專利名稱：用作造影劑的2-吡啶基亞甲基多氮雜大環(huán)膦酸及其絡合物和衍生物的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及在磁共振成像(MRI)中用作造影劑的配位體2—吡啶基亞甲基多氮雜大環(huán)膦酸及其絡合物和衍生物。為了更好地理解本發(fā)明，在下述部分提供了有關(guān)MRI的簡要背景。
MRI是一種非侵襲性診斷技術(shù)，其可在動物體內(nèi)，尤其在人體內(nèi)形成軟組織的高分辨截面像。此技術(shù)基于特定原子核(例如水質(zhì)子)的性質(zhì)，該原子核具有一種在外加磁場中排列的磁矩〔由數(shù)學等式定義；見G.M.Barrow，Physical Chemistry，3rd Ed.，McGraw—Hill，NY(1973)〕。一旦排列后，這一平衡態(tài)可通過施加一個外部射頻(RF)脈沖而被破壞，射頻脈沖使質(zhì)子傾斜出磁場的排列。當RF脈沖終止后，核返回到其平衡態(tài)，發(fā)生此過程所需的時間稱為馳豫時間。弛豫時間由兩個參數(shù)組成，即自旋—晶格(T1)和自旋—自旋(T2)弛豫。正是這些弛豫的數(shù)值提供了有關(guān)分子組織的程度和質(zhì)子與周圍環(huán)境相互作用的信息。
由于活組織的水分含量很大，并且在組織類型中存在含量和環(huán)境的差異，所獲得的生物組織的診斷性成像反映了質(zhì)子密度和弛豫時間。被檢組織中質(zhì)子的弛豫時間(T1和T2)差異越大，所獲得圖像的對比度越大〔例如，J.Magnetic Resonance 33，83—106(1979)〕。
已知具有對稱電子基態(tài)的順磁螯合物可大大影響并置水質(zhì)子的T1和T2弛豫率，并且螯合物的這一效應部分與產(chǎn)生磁矩的不成對電子的數(shù)目有關(guān)〔例如，Magnetic Resonance Annual，231—266，Raven Press，NY(1985)〕。而且也已知了當將這種順磁螯合物給予活動物時，其對不同組織的T1和T2的影響可在磁共振(MR)成像中直接觀察到，而且在螯合物定位區(qū)域觀察到對比度增加。因此已建議可給予動物穩(wěn)定的、無毒的順磁螯合物，從而增加通過MRI所獲得的診斷性信息〔例如，F(xiàn)rontiers of Biol.Energetics 1，752—759(1978)；J.Nucl.Med.25，506—513(1984)；Proc.of NMR Imaging Symp.(Oct.26—27，1980)；F.A.Cotton et al.，Adv.Inorg.Chem.634—639(1966)〕。以此方式使用的順磁金屬螯合物稱為造影增強劑或造影劑。
當進行MRI造影劑的設計時，可考慮許多順磁金屬離子。但實際上，最有用的順磁金屬離子有釓(Gd+3)，鐵(Fe+3)，錳(Mn+3)和(Mn+2)，以及鉻(Cr+1)，因為這些離子可通過其大的磁矩對水質(zhì)子施加最大的效應。如果以非絡合的形式(如GdCl3)存在，這些金屬對動物體有毒，因此避免使用其簡單鹽形式。所以，有機螯合劑(也稱配位體)的一個基本作用是使順磁金屬對動物體無毒，同時保持其對周圍水質(zhì)子的T1和T2弛豫率的適當影響。
MRI領域的現(xiàn)有技術(shù)很廣泛，下列概要，不意在盡數(shù)，僅提供本領域的概述和其它結(jié)構(gòu)上可能類似的化合物。美國專利4,899,755公開了一種使用Fe+3—亞乙基—二(2—羥基苯基甘氨酸)絡合物及其衍生物來改變動物體肝或膽小管中質(zhì)子NMR弛豫時間的方法，并且表明在各種其它化合物中，可能使用的為吡啶大環(huán)亞甲基羧酸。美國專利4,880,008(美國專利4,899,755的部分繼續(xù)申請)公開了大鼠肝組織的另一些成像數(shù)據(jù)，但是沒有指出任何別的絡合物。美國專利4,980,148公開了用于MRI的釓絡合物，其為無環(huán)化合物。C.J.Broan等〔J.Chem.Soc.，Chem.Commun.，1739—1741(1990)〕描述了一些雙官能大環(huán)膦酸化合物。C.J.Broan等〔J.Chem.Soc.，Chem.Commun.，1738—1739(1990)〕描述了三氮雜雙環(huán)化合物。L.K.Adzamli等〔J.Med.Chem.32，139—144(1989)〕描述了用于NMR成像的釓絡合物的無環(huán)膦酸衍生物。
