑制人和動物骨髓組織生成系統(tǒng)的新的肽。
種種調(diào)節(jié)信使和修飾基因起著骨髓組織生成的調(diào)節(jié)作用，例如菌落刺激因素、干擾素、和各種肽。下列文獻(xiàn)報導(dǎo)，成熟粒細(xì)胞提取物在蓋玻片培養(yǎng)中能特別地抑制人鼠骨髓組織生成細(xì)胞增生，參見Metcalf，Cell，43∶5(1985);Baserga R.，F(xiàn)oa P.，Metcalf D，Polli EE(eds)，Biological Regulation of Cell Proliferation (1986);Nicola et al.，J.Cell Physiol.128∶501(1986)，Zoumbos et al.，Proyr.Hemat.1∶341，14∶201(1986);Werner et al.，Experientia 42∶521(1986)，Rytomaa和Kivieniemi Cell Tissue Kinet 1∶329-340(1968);Rytomaa et al.，Control of Cellular Growth in Adult Organisms pp 106-138(1967)隨后，它們證實了分子量小于3000道爾頓的因子能夠?qū)е驴梢浦泊笫罅＜?xì)胞白血病的消退，并能夠抑制人的白血病細(xì)胞的生長。Paukovits等人從大鼠骨髓細(xì)胞中提取了類似的因子，并且證明了它抑制骨髓細(xì)胞滴定胸苷的攝入，參見Paukovits W.R.，Cell TissueKinet 4∶538-547(1971);Naturforsch 37∶1297(1982)，1979年Boll等人，Acta Haematologica 6∶130(1979)證實了大鼠粒細(xì)胞提取物對培養(yǎng)中的人的骨髓細(xì)胞的抑制效應(yīng)，許多其它研究者證實了該粒細(xì)胞提取物粗品抑制嚙齒動物骨髓細(xì)胞在體外產(chǎn)生g-CFUC和/或gm-CFUE。
該生物藥劑被稱為粒細(xì)胞抑素，從理論概念上說，它應(yīng)當(dāng)是一種分泌時在相同組織中作用的內(nèi)生細(xì)胞增生抑制劑。由提取物粗品得到的材料是非種特異性的，但是高度組織特異性的。此外，還發(fā)現(xiàn)它是無毒的并具有可逆活性。
1982年，有人報導(dǎo)了一種在體外和體內(nèi)都對骨髓組織生成細(xì)胞具有選擇性抑制疚的合成血調(diào)節(jié)五肽，其中主要效應(yīng)似乎是對于骨髓組織生成系細(xì)胞(CFU-gm)，參見Paukovits等人，Z.Naturforsch 37∶1297(1982)和美國專利4499081號。該肽被認(rèn)為與天然存在的粒細(xì)胞抑制因子類似，天然存在的粒細(xì)胞抑制因子被發(fā)現(xiàn)微量存在于骨髓提取物中。
現(xiàn)在，我們從試管試驗發(fā)現(xiàn)了某些對于骨髓組織生成細(xì)胞具有選擇性抑制效應(yīng)的合成肽。通過抑制細(xì)胞生成和尤其是粒細(xì)胞生成，這些肽趨于阻止非活動性細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞分裂，從而易受到細(xì)胞毒性抗癌藥的進(jìn)攻。這些肽除了在采用細(xì)胞毒性藥的治療中提供保護功能之外，還可以用來阻止與骨髓組織生成系統(tǒng)有關(guān)的癌細(xì)胞增生，即骨髓白血病。
本發(fā)明包括用下文式(Ⅰ)表示的肽，它們具有血調(diào)節(jié)活性，可用來抑制血細(xì)胞生成。
該肽可用于放射和/或細(xì)胞素毒性藥物治療中，提供保護功能，還可以用來阻止與骨髓組織生成系統(tǒng)有關(guān)的癌細(xì)胞的增生，例如用來治療骨髓白血病。該肽還可用于許多需要改變紅細(xì)胞生成作用的臨床情況。
