專利名稱：具有鄰位絡合官能度的雙官能配位體配合物及其共軛物的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及具有鄰位絡合官能度的螯合物，它們的配合物和共軛物，及其制備方法，以及將它們用于配方，和將它們用于診斷和/或治療癌癥的方法。
已知具有官能度的螯合物或雙官能度配位體能夠以共價鍵的形式結(jié)合到對癌或腫瘤細胞表位或抗原具有特異性的抗體上。這類抗體/螯合物結(jié)合物放射性核素復合物可以將放射性核素傳遞到癌或腫瘤細胞上，由此，可用于癌癥的診斷和/或治療。參見Meares et al，Anal Biochem·142，68-78，(1984);和Krejcarek et al，Biochem and Biophys Res Comm，77，581-585(1977)。
近幾年來，文獻中報導并研究了多種氨基羧酸螯合劑。典型的氨基羧酸是次氮基三乙酸(NTA)，乙二胺四乙酸(EDTA)，羥乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)，二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)，和反式-1，2-環(huán)己二胺四乙酸(DCTA)。已經(jīng)報導并制備了為數(shù)眾多的氨基羧酸為基礎的雙官能度螯合劑。例如，文獻中已報導了DTPA的混合環(huán)化二酸酐(Hnatowich et al，Science，220，613-615，1983;美國專利4，479，930號)，DTPA的羧基碳酸酐(Gansow，美國專利4，454，106號和4，472，509號;Krejcarek et al，Biochem and Biophys Res Comm·77，581-585，1977。當上述酸酐偶合到蛋白上時，通過形成一個酰胺鍵進行偶合，因此，二亞乙基三胺(DETA)主鏈上原有的五個羧甲基還剩下四個(Hnatowich et al，Int·J·Appl·Isot·33，327-332，1982)。另外，美國專利4，432，907號和4，352，751號公開了用于將金屬離子鍵合到“諸如有機靶分子或抗體之類的有機體上的雙官能度螯合劑。如上所述，通過利用二氨基四乙酸二酸酐形成酰氨基團完成偶合。酸酐的例子包括下述各酸的二酸酐EDTA，DCTA，亞丙基二胺四乙酸，亞苯基1，2-二胺四乙酸。最近，美國專利4，647，447號公開了幾種用于各種診斷技術的由復合酸陰離子形成的復合鹽。該文介紹了通過復合酸羧基的結(jié)合作用實現(xiàn)以酰胺鍵的連接。
在文獻中還詳細地介紹過另一類以氨基羧酸官能度為基礎的雙官能度螯合劑。Sundberg等人在“J·of Med Chem·17(12)，1304(1974)”中公開了EDTA的雙官能度同系物。具有代表性的這類化合物是1-(對硝基苯基)乙二胺四乙酸，1-(對氨基苯基)乙二胺四乙酸和1-(對重氮苯)乙二胺四乙酸。該文討論了通過對位取代基與蛋白的結(jié)合，以及將放射活性金屬離子鍵合到螯合基團上。在Biochem·Biophys·Res Comm·75(1)，149(1977)和美國專利3，994，966號和4，043，998號中也公開了這類化合物。其最重要的一點是通過乙二胺主鏈的碳將芳基連接到EDTA的結(jié)構上。美國專利4，622，420號公開了以EDTA，HEDTA和DTPA為基礎的具有光學活性的雙官能度螯合劑。該文還介紹了通過亞乙胺主鏈的碳將氨基羧酸官能度連接到雙官能團螯合分子的其余部分。在這些化合物中，通過亞烷基將芳香基團(含有連接到蛋白上所需的官能度)連接到含有螯合官能度的多胺的碳上。有關這類化合物的其他參考文獻包括Brechbiel et al Inorg Chem·25，2772-2781(1986)，美國專利4，647，447號和國際出版號為WO 86/06384的PCT申請。最近，美國專利4，678，667號公開了某些大環(huán)雙官能度螯合劑以及它們的銅鹽螯合結(jié)合物在診斷或治療中的應用。通過環(huán)狀多胺主鏈上的環(huán)碳原子將氨基羧酸官能度連接到雙官能度螯合分子的其余部分。因此，一端與環(huán)狀多胺的碳原子連接的連接體，其另一端也可以連接到能與蛋白質(zhì)反應的官能團上。
另一類有價值的雙官能度螯合劑是下述化合物化合物的螯合部分(即，氨基羧酸)通過氮原子連接到含有能與蛋白質(zhì)反應的分子的官能團上。例如，Mikola等人在PCT申請出版物(國際出版編號WO 84/03698，9/27/1984出版)中公開了通過下述反應制得的雙官能度螯合劑先由對硝基芐基溴與DETA反應，然后與溴代乙酸反應，形成氨基羧酸。將硝基還原成相應的氨基，然后與硫光氣反應轉(zhuǎn)化為硫代異氰酸基。這些化合物是雙官能度螯合劑，它們可以與生物有機分子結(jié)合，用作能與鑭系元素螯合的診斷劑。由于氨基羧酸中的一個氮原子將分子連接到該連接體的某一位置，那么就失去了用于螯合的一個潛在的氨基羧基。因此，制得了含有四個(不是五個)酸基的DETA-基質(zhì)雙官能度螯合劑。就此而言，這類雙官能度螯合劑類似于通過酰氨基連接到蛋白上并隨之失去羧基螯合度團的那些化合物。
在“J·Radioanalytical Chem·57(12)，553-564(1930)”中，Paik等人公開了采用對硝基芐基溴與“保護的”二亞乙基三胺〔即，二-(2-苯鄰二甲酰亞胺乙基)胺〕反應，然后去保護，并使用氯乙酸羧甲基化，由此得到N′-對硝基芐基二亞乙基三胺N，N，N″，N″-四乙酸。另外，由于是通過氮原子相連，則得到四乙酸衍生物。該文討論了雙官能度螯合劑的結(jié)合作用和與銦的螯合作用。Eckelman等人在“J。Pharm Sci 64(4)，(1975)”中還介紹了在氮原子上的取代反應，即，在羧甲基化前由胺(例如，亞乙基二胺或二亞乙基三胺)與適宜的烷基溴反應。這類化合物可成為有效的“放射藥物顯影劑”。
最近，Carney，Rogers，Johnson公開了題為“體內(nèi)高級組織不攝取銦111標記的抗體給裸鼠模型同時服用銦-111和碘-125標記的B72·3”和“螯合劑齒合性在裸鼠體內(nèi)對銦-111標記的B72·3免疫結(jié)合物生物分布的影響”的文摘(第三屆單克隆抗體國際會議，圣地亞哥，加利福尼亞，1988年2月，4-6日)。該文討論了銦-111與EDTA和DTPA雙官能度螯合劑絡合后的生物分布情況。通過乙酸基使芳香環(huán)與EDTA/DTPA殘基連接。在此之前，Hunt等人在美國專利4，088，747號和4，091，088號(1978)中公開了以亞乙基二胺二乙酸(EDDA)為基礎的螯合劑，其中，通過亞烷基或乙酸基使芳香環(huán)與EDDA殘基相連。據(jù)介紹，該類化合物可作為螯合劑用于研究肝膽管的功能。優(yōu)選金屬是锝-99m。另據(jù)介紹，銦-111和銦-113也可用作顯影的放射性核素。
Martell等人在“Inorganica Chemica Acta 138，215-230(1987)”中公開了用于治療地中海貧血的鐵螯合劑。所采用的配位體是具有以下特性的EDTA的同系物帶有氨基和羧酸基供電子基團，或者具有其他供電子基團，例如取代在吡啶環(huán)上的酚基;另外含有酚和氨基供電子基團的氨基膦酸或酯基;含有羧酸酯和/或酚供電子基團的大環(huán)多胺;三異羥肟酸;三兒茶酚;以及含有同向酰胺基的多齒配位體。
對癌癥患者來說，骨轉(zhuǎn)移瘤病變是經(jīng)常發(fā)生的災難性事件。疼痛，病變性骨折，經(jīng)常性神經(jīng)病學缺陷，以其由這些骨轉(zhuǎn)移瘤損傷引起強制性不動性給癌癥患者的生活帶來了極大困難。由于患有乳腺癌，肺癌或前列腺癌的所有患者中近50%最終都會發(fā)展成骨轉(zhuǎn)移瘤，因此，患有骨轉(zhuǎn)移瘤疾病的患者數(shù)目是巨大的。在患有腎癌、甲狀腺癌、膀胱癌、宮頸癌和其他腫瘤的病人中也可見到骨轉(zhuǎn)移瘤，總之，這就表明不足20%的患者會發(fā)展成骨轉(zhuǎn)移瘤。骨轉(zhuǎn)移癌對生命威脅極大，在發(fā)現(xiàn)骨損傷后存活數(shù)年的患者純屬偶然。最初治療目標集中于緩解疼痛，減少麻醉治療，增加行走。顯然，人們還是期望能夠治愈某些癌癥。
采用放射性核素治療骨轉(zhuǎn)移癌可以追遡到50年代初。據(jù)報導，以適宜的形式注射發(fā)射放射性粒子的核素，用以治療鈣化損傷。最理想的是將這類核素集中于骨損傷的區(qū)域，而將到達軟組織和正常骨骼的量降至最低。巳采用了放射性磷(P-32和P-33)化合物，但其核性質(zhì)及生物定位性質(zhì)限制了這些化合物的利用。
〔Kaplan，E，et al，J Nuc Med·1(1)，1，(1960);(美國專利3，965，254號)〕。
治療骨癌的另一方法就是采用含有硼殘基的磷化合物。將這些化合物注入體內(nèi)(靜脈注射)，并在骨骼系統(tǒng)積累。然后用中子幅射治療區(qū)域，借以激活硼，由此得到治療放射劑量(美國專利4，399，817號)。
在前述方法中，以不嚴重損傷正常組織為前提而使腫瘤達到治療劑量是不可能的。在許多情況下，尤其對骨轉(zhuǎn)移瘤損傷而言，腫瘤巳擴散到整個骨骼系統(tǒng)，截肢或放射治療都是不切實的(Seminars in Nuclear Medicine IX(2)，April，1979)。
也報導過采用Re-186與二磷酸鹽制成的復合物。〔Mathieu，L et al，Int J·App，Rad，& Isot 30，725-727(1979);Weinenger，J，Ketri，A·R，et al，J·Nuc Med 24(5)，125(1983)〕。但是制備和純化這一復合物的困難限制了它的廣泛應用。