目前，美國市售的唯一造影劑是釓與二亞乙基三胺五乙酸的絡合物(Schering的DTPA—GD+3—MegnevistTM)和DO3A衍生物〔1，4，7—三(羧甲基)—10—(2—羥丙基)-，4，7，10—四氮雜環(huán)十二烷〕釓(Squibb的ProhanceTM)。MegnevistTM和ProhanceTM被認為是非特異性/灌注劑，因為其可自由分布在細胞外液，隨后通過腎臟系統(tǒng)而被有效地消除。已證明MegnevistTM在腦損傷的診斷中特別有用，因為伴隨而來的血腦屏障的崩潰使造影劑可灌注到受損區(qū)域。除了MegnevistTM以外，Guerbet為市售的一種大環(huán)灌注劑〔1，4，7，10—四(羧甲基)—1，4，7，10—四氮雜環(huán)十二烷〕釓(DotaremTM)，它僅在歐洲有售。ProhanceTM比MegnevistTM的副作用小。許多其它潛在的造影劑正處于不同的發(fā)展階段。
本發(fā)明涉及新的配位體，其為通式(I)的2—吡啶基亞甲基多氮雜大環(huán)化合物及其衍生物，或其藥學上可接受的鹽 其中T獨立地為—CH2—COOH， 其中R是OH，C1—C5烷基或—O—(C1—C5烷基)；R1是OH或OCH3；R2是NO2，NH2，異硫氰酸根合，脲氨基，硫脲氨基，馬來酰亞氨基，溴乙酰氨基或羧基；條件是僅有一個T殘基是 其中R1和R2如前定義。
當上述通式(I)的配位體中所有T等于P(O)ROH，其中R是OH，或者其藥學上可接受的鹽時，該配位體稱為PD3P
所有T等于COOH，或者其藥學上可接受的鹽時，此配位體稱為PD3A；所有T等于P(O)ROH，其中R是—O—(C1—C5烷基)，或者其藥學上可接受的鹽時，該配位體稱為PD3(O—Alk)P；和所有T等于P(O)ROH，其中R是C1—C5烷基，或者其藥學上可接受的鹽時，此配位體稱為PD3(Alk)P。
本發(fā)明的絡合物可設計成為具有特定的總電荷，以有利地影響體內(nèi)生物定位和成像對比度。例如，當金屬離子為+3時，可得到下列通式(I)是PD3P時，總電荷為—3，其可用作鈣化組織造影劑；通式(I)具有兩個等于—CH2—PO3H2的T以及一個T具有COOH時，總電荷為-2，其可用作鈣化組織造影劑；通式(I)具有一個等于—CH2—PO3H2的T以及另一個T具有COOH時，總電荷為-1，其可用作鈣化組織造影劑；通式(I)具有一個等于—CH2—PO3HR的T，其中R為是—O—(C1—C5烷基)或C1—C5烷基，以及兩個T具有COOH；或者所有三個T等于—CH2—PO3HR，其中R是—O—(C1—C5烷基)或C1—C5烷基；或者所有三個T等于—CH2—COOH(PD3A)時，總電荷為0，其可用作全身灌注、血液、大腦或肝造影劑。
該絡合物可制成可對動物給藥的一種藥學上可接受的形式。
當一個T是
R1和R2如前所定義時，該化合物為雙官能配位體/絡合物，并可通過R2連接一個生物活性分子。
通式(I)化合物為了命名的目的而編號為 本發(fā)明的一個方面是關(guān)于通過對順磁螯合物進行合成修飾，開發(fā)能位點特異性地釋放造影劑到預計組織的造影劑。其優(yōu)點是，與非特異性灌注產(chǎn)生的對比度相比，基于組織親和性的有關(guān)區(qū)域的對比度提高，其中非特異性灌注可對胞外試劑明顯或不明顯。通式(I)配位體的特異性可通過調(diào)節(jié)總電荷和絡合物的親脂性來控制。該絡合物電荷的總體范圍為如上所述的-3至0。例如，對于具有3個PO3H2基團(PD3P)的絡合物而言，總電荷為高負性，預計骨骼可吸收；而當總電荷是0(中性，PD3A，PD3(O—Alk)P和PD3(Alk)P)，絡合物具有穿過血腦屏障的能力，正常大腦吸收是可能的。出乎意料地，對于總電荷為0的〔PD3(O—Pr)P〕絡合物而言，該絡合物表現(xiàn)出肝吸收。
雖不意于被理論所限制，但確信當本發(fā)明帶電的絡合物制成后(例如，可能-3對骨骼，-1對肝，+1對心臟)，螯合物離子帶電的不同會影響生物定位。
螯合物通過離子或共價連接到具有對目的靶組織具有特異性的天然或合成分子(例如通過R2)上而實現(xiàn)組織特異性。這一方法的一種可能應用是通過螯合物偶聯(lián)的單克隆抗體的使用，該抗體可將順磁螯合物轉(zhuǎn)運到患病組織，從而可通過MRI顯示。此外，將順磁螯合物連接到大分子上可進一步提高造影劑的效果，從而得到相對于游離螯合物改良的對比度。Lauffer最近的工作(美國專利4,880,008和4,899,755)證實，親脂性的變化可產(chǎn)生組織特異性藥劑，并且也證實了增加親脂性有利于與血蛋白的非共價相互作用，導致弛豫率提高。
具有非配位N—取代基的典型DO3A衍生物可產(chǎn)生中性鑭系元素螯合物，但是已發(fā)現(xiàn)其在酸條件下動力學不穩(wěn)定。DO3A衍生物PROHANCETM由于一個側(cè)鏈羥基而使動力學穩(wěn)定性提高，該側(cè)鏈羥基可與金屬離子配位，但是可能改變總的螯合離子性質(zhì)。
相比之下，本發(fā)明涉及通式(I)的一組DO3A衍生物，其具有一個可形成配位鍵但不改變總的螯合離子性質(zhì)的2—吡啶側(cè)基。此外，已發(fā)現(xiàn)2—吡啶取代基可增加螯合物在酸條件下(pH低于7)的動力學穩(wěn)定性。本發(fā)明的螯合物，其中配位部分為PO3HR，其中R是—O—(C1—C5烷基)，已證實其作為肝造影劑的潛力。
