專利名稱：虎紋捕鳥蜘蛛毒素的提取與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)。
現(xiàn)有技術(shù)天然生物毒素在神經(jīng)生物學(xué)、神經(jīng)遞質(zhì)受體和離子通道等基礎(chǔ)研究中已成為十分重要的工具試劑，同時(shí)在藥理學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域也有重要應(yīng)用。蜘蛛毒是天然動(dòng)物毒素的一個(gè)重要領(lǐng)域，由于其含量少和采毒的相對困難，對它的研究和開發(fā)沒有如蛇毒和蝎毒那樣深入和廣泛。目前國內(nèi)外已做過分離純化工作的蜘蛛毒有漏斗蛛(A.robustus和A.aperta)、平甲蛛(L，reclusa)、黑寡婦蛛(L，tredecimgutatus)以及我國的穴居狼蛛(L，singoriansis)等，但只有很少數(shù)分離純化的毒素完成了化學(xué)結(jié)構(gòu)測定?；⒓y捕鳥蜘蛛(Selenocosmia huwena)是最近在我國發(fā)現(xiàn)的蜘蛛新種，本專利發(fā)明人摸索出一種新的有效采取其毒液的方法，并通過反相與離子交換高效液相色譜分離純化了虎紋捕鳥蛛毒素-I，完成了其化學(xué)結(jié)構(gòu)測定，從其化學(xué)結(jié)構(gòu)分析它是一種不同于任何已知?jiǎng)游锒舅?包括已知蜘蛛毒素)的一種新的神經(jīng)毒素。
發(fā)明的目的本研究開發(fā)的目的是從蜘蛛毒中分離出在神經(jīng)生物學(xué)、藥理學(xué)和臨床醫(yī)療學(xué)的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用中有價(jià)值的新的神經(jīng)毒素分子。上述huwentoxin-I毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)證明它符合我們原定研究的目的。
發(fā)明的內(nèi)容和方案虎紋捕鳥蜘蛛是在我國云南廣西交界的山區(qū)發(fā)現(xiàn)的新種，從野外捕來之后在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)1-2年之后進(jìn)行采毒。
1.粗毒的采取;2.粗毒的分離純化;3.進(jìn)行藥理學(xué)性質(zhì)和生理活性測定等。
特點(diǎn)與應(yīng)用上述huwentoxin-I的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同于目前已知的所有天然毒素的結(jié)構(gòu)，經(jīng)過檢測，證明其為一新的神經(jīng)毒素，不與已知其他毒素同源。在目前已知化學(xué)結(jié)構(gòu)的蜘蛛毒素中它是首個(gè)確定含有三對二硫鍵的毒素。
由于該毒素能不可逆阻斷神經(jīng)肌肉接頭傳遞，因而可以作為一種試劑工具應(yīng)用在膽堿能的突觸傳遞和突觸后膜受體的神經(jīng)生物學(xué)研究中，同時(shí)在藥理學(xué)研究中也有應(yīng)用前景。
實(shí)施例(1)毒液的采集和huwentoxin-I的分離純化將3-4根長為4厘米內(nèi)徑為1.5毫米的透明塑料軟管捆成一束作為誘物，用大鑷子從側(cè)面夾住蜘蛛胸部，蜘蛛便張開螯爪，這時(shí)將軟管束誘物送入螯爪下，它即用觸肢抱住軟管束，將螯爪有力地刺入軟管內(nèi)射出毒液。由于每只蜘蛛的兩個(gè)螯爪通常并不同時(shí)射毒，而且每次每個(gè)螯爪不一定射出全部毒液，因而上述過程需進(jìn)行多次。射毒后從螯爪下慢慢抽出軟管束，用微量注射器將其中的毒液抽出，經(jīng)冰凍干燥后得到的白色(略帶黃色)干粉即為粗毒。