該化合物也可與共同未決的美國專利申請071547730號(本文引為參考文獻(xiàn))所述的二聚體結(jié)合使用，在骨髓細(xì)胞中提供高低交替的活性峰。從而增加血細(xì)胞生成的自然24小時節(jié)律。這樣，細(xì)胞生長抑制劑治療便可以在低骨髓活性周期中進(jìn)行，從而降低了骨髓損傷的危險，而再生將被后續(xù)的活性峰所促進(jìn)。本發(fā)明也是一種藥用組合物，它包括式(Ⅰ)化合物和藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明還包括抑制動物(包括人)骨髓組織生成系統(tǒng)的方法，它包括給予需要治療的動物以有效量的式(Ⅰ)化合物。
本發(fā)明肽可用式(Ⅰ)表示
式中A是吡啶甲酸、焦谷氨酸、脯氨酸或L-2-哌啶酸;
B是絲氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、胱氨酸或酪氨酸;
C是天冬氨酸或谷氨酸;
D是氨基丁酸、丙氨酸、炔丙基甘氨酸、甘氨酸、絲氨酸、胱氨酸或β丙氨酸;
X是酪氨酸或賴氨酸;
n是0或1;
E是-N(R1)-R2R3或E是甘氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、酪氨酸、對氨基苯基丙氨酸或羧酸胺或其羥甲基衍生物。
R1，R4和R5各自是氫，C1-5烷基、苯基、萘基或C5-7環(huán)烷基;
R2是C1-6烷基、苯基、萘基或C5-7環(huán)烷基;
R3是-NR4R5或吖丙啶基、吡咯烷基、咪唑基、吡咯基、哌啶基、哌嗪基、嗎啉基、吡咯烷基或Pyrralinyl;假定式(Ⅰ)化合物不是P-Glu-Glu-Asp-Cys-Lys;或其藥學(xué)上可接受的鹽。
本發(fā)明還包括本發(fā)明化合物的藥學(xué)上可接受鹽的復(fù)合物。應(yīng)當(dāng)注意到，式(Ⅰ)中E包括氨基酸或羧酰胺殘基的終端羧基或其羥甲基衍生物，所述氨基酸是指甘氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、對氨基苯基丙氨酸，或者，E是-N(R1)-R2R3基團的酰胺基。
此處采用本領(lǐng)域常用的縮寫和符號來描述肽ala＝丙氨酸pGlu＝焦谷氨酸Pro＝腈氨酸Glu＝谷氨酸Asp＝天冬氨酸Tyr＝酪氨酸Pic＝吡啶甲酸Ppc＝L-2-哌啶酸Abu＝氨基丁酸Ppg＝炔丙基甘氨酸Gly＝甘氨酸Orn＝鳥氨酸P-(NH2)Phe＝對氨基苯基丙氨酸Hna＝2，6-二氨基-4-已酸Lys＝賴氨酸Cad＝尸胺根據(jù)常規(guī)的表示方法，氨基末端在左邊;羧基末端在右邊。所有手性氨基酸可以是D或L絕對構(gòu)型。
氨基末端可通過乙?；Ｗo。保護基團的例子有叔丁氧羰基(t-Boc)、CH3CO和Ar-CO(Ar＝芐基或苯基)。
C-末端可以是羧基(像天然氨基酸一樣)或羧酰胺(
)或羥甲基(-CH2-OH)。
優(yōu)選的化合物是那些其中
A是焦谷氨酸或吡啶甲酸;
B是谷氨酸或絲氨酸;
C是天冬氨酸;
D是氨基丁酸;
E是甘氨酸或賴氨酸;和n是0;
的化合物，并且手性氨基酸是L絕對構(gòu)型。
特別優(yōu)選的是pGlu-Glu-Asp-Abu-Lys(SEQ ID NO1)和Pic-Ser-Asp-Abu-Lys。本發(fā)明肽可采用固相技術(shù)[Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85，2149(1964)]制備，或者可成功地采用本領(lǐng)域公知的溶液方法制備。下列文獻(xiàn)提出了肽合成的一般方法，參見J.M.Stewart，J.D.Young，"Solid Phase Peptide Synthesis"，Pierce Chemical Company，Rockford，IL(1984)，M.Bodansky，Y.A.Klauser，M.A.Ondetti，"Peptide Synthesis"，John Wiley& Sons，Inc.，New York，NY.(1976).