通式(I)和本發(fā)明中所用術(shù)語進一步定義為下“C1—C5烷基”，包括直鏈和支鏈烷基。
“動物”包括溫血哺乳動物，優(yōu)選人。
“絡合物”是指本發(fā)明化合物如通式(I)化合物與金屬離子絡合形成的絡合物，其中至少一個金屬原子被螯合。
“生物學活性物質(zhì)”是指葡聚糖，肽或?qū)κ荏w具有特異親和力的分子，或者優(yōu)選抗體或抗體片段。
“抗體”是指任何多克隆、單克隆、嵌合抗體或雜合抗體，優(yōu)選單克隆抗體；“抗體片段”包括Fab片段和F(ab′)2片段，和對目的抗原決定簇具有特異性的任何抗體部分。當使用“放射性金屬螯合物/抗體偶聯(lián)物”或“偶聯(lián)物”時，“抗體”意在包括整個抗體和/或抗體片段，包括半合成的或者其基因工程變體?？赡艿目贵w是1116—NS—19—9(抗結(jié)腸直腸癌)，1116—NS—3d(抗CEA)，703D4(抗人肺癌)，704A1(抗人肺癌)，CC49，CC83和B72.3。保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中的(American Type Culture Collection)的雜交瘤細胞系1116—NS—19—9，1116—NS—3d，703D4，704A1，CC49，CC83和B72.3，保藏號分別為ATCC HB8059，ATCCCRL 8019，ATCC HB 8301，ATCC HB 8302，ATCC HB 9459，ATCC HB 9453和ATCC HB 8108。
本文所述的雙官能螯合劑〔由通式(I)代表〕可用以螯合金屬離子以形成金屬離子螯合物(本文中也稱為“絡合物”)。由于存在官能化殘基〔由通式(I)的R2代表〕，該絡合物可共價連接到生物活性物質(zhì)上，例如葡聚糖，具有受體特異親和性的分子，或者優(yōu)選共價連接到抗體或抗體片段上。因此，本文所述的絡合物可以共價連接到一個抗體或抗體片段上或者其對受體具有特異親和性，并且在本文中稱為“偶聯(lián)物”。
本文中所用的“藥學上可接受的鹽”意指任何通式(I)化合物的鹽或鹽的混合物，其足夠無毒可用于動物的診斷，尤其是哺乳動物。例如這些鹽可用于本發(fā)明。從下列有機和無機酸通過標準反應形成具有代表性的鹽，包括，例如硫酸、鹽酸、磷酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、乳酸、馬來酸、富馬酸、棕櫚酸、膽酸、palmoic、粘酸、谷氨酸、葡糖酸、d—樟腦酸、戊二酸、乙醇酸、苯二甲酸、酒石酸、甲酸、月桂酸、steric、水楊酸、甲磺酸、苯磺酸、山梨酸、苦味酸、苯甲酸、肉桂酸和其它適宜的酸。同時也包括從下列有機和無機物通過標準反應形成的鹽，例如銨或1—脫氧—1—(甲基氨基)—D—glucitol，堿金屬離子，堿土金屬離子以及其它類似離子。特別優(yōu)選的是通式(I)化合物的鹽，其中該鹽為鉀、鈉或鋁鹽。同時也包括以上鹽的混合物。
通式(I)化合物可通過各種途徑制備。下述反應方案提供了這些途徑的典型的一般合成方法。
這些方案中所示的通式(II)的起始物通過1，4，7，10—四氮雜環(huán)十二烷(“cyclen”)與2—氯甲基吡啶在室溫下于惰性有機溶劑如氯仿中烷基化制備而得。
方案1中，制備了通式(I)化合物，其中所有的T為—CH2—COOH。
方案1 堿水溶液為堿金屬的氫氧化物，例如氫氧化鈉或氫氧化鉀。反應的pH值保持在約8—12。溫度為約60—90℃之間。壓力并不關(guān)鍵，常壓即可。
方案2中，制備了通式(I)化合物，其中所有的T為 方案2中的水解是通過在已知的酸水溶液條件下完成的，例如使用3到12M的鹽酸。反應pH值維持在低于3。溫度為回流溫度。壓力并不關(guān)鍵，常壓即可。或者，當反應一步完成時，使用磷酸、鹽酸和過量的甲醛。反應的pH值低于2。溫度為回流溫度。壓力并不關(guān)鍵，常壓即可。
方案3中，制備了通式(I)化合物，其中所有T為 其中R是—O—(C1—C5烷基)。
方案3 其中R是—O—(C1—C5烷基)。
方案3中的水解是通過在已知的堿水溶液條件下完成的，例如使用過量的堿金屬氫氧化物，例如氫氧化鈉或氫氧化鉀。反應的pH值高于9。溫度為回流溫度。壓力并不關(guān)鍵，常壓即可。
方案4中，制備了通式(I)化合物，其中所有T為 其中R為C1—C5烷基。方案4表明了當R為甲基的通式(I)化合物的制備。
方案4 方案4中的水解是通過在已知的堿水溶液條件下完成的，例如使用過量的堿金屬氫氧化物，如氫氧化鈉或氫氧化鉀。反應的pH值高于9。溫度為回流溫度。壓力并不關(guān)鍵，常壓即可。
方案5表明了當R為乙基的通式(I)化合物的制備。
方案5
方案5中的反應是在鹽酸的酸條件下完成的。反應的pH值低于3。溫度為回流溫度。壓力并不關(guān)鍵，常壓即可方案6表明了當T具有一個雙官能殘基時通式(I)化合物的制備。