將1-3毫克上述粗毒溶于200微升雙蒸水中，上樣到事先用0.1%三氯乙酸平衡好的C4反相色譜柱中(美國Waters公司出品，Delta pak，C4300 A，30×0.46cm)，用0%-70%乙腈梯度洗脫，柱溫45℃，時(shí)間120分鐘，流速0.7ml/min。洗脫結(jié)果共分到約23個(gè)紫外吸收峰(220nm)(見附圖-1)，其中的A峰即含有huwnetoxin-I，收集A峰洗脫液，冰凍干燥后溶于雙蒸水中，上樣到事先用0.02M磷酸鈉緩沖液(pH 6.6)平衡的WCX-1離子交換高效液相色譜柱中(日本島津公司，5×0.4 cm)，用0%-45% 1M乙酸鈉(pH 7.0)，溶液梯度洗脫，時(shí)間30分鐘，流速0.8ml/min，結(jié)果得到兩個(gè)紫外吸收峰(220nm)(見附圖-2)，其中第二個(gè)峰即為huwentoxin-I。將第二峰收集液用國產(chǎn)YWG-C18柱脫鹽后，冰凍干燥即為純凈的產(chǎn)品。用上述方法得到的huwentoxin-I用SDS凝膠電泳和等電點(diǎn)聚焦電泳測試皆為一條區(qū)帶。
huwentoxin-I經(jīng)MilliGen 6600型蛋白質(zhì)順序分析儀多次測定，以及系統(tǒng)二硫鍵定位法測定出其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下

上述化學(xué)結(jié)構(gòu)除得到氨基酸組成分析、羧肽酶Y降解分析實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證外，另外在質(zhì)譜儀上做了質(zhì)譜分析，質(zhì)譜測出其準(zhǔn)確分子量為3749.3±1，與按順序分析結(jié)果計(jì)算得出的分子量3750完全吻合，并確證6個(gè)半胱氨酸殘基是以三對二硫鍵形式存在。
用小白鼠膈神經(jīng)-膈肌標(biāo)本研究了huwentoxin-I的藥理學(xué)性質(zhì)。將神經(jīng)肌肉標(biāo)本放在標(biāo)本槽內(nèi)，槽內(nèi)溫度維持在30-32℃，用臺(tái)氏液灌流，并通過95% CO2和5% CO2的混合氣體，50-70個(gè)氣泡/分鐘，并用電子刺激器產(chǎn)生的方波脈沖通過吸力電極刺激神經(jīng)或直接刺激肌肉，脈沖寬度0.2毫秒，刺激頻率為每分鐘12次，用半導(dǎo)體應(yīng)變片張力傳感器將肌肉收縮的機(jī)械能轉(zhuǎn)化為電信號，經(jīng)放大后用筆描記錄儀記錄。待收縮穩(wěn)定后，換用濃度為1×10-5g/ml的huwentoxin-I(用臺(tái)氏液配制)灌流標(biāo)本，觀察對肌肉收縮的影響。結(jié)果表明在上述濃度的毒素作用下，肌肉收縮幅度逐漸減小，最后停止在舒張狀態(tài)，但對直接刺激仍能產(chǎn)生正常的收縮反應(yīng)，表明神經(jīng)肌肉接頭傳遞被阻斷(見附圖3)。在五例標(biāo)本中，接頭傳遞完全阻斷所需時(shí)間13.4+1.3分鐘，沖洗半小時(shí)不能恢復(fù)，說明阻斷是不可逆的。如用筒箭毒與huwentoxin-I的混合液灌流標(biāo)本，則可防止阻斷作用的出現(xiàn)，表明毒素的作用在突觸后，與箭毒有競爭性關(guān)系。
huwnentoxin-I對小鼠的毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果為腹腔注射LD50為0.70mg/kg體重，腦內(nèi)注射LD50為9.40μg/kg。