它們可用來制備本發(fā)明肽，并作為參考文獻(xiàn)并入本文。
每種氨基酸或肽都按照肽領(lǐng)域公知的方法予以適當(dāng)保護。例如用α-氟烯基甲氧基羰基(α-fluoroenylmethyloxycarbonyl，F(xiàn)moc)或叔丁氧羰基(t-Boc)來保持氨基較好，尤其在α位置?？蓪⑦m當(dāng)取代的芐酯基用于賴氨酸的ε-氨基和將適當(dāng)取代的芐基分別用于Asp和Glu的β和γ羧基。芐酯基保護基團的適當(dāng)取代是氯、溴、硝基或甲基的鄰和/或?qū)ξ蝗〈?，并用來改進(jìn)保護基團的反應(yīng)性。除叔丁氧羰基外，保護基團最好是那些不會被溫和酸處理除去的基團。這些保護基團可用本領(lǐng)域公知的方法(例如催化氫化、液氨鈉處理或HF處理)除去。
如果采用固相合成方法，則肽便由羧基末端開始順序向肽的氨基末端聯(lián)結(jié)而建立。固相合成由被護氨基酸與適當(dāng)樹脂的共價聯(lián)結(jié)C末端開始，所述適當(dāng)樹脂的例子有二苯甲基胺樹脂(BHA)、甲基二苯甲基胺樹脂(MBHA)或氯甲基樹脂(CMR)(均在美國專利4244946中一般性地提出)或苯基酸氨基甲基樹脂(PAM)。如果欲使產(chǎn)物肽的羧基末端為羰酰胺的話，則應(yīng)采用BHA或MBHA載體樹脂。如果欲使產(chǎn)物肽羧基末端為羧基的話，則一般應(yīng)使用ACMR或PAM樹脂，盡管也可以用它來制備羧酰胺或酯。
α-氨基上的保護基團可通過溫和的酸(即三氟乙酸)處理而除去。采用本領(lǐng)域公知的適當(dāng)?shù)娜ケＷo、中和和偶聯(lián)環(huán)化方法不必分離中間產(chǎn)物，將氨基酸順序加上，直至形成期望的肽。完成的肽可隨后解封閉和/或以任何順序與載體樹脂分離。
用HF或HBr/乙酸處理樹脂承載的肽使得肽與樹脂分離，產(chǎn)生作為羧酸或羧酰胺的羧基末端氨基酸。
如果希望得到酯，可在三乙胺存在下用適當(dāng)?shù)拇?例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或芐醇)處理CMR或Pam樹脂，使得肽從樹脂上解離，直接制得酯。
本發(fā)明肽的酯還可以按常規(guī)方法由羧酸前體制得。通常在酸催化劑存在下，用醇處理羧酸?；蛘?，可將羧酸轉(zhuǎn)化為活化的?；虚g體，例如酰囟，再用醇處理，最好在堿存在下處理。
將肽從載體樹脂中解離的較好的方法是在適當(dāng)?shù)年栯x子清除劑(例如苯甲醚或二甲氧基苯)存在下，用無水HF處理樹脂承載的肽。這一方法在除去所有保護基團(只有硫代烷基保護的硫例外)的同時，將肽從樹脂中解離。用該方法從CMR和Pam樹脂中水解的肽是羧酸，從BHA樹脂分解得到的是羧酰胺。
肽末端氨基的修飾可按照本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行烷基化或酰化。這些修飾可以在氨基酸進(jìn)入肽之前進(jìn)行，或者在肽被合成且末端氨基被釋放之后，但在保護基除去之前對肽進(jìn)行修飾。
通常，對游離氨基的?；窃谑灏反嬖谙?，用相應(yīng)烷基或芳基酸的酰囟、酸酐或活化酯進(jìn)行的。一烷基化最方便的方法是在溫和的還原劑(例如氰基硼氫化鈉或氰基硼氫化鋰)存在下，用適當(dāng)?shù)闹救┗蛲獙被€原烷基化。在堿存在下，用過量的烷基囟化物處理氨基可進(jìn)行二烷基化。