方案6(續(xù))
方案7中表明了當一個T為PO3HR，其中R如通式(I)所定義，并且其它兩個T是COOH的通式(I)化合物的制備。
方案7
方案7中的水解步驟通過前述方案所述來進行。甲醛/亞硫酸氫鹽加成復合反應在含水堿性條件下完成，以在4，10—位選擇性烷基化。膦酸基選擇性引入到7—位。
上述方案中，總過程的描述闡明了可用以完成預計反應步驟的特異步驟。這些方法步驟的概述如下。
方案1中所描述的羧酸衍生物是通過常規(guī)的烷基化步驟利用氯代或溴代乙酸在堿水溶液條件下制備的。
方案2中所描述的膦酸衍生物可通過胺先與亞磷酸三烷酯及多聚甲醛的烷基化，得到一種有機可溶性全酯。該酯然后在回流酸條件下水解而得預計的氨基膦酸。或者，該膦酸可在酸條件下通過使用亞磷酸和甲醛與鹽酸制備而得。
膦酸半酯可按照方案3制備，先生成膦酸二烷基酯，隨后在堿條件下水解制備而得。堿水解后完全轉(zhuǎn)化為半酯。
方案4闡述了利用二乙氧基甲基膦作為親核試劑以及多聚甲醛來合成甲基次膦酸衍生物的方法。在例如四氫呋喃(THF)、二甲基甲酰胺(DMF)、二噁烷、乙腈或醇溶劑中進行縮合。所得次膦酸酯然后在酸條件下(例如6N HCl，80—100C)或堿條件下(過量堿，40—100℃)水解而得到相應的甲基次膦酸?；蛘?，如方案5所述，使用由A.D.Sherry等(Inorg.Chem.，submitted 1991)設計的利用就地形成的乙基膦酸的方法來獲得具有增加了親脂性的次膦酸衍生物。
方案6闡述了通式(I)雙官能化合物的制備，其接著可連接到一個生物活性的物質(zhì)上。
方案7描述了一種利用甲醛/亞硫酸氫鹽加成物進行4，10—位選擇性烷基化的一般步驟。所得中間體轉(zhuǎn)化為相應的腈，隨后在7—位引入膦酸酯部分。酸或堿水解得到相應的水解終產(chǎn)物。
用以形成本發(fā)明絡合物的金屬離子是Gd+3，Mn+2，F(xiàn)e+3，可購得，例如從Aldrich化學公司。存在的陰離子為鹵離子，優(yōu)選氯離子或者為游離鹽(金屬氧化物)。
本發(fā)明的“順磁核素”意指一種具有自旋角動量和/或軌道角動量的金屬離子。這兩種類型的動量聯(lián)合而得到可觀測的順磁矩，其在很大程度上依賴于具有未成對電子的原子，并且稍少程度上依賴于該原子的環(huán)境。發(fā)現(xiàn)可用于實現(xiàn)本發(fā)明的順磁核素有釓(Gd+3)，鐵(Fe+3)和錳(Mn+2)，優(yōu)選Gd+3。
絡合物通過本領域熟知的方法制備。例如，見ChelatingAgents and Metal Chelates，Dwyer & Mellor，Academic Press(1964)，第7章。制備氨基酸的方法也見Synthetic Productionand Utilization of Amino Acid，(Kameko等編)John Wiley &Sons(1974)。
制備絡合物的一個實例包括將雙環(huán)聚氮雜大環(huán)膦酸與金屬離子在pH值5—7的含水條件下反應。所形成的絡合物通過化學鍵連接，并且得到的是一個穩(wěn)定的順磁核素組合物，例如對順磁核素從配位體解離是穩(wěn)定的。
本發(fā)明絡合物以配位體與金屬的摩爾比至少約1∶1，優(yōu)選從1∶1到1∶3，更優(yōu)選1∶1到1.5∶1的比例給藥。太過量的配位體是不可取的，因為未絡合的配位體可能對動物有毒或者可導致心博停止或血鈣過少性驚厥。
本發(fā)明是與生理上可接受的載體和賦形劑一起使用的。制備這樣的制劑的方法是熟知的。該制劑可以為懸浮液、注射用溶液或其它適當?shù)闹苿┬问?。可使用生理上可接受的懸浮介質(zhì)，使用或者不用佐劑。
一種“有效量”的制劑可用于診斷。劑量依動物的疾病和體格參數(shù)，例如體重的不同而不同。使用本發(fā)明的制劑也考慮體內(nèi)診斷學。
本發(fā)明的一些螯合劑的其它用途包括從體內(nèi)消除不需要的金屬(如鐵)，為了不同目的(例如作為診斷劑)而連接到聚合物載體上，以及通過選擇性提取而除去金屬離子。具有至少兩個以R表示的T等于—CH2—P(O)R1OH的通式(I)配位體可用作金屬離子對照的標準抑制劑(scale inhibitors)。一些這樣的配位體可以少于化學計量的數(shù)量使用。在美國專利2,609,390；3,331,773；3,336,221和3,434,969中所描述的化合物已知有類似的用法。
本發(fā)明通過下述實施例將進一步闡明，這些實施例只是作為本發(fā)明的舉例。
下述實施例中所使用的一些術(shù)語定義如下LC＝液相色譜，在低壓下使用手工填料的Q—SepharoseTM的陰離子交換柱(23×2cm)用Dionex2010i體系進行純化。
DMF＝二甲基甲酰胺AcOH＝乙酸g＝克mg＝毫克kg＝千克ml＝毫升