另外還報導過將鍶-89用于治療骨轉(zhuǎn)移瘤損傷的患者。但是，它的缺點是半衰期長(50·4天)，血藥濃度高，損傷/正常骨骼比低?！睩irusian，N，Mellin，P，Schmidt，C·G，The Journal of Urology，116，764，(1976);Schmidt，C·G，F(xiàn)irusian，N，Int·J·Clin Pharmacol，93，199-205(1974)〕。
據(jù)報導，采用I-131標記的α-氨基-(3-碘-4-羥基苯亞甲基)二磷酸酯可以比較緩解地治療骨轉(zhuǎn)移瘤〔Eisenhut，M，J·Nuc Med 25(12)，1356-1361，(1984)〕。眾所周知，由于碘有可能滯留在甲狀腺內(nèi)，所以采用放射性碘作為治療放射性核素是不理想的。Eisenhut的研究表明碘化物是該化合物可能的代謝產(chǎn)物之一。另外，由碘化反應所殘留的，以及在清洗過程中未分離的任何I-131都會構成對甲狀腺的威脅。
據(jù)認為，氨基羧酸可螯合金屬離子，它與堿土金屬，過渡金屬系可形成十分穩(wěn)定的螯合物。
O′Mara等人(J Nuc Med 10，49-51，1969)巳經(jīng)制得了氨基羧酸與稀土金屬(螯合比10∶1)的復合物，發(fā)現(xiàn)它們具有良好的骨骼作用，并試圖將它們用作骨骼診斷劑。除了骨骼攝取量高外，還發(fā)現(xiàn)在肌肉和/或肝臟中幅射量很高。經(jīng)評價認為，在稀土核素中Sm-153和Er-171最適宜用作人體顯影劑。但未提及將這些試劑用作治療劑。
Rosoff，B等人(Int J App Rad and Isot 14，129-135(1963)〕公開了EDTA，NTA與某些放射性核素形成的復合物，所述核素包括Sc-46，y-91，La-140，Sm-153。該文揭示了這類復合物穩(wěn)定常數(shù)與排泄的關系。螯合劑與金屬的摩爾比為5∶1，并發(fā)現(xiàn)，在肝臟，脾，腎，肺和骨中放射濃度高。
本發(fā)明涉及新的具有鄰位絡合官能度的螯合劑，該螯合劑與金屬，尤其是具有稀土型化學性質(zhì)的“放射性”金屬形成復合物。優(yōu)選的放射性金屬包括釤-153(153Sm)，鈥-166(166Ho)，釔-90(90y)，钷-149(149Pm)，釓-159(159Gd)，鑭-140(140La)，镥-177(177Lu)，鐿-175(175Yb)，鈧-47(47Sc)，鐠-142(142Pr)。就治療和/或診斷用途而言，按上述方法形成的復合物本身即可使用，或者也可以將它們連接到抗體或抗體片段上使用。可以將上述復合物和/或結(jié)合物配成制劑，在體內(nèi)或體外應用。經(jīng)過配制的結(jié)合物之優(yōu)選用途是治療動物，尤其是人體的癌癥。
另外，以組合物形式使用某些螯合劑一放射性核素復合物，可成為有效的鈣化腫瘤的治療劑和/或診斷劑，和/或作為緩解骨痛的有效治療劑。
更具體地講，本發(fā)明涉及下式化合物及其藥物上可以接受的鹽
式中Z是能與抗體或抗體片段或合成連接體以共價鍵相連的親電或親核性殘基，該合成連接體不能妨礙與放射性核素的復合反應，并可可以連接到抗體或抗體片段上，X是氫，C1-3烷基或CR3R4COOH;
R1，R2，R3和R4各自獨立為氫，羥基，CO2H或C1-3烷基;
R5是氫或(CR1R2)nCR3R4B;
B代表直鏈或支鏈胺或聚亞烷基胺，其中至少有一個胺氫原子被CR3R4CO2H基團取代;
n是0或1。
最好將羧基(如果有的話)連接到從B基團氮數(shù)起第一或第二個碳原子上(即螯合劑部分氮的α或β-碳原子)。在優(yōu)選的式(Ⅰ)化合物中，n是0;或R1，R2，R3和R4各自是氫;或n是O和R3或R4之一是氫，而另一個則是COOH;或X是氫。當以雙官能度螯合劑使用該螯合物時，那么Z最好是氨基，硫代異氰酸基，氨基脲，硫代氨基脲，羧基，溴代乙酰氨基或馬來酰亞胺基。
另外，本發(fā)明還涉及下列式(Ⅱ)化合物及其藥物上可以接受的鹽
式中Z′是氫，NH2，NO2，NH((O)CH3或NCR′)2，其中R′是氫或C1-3烷基;
X是氫，C1-3烷基或CR3R4COOH;
R′1是氫或COOH;
R′3R′4和R′5各自是氫或CR3R4COOH，其前提是R′1，R′3，R′4和R′5中至少有一個是氫。
此外，本發(fā)明涉及下列式(Ⅲ)化合物及其藥物上可以接受的鹽;
式中Z′是氫，NH2，NO2，NHC(O)CH3，N(R′)2，其中R′是氫或C1-3烷基，X是氫，C1-3烷基或CR3R4COOH;
R′1和R′2各自是氫或COOH，其前提是至少有一個COOH;R′3，R′4，R′5和R′6各自是氫或CR3R4COOH，其前提是至少有3個CR3R4COOH。
本發(fā)明還涉及放射性金屬離子復合物，尤其是放射性稀土型金屬離子復合物，還涉及由上述復合物與抗體或抗體片段形成的結(jié)合物。另外，本發(fā)明還包括含有本發(fā)明所述螯合劑-放射性核素復合物和/或結(jié)合物以及藥物上可以接受載體的制劑。在這些配方中的藥物上可接受的載體一般是液體。本發(fā)明還包括通過給哺乳動物服用有效量的上述制劑診斷或治療疾病，尤其是癌癥的方法。
本文所采用的下述術語的定義為就Z而言，“親電性殘基”包括(但不限于)硫代異氰酸基，溴代乙酰氨基，馬來酰亞胺基，亞氨酸酯基，硫代苯鄰二甲酰亞胺基，N-羥基琥珀酰亞胺酯基，吡啶基二硫基，苯基偶氮基;適宜的“親核性殘基”包括(但不限于)羧基，?；?，氨基脲，硫代氨基脲;“合成連接體”包括能與抗體或抗體片段以共價鍵相連的任何合成的有機或無機連接體，優(yōu)選的合成連接體是在患者血清內(nèi)是穩(wěn)定的，但在放射性同位素清除的器官內(nèi)具有潛在酶降解作用，即，生物可降解的合成連接體，例如，生物可降解多肽或含多肽的基團。在親電性殘基中，優(yōu)選的是硫代異氰酸基，溴化乙酰胺基，馬來酰亞胺基;特別優(yōu)選的是硫代異氰酸基;在親核性殘基中，優(yōu)選者是氨基，羧基，氨基脲，硫代氨基脲，特別優(yōu)選的是氨基或羧基。Z的性質(zhì)和/或位置不應明顯地妨礙螯合反應。如果最終用途不涉及將螯合物連接到蛋白上，Z也可以是非反應性殘基，例如，H，NO2，NHC(O)CH3，NR′2(其中R′是H或C1-3烷基)。
術語“C1-3烷基”包括甲基，乙基，正丙基和異丙基。
術語“直鏈或支鏈胺或聚亞烷基胺”意指至少含有1個(通常是多于1個)氮原子的直鏈或支鏈烷基。
本文所采用的術語“哺乳動物”意指通過乳腺分泌奶液哺乳其后代的動物，最好是溫血動物，最理想的是人。
“抗體”意指任何多克隆，單克隆，嵌合抗體或異種抗體，最好是單克隆抗體;“抗體片段”包括Fab片段和F(ab′)2片段，以及對所期某個表位或多個表位具有特異性的抗體中的任何部分。當采用術語“放射性金屬螯合劑/抗體結(jié)合物”或“結(jié)合物”時，“抗體”包括整個抗體和/或抗體片段，其中包括它們的半合成或基因工程突變體。優(yōu)選的抗體是CC-49和像Fab和F(ab′)2之類的抗體片段。其他可能的抗體是CC-83和B72·3。雜交細胞系B72·3保存于美國標準菌庫(ATCC)，其登記號為ATCC HB8108。其他鼠類單克隆抗體具有TAG-72表位，與腫瘤有關的抗原。
本文所采用的“放射性金屬復合物”或“復合物”意指本發(fā)明化合物，如，式(Ⅰ)化合物，與稀土型金屬離子，尤其是放射性稀土型金屬離子絡合而成的復合物，其中至少有一個金屬原子被整合或隔離;“放射性金屬離子螯合體/抗體結(jié)合物”或“放射性金屬離子結(jié)合物”意指以共價鍵連接到抗體或抗體片段上的放射性金屬離子結(jié)合物;“放射性”，當該詞與“金屬離子”一詞連用時，意指能發(fā)射粒子和/或光子的稀土型元素的一種或多種同位素，例如，153Sm，166Ho，90Y，149Pm，159Gd，140La，177Lu，175Yb，47Sc和142Pr。術語“雙官能度配位體”，“雙官能度螯合劑”和“官能化螯合劑”可以交替使用，并且意指含有螯合劑殘基的化合物，所述螯合劑殘基能夠以共價鍵的形式將金屬離子和連接體/隔斷體殘基連接到所述螯合劑殘基上，該殘基以共價鍵連接到抗體或抗體片段上。
本文所采用的“藥物上可以接受的鹽”意指絕對無毒的，可用于診斷或治療哺乳動物疾病的式(Ⅰ)化合物的任何鹽。因此，本發(fā)明所述的鹽是有用的。通過標準反應，由有機和無機試劑形成的這些鹽包括例如，硫酸鹽，鹽酸鹽，磷酸鹽，乙酸鹽，琥珀酸鹽，檸檬酸鹽，乳酸鹽，馬來酸鹽，富馬酸鹽，棕櫚酸鹽，膽酸鹽，雙羥萘酸鹽，粘酸鹽，谷氨酸鹽，d-樟腦酸鹽，戊二酸鹽，乙醇酸鹽，苯二甲酸鹽，酒石酸鹽，甲酸鹽，月桂酸鹽，硬脂酸鹽，水楊酸鹽，甲磺酸鹽，苯磺酸鹽，山梨酸鹽，苦味酸鹽，苯甲酸鹽，肉桂酸鹽和其他適宜的酸式鹽。通過標準反應，由有機或無機試劑形成的其他鹽包括例如，銨鹽，堿金屬離子鹽，堿土金屬離子鹽，和其他類似的離子鹽。特別優(yōu)選的式(Ⅰ)化合物的鹽是鉀鹽，鈉鹽，銨鹽或它們的混合物。
本文所述雙官能度螯合劑(由式(Ⅰ)代表，可用于螯合或隔離稀土型金屬離子，尤其是放射性稀土型金屬離子，由此形成金屬離子螯合物(本文稱之為“復合物”)。由于有官能度殘基(由式(Ⅰ)的“Z”代表)，可將上述復合物連接到官能化載體上，例如，官能化聚合物載體，或者，最好以共價鍵連接到抗體或抗體片段上。因此，可將本發(fā)明所述復合物以共價鍵連接到抗體或抗體片段上，并在本文中稱之為“結(jié)合物”。