肽的溶液合成是采用常規(guī)的用來生成酰胺鍵的方法進(jìn)行的。通?？稍诖呋瘎例如1-羥基苯并三唑(HOBT)或二甲基氨基吡啶(DMAP)]的存在下，用適當(dāng)?shù)呐己蟿例如N，N′-二環(huán)已基碳化二亞胺(DCC))]將帶有游離羧基的保護的叔丁氧羰基氨基酸偶聯(lián)到帶有游離氨基的保護的氨基酸上。其它合適的方法有，例如生成保護的叔丁氧羰基氨基酸的游離羧基的活化酯、酸酐或酰囟，隨后，可在堿存在下，與保護的氨基酸的游離胺反應(yīng)。例如，在堿[如N-甲基嗎啉，DMAP(二甲基氨基吡啶)或三烷基氨]存在下，在無水溶劑[如二氯甲烷或四氫呋喃(THF)]中，用氯甲酸異丁酯處理保護的丁氧羰基氨基酸或肽，生成“活化酸酐”，隨后將其與另一保護的氨基酸或肽的游離胺反應(yīng)。采用常規(guī)技術(shù)，可使得用該方法生成的肽在氨基或羧基末端選擇性地去保護，并采用類似技術(shù)將其偶聯(lián)在其它肽或氨基酸上。肽完全后，要采用前述方法除去保護基團，例如在鈀或鉑催化劑存在下氫化，在液氨、氫氟酸或堿中用鈉處理。
如果最終的肽在去保護后含有堿性基團，便可制備酸加成鹽。肽的酸加成鹽是按標(biāo)準(zhǔn)方法，在適當(dāng)溶劑中由固體化合物和稍微過量的酸制備的。所述酸的例子有鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、馬來酸、琥珀酸或甲磺酸。乙酸鹽形式特別有用。如果最終的肽含有酸性基團，則可制備陽離子鹽。通常用稍微過量的含有適當(dāng)陽離子的堿性試劑(例如氫氧化物、碳酸鹽或烷氧化物)處理母體化合物。像Na+，K+，Ca++和NH+4之類的陽離子是藥學(xué)上可接受鹽中陽離子的例子。Na+和NH+4特別優(yōu)選。
一般來說，為了產(chǎn)生抑制效果，將本發(fā)明肽向患者給藥時，每70Kg體重注射日劑量范圍是約0.5ng至約10mg，例如約5-500ng，口服日劑量范圍是約50ng至約5mg，例如約0.1ng至1mg。如果采用灌注或類似方法給藥，劑量范圍是每70kg體重約0.005ng至約10mg，例如約0.03ng至1mg，連續(xù)6天。原則上最好使患者的細(xì)胞外流體的肽濃度為約10-15M至約10-5M。
本發(fā)明還有一個特征是提供包含上面定義的一種或多種式(Ⅰ)化合物或其生理學(xué)上可接受的鹽作為活性成分以及藥用載體或賦形劑的藥用組合物。本發(fā)明組合物可以是例如適于口服、經(jīng)鼻、非腸道或直腸給藥的形式。
此外所用的術(shù)語“藥用”包括本發(fā)明的獸醫(yī)應(yīng)用。本發(fā)明肽可制成膠囊劑、片劑或制成乳劑或糖漿供口服。可加入藥學(xué)上可接受的固體或液體載體以增強或穩(wěn)定組合物，或使組合物便于制劑。液體載體包括蜂密、花生油、橄欖油、甘油、鹽水和水。固體載體包括淀粉、乳糖、二水硫酸鈣、白土、硬酯酸鎂或硬脂酸、滑石粉、果膠、阿拉伯樹膠、瓊脂或明膠。載體還可以包括緩釋物質(zhì)，例如甘油-硬酯酸酯或甘油二硬脂酸酯，可單獨或與臘一起使用。固體載體的量可以變化，但最好是每單位劑量在約20mg至約1g之間。藥用制劑是按照制藥的常規(guī)技術(shù)制備的，包括必要時經(jīng)研磨，混合、刺粒和壓制，制得片劑;或者研磨、混合、填裝制得硬明膠膠囊。例如，將活性成分與惰性載體例如乳糖或山梨醇混合，將混合物裝入明膠膠囊便可制得含一種或多種活性成分的膠囊劑。使用液體載體時，制劑將是糖漿、酏劑、乳劑或水性或非水混懸液的形式。這樣的液體制劑可直接口服或裝入軟明膠膠囊中。也可使用器官特異性載體體系。
或者，本發(fā)明肽或其衍生物的藥用組合物也可制成凍干粉的溶液，供非腸道給藥用。粉劑在使用前可加入適當(dāng)?shù)南♂尰蚱渌帉W(xué)上可接受的載體而改變組成。液體制劑通常是緩沖的等滲的水溶液。適當(dāng)稀釋劑的例子是標(biāo)準(zhǔn)等滲鹽水液、標(biāo)準(zhǔn)5%葡萄糖水溶液或緩沖的乙酸鈉或乙酸銨溶液。這樣的制劑特別適合于非腸道給藥，但亦可用于口服給藥和裝入計量劑量吸入器或噴霧器中供吹入用。最好再加入賦形劑，例如聚乙烯基吡咯烷酮、明膠、羥基纖維素、阿拉伯樹膠、聚乙二醇、甘露糖醇、氯化鈉或檸檬酸鈉。
就直腸給藥而言，可將研磨的本發(fā)明肽粉末與賦形劑(例如可可油、甘油明膠或聚乙烯醇)混合，然后模制成栓劑。研磨的粉末也可與油狀制劑、凝膠、膏劑或乳劑混合，使之成為緩沖液或非緩沖液，并經(jīng)皮給藥。