μl＝微升測定pH穩(wěn)定性的一般步驟將2μl3×10-4M159GdCl3的0.1N HCl溶液加入至2ml3×10-4M的159GdCl3的載體溶液中而制備備用159GdCl3(或153SmCl3)溶液。然后在去離子水中制備適當?shù)呐湮惑w溶液。接著通過將配位體(溶于100—500μl去離子水中)和2ml儲備159GdCl3溶液混合而制備1∶1配位體/金屬絡合物，隨后混合而得一種酸溶液(pH＝2)。用0.1N NaOH將溶液的pH值升至7.0。絡合物中金屬的百分比是通過將絡合物溶液樣品通過一個SepharoseTMG—50柱測定的，用4∶1的鹽水(85％NaCl/NH4OH)洗脫，并收集2×3ml流份。將合并洗脫液中放射性的量與殘留在樹脂中的量(非絡合的金屬保留在樹脂上)相比較。pH穩(wěn)定性分布圖通過用1MNaOH或1MHCl調(diào)節(jié)絡合物溶液的等分試樣的pH，并用上述離子交換法確定絡合物中金屬的百分比，測得pH穩(wěn)定性。通過實驗比較而得Sm結(jié)果，本發(fā)明配位體的絡合及生物分布完全相同。
配位體的合成一般材料和方法所有的試劑都由市售而得，并直接使用而不進一步純化。在配有多核四探頭(1H，13C，31P和19F)的Bruker AC—250MHZ光譜儀上于297°K(除非另外提示)記錄NMR譜。用溶劑抑制脈中序列(“PRESAT”，單核預飽和)記錄D2O中的1H譜。
1H譜以δ7.26的殘余氯仿(在CDCl3中)或δ3.55的外來二噁烷(在D2O中)定位。所記錄的13C和31P譜是質(zhì)子去偶的(寬帶)。利用DEPT(通過極化轉(zhuǎn)移的非變形增益)實驗有助于13C{1H}化學位移的指定。13C{1H}譜以δ77.00的CDCl3中央峰(在CDCl3中)和δ66.66的外來二噁烷(在D2O中)定位。31p{1H}譜以δ0.00的外來85％H3PO4定位。通過毛細管熔融法確定熔點，并且未校正。用配有手工填料的Q—SepharoseTM(陰離子交換)或SP—SepharoseTM(陽離子交換)玻璃柱的標準玻璃柱，并且用聯(lián)機UV檢測器在263nm監(jiān)測洗脫下，于低壓下(＜600psi)進行半制備離子交換色譜分離。在Hewlett Packard5890A氣相色譜/5970質(zhì)量選擇檢測器上測定GC/MS譜。
起始物質(zhì)實施例AN—(2—吡啶基甲基)—1，4，7，10—四氮雜環(huán)十二烷的制備堿化3ml 1.03g(6.3mmol)的氯化2—吡啶甲基鹽酸鹽水溶液至pH＞14，并萃取到氯仿中，制得氯化2—吡啶甲基的氯仿溶液。向攪拌下的2.03g(11.8mmol)1，4，7，10—四氮雜環(huán)十二烷的氯仿溶液中一次加入10ml制備好的氯化2—吡啶甲基的氯仿溶液。室溫下攪拌30分鐘后，反應混合物在真空中濃縮得殘余物，將其在硅膠(柱，2.5×20cm)上進行層析，用CHCl3CH3OHNH3OH(10∶4∶1)洗脫，SiO2板上的Rf＝0.29。洗脫液濃縮后，分離得到稠的淡黃色液體狀單烷基化產(chǎn)物，其經(jīng)靜置固化得1.17g灰白色粉末(72％，基于氯化2—吡啶甲基)，進一步的特征為δ2.54-2.82(m，16H)，3.75(s，2H)，7.11-7.14(m，1H)，7.42-7.46(m，1H)，7.64-7.65(m，1H)，8.46-8.48(m，1H)；and13C{1H}NMR(CDCl3)δ45.02，46.31，47.04，51.51，61.03.122.122.87，136.61.148.83，150.53
實施例BN—(2—吡啶基甲基)—N′，N″，N—三(亞甲基膦酸二乙酯)—1，4，7，10—四氮雜環(huán)十二烷的制備向如實施例A制備的331mg(1.27mmol)的N—(2—吡啶基甲基)—1，4，7，10—四氮雜環(huán)十二烷中加入229mg(7.63mmol，過量)的多聚甲醛和1.3ml 1.27g(7.62mmol，過量)的亞磷酸三乙酯。將混合液緩緩攪拌10分鐘后得到充分混合的漿，將其加熱至90℃1小時。過量的試劑和副產(chǎn)物在真空(125℃/0.01mmHg)中除去，得到896mg(99％)的黃色油狀目標產(chǎn)物，進一步的特征為δ1.25-1.39(m，18H)，2.66-2.95(m，22H)，3.71(s，2H)，4.01-4.22(m，12H)，7.10-7.15(m，1H)，7.57-7.65(m，2H)，8.46-8.52(m，1H)；13C{1H}NMR(CDCl3)δ16.38，16.46，50.45，50.67，52.41，53.19，53.29，53.48，53.58，61.37，61.47，61.52，121.67，123.28，136.19，148.61，159.90；and31P{1H}NMR(CDCl3，297°K)δ26.21；31P{1H}NMR(CDCl3，217°K)δ24.18(1P)，24.32(2P).