用于本發(fā)明所述結(jié)合物的抗體或抗體片段可由本領域眾所周知的技術制得。通過本領域周知的雜交技術可以制得高特異性的單克隆抗體，參見Kohler and Milstein〔Nature 256，495-497(1975);and Eur J Immunol 6 511-519(1976)〕。這類抗體一般具有很高的特異反應性。在以抗體作為靶目標的放射性金屬離子結(jié)合物中，可采用與任何所期抗原或半抗原相對應的抗體。在放射性金屬離子結(jié)合物中所采用的抗體最好是對某個或多個所期表位具有高度特異性的單克隆抗體或其片段。本發(fā)明所采用的抗體可以直接抗腫瘤，細菌，霉菌，病毒，寄生蟲，支原菌，differentiation和其他細胞膜抗原，病原體表面抗原，毒素，酶，過敏原，藥物以及生物活性分子。某些抗體或抗體片段的例子是CC-11，CC-15，CC-30，CC-46，CC-49F(ab′)2，CC-49，CC-83，CC-83F(ab′)2，CC-92和B72·3?！睠C-49，CC-83和B72·3抗體參見D Colcher et al，Cancer Res 48，4597-4603(1988年8月15日)〕。下述CC抗體保存于ATCCCC-11(HB9455);CC-15(HB·9460);CC-30(HB·9457);CC-46(HB·9458);CC-49(HB·9459);CC-83(HB·9453);CC-92(HB·9454);B72·3(HB·8108)。美國專利4，193，983號給出了更詳盡的抗原。本發(fā)明所述放射性金屬離子螯合物/抗體結(jié)合物特別適用于診斷治療各種癌癥。
下式代表本發(fā)明優(yōu)選的稀土型(鑭系元素或偽鑭系元素)復合物C〔Ln(BFC)〕其中，Ln是稀土金屬(鑭)離子，例如，Ce3+，Pr3+，Nd3+，Pm3+，Sm3+，Eu3+，Gd3+，Tb3+，Dy3+，Ho3+，Er3+，Tm3+，Yb3+，Lu3+，或者是偽鑭系金屬離子，例如，Sc3+，Y3+和La3+;BFC代表雙官能度螯合劑;C代表有足夠的電荷使整個復合物呈中性的藥物上可以接受的離子或離子團。如果BFC含有四個或更多的負電荷殘基，那么C是陽離子或陽離子基團，例如，H+，Li+，Na+，K+，Rb+，Cs+，Mg2+，Ca2+，Sr2+，Ba2+，Ra2+，NH4+，N(CH3)4+，N(C2H5)4+，N(C3H7)4+，N(C4H9)4+，As(C6H5)4+，〔(C6H5)3P＝〕2N+和其他質(zhì)子化胺。如果BFC含有3個負電荷殘基，那么不需要C。如果BFC含有2個負電荷殘基，那么C是陰離子，例如F-，Cl-，Br-，I-，ClO4-，BF4-，H2PO4-，HCO3-，HCO2-，CH3SO3-，H3C-C6H4-SO3-，PF6-，CH3CO2-和B(C6H5)4-。
本發(fā)明化合物與生理上可以接受的載體或賦形劑一道使用。制備這些制劑的方法是眾所周知的，所述制劑可以是混懸液，注射液或其他適宜的制劑。可采用生理上可以接受的懸浮介質(zhì)，加或不加輔藥均可。
治療“有效量”的制劑。劑量根據(jù)所治療的疾病改變。盡管可采用本發(fā)明制劑進行體外診斷，但也可采用本發(fā)明制劑輔之以體內(nèi)診斷。在放射免疫導向的外科治療(RIGS)中，也可采用本發(fā)明所述結(jié)合物及制劑;但是，可用于這一目的的其他金屬包括99mTc，111In，113nIn，67Ga和68Ga。
當將本發(fā)明所述螯合劑-放射性核素復合物用于治療骨癌時，必須滿足某些標準。盡管放射性核素的性質(zhì)是重要的，但含有放射性核素-螯合劑復合物的組合物之總體性質(zhì)則是決定性因素。無論是借助于配位體還是借助于放射性核素的一個或多個優(yōu)點可克服任一性能的缺點，但是以組合物的形式使用時必須將二者結(jié)合起來考慮。
下文討論在選擇本發(fā)明組合物所使用的任何具體的放射性核素與配位體結(jié)合(即，復合物)所必須考慮的那些標準。如果不采用適量過量的本發(fā)明所述配位體，則放射性核素一螯合劑復合物不可能用于治療目的，或者無效。
因此，組合物必須遵循下述標準才能給鈣化腫瘤提供治療的放射劑量而又使抵軟組織的放射劑量控制在最低點。
必須使放射核素盡量抵達骨組織而不到軟組織。更具體地講，肝攝取或血攝取均是不希望的。
應該從非骨性組織中迅速干凈地除去放射性核素，以免對這類組織造成不必要的損害，例如，它應該從血液中迅速而干凈地除去。
某些本發(fā)明組合物的推薦用途是治療動物的鈣化腫瘤。本文所稱的“鈣化腫瘤”包括原發(fā)瘤，即，骨骼系統(tǒng)是涉及的第一位點;骨轉(zhuǎn)移癌，即，腫瘤從原發(fā)位置(如前列腺和乳腺)擴散進骨骼系統(tǒng)。本發(fā)明提供了一種通過施用治療放射劑取得對鈣化瘤的以下療效的方法緩解疼痛和/或減小體積，和/或抑制生長和/或擴散，或者使腫瘤消退和/或消滅腫瘤。
可按單一劑量或分次劑量長時間服用該組合物。必須將足夠量的放射性核素送至腫瘤，以便獲得上述療效。
本發(fā)明所述某些螯合劑的其他用途包括從體內(nèi)除去不希望的金屬(如鐵)，磁性共振造影(magnetic resonce imaging)，為各種目的連接到聚合載體上(例如，用作診斷劑)，通過選擇性提取除去鑭系金屬或偽鑭系金屬離子。除了將放射性核素送至鈣化位點外，金屬配位復合物還具有分離骨髓的作用(即骨髓移植)。
可采用多種方法生產(chǎn)放射性核素。在核反應器中，用中子轟擊核素即可獲得放射性核素，如Sm-152+中子→Sm-153+γ獲得放射性核素的另一方法是采用由線性型加速器或回旋加速器產(chǎn)生的粒子轟擊核素。還有一種方法是從裂變產(chǎn)物混合物中分離放射性核素，對獲得本發(fā)明所用核素的方法來說并無嚴格要求。
本文所公開的螯合劑可按照本領域公知的方法制備。參見“螯合劑和金屬螯合物”Dwyer & Mellor，Academic Press(1964)，第7章，另參見制備氨基酸的方法，“氨基酸的合成生產(chǎn)和利用”(edited by Kameko，et al)John Wiley & Sons(1974)。
當Z(式中)為親電性殘基時，可按本領域巳知方法制得。參見Acc Chem Res 17 202-209(1984)。
用于制備式Ⅰ，Ⅱ或Ⅲ螯合物的某些方法是A)在苛性堿和適宜溶劑存在下，于20℃(或更低)使下式(a)化合物或其藥物上可接受的鹽與化合物B和醛或醛的等價前體反應，然后加熱，并分離所期式Ⅰ，Ⅱ或Ⅲ產(chǎn)物，式(a)為
式中，Z是能與抗體或抗體片段或合成連接體以共價鍵相連接的親電或親核素性殘基，該合成連接體不能妨礙與放射性核素的復合反應，而且可以連接在抗體或抗體片段上，X是氫;
R5是氫或(CR1R2)nCR3R4T，其中R1，R2，R3和R4各自獨立為氫，羥基，CO2H或C1-3烷基，n是0或1，T代表線型或支鏈胺或聚亞烷基胺，其中至少有一個氨基氫巳被CR3R4CO2H基團取代;
B代表式中至少有一個氨基氫的線型或支鏈胺或聚亞烷基胺;
B)在pH9(或更高)，在苛性堿存在下，于20℃(或更低)由步驟(A)所得產(chǎn)物與鹵代(CR1R2)nCR3R4酸反應，得到式中R1，R3，R3和R4中至少有一個是CO2H的式Ⅰ，Ⅱ或Ⅲ化合物;
C)用NaOH的水溶液水解式中Z是NHC(O)CH3的步驟(B產(chǎn)物，得到式中Z是NH2的式Ⅰ，Ⅱ或Ⅲ產(chǎn)物;
D)在PH9(或更高)，于20℃(或更低)，在苛性堿中，由步驟(A)產(chǎn)物與乙醇腈反應，然后用Hcl的水溶液使氰基水解，得到式中R1，R2，R3和R4中至少有一個是CO2H的式Ⅰ，Ⅱ或Ⅲ產(chǎn)物;
E)用DCl和D2O，通過加熱，將式中Z是NHC(O)CH3的步驟(A)產(chǎn)物水解，得到式中Z是NH2的式Ⅰ，Ⅱ或Ⅲ產(chǎn)物;
F)使式中Z是NH2的步驟(A)至(E)中的任一步驟所得產(chǎn)物與二氯硫化碳反應，得到式中Z是硫代異氰酸基的式Ⅰ，Ⅱ或Ⅲ產(chǎn)物。
上述各步反應所用的條件和試劑如下當溫度為“20℃(或更低)”時，通常采用冰/水浴，“加熱”通常指回流或室溫以上的溫度;優(yōu)選的“苛性堿”是氫氧化鈉，但是，任何可維持所期pH而又不損害反應產(chǎn)物的堿都是可以接受的;“適宜的溶劑”是指惰性的，能夠溶解各反應產(chǎn)物的溶劑，例如，水，醇(如甲醇);可采用任何慣用方法分離所期產(chǎn)物，例如，從溶劑(如丙酮)中沉淀。
采用慣用方法制備式Ⅰ，Ⅱ或Ⅲ的復合物，例如，在螯合劑隔離金屬的條件下使螯合劑與金屬反應。通常螯合劑過量于金屬。
采用慣用方法制備式Ⅰ，Ⅱ或Ⅲ的結(jié)合物，例如，使復合物以共價鍵連接于抗體或抗體片段。
下列實施例意在通過本發(fā)明的純應用實施例對本發(fā)明作進一步說明。表Ⅰ中示出了符合通式Ⅰ化合物的結(jié)構式。
實施例A 不對稱乙二胺二乙酸的制備將去離子水(60.6g)，98%的N-乙酰基乙二胺(20.4g，0.2mole)，和溴乙酸(155.7g，0.4mole)加到反應器中，并用冰-水浴冷卻之。攪拌下，用25%的NaOH溶液將該混合物調(diào)至約pH8.1。在加苛性堿期間將混合物的溫度維持在20℃以下。除去冰-水浴，加入25%的NaOH溶液以使pH維持在7和8之間。用冰-水浴定時冷卻，將溫度控制在37℃以下。攪拌該反應混合物，時間為31小時左右，然后移至裝有水冷回流冷凝器、磁力攪拌棒、溫度計、加料漏斗和加熱套的園底反應燒瓶中。加入NaOH溶液(40.1g，50%)，將該混合物攪拌，加熱回流約15小時，然后冷卻，用玻璃沙芯漏斗減壓過濾，將濾液定量移(用去離子水)至燒杯中，并用冰-浴冷卻至25℃以下，攪拌下加入去離子水(100ml)，用濃鹽酸將pH調(diào)至約4，同時使溫度保持在25℃以下，采用玻璃砂芯漏斗減壓過濾該混合物，將約1200ml乙醇加到大燒杯中，用磁力攪拌棒攪拌，將上述濾液加到乙醇中，充分混合，出現(xiàn)油狀物，并逐漸轉(zhuǎn)化成白色固體，繼續(xù)攪拌2小時，采用玻璃砂芯漏斗減壓過濾收集固體，將該固體暴露在空氣中干燥約1.5小時，然后置于真空爐中于55-60℃干燥數(shù)小時。收集含有無機鹽的白色固體，約42.9g，通過質(zhì)子和碳NMR鑒定為不對稱乙二胺二乙酸。