鼻用噴劑可類似地制成水溶液，裝入帶有氣霧推進(jìn)劑或帶有手壓裝置的噴霧容器中。
含有本發(fā)明化合物的劑量單元最好含1mg-100mg，例如，含0.1-50mg式(Ⅰ)肽或其鹽。
本發(fā)明還有一個特征是提供抑制骨髓組織生成的方法，它包括給予宿主以有效量的上述定義的藥用組合物。
按照本發(fā)明，服用本發(fā)明化合物時不會產(chǎn)生不可接受的毒性效應(yīng)。
生物檢定A.體外血細(xì)胞生成檢定下述體外檢定系統(tǒng)能夠定量本發(fā)明化合物對粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞先組細(xì)胞(CFU-GM)在體外脈沖暴露后進(jìn)入細(xì)胞循環(huán)的正向或逆向效應(yīng)。在有適當(dāng)血細(xì)胞生成因素存在的溫和的瓊脂培養(yǎng)條件下，粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞菌落可加以定量，并且可特別地由單CFU-GM的增生而產(chǎn)生。為了增生，CFU-GM必須進(jìn)入細(xì)胞循環(huán)的S期。在用軟瓊脂培養(yǎng)前，將骨髓細(xì)胞暴露在3H-胸苷中消除了那些活性增生即在細(xì)胞循環(huán)的S-期的CFU-GM。該效應(yīng)通過在瓊脂檢定中定量的總體CFU-GM菌落的減少而定量。與對照物相比，菌落數(shù)的減少或增加的程度分別提供了CFU-GM增生的刺激或抑制指數(shù)。
方法取股骨髓細(xì)胞，以6-9×106細(xì)胞/ml的濃度混懸于McCoy氏培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中還補充有10%胎牛血清、抗菌劑、必要的和非必要的氨基酸、MEM維生素、絲氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丙酮酸鈉和碳酸氫鈉。用1pg-1mg/ml最終濃度的本發(fā)明化合物將復(fù)制培養(yǎng)物博動2小時，并在7%CO2氣氛在溫濕空氣中于37℃保溫。保溫后，用檢定介質(zhì)將培養(yǎng)物洗三次以除去肽，在560μCi的3H-胸苷(放射強度率＝20Ci/mMole)中暴露20分鐘。暴露后，向每只試管中加0.5ml冷胸苷(1mg/ml貯存液)以停止反應(yīng)。將培養(yǎng)物洗三次并置于CFU-GM瓊脂檢定中，濃度為每個處于上述介質(zhì)中的培養(yǎng)物75000個細(xì)胞，并且含有被暴露在作為血細(xì)胞生成因子源的商陸分裂素中的脾細(xì)胞調(diào)節(jié)的0.3%瓊脂和10%V/V介質(zhì)。將培養(yǎng)物于37℃，7%CO2的濕氣中保溫5-7天，用顯微鏡將CFU-GM菌落計數(shù)。S-期的CFU-GM的百分?jǐn)?shù)通過將3H-胸苷處理過的培養(yǎng)物菌落數(shù)目除以未處理的對照培養(yǎng)物菌落數(shù)目而得到。將這些值與由肽暴露的和未處理的細(xì)胞類似算得的數(shù)字比較。
B.過氧化物形成的測定多形核白細(xì)胞嗜中性白細(xì)胞(PMN)是抵抗包括C.albicans在內(nèi)的許多病原體入侵的第一道防線。由治療動物的體外PMN念珠菌活性的檢定在測定C.albicans動物模型中治療化合物的反應(yīng)模式方面非常重要。在活化的PMN的呼吸突發(fā)中，氧還原的主要初始產(chǎn)生是過氧化物，而在呼吸突發(fā)中產(chǎn)生的各種氧基團對于入侵病原體是直接或間接細(xì)胞毒性的。因此，在刺激期間過氧化物生成和釋放的測定對于吞噬細(xì)胞的氧化代謝和隨后的殺滅有效性是重要的。