實施例CN—(2—比啶基甲基)—N′，N″，N—三(亞甲基膦酸二丙基酯)—1，4，7，10—四氮雜環(huán)十二烷的制備向如實施例A制備的445mg(1.71mmol)的N—(2—吡啶基甲基)—1，4，7，10—四氮雜環(huán)十二烷中加入154mg(5.12mmol，過量)的多聚甲醛和3.5ml 3.20g(5.12mmol，過量)的亞磷酸三丙基酯。將混合液緩緩攪拌10分鐘后得到充分混合的漿，將其加熱至100℃30分鐘。過量的試劑和副產(chǎn)物在真空(4小時，160℃/0.01mmHg)中除去，得到1.36g(定量)的稠的黃色油狀目標產(chǎn)物，進一步的特征為δ0.91-1.00(m，18H)，1.60-1.76(m，12H)，2.67-2.99(m，22H)，3.73(s，2H)，3.94-4.08(m，12H)，7.12-7.15(m，1H)，7.46-7.67(m，2H)，8.48-8.52(m，1H)；13C{1H}NMR(CDCl3)δ9.93，10.21，23.71，23.80，50.17，50.44，52.38，53.09，53.44，61.44，66.79，66.83，121.61，123.23.136.14，148.54，159.92；and31P{1H}NMR(CDCl3)δ26.20(1P)，26.23(2P).
終產(chǎn)物配位體如方案1所示制備二亞甲基羧酸。
實施例1N—(2—吡啶基甲基)—N′，N″，N—三乙酸—1，4，7，10—四氮雜環(huán)十二烷(PD3A)的制備向如實施例A制備的201.4mg(0.51mmol)的N—(2—吡啶基甲基)—1，4，7，10—四氮雜環(huán)十二烷的2ml水溶液中加入350mg(2.52mmol，65％過量)的溴乙酸，反應混合液的pH值通過加入少量的濃縮氫氧化鈉維持在11以上，直到不需要堿以維持pH＞11(約30分鐘)。然后將反應混合液加熱(60℃)1小時。反應混合液冷卻至室溫后，調(diào)節(jié)反應混合液的pH值至7，并將該中性溶液在陽離子交換(SP—SepharoseTM)柱(1.5×50cm)上進行層析，先用去離子水洗脫，然后再用1M鹽酸洗脫。將含有產(chǎn)物的酸性流份蒸發(fā)干燥，隨后與新制去離子水(3×2ml)共同(共沸物)蒸發(fā)以除去過量的鹽酸。將水溶液冷凍干燥分離得白色固體終產(chǎn)物，進一步的特征為δ2.79-4.13(m，24H)，7.88-8.01(m，2H)，8.35-8.42(m，1H)，8.63-8.66(m，1H)；and13C{1H}NMR(D2O)δ51.04，51.25，53.73，55.47，56.00，56.90，57.52，129.86，131.21，145.49，150.82，153.54，171.61，178.76.
配位體如方案3所示制備二亞甲基膦酸半酯實施例2N—(2—吡啶基甲基)—N′，N″，N—三(亞甲基膦酸乙酯)—1，4，7，10—四氮雜環(huán)十二烷(PD3EP)的制備向如實施例B制備的102.7mg(0.14mmol)的N—(2—吡啶基甲基)—N′，N″，N—三(亞甲基膦酸二乙酯)—1，4，7，10—四氮雜環(huán)十二烷中加入1ml 0.1M的氫氧化鉀并于90℃加熱6小時。冷卻至室溫后，將水溶液冷凍干燥得褐色固體，將其在陰離子交換(Q—SepharoseTM)柱(1.5×50cm)上進行層析，先用去離子水洗脫，然后再用1M鹽酸洗脫。將洗脫液冷凍干燥后，分離得棕色固體產(chǎn)物，進一步的特征為δ1.41-1.57(m，9H)，3.28-3.89(m，22H)，4.09-4.64(m，8H)，8.22-8.26(m，2H)，8.70-8.75(m，1H)，9.00-9.12(m，1H)；and13C{1H}NMR(D2O，338°K)δ19.41，19.51，52.58，53.00，52.31，53.75，53.82，56.04，59.53，64.60，64.76，129.86，131.41，147.31，149.06，154.34；and31P{1H}NMR(D2O，338°K)δ9.64(2P)，19.79(1P).