實施例B 2-氧-1-哌嗪乙酸的制備;乙二胺二乙酸的己內(nèi)酰胺將去離子水(150g)，25.0g(0.14mole)對稱乙二胺二乙酸和28g濃鹽酸加到裝有溫度計，控溫器，水冷回流冷凝器和加熱套的園底反應燒瓶中，然后用磁力攪拌棒攪拌該混合物，加熱回流4小時，冷卻。采用玻璃砂芯漏斗減壓過濾，用50%的NaOH溶液將濾液調(diào)至pH約1.5，用玻璃砂芯漏斗減壓過濾，用50%的NaOH溶液將濾液的pH調(diào)至約5，在60-70℃除去(減壓)揮發(fā)物，于55-60℃，在減壓爐中將固體干燥數(shù)小時。經(jīng)質(zhì)子和碳NMR鑒定為對稱乙二胺二乙酸的己內(nèi)酰胺。
實施例C 2-氧-1，4-哌嗪二乙酸的制備;乙二胺三乙酸的己內(nèi)酰胺將約40.8g2-氧-1-哌嗪乙酸(按實施例B方法制得)，70g去離子水加到燒杯中，并用磁力攪拌棒攪拌數(shù)小時，采用玻璃砂芯漏斗減壓過濾，將濾液和20.0g溴乙酸加到燒杯中，攪拌，直到溴乙酸全部溶解為止。用25%的NaOH溶液將PH調(diào)至約7，在加入苛性堿期間用冰-水浴冷卻，將溫度維持在25℃以下，除去冰水浴，將該混合物在約35℃攪拌約4-5小時，同時定期加入25%的NaOH溶液以將PH維持在7左右。將該反應混合物放置數(shù)小時，然后減壓濃縮至約90-100g，采用玻璃砂芯漏斗減壓過濾，在55-60℃減壓除去濾液中的揮發(fā)物，殘留物在減壓爐中于55-60℃減壓干燥數(shù)小時，經(jīng)質(zhì)子和碳NMR鑒定為乙二胺三乙酸的己內(nèi)酰胺。
實施例D 乙二胺三乙酸三鈉的制備將約44.5g2-氧-1，4-哌嗪二乙酸粗品(按實施例C方法制得)，280g去離子水加到燒杯中，攪拌直到己內(nèi)酰胺溶解。攪拌下加入苛性堿溶液(110g，50%)，通過冰浴冷卻將溫度維持在25℃以下，然后將含有該溶液的管浸入控溫于87℃的水浴中使之水解。15分鐘后，除去該溶液，并用冰-水浴冷卻。經(jīng)質(zhì)子和碳NMR分析表明在堿性水解質(zhì)中存在有乙二胺三乙酸三鈉。
實施例D 4-二亞乙基三胺乙酸的制備將75.0g苯鄰二甲酸酐，350.5g乙酸和26.0g二亞乙基三胺加到裝有水冷回流冷凝器，磁力攪拌器和溫度計的燒瓶中，攪拌該混合物，并在116℃左右加熱1.5小時，然后冷卻。在65-70℃減壓除去揮發(fā)物，直到重量為218g，攪拌下將該混合物倒入600g乙醇中，2小時后，采用玻璃砂芯漏斗濾出固體，該固體用500ml乙醇洗滌兩次，然后在減壓爐中于60-65℃干燥，收集到約66g二苯鄰二甲?；衔?。
將65.6g按上述方法制得的二鄰苯二甲?；衔?，17.7g碳酸鈉和800ml乙醇加到裝有水冷卻回流冷凝器，加料漏斗，機械攪拌器，控溫溫度計的燒瓶中，由此制得上述二苯鄰二甲?；衔锏囊阴?。將溴乙酸乙酯(51.0g)用15分鐘加到上述攪拌混合物中，然后加熱回流16小時。采用Dean-Stark蒸餾井除去乙醇(200ml)，加入碎冰將剩余的反應混合物冷卻到5℃以下。在冰浴中將該混合物再冷卻5小時，用玻璃砂芯漏斗過濾。用乙醇洗滌固體兩次，并在減壓爐中于65-70℃干燥。得到約81g1，7-二苯鄰二甲酰基-4-二亞乙基三胺乙酸乙酯。將20.1g(0.045moles)1，7-二苯鄰二甲酰基-4-二亞乙基三胺乙酸乙酯溶解在30.32g水和76.4g濃鹽酸中，加熱至93℃，然后使該混合物在93℃反應6.5小時。濾出所得白色沉淀，并用水洗滌，合并濾液，并于60℃減壓濃縮，得到白色固體。NMR分析表明苯鄰二甲?；鶊F并未完全水解，合并兩個固體，加入帶有少量水的濃鹽酸中，然后將該漿液加熱回流6小時，冷卻至室溫，過濾，得到12.3g苯鄰二甲酸。減壓下蒸發(fā)濾液，得到13.9g黃色固體產(chǎn)物。通過加入6g50%NaOH使產(chǎn)物溶解于水中，在100℃用活性炭處理，然后過濾，減壓蒸發(fā)，得到15.2g4-二亞乙基三胺乙酸。
實施例12-〔(2-｛〔雙(羧甲基)〕氨基｝乙基)氨基〕-2-(5-乙酰氨基-2-羥苯基)-乙醇酸的制備將去離子水(10.3g)，98%4-乙酰氨基苯酚(15.1g，0.1mole)，50%含水二羥乙酸(14.8g，0.1mole)和甲醇(50.5g)加到燒杯中，并用磁力攪拌棒混合。加入不對稱乙二胺二乙酸(19.5g)(按實施例A方法制得)，并在冰-水浴中冷卻該混合物，攪拌下用50%的NaOH溶液將該混合物的pH調(diào)至8左右，在加苛性堿期間將混合物的溫度維持在20℃以下。除去冰-水浴，將混合物的PH調(diào)至8.7左右，并在25-32℃攪拌約2小時。將該混合物移至裝有水冷回流冷凝器，磁力攪拌棒，溫度計和加熱套的園底反應燒瓶中，攪拌下將該混合物在70℃加熱8小時，然后冷卻，用玻璃砂芯漏斗減壓過濾，將固體暴露在空氣中干燥7小時，然后置于減壓爐中于55-60℃干燥數(shù)小時。收集到約29.6g固體，然后將該固體與約300g丙酮一道攪拌，采用玻璃砂芯漏斗減壓過濾，再用300g丙酮將固體洗滌一次，空氣干燥，然后置于減壓爐中于55-60℃干燥1小時。得到約26.7g 2-〔(2-〔雙(羧甲基)氨基 乙基)氨基〕-2-(5-乙酰氨基-2-羥苯基)乙醇酸鈉鹽。將這些固體和180g去離子水置于燒杯中，用磁力攪拌棒攪拌。用濃鹽酸將PH調(diào)至2.2，此時，酸式產(chǎn)物開始從溶液中沉淀。過濾收集產(chǎn)物，用約150g去離子水洗滌，將產(chǎn)物，2-〔(2-｛〔雙(羧甲基)〕氨基｝乙基)氨基〕-2-(5-乙酰氨基-2-羥苯基)乙醇酸在減壓爐中于55-60℃干燥數(shù)小時。得到約14.2g產(chǎn)物，質(zhì)子NMR確認產(chǎn)物的結(jié)構(見表1)。
實施例22-〔(2-｛〔雙(羧甲基)〕氨基｝乙基)(羧甲基)氨基〕-2-〔5-乙酰氨基-2-(羧甲氧基)苯基乙醇酸的制備將去離子水(4.5g)，溴乙酸(2.0g)和按實施例1方法制得的2-〔(2-｛〔雙(羧甲基)〕氨基｝乙基)氨基〕-2-(5-乙酰氨基-2-羥苯基)乙酮酸(2.5g)加到一小反應器中，并用冰-水浴冷卻之。攪拌下，用25%的NaOH溶液將混合物的PH調(diào)至9.3左右，在加苛性堿期間將混合物的溫度維持在20℃以下，除去冰-水浴，將該混合物在35-40℃攪拌48小時，在此期間定時加入25%的NaOH溶液使PH維持在10.5至11.5之間。將該反應混合物(10.2g)加到一燒杯中，并用磁力攪拌棒攪拌之，用15分鐘將丙酮(125g)加到該溶液中，沉淀出油狀物，傾掉丙酮，再在沉淀物中加入50g丙酮，混合，除去丙酮層，將油在空氣中干燥，再在減壓爐中于60-65℃干燥約2小時，得到一易碎的黃色固體。在15mm×500mm柱上進行陽離子交換層析(Q-SepharoreTmfrom Pharmacia Inc)純化產(chǎn)物，用0-30%甲酸進行梯度洗脫，時間為2小時，速度為3ml/分，收集洗脫液，用UV吸收監(jiān)測洗脫液，合并適宜的洗脫液，凍干，得到所期產(chǎn)物(見表Ⅰ)。
實施例32-〔(2-｛〔雙(羧甲基)〕氨基｝乙基)(羧甲基)氨基〕-2-〔5-氨基-2-(羧甲氧基)苯基〕乙醇酸五鈉鹽的制備將約40mg由實施例2方法制得的2-〔(2-｛〔雙(羧甲基)〕氨基｝乙基)(羧甲基)氨基〕-2-〔5-乙酰氨基-2-(羧基甲氧基)苯基〕乙醇酸溶解在700μlD2O中，并用NaOD/D2O調(diào)至pH13。在環(huán)境溫度下，將N-乙?；獬上鄳谋桨饭倌軋F，然后用質(zhì)子NMR確認其結(jié)構(見表Ⅰ)。
實施例42-〔(2-｛〔雙(羧甲基)〕氨基｝乙基)(氰基甲基)氨基〕-2-(5-乙酰氨基-2-羥苯基)乙醇酸的制備將去離子水(3.1g)，2.5g2-〔(2-｛〔雙(羧甲基)〕氨基｝乙基)氨基〕-2-(5-乙酰氨基-2-羥苯基)乙醇酸(按實施例1方法制得)加到一小玻璃瓶中，并用冰-水浴冷卻，用25%的NaOH溶液將PH調(diào)至9.8-9.9。在加入苛性堿期間，將混合物的溫度控制在20℃以下，除去冰浴，加入1.0g的40%乙醇腈水溶液并混合之，用25%的NaOH溶液將pH調(diào)至9.9-10.0。將該混合物移至裝有控溫溫度計，水水冷回流冷凝器，加熱套的小反應燒瓶中。用磁力攪拌棒攪拌該反應混合物，并在49-50℃加熱8小時，冷卻，在環(huán)境溫度下放置72小時。將部分反應混合物(8.5g)加到燒杯中，并用磁力攪拌棒攪拌之，用10分鐘時間在該溶液中加入丙酮(146g)，產(chǎn)生固體沉淀。傾掉丙酮，再在沉淀中加入50g丙酮，混合，除去丙酮層，將該物質(zhì)在減壓爐中于60-65℃干燥約4小時，得到約2.9g產(chǎn)物。質(zhì)子NMR表明其為所期望的氨基乙腈衍生物(見表1)。