將化合物或?qū)φ瘴锝o予正常小鼠，每天腹膜內(nèi)給藥7天。從各個治療動物身體收集周圍血液并加以混合。用標(biāo)準(zhǔn)分離方法純化PB-PMN(參見(Boyum，A.1968."Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human peripheral blood" Scand.J.Clin.Lab Invest.21∶77-89);
來自各不同組的細(xì)胞混懸液被規(guī)格化成含等量PMN/ml。就念珠菌檢定而言，向一式四份含C.albicans酵母和10%標(biāo)準(zhǔn)小鼠血清的平衡鹽溶液的試管中加入足量PB-PMN，使最終E∶T比值為10∶1。在對照試管中不加PB-PMN。將試管于37℃保溫1小時。將巨噬細(xì)胞溶解，等分置于瓊脂板上，將板保溫48小時，這時將菌落形成單元(CFU)計數(shù)，并測定每個試樣中CFU減少的百分?jǐn)?shù)。
過氧化物歧化-可抑制過氧化物陰離子產(chǎn)生是在微量滴定計亞鐵細(xì)胞色素C還原檢定(1.5×105PB-PMN/池)中定量的，定量是在暴露于可溶性和顆粒狀刺激物(相應(yīng)為12-肉豆蔻酸13-乙酸大戟二萜醇酯(PMA)和血清調(diào)理的C.albicans)期間，在0.5%凝膠/平衡鹽溶液中進(jìn)行的。經(jīng)1小時保溫后，測定亞鐵細(xì)胞色素C還原的摩爾數(shù)/池(四等份池/收集組)。在無任何刺激物的情況下測定過氧化物活性基線。在數(shù)據(jù)計算前，將PMA和Candida刺激活性修正，供自發(fā)產(chǎn)生過氧化物。每一治療組的PB-PMN數(shù)據(jù)均表示為對照過氧化物的百分?jǐn)?shù)，其中對照活性是從PBS/血清治療的小鼠的PB-PMN觀察到的。
下述實施例用來說明本發(fā)明。這些實施例決無限制本發(fā)明范圍之意，只是用來說明如何制造和使用本發(fā)明化合物。
在實施例中，所有溫度均為攝氏度。氨基酸分析在Dionex Autoion 100上進(jìn)行。肽含量分析基于氨基酸分析。FAB質(zhì)譜是在VGZAB質(zhì)譜儀上用快速原子轟擊進(jìn)行的。所用縮寫如下Abu＝氨基丁酸Ala＝丙氨酸Asp＝天冬氨酸t(yī)-Boc＝叔丁氧羰基Cad＝尸氨酸Cl-Z＝對氯芐氧羰基(乙＝芐氧羰基)DCC＝二環(huán)已基碳化二亞胺DCM＝二氯甲烷DIEA＝二異丙基乙胺EDC＝(N-乙基-N′-)3-二甲氨基丙基)碳化二亞胺Glu＝谷氨酸P-Glu＝焦谷氨酸Tyr＝酪氨酸Hna＝二氨基已酸HOBT＝羥基苯并三唑Lys＝賴氨酸NMP＝N-甲基吡咯烷酮Pic＝吡啶甲酸Pro＝脯氨酸Ppg＝炔丙基苷氨酸Gln＝谷酰胺
Gly＝甘氨酸Orn＝鳥氨酸實施例1(PGlu-Glu-Asp-Abu-Lys)(SEQ ID NO. 1)C24H38N6O11M.W.585.6將800mg BOC-Lys(Cl-Z)-PAM樹脂(0.5mM，取代＝0.63mM/g)裝入一個ABI型430A肽合成器中。按照制造商所建議的標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議，每種氨基酸用2mM，合成了目標(biāo)肽。(Applied Biosystems型431A肽合成器用戶手冊，1-30版，1987年2月，分節(jié)號000066)。合成完全后，用DCM洗滌樹脂肽并干燥之(1.665g)，將肽樹脂(1.2g)裝入一解離裝置中，用10ml HF和1ml苯甲醚于-15℃解離2小時。除去HF后，用乙醚將樹脂充分洗滌，用冰乙酸提取肽。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去大部分乙酸，殘余物用水稀釋并冷凍干燥。得到220mg肽粗品。經(jīng)柱(C-18“Bond Elute" 柱)色譜提純，用乙腈/水/三氟乙酸(TFA)緩沖液洗脫，得純肽(130mg)。