實施例3N—(2—吡啶基甲基)—N′，N″，N—三(亞甲基膦酸丙酯)—1，4，7，10—四氮雜環(huán)十二烷(PD3PP)的制備向如實施例C制備的0.71g(0.89mmol)的N—(2—吡啶基甲基)—N′，N″，N—三(亞甲基膦酸二丙基酯)—1，4，7，10—四氮雜環(huán)十二烷中加入3ml0.1M的氫氧化鉀，并加熱回流18小時。冷卻至室溫后，過濾水溶液，并冷凍干燥而得褐色殘余物，將其再溶入CH2Cl2/C2H5OH(95∶5)，并且過濾。隨后蒸發(fā)溶劑并且在真空中濃縮，分離得褐色固體產(chǎn)物，進一步的特征為δ1.24-1.36(m，9H)，1.95-2.04(m，6H)，3.03-3.29(m，22H)，4.10-4.25(m，8H)，7.74-7.92(m，2H)，8.23-8.29(m，1H)，8.87-8.96(m，1H)；and13C{1H}NMR(D2O，353°K)δ13.15，27.20，50.43，53.89，54.48，54.98，55.42，64.33，69 41，126.38，128.30，141.24，152.46，161.45；and31P{1H}NMR(D2O，353°K)δ21.61(2P)，21.95(1P).
絡合物為生物分布研究制備金屬/配位體絡合物。
一般步驟金屬配位體絡合物可通過不同的方法制備。該方法包括在水溶液中混合金屬和配位體，并且調(diào)節(jié)pH至期望值。在含有鹽和/或緩沖劑及水的溶液中進行絡合。有時發(fā)現(xiàn)熱溶液中絡合率高于在室溫下進行絡合時的絡合率。
例如，將配位體溶于去離子水(約pH＝2)中制備配位體溶液。然后將配位體溶液與含有示蹤劑153SmCl3的SmCl3.H2O(3×10-4M，在0.01N HCl中)水溶液混合。充分混合后，將絡合物溶液通過一個SephadexTM柱確定絡合金屬的百分比，用4∶1鹽水(0.85％NaCl/NH4OH)洗脫，并收集2×3ml流份。然后將總洗脫液中放射性的數(shù)量與殘留在樹脂中的相比較。在這種情況下，絡合物和洗脫液一起被除去，而非絡合的金屬保留在樹脂中。通過這種方法確定的絡合率通常為約95％或更高。
使用上述步驟，可制備釤與N—(2—吡啶基甲基)—N′，N″，N—三乙酸—1，4，7，10—四氮雜十二烷(PD3A)；N—(2—吡啶基甲基)—N′，N″，N—三(亞甲基膦酸乙酯)—1，4，7，10—四氮雜十二烷(PD3EP)；N一(2—吡啶基甲基)—N′，N″，N—三(亞甲基膦酸丙酯)—1，4，7，10—四氮雜十二烷(PD3PP)；和N—(2—吡啶基甲基)—N′，N″，N—三(亞甲基膦酸—1，4，7，10—四氮雜十二烷(PD3P)的絡合物。與釓的絡合物用類似的方式制備。
下表闡明了由PD3A、PD3PP和PD3EP衍生而來的Sm絡合物的動力學惰性。
153Sm—PD3A的pH穩(wěn)定性
153Sm—PD3PP的pH穩(wěn)定性
153Sm—PD3A的pH穩(wěn)定性
生物分布一般步驟讓Sprague Dawley大鼠適應5天，然后經(jīng)尾靜脈注射100μl絡合物溶液。注射時大鼠體重在150和200g之間。30分鐘后，頸脫臼處死大鼠并解剖。通過耦合到多道分析器上的NaI閃爍計數(shù)器計數(shù)確定每種組織的放射性數(shù)量。將該計數(shù)與100μl標準的計數(shù)比較來確定每種組織或器官中的劑量百分比。
假定血液為總體重的6.5％來估計血液中的百分劑量。將股骨中的百分劑量乘以25來估計骨中的百分劑量。假定肌肉為總體重的43％來估計肌肉中的百分劑量。計算平均值所用大鼠的個數(shù)為n。
除了器官的生物分布外，評價通式(I)化合物的螯合物的骨定位效率，因為已知膦酸能結(jié)合到羥基磷灰石上。這些試驗的結(jié)果如下。
實施例I當評價絡合物153Sm〔N—(2—吡啶基甲基)—N′，N″，N—三(亞甲基膦酸乙酯)—1，4，7，10—四氮雜十二烷〕(153Sm—PD3EP)時，結(jié)果如下表I所示。數(shù)值代表注射后2小時時每個數(shù)據(jù)點最少2只大鼠的平均值。
表I153Sm—PD3EP的生物分布，注射劑量的百分數(shù)
實施例II
當評價絡合物153Sm〔N—(2—吡啶基甲基)—N′，N″，N—三(亞甲基膦酸丙酯)—1，4，7，10—四氮雜十二烷〕(153Sm—PD3PP)時，結(jié)果如下表II所示。數(shù)值代表注射后2和24小時時每個數(shù)據(jù)點最少3只大鼠的平均值。
表II153Sm—PD3PP的生物分布注射劑量的百分數(shù)
根據(jù)在此公開的說明書和實施方式，本發(fā)明的其它方案對于本領域的專業(yè)人員是顯而易見的。而且說明書和實施例僅作為舉例，本發(fā)明真正的范圍和實質(zhì)如下面的權(quán)利要求書所述。
權(quán)利要求