實施例52-〔(2-｛〔雙(羧甲基)〕氨基｝乙基)(羧甲基)氨基〕-2-(5-氨基-2-羥苯基)乙醇酸將約1.0g按實施例4方法制得的2-〔(2-｛〔雙(羧甲基)〕氨基｝乙基)(氰基甲基)氨基〕-2-(5-乙酰氨基-2-羥苯基)乙醇酸在酸性條件下水解，使氨基乙腈官能團轉(zhuǎn)為相應的乙酸基，使N一乙酰基轉(zhuǎn)化為苯胺基。將氨基乙腈化合物，2.2gD2O，7.8g20%的DCl加到玻璃管中。將該管置于88-89℃的控溫水浴中33分鐘，然后除去水浴，冷卻之。用質(zhì)子NMR跟蹤水解反應，然后將該溶液冷凍干燥，凍干，得到1.3g固體。在15mm×500mm柱上進行陰離子交換(Q-SepharoseTm，純化產(chǎn)物，用0-1MZ酸進行梯度洗脫，洗脫時間為1小時，速度為3ml/分，收集6ml洗脫液。用UV吸收監(jiān)測洗脫液，合并適宜的洗脫液，凍干，得到所期產(chǎn)物(見表1)。
實施例62-〔雙(2-｛〔雙(羧甲基)〕氨基｝乙基)氨基〕-2-〔5-乙酰氨基-2-(羧甲氧基)苯基〕乙醇酸和2-〔｛2-〔(2-〔雙(羧甲基)〕氨基｝乙基)(羧甲基)氨基〕乙基(羧甲基)氨基〕-2-〔5-乙酰氨基-2-(羧甲氧基)苯基〕乙醇酸的制備將去離子水(24.8g)，98%的4-乙酰氨基苯酚(15.1g，0.1mole)和50%二羥乙酸水溶液(14.8g，0.1mole)加到一燒杯中，并用冰-水浴冷卻之。在將溫度保持在20℃以下的同時，用25%NaOH溶液將上述混合物的pH調(diào)至3.3。然后加入DETA(9.8g)。通過用冰-水浴冷卻再次將溫度降至20℃以下。加入DETA后，PH約為10.2。將該混合物移至裝有溫度計，控溫器，水冷回流冷凝器和加熱套的反應燒瓶中。用磁力攪拌棒攪拌該反應混合物，并在75℃加熱約7小時，冷卻。在大燒杯中加入丙酮(1400g)，并用磁力攪拌棒攪拌。用10分鐘時間加入前述制備的約40g反應溶液，產(chǎn)生固體沉淀，傾掉丙酮，再加入1460g丙酮，研磨該固體，與丙酮充分混合。用玻璃砂芯漏斗減壓過濾回收固體。用大量的丙酮洗滌固體，然后在減壓爐中于60-65℃干燥7小時?；厥盏郊s7.8g固體，質(zhì)子NMR表明它是DETA化合物所期異構體的混合物。
將去離子水(5.3g)，和4.0g按上述方法分離的固體加到燒杯中，用磁力攪拌器攪拌約3小時，此時，固體完全溶解，攪拌下加入溴乙酸(10.1g)，并在冰-水浴中使該混合物冷卻，用25%的NaOH溶液將該混合物的PH調(diào)至11左右，在加苛性堿期間應使溫度維持在20℃以下。除去冰-水浴，在35-40℃將該混合物攪拌50小時，在此期間定時加入25%NaOH溶液使PH保持在約10.5-11.5之間。將丙酮(240g)加到燒杯中，用磁力攪拌棒攪拌將約5g反應溶液加到丙酮中，產(chǎn)生固體沉淀。傾掉丙酮，再加入245g丙酮，混合，除去丙酮層，采用玻璃砂芯漏斗減壓過濾收集固體，用丙酮洗滌固體，然后在減壓爐中于55-60℃干燥數(shù)小時。得到約2.6g固體。(見表Ⅰ)。
實施例72-〔雙(2-｛〔雙(羧甲基)〕氨基｝乙基)氨基〕-2-〔5-氨基-2-(羧甲氧基)苯基〕乙醇酸和2-〔｛2-〔(2-〔雙(羧甲基)〕氨基｝乙基)(羧甲基)氨基〕乙基(羧甲基)氨基〕-2-〔5-氨基-2-(羧甲氧基)苯基〕乙醇酸的制備將按實施例6方法制備的376mg2-〔雙(2-｛〔(雙(羧甲基)〕氨基｝乙基)氨基〕-2-〔5-乙酰氨基-2-(羧基甲氧基)苯基〕乙醇酸和2-〔｛2-〔(2-｛〔雙(羧甲基)〕氨基｝乙基)(羧甲基)氨基〕乙基｝(羧甲基)氨基〕-2-〔5-乙酰氨基-2-(羧甲氧基)苯基〕乙醇酸溶解在1.0gD2O中，用5滴37%DCl處理。然后將該酸性溶液在80℃加熱2小時，此后，質(zhì)子NMR譜表明乙酰苯胺基團已全部轉(zhuǎn)化為苯胺基團和乙酸。在干冰丙酮浴中使該溶液凍結(jié)，冷凍過夜，得到淡棕色固體狀所期產(chǎn)物(見表Ⅰ)。
實施例82-〔｛2-〔(2-｛〔雙(羧甲基)〕氨基｝乙基)(羧甲基)氨基〕乙基｝(羧甲基)氨基〕-2-〔5-氨基-2-(羧甲氧基)苯基〕乙醇的制備將按實施例E方法制得的8.0g4-二亞乙基三胺乙酸溶解在40ml水中，然后在冰浴中將混合物冷卻。將6.08g(0.04moles)4-乙酰氨基苯酚和濃度為50%(w/w)的二羥乙酸(5.95g，0.04moles)的冷卻水溶液加到前述冷卻溶液中。在用冰浴將該漿液保持在20℃以下的同時，一次加入2.5ml50%(w/w)的氫氧化鈉。在PH8.75時將所得漿液緩慢升溫至80℃，在該溫度攪拌4.5小時，然后冷卻過夜。將該溶液減壓蒸發(fā)至約25ml體積，然后加到300ml丙酮中，從所得固體中傾掉丙酮，用丙酮將該固體洗數(shù)次，干燥，得到26.1g深色粘結(jié)固體產(chǎn)物。將26.05g該固體溶解在50ml水中，再將26.7g(0.192moles)溴乙酸溶解在該溶液中。用冰浴冷卻所得溶液，用50%(w/w)的NaOH將PH調(diào)至10.5，使其溫熱至室溫，然后加熱到46℃。在46℃，PH10.5(通過加入50%w/w NaOH溶液維持)下保溫23小時。然后在減壓下將體積減少至50ml。在劇烈攪拌下將濃縮后的溶液加到500ml丙酮中，靜置使沉淀物沉著。傾出丙酮，再加入400ml丙酮，劇烈攪拌，然后再傾掉丙酮。最后以相同的方法用100ml丙酮洗滌之。將該固體減壓干燥，得到52.55g易碎棕色固體。取2.00g該棕色固體，將其溶解在20ml水中，并用1.48g濃鹽酸處理之。將該溶液加熱到80℃，直到質(zhì)子NMR分析表明N-乙?；耆鉃橹埂Ｈ缓髮⒃撊芤豪鋬龈稍?，得到2.13g含有題目化合物的棕色固體。(見表Ⅰ)實施例92-〔(2-〔(2-〔(2-｛〔雙(羧甲基)〕氨基｝乙基)(羧甲基)氨基〕乙基)(羧甲基)氨基〕乙基)(羧甲基氨基〕-2-〔5-乙酰氨基-2-(羧甲氧基)苯基〕乙醇酸和2-〔(2-〔(2-｛〔雙(羧甲基)〕氨基｝乙基)(羧甲基)氨基〕乙基)(2-｛〔雙(羧甲基)〕氨基｝乙基)氨基〕-2-〔5-乙酰氨基-2-(羧甲氧基)苯基〕-乙醇酸的制備將去離子水(12.5g)，98%4-乙酰氨基苯酚(7.6g)，和50%的二羥乙酸水溶液(7.4g)加到燒杯中，并用冰-水浴冷卻之。用25%的NaOH溶液將混合物的PH調(diào)至3.6，同時將溫度維持在20℃以下。在將溫度保持在20℃以下的同時，加入線型三亞乙基四胺(7.2g)。加入三亞乙基四胺后，PH約為10.6。將該混合物移至裝有含溫度控制器的溫度計，水冷回流冷凝器和加熱套的反應燒瓶中。用磁力攪拌棒攪拌該反應混合物，并在80-83℃加熱4.5小時，然后冷卻。在燒杯中加入丙酮(175g)，用磁力攪拌棒攪拌，加入約12g反應溶液，產(chǎn)生油狀沉淀。傾出丙酮，再加入175g丙酮，繼續(xù)攪拌。除去丙酮，在減壓爐中于60-65℃將沉淀物干燥數(shù)小時。得到約3.1g固體。將該固體置于100g丙酮中制漿，充分混合，采用玻璃砂芯漏斗減壓過濾，然后再用250ml丙酮洗滌該固體，再在減壓爐中于60-65℃干燥約4小時?；厥盏郊s2.0g產(chǎn)物，質(zhì)子NMR表明是三亞乙基四胺異構體混合物。
將去離子水(2.0g)和1.86g上述固體產(chǎn)物加到燒杯中，攪拌1小時，此時，固體大部分溶解。攪拌下加入溴乙酸(5.0g)，然后在冰-水浴中冷卻。將混合物的PH調(diào)至約10.5，在定時加入25%NaOH溶液將PH維持10.5-11.5之間的同時，于35-40℃保溫47小時。在燒杯中加入丙酮(130g)，用磁力攪拌棒攪拌，將約10.8g反應溶液加到丙酮中，產(chǎn)生固體沉淀。傾出丙酮，再在沉淀中加入150g丙酮，混合，除去丙酮層，在減壓爐中于60-65℃將固體干燥數(shù)小時。得到約7.2g固體。(見表Ⅰ)
實施例102，6-雙｛〔雙(羧甲基)氨基〕羧甲基｝-4-乙酰氨基苯酚的制備將38.6g98%4-乙酰氨基苯酚，35.3g98%亞氨基二乙酸，150ml甲醇，38.5g50%二羥乙酸水溶液，30g去離子水加到燒杯中。在冰-水浴中將該混合物冷卻，同時用50%NaOH溶液將PH調(diào)至約9.4。在加入苛性堿的同時將溫度維持在30℃以下。將該混合物移至裝有水冷回流冷凝器，溫度計和加熱套的反應燒瓶中。將該反應混合物加熱至約74-76℃，監(jiān)測pH，并定時加入50%NaOH溶液將pH保持在8.7-9.5之間。將該混合物共加熱18小時。在此期間，加入約40g去離子水。經(jīng)冷卻后，用玻璃砂芯漏斗減壓過濾。在濾液中加入去離子水(75g)，并在環(huán)境溫度(約20-25℃)下減壓除去甲醇。將該溶液放置數(shù)小時，采用玻璃砂芯漏斗減壓過濾從溶液中除去沉淀固體。將約30g濾液和15g乙醚充分混合，然后分離醚層。采用15g和10g乙醚連續(xù)重復上述過程。用鹽酸水溶液將水層的pH調(diào)至0.5左右，于50-55℃減壓除去揮發(fā)物。收集到約13.5g固體，在該固體中加入甲醇(75g)，過濾除去不溶性鹽。減壓除去甲醇，將殘留固體在減壓爐中于70-75℃干燥數(shù)小時。質(zhì)子NMR分析表明仍含有一些無機鹽的產(chǎn)物主要是雙取代產(chǎn)物。(見表Ⅰ)