氨基酸分析Asp 1.0(1)，Glu 1.98(2)，Abu 1.12(1)，Lys 1.06(1)FAB/MS MH+587.5實施例2(Pic-Glu-Asp-Abu-Lys)C25H36N6O10M.W.580.6將800mg BOC-Lys(Cl-Z)-PAM樹脂(0.5mM，取代＝0.63m/M/g)裝入一個ABI型430A肽合成器中。按照制造商所建議的標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議，每種氨基酸用2mM，合成了目標(biāo)肽。合成完全后，用DCM洗滌樹脂肽并干燥之(1.665g)，將肽樹脂(1.2g)裝入-HF解離裝置中，用10mlHF和1ml苯甲醚于-15℃解離2小時。除去HF后，用乙醚將樹脂充分洗滌，用冰乙酸提取肽。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去大部分乙酸，殘余物用水稀釋并冷凍干燥。得到251mg肽粗品。經(jīng)C-18“Bond Elute”
柱色譜提純，用乙腈/水/三氟乙酸(TFA)緩沖液洗脫，得純肽(141mg)。(HPLC純度97%)。
氨基酸分析Asp 1.0(1)，Glu 1.03(1)，Abu 1.12(1)，Lys 1.17(1).
氨基酸分析未測到PicFAB/MS 581.1實施例3(Pic-Ser-Asp-Abu-Lys)C23H34N6O9M.W.538.56將850mg BOC-Lys(Cl-Z)-PAM樹脂(0.56mm樹脂)裝入一個ABI型430A肽合成器中。按照制造商所建議的標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議，每種氨基酸用2mM，合成了目標(biāo)肽。合成完全后，用DCM洗滌樹脂肽并干燥之(1.038g)，將肽樹脂(1.03g)裝入-HF解離裝置中，用10ml HF和1ml苯甲醚于-15℃解離2小時。除去HF后，用乙醚將樹脂充分洗滌，用三氟乙酸提取肽。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去大部分三氟乙酸，殘余物用水稀釋并冷凍干燥。得到298mg肽粗品。經(jīng)C-18“Bond Elute”
柱色譜提純，用乙腈/水/三氟乙酸(TFA)緩沖液洗脫，得純肽(178mg)。(HPLC純度97%)氨基酸分析Asp 1.0(1)，Ser 0.88(1)，Abu 1.12(1)，Lys 1.17(1).
氨基酸分析未測到Pic實施例4(PGlu-Glu-Asp-Abu-Tyr-Lys)(SEQ ID NO1)C33H47N7O13 M.W.749.77將850mg BOC-Lys(Cl-Z)-PAM樹脂(0.56mM)裝入一個ABI型430A肽合成器中。按照制造商所建議的標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議，每種氨基酸用2mM，合成了目標(biāo)肽。合成完全后，用DCM洗滌樹脂肽并干燥之(1.353g)，將肽樹脂(1.3g)裝入-HF解離裝置中，用10ml HF和1ml苯甲醚于-15℃解離2小時。除去HF后，用乙醚將樹脂充分洗滌，用三氟乙酸提取肽。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去大部分三氟乙酸，殘余物用水稀釋并冷凍干燥。得到454mg肽粗品。將肽粗品(204.7mg)經(jīng)C-18“Bond Elute”
柱色譜提純，用乙腈/水/三氟乙酸(TFA)緩沖液洗脫，得純肽(95.2mg)。(HPLC純度90%)。
PGlu+Glu 2.02(2)，Asp 1.0(1)，Tyr 0.94(1)，Lys 1.03(1)實施例5-11按照上述方法制備了下列肽實施例