1.下式2—吡啶基亞甲基多氮雜大環(huán)化合物或其藥學上可接受的鹽， 其中T獨立地為—CH2—COOH， 其中R為OH，C1—C5烷基或—O—(C1—C5烷基)；R1是OH或OCH3；R2是NO2，NH2，異硫氰酸根合，脲氨基，硫脲氨基，馬來酰亞氨基，溴乙酰氨基或羧基；條件是僅有一個T是 其中R1和R2如前所定義。
2.權(quán)利要求1的化合物或其藥學上可接受的鹽，其中T等于—CH2—P(O)ROH，R是OH，并且命名為N—(2—吡啶基甲基)—N′，N″，N—三(亞甲基膦酸)—1，4，7，10—四氮雜環(huán)十二烷。
3.權(quán)利要求1的化合物或其藥學上可接受的鹽，其中T等于—CH2—COOH，并且命名為N—(2—吡啶基甲基)—N′，N″，N—三乙酸—1，4，7，10—四氮雜環(huán)十二烷。
4.權(quán)利要求1的化合物或其藥學上可接受的鹽，其中T等于—CH2—P(O)ROH，R是—O—(C1—C5烷基)。
5.權(quán)利要求4的化合物或其藥學上可接受的鹽，其中R是乙氧基，并且命名為N—(2—吡啶基甲基)—N′，N″，N—三(亞甲基膦酸乙酯)—1，4，7，10—四氮雜環(huán)十二烷。
6.權(quán)利要求4的化合物或其藥學上可接受的鹽，其中R是丙氧基，并且命名為N—(2—吡啶基甲基)—N′，N″，N—三(亞甲基膦酸丙酯)—1，4，7，10—四氮雜環(huán)十二烷。
7.權(quán)利要求1的化合物，其中T等于—CH2—P(O)ROH，R是C1—C5烷基。
8.權(quán)利要求1的化合物，其中一個T是 其中R1和R2如權(quán)利要求1所定義；同時其它T如權(quán)利要求1所定義。
9.一種含有下式多氮雜大環(huán)化合物或其藥學上可接受鹽的絡合物， 其中T獨立地為—CH2—COOH， 其中R為OH，C1—C5烷基或—O—(C1—C5烷基)；R1是OH或OCH3；R2是NO2，NH2，異硫氰酸根合，脲氨基，硫脲氨基，馬來酰亞氨基，溴乙酰氨基或羧基；條件是僅有一個T是 其中R1和R2如前所定義；其中所述化合物與選自Cd+3，Mn+2或Fe+3的金屬離子絡合。
10.權(quán)利要求9的絡合物，其中金屬為Gd+3。
11.權(quán)利要求9的絡合物，其中T是—CH2—P(O)ROH，R是OH，并且金屬為Gd+3。
12.權(quán)利要求9的絡合物，其中T是—CH2—COOH，并且金屬為Gd+3。
13.權(quán)利要求9的絡合物，其中T是—CH2—P(O)ROH，R是—O—(C1—C5烷基)，并且金屬為Gd+3。
14.權(quán)利要求9的絡合物，其中T是—CH2—P(O)ROH，R是C1—C5烷基，并且金屬為Gd+3。
15.一種藥物制劑，其包括一種權(quán)利要求9的絡合物及藥學上可接受的載體。
16.一種用于診斷動物疾病的方法，其包括給予所述動物有效量的權(quán)利要求15的制劑。
17.一種制備下式多氮雜大環(huán)化合物或其藥學上可接受鹽的方法， 其中T獨立地為—CH2—COOH，或 其中R為OH，C1—C5烷基或—O—(C1—C5烷基)；該方法包括下述任意一種(A)將通式(II)化合物 與X—CH2—COOH反應，其中X是氯或溴原子，在堿金屬的氫氧化物的水溶液存在下，pH值約8—10之間，溫度為約60—90℃之間反應；得到上述通式(I)化合物，其中T等于—CH2—COOH；或者(B)將通式(II)化合物 與亞磷酸在鹽酸和過量甲醛中反應，pH值低于2，回流溫度；得到上述通式(I)化合物，其中T等于—CH2—PO3H2；或者(C)將通式(II)化合物 與P(OR)3，其中R是C1—C4烷基，在甲醛中反應，接著用3至12M的鹽酸進行水解，pH值低于約3，回流溫度；得到上述通式(I)化合物，其中T等于—CH2—PO3H2；或者(D)將通式(II)化合物 與P(OR)3，其中R是C1—C4烷基，在甲醛中反應，接著用過量的堿金屬氫氧化物進行水解，pH值高于約12，回流溫度；得到上述通式(I)化合物，其中T等于—CH2—PO2HR，R是—O—(C1—C5烷基)；或者(E)將通式(II)化合物 與H3C—P(OEt)2在甲醛和四氫呋喃中反應，接著用過量的堿金屬氫氧化物進行水解，pH值高于約12，回流溫度，或者與HP(O)OH—C2H5在甲醛和鹽酸中反應，pH值低于約3，回流溫度；得到上述通式(I)化合物，其中T等于—CH2—PO(OH)R，R是C1—C5烷基。
全文摘要
本發(fā)明公開了2-吡啶基亞甲基多氮雜大環(huán)膦酸化合物及其衍生物，其可與Gd，Mn或Fe離子形成惰性絡合物。絡合物的總電荷可以是不同的，以改變體內(nèi)生物定位。該絡合物可用作用于診斷目的的造影劑。
文檔編號C07F9/6524GK1125905SQ9419252
公開日1996年7月3日 申請日期1994年5月5日 優(yōu)先權(quán)日1993年5月6日
發(fā)明者G·E·基弗, W·D·金 申請人:陶氏化學公司