上述結(jié)果證明huwnetoxin-I是一種較強(qiáng)的哺乳動(dòng)物神經(jīng)肌肉接頭傳遞的不可逆阻斷劑。


圖1 虎紋捕鳥蛛毒素經(jīng)C4反相高效液相色譜分離的圖譜其中A峰為虎紋捕鳥蛛毒素-I(HWTX-I)所在峰圖2 含有虎紋捕鳥蛛毒素-I的組份經(jīng)WCX-I離子交換柱的進(jìn)一步分離純化其中第二峰為純凈的HWTX-I圖3 虎紋捕鳥蛛毒素-I對小鼠膈神經(jīng)膈肌的生理活性實(shí)驗(yàn)1.未加毒前的肌肉收縮反應(yīng)，A為間接刺激，B為直接刺激2.加入濃度為10-5g/ml HWTX-I后的肌肉收縮反應(yīng)，A、B、C、D分別為加毒后8、10、12、14分鐘3.加毒傳遞阻斷后肌肉對直接刺激的反應(yīng)
權(quán)利要求
1.一種從虎紋捕鳥蜘蛛中提新型哺乳動(dòng)神經(jīng)毒素的虎紋捕鳥蛛毒素-Ⅰ(huwentoxin-Ⅰ)的方法，其特征在于所述方法包括1)毒液的采集將3-4根長為4厘米內(nèi)徑為1.5毫米的透明塑料軟管捆成一束作為誘物，用大鑷子從側(cè)面夾住蜘蛛胸部，蜘蛛便張開螯爪，這時(shí)將軟管束誘物送入螯爪下，它即用觸肢抱住軟管束，將螯爪有力地刺入軟管內(nèi)射出毒液，上述過程可進(jìn)行多次，使蜘蛛每個(gè)螯爪的毒液全部射出，射毒后從螯爪下慢慢抽出軟管束，用微量注射器將其中的毒液抽出，經(jīng)冰凍干燥后得到的白色(略帶黃色)干粉即為粗毒；2)粗毒的純化將1-3毫克上述粗毒溶于200微升雙蒸水中，上樣到事先用0.1%三氯乙酸平衡好的C4反相色譜柱中(美國Waters公司出品，Deltapak，C4300A，30×0.46cm)，用0%-70%乙腈梯度洗脫，柱溫45℃，時(shí)間120分鐘，流速0.7ml/min，洗脫結(jié)果共分到約23個(gè)紫外吸收峰(220nm)(見附圖-1)，其中的A峰即含有huwnetoxin-Ⅰ，收集A峰洗脫液，冰凍干燥后溶于雙蒸水中，上樣到事先用0.02M磷酸鈉緩沖液(pH6.6)平衡的WCX-1離子交換高效液相色譜柱中(日本島津公司，5×0.4cm)，用0%-45%1M乙酸鈉(pH7.0)溶液梯度洗脫，時(shí)間30分鐘，流速0.8ml/min，結(jié)果得到兩個(gè)紫外吸收峰(220nm)(見附圖2)，其中第二個(gè)峰即為huwentoxin-Ⅰ，將第二峰收集液用國產(chǎn)YWG-C18柱脫鹽后，冰凍干燥即為純凈的產(chǎn)品，用上述方法得到的huwentoxin-Ⅰ用SDS凝膠電泳和等電點(diǎn)聚焦電泳測試皆為一條區(qū)帶；huwentoxin-Ⅰ經(jīng)MilliGen 6600型蛋白質(zhì)順序分析儀多次測定，以及系統(tǒng)二硫鍵定位法測定出其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下
3)用小白鼠膈神經(jīng)-膈肌標(biāo)本研究了huwentoxin-Ⅰ的藥理學(xué)性質(zhì)；將神經(jīng)肌肉標(biāo)本放在標(biāo)本槽內(nèi)，槽內(nèi)溫度維持在30-32C，用臺(tái)氏液灌流，并通以95%CO2和5%CO2的混合氣體，50-70個(gè)氣泡/分鐘，并用電子刺激器產(chǎn)生的方波脈沖通過吸力電極刺激神經(jīng)或直接刺激肌肉，脈沖寬度0.2毫秒，刺激頻率為每分鐘12次，用半導(dǎo)體應(yīng)變片張力傳感器將肌肉收縮的機(jī)械能轉(zhuǎn)化為電信號，經(jīng)放大后用筆描記錄儀記錄；待收縮穩(wěn)定后，換用濃度為1X10-5g/ml的huwentoxin-Ⅰ(用臺(tái)氏液配制)灌流標(biāo)本，觀察對肌肉收縮的影響；結(jié)果表明在上述濃度的毒素作用下，肌肉收縮幅度逐漸減小，最后停止