5 P-Glu-Glu-Asp-Cys-Gly-OH6 PGlu-Glu-Asp-Ser-Gly7 Pic-Glu-Asp-Abu-Lys-OH8 Pic-Ser-Asp-Abu-Lys-OH9 PGlu-Glu-Asp-Abu-Lys-OH10 PGlu-Glu-Asp-Abu-Tyr-Lys-OH11 PGlu-Glu-Asp-Abu-Lys-Tyr-OH實施例12包含本發(fā)明化合物的藥用制劑可制成多種形式，并且可含有眾多的賦形劑。所述制劑的實例如下片劑/成分每片1.活性成分(式Ⅰ化合物) 40mg2.玉米淀粉 20mg3.藻朊酸 20mg4.藻朊酸鈉 20mg5.硬脂酸鎂 1.3mg2.3mg制片劑方法第一步將成分No.1，NO.2，No.3和No.4在適當(dāng)?shù)幕旌掀?攪切器中混合第二步分次向第一步的混合物中加入足夠的水，每次加水后都仔細(xì)混合。如此加水和混合，直至得到能制成濕顆粒的均勻物料。
第三步將濕物料通過8目(2.38mm)網(wǎng)篩的振蕩制粒器。
第四步將濕粒在140°F(60℃)烘箱中烘干，直至干燥。
第五步用成分No.5潤滑干燥的顆粒。
第六步將經(jīng)潤滑的顆粒在適當(dāng)?shù)膲浩瑱C上壓片。
非腸道制劑將適量式Ⅰ化合物在加熱下溶于聚乙二醇中，可制得非腸道給藥的藥用組合物。然后用Ph Eur.注射水稀釋(至100ml)。然后用0.22微米膜過濾消毒，并密封在消毒容器中。
權(quán)利要求
1.式(Ⅰ)化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽的制備方法，式(Ⅰ)如下式中A是吡啶甲酸、焦谷氨酸、脯氨酸或L-2-哌啶酸；B是絲氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、胱氨酸或酪氨酸；C是天冬氨酸或谷氨酸；D是氨基丁酸、丙氨酸、炔丙基甘氨酸、甘氨酸、絲氨酸、胱氨酸或β丙氨酸；X是酪氨酸或賴氨酸；n是0或1；E是-N(R1)-R2R3或E是甘氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、酪氨酸、對氨基苯基丙氨酸或羧酰胺或其羥甲基衍生物。R1，R4和R5各自是氫，C1-5烷基、苯基、萘基或C5-7環(huán)烷基；R2是C1-6烷基、苯基、萘基或C5-7環(huán)烷基；R3是-NR4R5或吖丙啶基、吡咯烷基、咪唑基、吡咯基、哌啶基、哌嗪基、嗎啉基、吡咯烷基或Pyrralinyl；假定式(Ⅰ)化合物不是P-Glu-Glu-Asp-Cys-Lys；該方法包括a)將被護氨基酸偶合，以形成下式的適當(dāng)保護的化合物式中A、B、C、D、X和n的定義如上，[E′]是氯甲基、甲基二苯甲基胺、二苯甲基胺或苯基乙酰胺基甲基樹脂，或者E是-N(R1)-R2R3或者是甘氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、酪氨酸、對氨基苯基丙氨酸或它們的羧酰胺或羥甲基衍生物；b)除去保護基團，必要時將肽從樹脂中離解；并且c)可制成其藥學(xué)上可接受的鹽。
2.按權(quán)利要求1的方法，其中A是焦谷氨酸或吡啶甲酸;B是谷氨酸或絲氨酸;C是天冬氨酸;D是氨基丁酸;E是甘氨酸或賴氨酸且n是0。
3.按權(quán)利要求1或2的方法，其中手性氨基酸是L絕對構(gòu)型。
4.按權(quán)利要求1的方法，其中n是1，E是甘氨酸或賴氨酸。
5.按權(quán)利要求1的方法制備下列化合物之一;pic-Glu-Asp-Abu-LyspGlu-Glu-Asp-Abu-Tyr-Lys(SEQ ID NO2)pGlu-Glu-Asp-Abu-Lys(SEQ ID NO1)Pic-Ser-Asp-Abu-Lys
6.將權(quán)利要求1定義的式(Ⅰ)化合物用于抑制骨髓組織生成系統(tǒng)藥物的制造。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有血調(diào)節(jié)活性并能用來抑制人和動物骨髓組織生成系統(tǒng)的新的肽。
文檔編號C07K7/02GK1088935SQ9310047
公開日1994年7月6日 申請日期1993年1月2日 優(yōu)先權(quán)日1993年1月2日
發(fā)明者P·K·巴特納加, W·F·哈夫曼 申請人:史密絲克萊恩比徹姆公司