實施例112，6-雙｛〔(2-｛〔雙(羧甲基)〕氨基｝乙基)(羧甲基)〕氨基甲基｝-4-(乙酰氨基)苯酚的制備在冰浴中冷卻按實施例D方法制得的堿性乙二胺三乙酸三鈉鹽溶液，攪拌下加入鹽酸，使PH達13.8左右。加酸期間將溫度維持在35℃以下。于室溫下減壓除去揮發(fā)物，使殘留物達210g。采用玻璃砂芯漏斗減壓除去固體。將濾液移至裝有水冷回流冷凝器，磁力攪拌器，溫度計，控溫器，加熱套和加料漏斗的容量為250ml的園底燒瓶中。用鹽酸將PH調(diào)至11左右。在加酸期間將溫度維持在30℃以下。將該混合物加熱到約40℃，然后用35分鐘，從加料漏斗滴加11.6g37%的甲醛水溶液。將該反應混合物再攪拌加熱30分鐘，然后冷卻。用25%的NaOH溶液將該溶液的PH調(diào)至約9.8，移至加料漏斗中。將10.3g98%的4-乙酰氨基苯酚，25.2g去離子水，9.5g25%的NaOH溶液加到燒杯中，攪拌該混合物，直到完全溶解為止。將該溶液移至裝有前述設備的園底反應燒瓶中，加熱并攪拌。將該混合物加熱到約65℃，此時，用約1小時的時間滴加前述制得的甲醛合物溶液，將該反應在65℃再加熱攪拌12小時，然后冷卻。在燒杯中加入丙酮(150g)，用磁力攪拌棒攪拌之。將約10g粗制反應混合物加到丙酮中，產(chǎn)生油狀沉淀，傾掉丙酮，再將150g丙酮加到沉淀物中，混合，除去丙酮層。在減壓爐中于55-60℃將上述物質(zhì)干燥數(shù)小時。收集到約3.1g固體，將約165mg固體物溶解在微量水中，裝在Q-SepharoreTm(from Pharmacia Inc)柱(1.5cm×50cm乙酸鹽型)上，用0至1M的乙酸銨進行梯度洗脫，時間為2小時，速度為2ml/分。在300nm處有吸收。第三個主峰是產(chǎn)物。分離這一產(chǎn)物，凍干，得到36.4mg固體，其質(zhì)子和碳NMR，及快速原子轟擊質(zhì)譜均證實為2.6-雙｛〔(2-｛〔雙(羧甲基)〕氨基｝乙基)(羧甲基)〕氨基甲基｝-4-(乙酰氨基)苯酚。(見表Ⅰ)。
實施例122，6-雙｛〔(2-｛〔雙(羧甲基)〕氨基｝乙基)(羧甲基)〕氨基甲基｝-4-(氨基)苯酚的制備將264mg按實施例11方法制得的2，6-雙｛〔(2-｛〔雙(羧甲基)〕氨基｝乙基)(羧甲基)〕氨基甲基｝-4-(乙酰氨基)苯酚，置于5mm NMR管中，并將其溶解在D2O(0.5ml)和DCL(0.5ml，20%)的混合物中。將該NMR管短時置于熱水浴(85℃)中，用NMR監(jiān)測反應進度(乙酰氨甲基質(zhì)子消失，出現(xiàn)乙酸)。35分鐘后反應完成。將反應混合物凍干，得到深色固體狀胺的鹽酸鹽粗品。將該粗產(chǎn)物溶解在微量水中，并裝在Q-SepharoseTm柱(1.5cm×50cm，乙酸鹽型)上，用0至1M乙酸銨進行梯度洗脫，時間為3小時，速度為2ml/分。在300nm處有吸收，收集第三個主峰的產(chǎn)物，冷凍干燥，得到淡琥珀狀固體(122mg)，該固體是所期胺產(chǎn)物和氯化銨的混合物。通過質(zhì)子碳NMR和元素分析給該產(chǎn)物混合物定性。在Q-SepharoseTm柱(1.5cm×50cm，甲酸鹽型)上進一步純化含產(chǎn)物的鹽(n批合并共250mg)，用0至10%的甲酸洗脫，時間為4小時。在300nm處有吸收，第一主峰為所期產(chǎn)物，分離該產(chǎn)物，凍干，得到8.3mg白色結(jié)晶固體。通過質(zhì)子和碳NMR及快速原子轟擊質(zhì)譜確認結(jié)構。(見表Ⅰ)實施例132，6-雙｛〔(2-｛〔雙(羧甲基)〕氨基｝乙基)(羧甲基)〕氨基甲基｝-4-(硫代異氰酸基)苯酚將按實施例12制備的，含有2.6-雙｛〔(2-｛〔雙(羧甲基)〕氨基｝乙基)(羧甲基)〕氨基甲基｝-4-(氨基)苯酚和無機鹽(208mg，含15%NH4Cl)的產(chǎn)物溶解在少量水中，并使其通過SephadexTmG 10(pharmacia Inc)脫鹽柱(1cm×35cm)。用水洗脫無鹽胺，冷凍干燥(11.5mg)。將該胺溶解在水(10ml)中，并置于園底反應燒瓶中。加入溶解在二氯甲烷(1ml)中的二氯硫化碳(0.015ml，10當量)。將該反應混合物在室溫下攪拌1小時。然后用二氯甲烷將該混合物洗滌數(shù)次，以除去過量的二氯硫化碳，將水層冷凍干燥，得到硫代異氰酸產(chǎn)物粗品，通過快速原子轟擊質(zhì)譜確認其結(jié)構(見表Ⅰ)。
實施例142-(｛〔雙(羧甲基)〕氨基｝甲基)-4-(乙酰氨基)苯酚的制備將去離子水(35.3g)，35.3g98%亞氨基二乙酸(0.25mole)和29.9g50%氫氧化鈉水溶液加到裝有水冷回流冷凝器，機械攪拌器，帶有控溫器的溫度計和加料漏斗的園底反應燒瓶中。將該混合物加熱攪拌至55℃。將37%甲醛水溶液(21.5g)放入加料漏斗中，然后用15分鐘將其加到反應燒瓶中。將該反應混合物在55℃加熱約45分鐘，冷卻，移至加料漏斗中。將38.7g(0.25)mole)98%4-乙酰氨基苯酚，35.3g去離子水，12.2g50%氫氧化鈉水溶液加到裝有上述設備的園底燒瓶中。將該混合物加熱，攪拌至約65℃，用30分鐘加入甲醛-亞氨基二乙酸加合物溶液。將該反應混合物在65℃再加熱12小時，冷卻。加入濃鹽酸(55.5g)，并將該反應混合物攪拌1小時，然后將該溶液放置數(shù)周，濾出結(jié)晶沉淀，用去離子水洗滌，在減壓爐中于65℃干燥數(shù)小時。得到約17.4g固體，通過質(zhì)子NMR確認結(jié)構。(見表Ⅰ)實施例152-(｛〔雙(羧甲基)〕氨基｝甲基)-6-｛〔(雙(羧甲基)〕氨基｝乙基)(羧甲基)氨基〕甲基-4-(乙酰氨基)苯酚的制備將約5.7g2-氧-1，4-哌嗪二乙酸粗品(按實施例C方法制得)，38.6g去離子水加到燒杯中，充分混合直到已內(nèi)酰胺溶解。通過冰水浴冷卻將溫度維持在30℃以下的同時加入苛性堿溶液(13.5g，50%的NaOH溶液)。然后將該溶液移至玻璃管中，并將該管在90℃水浴中浸泡10分鐘，然后在冰水浴中冷卻。經(jīng)質(zhì)子NMR確認已內(nèi)酰胺轉(zhuǎn)化為乙二胺三乙酸三鈉鹽。然后加入鹽酸將該溶液的PH調(diào)至11.9。用冰水浴冷卻，將溫度維持在25℃以下。將該溶液移至反應器中，用20分鐘滴加1.5g37%的甲醛水溶液。在此期間，另加入少量苛性堿水溶液調(diào)節(jié)PH。將該混合物再攪拌1小時，同時定時加入氫氧化鈉水溶液以將PH維持在11.0-11.5之間。
將1.5g2-(〔雙(羧甲基)〕氨基 甲基)-4-(乙酰氨基)苯酚(按實施例12方法制得)，2.5g去離子水加到另一反應器中。在冰浴冷卻下加入25%NaOH水溶液將PH調(diào)至11左右。然后，在約30℃，用30分鐘的時間，將按上述方法制得的甲醛加合物溶液加到酚化合物中。將該反應混合物混合，再在70℃加熱10小時，然后冷卻。在燒杯中加入丙酮(100g)，并用磁力攪拌棒攪拌。將約10g反應混合物粗品加到丙酮中，產(chǎn)生膠狀沉淀。傾出丙酮，再在該物質(zhì)中加入50g丙酮，研磨丙酮中的產(chǎn)物。傾掉丙酮層，在減壓爐中于60-65℃將固體干燥數(shù)小時。使該將固體的水溶液通過Q-SepharoseTm柱，按實施例11方法分離所期洗脫物，借以從粗品混合物中分離出所期產(chǎn)物。(見表Ⅰ)實施例UN，N′-二(2-羥基，5-乙酰氨基芐基)乙二胺-N，N′-二乙酸的制備(對照)將乙二胺-N，N′-二乙酸(10g，0.056molc)，25g去離子水，7.0g50%的NaOH溶液，5.0g甲醇加到裝有水冷回流冷凝器，機械攪拌器，帶有控溫器的溫度計和加料漏斗的園底反應燒瓶中。將該反應混合物加熱到55℃，將37%的甲醛水溶液(9.2g，0.11mole)裝入加料漏斗中，然后用20分鐘加到反應物中。將該反應混合物在55℃加熱1小時，然后冷卻，并將共移至另一加料漏斗中。將17.2g4-乙酰氨基苯酚(0.11mole)，36g去離子水，2.0g50%的NaOH溶液，36g甲醇加到裝有前述設備的反應燒瓶中，將該混合物加熱到665℃，用1小時15分鐘的時間加入甲醛/乙二胺-N，N′-二乙酸加合物水溶液。將該反應混合物在64-65℃再加熱12小時。將一部分反應產(chǎn)物濃縮，減壓下除去甲醇，用鹽酸將溶液調(diào)至PH1.5-2.0，產(chǎn)生乙酰產(chǎn)物的沉淀。將該物質(zhì)過濾，用去離子水洗滌，在減壓爐中于55-60℃干燥數(shù)小時。通過質(zhì)子NMR確認其結(jié)構。
實施例VN，N′-二(2-羥基-5-氨基芐基)乙二胺-N，N′-二乙酸鹽酸鹽的制備(對照)將12.5g去離子水和8g濃鹽酸加到約0.9g實施例U分離出的產(chǎn)物中。將該溶液在園底反應燒瓶中加熱，攪拌，回流1小時。減壓除去揮發(fā)物，將產(chǎn)物胺鹽在減爐中于50-60℃干燥數(shù)小時。經(jīng)質(zhì)子NMR確認結(jié)構。
實施例W乙二胺二〔(2-羥基-5-乙酰氨基苯基)乙酸〕的制備(對照)將50%的二羥乙酸(30.0g，0.20mole)水溶液98%的4-乙酰氨基苯酚(30.9g，D·20mole)和去離子水(22g)加到裝有水冷回流冷凝器，機械攪拌器和帶有控溫器的溫度計的園底反應燒瓶中。用冰-水浴將該燒瓶冷卻，攪拌下慢慢地加入19.0g50%NaOH溶液，同時將溫度維持在30℃以下。在低于30℃下加入乙二胺(6.1g，0.10mole)。除去冰浴，在85-86℃將該反應混合物加熱攪拌5小時。用10g乙醚處理約20g含水反應產(chǎn)物，除去醚層，再重復處理一次。然后用鹽酸將含水部分調(diào)至約PH4.2，并加入35g丙酮攪拌之。除去丙酮層并丟棄之。在殘留物中加入65g甲醇，并攪拌。濾出所得固體，并在減壓爐中于55-60℃干燥數(shù)小時。
實施例X乙二胺二〔(2-羥基-5-氨基苯基)乙酸〕的制備(對照)將6g去離子水和21g濃鹽酸加到約4.5g上述固體中。將該混合物過濾，并加入6g水。將該溶液置于裝有水冷回流冷凝器，機械攪拌器和溫度計的園底反應燒瓶中。將該溶液在100-103℃加熱1小時，然后冷卻。減壓除去揮發(fā)物，將產(chǎn)物，乙二胺二(2-羥基-5-氨基苯基)乙酸鹽酸鹽，在減壓爐中于60℃干燥數(shù)小時。經(jīng)質(zhì)子NMR證實，乙酰官能度水解。
復合物的制備及百分復合物的測定在下列實施例中采用下列術語Conc·意為濃的;OAC意為乙酸殘基，OCOCH3;TLC意為薄層層析;環(huán)境溫度意為室溫或約20-25℃;過夜意為約9-18小時;SP-SephadexTmC-25樹脂是Pharmacia Inc出售的具有磺酸官能團的陽離子交換樹脂。