在舒張狀態(tài)，但對直接刺激仍能產(chǎn)生正常的收縮反應(yīng)，表明神經(jīng)肌肉接頭傳遞被阻斷(見附圖-3)；在五例標(biāo)本中，接頭傳遞完全阻斷所需時(shí)間為13.4+1.3分鐘，沖洗半小時(shí)不能恢復(fù)，說明阻斷是不可逆的；如用筒箭毒與huwnetoxin-Ⅰ的混合液灌流標(biāo)本，則可防止阻斷作用的出現(xiàn)，表明毒素的作用在突觸后，與箭毒有競爭性關(guān)系；huwentoxin-Ⅰ對小鼠的毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果為腹腔注射LD50為0.70mg/kg體重，腦內(nèi)注射LD50為9.40μg/kg；上述結(jié)果證明huwentoxin-Ⅰ是一種較強(qiáng)的哺乳動(dòng)物神經(jīng)肌肉接頭傳遞的不可逆阻斷劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求12)中所述的化學(xué)結(jié)構(gòu)式，其特征在于，上述化學(xué)結(jié)構(gòu)除得到氨基酸組成分析、羧肽酶Y降解分析實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證外，另外在質(zhì)譜儀上做了質(zhì)譜分析，質(zhì)譜測出其準(zhǔn)確分子量為3749.3±1，與按順序分析結(jié)果計(jì)算得出的分子量3750完全吻合，并確證6個(gè)半胱氨酸殘基是以三對二硫鍵形式存在。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的虎紋捕鳥蛛毒素-I(huwentoxin-I)，其特征在于它是由33個(gè)氨基酸殘基組成的多肽毒素，含有三對二硫鍵。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述虎紋捕鳥蛛毒素-I(huwentoxin-I)，其特征在于，它能作為阻止哺乳動(dòng)物神經(jīng)肌肉接頭傳遞的試劑，應(yīng)用于神經(jīng)生物學(xué)和藥理學(xué)研究和有關(guān)臨床實(shí)驗(yàn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述虎紋捕鳥蛛毒素-I(huwentoxin-I)，其特征在于，它具有以下生物化學(xué)性質(zhì)其分子量為3750道爾頓，分子量的測定方法為在質(zhì)譜儀(美國Millipore)上用快原子轟擊法測定;其等電點(diǎn)為pI＝8.95，用等電聚焦電泳法測定;其最大紫外吸收波長為280nm;其對小鼠經(jīng)腹腔注射的半至死量為LD50＝0.70mg/kg體重，對小鼠腦內(nèi)注射的半至死量為，9.4ug/kg體重。
全文摘要
“虎紋捕鳥蛛毒素-I”為一新型哺乳動(dòng)物神經(jīng)毒素，它是從我國虎紋捕鳥蜘蛛中經(jīng)反相和離子交換高效液相色譜提純的，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為由33個(gè)氨基酸殘基以特定的順序組成的多肽，含有三對鏈內(nèi)二硫鍵。它能不可逆地阻斷哺乳動(dòng)物神經(jīng)肌肉接頭傳遞，可作為工具試劑應(yīng)用于神經(jīng)生物學(xué)和藥理學(xué)研究中。
文檔編號C07K14/435GK1079475SQ9310472
公開日1993年12月15日 申請日期1993年5月10日 優(yōu)先權(quán)日1993年5月10日
發(fā)明者梁宋平, 張東裔, 周培愛 申請人:湖南師范大學(xué), 北京大學(xué)