按照下述方法制得了幾種化合物的釔和/或釤復合物，并測定了百分復合量釔復合物的制備通過制備0.0003M釔水溶液(YCl3·6H2O，303.26g/mole;Y(DAc)3·12.1%H2O)制備復合物。加入放射活性的YCl3(Oakridge National Laboratories)得到所期的計數(shù)。將10μl配位體溶液(0.03M)加到990μl Y溶液中，使其配位體與金屬比為1∶1(如果要求配位體與金屬比為10∶1，則加入十倍量的配位體溶液)。用數(shù)毫升鹽酸或氫氧化鈉將PH調(diào)至7.4。然后采用下文所述陽離子交換法測定復合釔的量。
百分復合量的測定用1-2ml水-膨脹SephadexTmC-25陽離子交換樹酯填充可處理的10ml塑料(Biorad)柱。加壓使水洗脫至樹酯頂部。在樹酯頂部加上15μl復合物(或者，如果計數(shù)低加入量增加)。然后用2ml4∶1(V∶V)等滲鹽水濃NH4OH溶液洗脫，洗脫液滴入計數(shù)管。再加壓洗脫至樹酯的頂部，另加入2ml洗脫液，給該柱加壓洗脫，除去所有的液體。然后將干燥過的樹脂放在第三個計數(shù)管中。用連接在計算機上的Canbera多路分析儀通過NaI井計數(shù)器對上述3只管計數(shù)。用2個洗脫液計數(shù)除以洗脫液加柱的總計數(shù)，再×100，確定百分復合量。按此方法，未復合的釔仍在柱上。
釤復合物的制備/%復合量的測定按照前述制備釔復合物的方法制得了釤復合物，其不同之處在于將Sm2O3(348.7g/mole)溶于0.1M HCl中制得了0.0003M的釤。放射性Sm-153是得自University of Missouri Research Reartor，Columbia，Missouri，的溶于0.1M HCl中的0.0003M溶液。以與測定釔復合物相同的方法測定百分復合量。結(jié)果歸納于表Ⅱ。
實施例Ⅰ-ⅩⅤ及對照實施例A-F，雙官能度螯合物的體內(nèi)篩選某些稀土螯合物的穩(wěn)定性與動物體內(nèi)試驗有關。例如，Rosoff等在“International Journal of Applied Radiat-ion and Isotopes，”14，129-135(1963)中報導了鼠體內(nèi)某些氨基羧酸中放射性稀土螯合物的分布。該文指出在體內(nèi)“螯合劑與機體結(jié)構(有機或無機的)之間競爭稀土離子，確定其沉著和排泄”。據(jù)認為強稀土螯合物解離很少并被排泄掉，而弱和強度適中的螯合物很快解離，因此沉著于器官(如肝)中。但是，肝臟中放射性核素的濃度不是絕對取決于形成弱復合物，而在某些情況下是取決于金屬螯合物對肝臟的親合力(見表Ⅲ中對照實施例A & B)。事實上，巳有人制備了用于評價肝功能的化合物;Fritzberg，Alan R，RadiopharamceuticalsProgre ss and Clinical Perspectives 1，(1986);美國專利4，088，747號和4，091，088號(Hunt)et al)。
＊配位體/金屬比約為1∶1;
＊＊配位體/金屬比約為50∶1
測定了本文公開的幾種釤和/或釔螯合物的生物分布，以肝臟內(nèi)的百分劑量作為體內(nèi)篩選方法定量地評估螯合物的穩(wěn)定性。將NTA和EDTA螯合物作為對照物。另外注射氯化作為的未螯合形式。
從Charles River Laboratories購得體重為150至200g的Sprague-Dawley鼠。將這些動物置于籠內(nèi)，隨意進食進水。在使用前至少要使動物適應環(huán)境5天。在注射復合物前將動物置于熱燈泡下(15至30分鐘)以使尾靜脈擴張，然后將各動物置于限制籠中，并用酒精擦洗尾巴，通過尾靜脈給動物注射(50至200μl)。注射后，將動物在另一籠中放置2小時，此后，采用頸脫位法處死動物。將動物解剖，用去離子水漂洗各組織，輕拍去水，放入標出皮重的水瓶中。無論注射量多大，每一相同的材料至少制備3個標準品，對動物組織計數(shù)。百分劑量是標準品計數(shù)除以器官中的計數(shù)，再×100(見表Ⅲ)
＊實施例1-11，13，15;復合物的配位體/金屬比為10∶1;實施例12和14為1∶1;實施例C為5∶1;實施例D和E約為300∶1。
實施例ⅩⅤⅠ &和ⅩⅤⅠⅠ采用前述技術，制得了釔與下述配位體的1∶1復合物，所述配位體是1-(對氨基芐基)二亞乙基三胺五乙酸(ABDTPA)，(文獻采用的周知的雙官能度螯合劑)，及實施例2相應為實施例ⅩⅤⅠ)和實施例12(相應為實施例ⅩⅤⅡ)配位體。然后將它們分成100毫升的幾個等份裝入幾只離心管中。加入過量的金屬，以使總體積變化降至最低，并注意時間。加入金屬半小時后，采用SephadexTmC-25方法測定百分復合量，并將其與原復合物量相比較。加入金屬的百分復合量說明配位體-金屬復合物的易變性。所得結(jié)果如下，并與EDTA-釔復合物比較。
實施例ⅩⅧ在PH6.5，0.5M乙酸鈉緩沖溶液中制得了0.18M/L1-(對氨基芐基)二亞乙基三胺五乙酸(ABDTPA)溶液和同為0.18M/L的實施例12配位體溶液。然后，用1.5當量釔-90(0.03M/r氯化釔)處理上述溶液。所得復合物的PH為5-6。使該復合物通過1ml體積的ChelexTm樹酯(Bio-Rad Laboratories)床除去過量的Y-90。經(jīng)過純化的復合物濃度為0.0013M。將適量的該溶液加到含有1.7×109摩爾醛的CC-46單克隆抗體上，得到40∶1復合物-抗體。暴光1小時后，加入過量236摩爾(相對于抗體)NaCNBH3，將該溶液放置約1小時。此后，通過SephadexTmG-25膠過濾從未鍵合的復合物中分離出抗體(和任何以共價鍵連接的復合物)。該方法制得了每個抗體平均含5.0分子1-(對氨基芐基)-二亞乙基三胺五乙酸的復合物，和每個抗體平均含5.4分子實施例12配位體的復合物。
實施例ⅩⅨ為證實實施例ⅩⅤⅢ抗體-復合物結(jié)合物的惰性，按下列方法采用過量的二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)激發(fā)上述結(jié)合物。將經(jīng)過純化的抗體-復合物加到PH7.4的HEPES緩沖液(N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸)中，用適量的0.1DTPA溶液(PH7.4)處理之，以保證與連接到抗體上的復合物相比，DTPA的摩爾數(shù)過量1000倍。1小時后，移出一等份，并通過膠濾使抗體-復合物結(jié)合物與低分子物質(zhì)分開。結(jié)果表明ABDTPA系統(tǒng)失去大于98%的釔，而采用實施例12的配位體系統(tǒng)則失去約39%的釔。
實施例ⅩⅩ2，6-雙｛〔(2-｛〔雙(羧甲基)〕氨基｝乙基)(羧甲基)〕氨基甲基｝-4-(氨基)苯酚，復合物的制備在1ml的小瓶中，將放射153Sm(200μl 3×104M溶液，溶劑是0.1M HCl，6×105mmole)和“冷”SmCl3·6H2O(4.8mg，1.31×102mmole)合并，由此制得溶液。將該溶液加到由實施例11方法制得的2，6-雙〔(2-〔雙(羧甲基)〕氨基乙基)(羧甲基)〕氨基甲基-4-(乙酰氨基)苯酚(3.2mg，5.31×103mmole)中。然后，加入NaOH(40μl，1.0M溶液)將PH調(diào)至7。采用SephadexTmC-25方法測得百分復合量為68%。
采用陰離子交換層析(Q-SepharoseTm，1.5cm×21cm，0至1M NaCl洗脫，時間30分鐘，速度2ml/分，在285nm處檢測)，使上述復合物純化。合并含復合物的洗脫液(每份1ml，共6ml)，經(jīng)測定，百分復合量為95%。
實施例ⅩⅩⅠ2，6-雙｛〔(2-｛〔雙(羧甲基)〕氨基｝乙基)(羧甲基)〕氨基甲基｝-4-(氨基)苯酚，復合物與CC-46單克隆抗體結(jié)合。
將碳酸氫鈉(60mg，7.14×101mmole)置于1打蘭玻璃小瓶中，加入由實施例ⅩⅩ制得的復合物溶液(1ml，約8.8×104mmole)。加入置于氯仿(1ml)中的二氯硫化碳(10μl，1.31×101mmole)，并將該小瓶密封。將該混合物振蕩15分鐘，此后，用氯仿(每次1ml)將該水層洗滌兩次。經(jīng)測定百分復合量為96%。
將上述硫代異氰酸復合物(100μl，約8.8×105mmole)與CC-46單克隆抗體(100μl，8mg/ml溶液，約5.3×106mmole)混合，放置24小時。通過篩析色譜法測定結(jié)合在抗體上的復合物量為46%。
實施例ⅩⅫ2-〔雙(2-｛〔(雙(羧甲基)〕氨基｝乙基)氨基〕-2-〔5-氨基-2-(羧甲氧基)苯基〕乙醇酸和2-〔2-〔(2-｛〔雙(羧甲基)〕氨基｝乙基)(羧甲基)氨基〕乙基(羧甲基)氨基〕-2-〔5-氨基-2-(羧甲氧基)苯基〕乙醇酸，復合物的制備。
將266mg冷凍干燥的固體溶解在1ml水中，制成實施例7配位體的溶液。取出33.85μl該溶液，用1ml濃度為3×104M的SmCl3溶液溶劑是含有痕量放射性153Sm的0.1N HCl)處理前述溶液。用50(w/w)的NaOH溶液將該復合物溶液的PH調(diào)至13左右，然后再用1.0N HCl調(diào)至PH7.5左右。按實施例16至33所述方法測定，被復合的Sm百分含量為100%。
為證實復合物的惰性，將2個500μl等份的復合物溶液置于兩個小瓶中。用1-2μl0.1N HCl處理一個樣品直到PH降低為止，用0.1N NaOH處理另一樣品，以使其PH升高。在每個PH變化點，將該復合物放置5-10分鐘，然后將它們作為樣品，按照實施例16至33所述方法在該PH值測定其百分復合量。
實施例ⅩⅩⅢ2-〔｛2-〔(2-｛〔雙(羧甲基)〕氨基｝乙基)(羧甲基)氨基〕乙基｝(羧甲基)氨基〕-2-〔5-氨基-2-(羧甲氧基)苯基〕乙醇酸，復合物的制備將13.9mg帶棕色的固體溶解在772μl水中，制成實施例8配位體的溶液。將500μl該配位體溶液溶解在1ml事先用放射性153Sm處理過的濃度為3×104M的SmCl3溶液中(溶劑是0.1NHCl)，制得復合物。加入1.0NNaOH，將該復合物溶液調(diào)至pH7左右。按實施例16至33方法測得百分復合量為96%。
為證實該復合物的惰性，將2個500μl等份的復合物溶液分置于小瓶中。用1-2μl1.0NHCl處理其中的一份，直到PH降低為止，用0.1N，1.0N和50%(w/w)NaOH處理另一份，以使PH上升。在每一PH變化點將該復合物放置約5分鐘，然后將它們作為樣品，按實施例16至33方法測定百分復合量。結(jié)果列于下表。
生物分布數(shù)據(jù)實施例將配位體和金屬溶液混合，然后調(diào)至PH7-8，由此制得復合物。采用陽離子交換層析法確定復合于配位體上的金屬量。游離金屬留在樹酯上，而復合物金屬則不會留下。
給3只Sprague Dawley鼠經(jīng)尾靜脈注射100μl復合物，注射后兩小時，采用頸脫臼法處死大鼠，采集組織樣品，將該組織稱重，采用NaI井計數(shù)儀測定每一組織的放射量，并將它們與標準品比較，按照血液重量占動物體重6.5%測定血液中的百分劑量。肌肉占體重46%，骨骼中的量是股骨中百分劑量的25倍。下列實施例的不同之處在于配位體，配位體的量和所采用的金屬量。采用非放射性金屬得到所期望的配位體/金屬比，采用痕量放射性金屬得到生物分布。
實施例ⅩⅩⅣ將實施例10的配位體與Sm-153溶液混合。Sm的濃度是3×104M，所采用的配位體過量300倍摩爾。生物分布表明骨骼中52.7%，肝臟中0.12%，脾臟中0.005%，肌肉中0.23%，血液中0.05%。
實施例ⅩⅩⅤ將實施例10配位體與Ho-166復合。Ho的濃度是3×104M，制劑中含有過量300倍摩爾的配位體。生物分布表明骨骼中52.9%，肝臟中0.26%，脾臟中0.007%，肌肉中1.1%，血液中0.09%。
實施例ⅩⅩⅥ將實施例10配位體與Sm-153復合，所采用Sm的濃度是3×104M，配位體過量10倍摩爾。生物分布表明骨骼中48.5%，肝臟中1.3%，脾臟中0.01%，肌肉中0.73%，血液中0.18%。
實施例ⅩⅩⅦ按照與大鼠相同的方法，給兔子注射含有Y-90(Y濃度為3×104M)，實施例10配位體(摩爾量過量10倍)的制劑。測定其活性表明最小吸收為骨骼中59%，肝臟中1.1%，脾臟中0.19%，肌肉中1.5%，血液中0.68%。
實施例ⅩⅩⅧ將實施例1配位體與劑量的Y-90復合。Y濃度是3×104M加入的配位體摩爾過量10倍。大鼠生物分布(兩只大鼠的平均值)表明骨骼中56.1%，肝臟中0.87%，脾臟中0.03%，肌肉中0.78%，血液中0.57%。
實施例ⅩⅩⅨ采用在右側(cè)鄰近骨處患有骨肉瘤，并且行走有明顯殘疾的狗。采用實施例10配位體和Sm-153溶液制備復合物。Sm的濃度是3×104M，所采用的配位體過量300倍摩爾。Sm-153的放射性比度是30mCi/ml。按照每公斤體重0.95mCi Sm-153的劑量給狗靜脈注射這一復合物。注射1星期后，狗的步態(tài)明顯改善。
權利要求
1.一種制備式(IA)所示的具有鄰位絡合官能度的雙官能配位體配合物或其藥物上可接受的鹽的方法
式中Z為氨基、硫代異氰酸基、氨基脲、硫代氨基脲、羧基、溴代乙酰氨基或馬來酰亞胺基；X為氫、C1-C3烷基或CR3R4COOH；R1、R2、R3和R4各自獨立為氫、羥基、CO2H，或C1-C3烷基；R5是氫或(CR1R2)nCR3R4B；B是線型或支鏈胺或聚亞烷基胺，上述胺中至少有一個氨基氫被CR3R4COOH基團取代；條件是當n=0和R5為氫時，則R3或R4中的一個基團必須是CO2H；n為0或1；和M為選自La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Y或Sc；該法包括將具有式(Ⅰ)的化合物
式中各基團定義如上所述；與金屬離子M進行反應。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其中n為0。
3.根據(jù)權利要求1的方法，其中R4為CO2H。
4.根據(jù)權利要求1的方法，其中X為氫。
5.根據(jù)權利要求1的方法，其中R1、R2和R3各自為氫。
6.制備權利要求1的配合物的方法，其中金屬離子為153Sm、166Ho、90Y、149Pm、159Gd、140La、177Lu、175Yb、47Sc或142Pr。
7.根據(jù)權利要求1的方法，其中該配位體為2-[(2-｛(雙(羧甲基)氨基｝乙基)氨基]-2-(5-乙酰氨基-2-羥苯基)乙醇酸。
8.根據(jù)權利要求1的方法，其中該配位體為2-[(2-｛(雙(羧甲基)]氨基｝乙基)-(羧甲基)氨基]-2-[5-乙酰氨基-2-(羧甲氧基)-苯基]乙醇酸。
9.根據(jù)權利要求1的方法，其中該配位體為2-[(2-｛(雙(羧甲基)]氨基｝乙基)-(羧甲基)氨基]-2-[5-氨基-2-(羧甲氧基)-苯基]乙醇酸。
10.根據(jù)權利要求1的方法，其中該配位體為2-[(2-｛(雙(羧甲基)]氨基｝乙基)-(羧甲基)氨基]-2-(5-氨基-2-羥苯基)乙醇酸。
11.根據(jù)權利要求1的方法，其中該配位體為2-[雙(2-｛[(雙(羧甲基)]氨基｝乙基)氨基]-2-[5-乙酰氨基-2-(羧甲氧基)苯基]乙醇酸。
12.根據(jù)權利要求1的方法，其中該配位體為2-[｛2-[(2-｛[雙(羧甲基)]氨基｝乙基)-(羧甲基)-氨基]乙基｝(羧甲基)氨基]-2-[5-乙酰氨基-2-(羧甲氧基)-苯基]乙醇酸。
13.根據(jù)權利要求1的方法，其中該配位體為2-[雙(2-｛(雙(羧甲基)]氨基｝乙基)氨基]-2-[5-氨基-2-(羧甲氧基)-苯基]乙醇酸。
14.根據(jù)權利要求1的方法，其中該配位體為2-[｛2-｛[雙(羧甲基)]氨基｝乙基)-(羧甲基)氨基]乙基｝(羧甲基)氨基]-2-[5-氨基-2-(羧甲氧基)-苯基]乙醇酸。
15.根據(jù)權利要求1的方法，其中該配位體為2-[｛2-[(2-｛[雙-(羧甲基)]氨基｝乙基)-(羧甲基)氨基]乙基｝(羧甲基)氨基]-2-[5-氨基-2-(羧甲氧基)苯基]乙醇酸。
16.根據(jù)權利要求1的方法，其中該配位體為2-[(2-[(2-[(2-｛[雙-(羧甲基)]氨基｝乙基)-(羧甲基)氨基]乙基)(羧甲基)氨基]乙基)-(羧甲基)氨基]-2-[5-乙酰氨基-2-(羧甲氧基)-苯基]乙醇酸。
17.根據(jù)權利要求1的方法，其中該配位體為2-[(2-[(2-｛[雙-(羧甲基)]氨基｝乙基)-(羧甲基)氨基]乙基)(2-｛[雙-(羧甲基)]-氨基｝乙基)氨基]-2-[5-乙酰氨基-2-(羧甲氧基)-苯基]乙醇酸。
18.根據(jù)權利要求1的方法，其中該配位體為2，6-雙｛(雙-(羧甲基)氨基)-(羧基)甲基｝-4-(乙酰氨基)苯酚。
19.根據(jù)權利要求1的方法，其中該配位體為2，6-雙｛[(2-｛[2-｛[雙(羧甲基)]氨基｝乙基)-(羧甲基)]氨基甲基｝-4-(乙酰氨基)苯酚。
20.根據(jù)權利要求1的方法，其中該配位體為2，6-雙｛[(2-｛[雙-(羧甲基)]氨基｝乙基)-(羧甲基)]氨基甲基｝-4-(氨基)苯酚。
21.根據(jù)權利要求1的方法，其中該配位體為2，6-雙｛[(2-｛[雙(羧甲基)]氨基｝乙基)-(羧甲基)]氨基甲基｝-4-(硫代異氰酸基)苯酚。
22.根據(jù)權利要求1的方法，其中該配位體為2-(｛[雙-(羧甲基)]-氨基｝甲基)-6-｛[(｛[雙｛羧甲基)氨基｝乙基)(羧甲基)氨基]甲基｝-4-(乙酰氨基)苯酚。
23.根據(jù)權利要求1的方法，其中該配位體為2-(｛[雙(羧甲基)]氨基｝甲基)-6-｛[(｛[雙(羧甲基)]氨基｝乙基)(羧甲基)]-氨基｝甲基｝-4-乙酰氨基)苯酚。
24.一種制備共軛物的方法，該共軛物包括以共價鍵通過Z基團與抗體或抗體片段連接的權利要求1或6的配合物，該方法的特征在于將該配合物與抗體或抗體片段進行反應。
25.一種制備權利要求24的共軛物的方法，其中該抗體或抗體片段為單克隆抗體或其片段。
26.一種制備權利要求24的共軛物的方法，其中該抗體或抗體片段為CC-46、CC-49、CC-49F(ab′)2、CC-83、CC-83F(ab′)2或B72.3。
27.一種制備包括權利要求1或6的配合物的藥物制劑的方法，該方法的特征在于將該配合物與生理上可接受的載體進行混合。
28.一種制備包括權利要求24至26中的任何一項權利要求的共軛物的藥物制劑的方法，該方法的特征在于將該共軛物與生理上可接受的載體進行混合。
全文摘要
本發(fā)明公開了具有鄰位絡合官能度的官能化胺配合劑的制備方法，該螯合劑與稀土金屬離子形成復合物。該復合物可以以共價鍵與抗體或抗體片段連接，并用于治療和/或診斷目的。另外，在組合中可使用某些螯合劑-放射性核素復合物用作鈣化瘤和/或緩解骨痛的治療劑和/或診斷劑。
文檔編號C07C255/25GK1090286SQ9311888
公開日1994年8月3日 申請日期1993年10月21日 優(yōu)先權日1988年10月31日
發(fā)明者戴維·A·威爾遜, 約瑟夫·R·加里希, 理查德·K·弗蘭克, 肯尼思·麥米蘭, 賈米·西蒙 申請人:唐化學原料公司