專利名稱：成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白的組織特異性表達(dá)的制作方法
背景技術(shù)：
成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤基因(RB)和轉(zhuǎn)錄因子E2F在細(xì)胞生長控制中都具有關(guān)鍵作用(可參見Adams，P.和Kaelin，W.Seminars in Cancer Biology699-108(1995)的綜述)。在各種人類腫瘤細(xì)胞中，RB基因座常常被失活。將野生型RB基因(如Bookstein等人，Science 247712-715(1990))或野生型RB蛋白(pRB)(如Antelman等人，Oncogene 10697-704(1995))再引入RB陰性/RB突變細(xì)胞可以抑制這些細(xì)胞在培養(yǎng)過程中的生長以及這些細(xì)胞的體內(nèi)腫瘤發(fā)生能力。
E2F的作用是激活S期基因的轉(zhuǎn)錄，而RB抑制它的活性。RB通過阻斷從G期進(jìn)入S期的出口而使細(xì)胞生長停滯(例如，Dowdy等人，Cell73499-511(1993))，但其阻滯作用(arrest)的準(zhǔn)確途徑還是不清楚的。
盡管E2F與RB形成復(fù)合體，但如果存在一種E2F相關(guān)蛋白DP-1的話，則復(fù)合體的形成會更有效率。E2F-1和DP-1形成穩(wěn)定的異二聚體，結(jié)合DNA(例如，Qin等人，Genes and Dev.6-953-964(1992))。DP-1-E2F復(fù)合物的作用是協(xié)同激活依賴于E2F的基因的轉(zhuǎn)錄。象阻抑受E2F-1或DP-1激活的轉(zhuǎn)錄一樣，pRB能以同樣的方式阻抑這樣的轉(zhuǎn)錄。
在一些情況下，可以通過將pRB連接到一個啟動子上而獲得RB對基因的轉(zhuǎn)錄阻抑。例如，GAL4-pRB融合體結(jié)合于GAL4 DNA結(jié)合域并阻抑從p53、Sp-1或AP-1元件的轉(zhuǎn)錄(Adnane等人，J.Biol.Chem.2708837-8843(1995)；Weintraub等人，Nature 358259-261(1995))。Sellers等人(Proc.Natl.Acad Sci.9211544-11548(1995))公開了E2F的氨基酸殘基1-368和RB的氨基酸379-792或379-928的融合體。
Chang等人(Science 267518-521(1995))公開了用一種復(fù)制缺陷型腺病毒-RB構(gòu)成物在兩個再狹窄動物模型中減少新內(nèi)膜的形成，其中所述再狹窄是一種高增殖性疾病。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了下述驚人的結(jié)果E2F多肽與RB多肽的融合體在阻抑E2F啟動子的轉(zhuǎn)錄中比單獨(dú)的RB更有效，并且這樣的融合體能在各種細(xì)胞類型中使細(xì)胞周期停滯。因此這樣的融合體可以滿足治療高增殖性疾病、包括癌癥的迫切需要。
本發(fā)明的一方面是包含一種轉(zhuǎn)錄因子與一種成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤(RB)多肽的融合體的多肽，其中所述轉(zhuǎn)錄因子包含一個DNA結(jié)合域，所述RB多肽包含一個生長抑制域。本發(fā)明的另一方面是編碼這樣一種融合多肽的DNA。可以將所述DNA插入一種腺病毒載體中。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)錄因子是E2F。所述E2F的細(xì)胞周期蛋白A結(jié)合域可以缺失或是沒有功能的。在一些實(shí)施方案中，所述E2F可以包含氨基酸殘基約95到約194或約95到約286。
所述成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤多肽可以是野生型RB、RB56、或上述多肽的一種變異體或一個片段。在一些實(shí)施方案中，所述成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤多肽包含氨基酸殘基約379到約928。所述RB多肽上優(yōu)選的氨基酸取代包括殘基2、608、788、807和811。
本發(fā)明的另一方面是包含編碼一種多肽的DNA的表達(dá)載體，所述多肽包含一種轉(zhuǎn)錄因子與一種成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤(RB)多肽的融合體，其中所述轉(zhuǎn)錄因子包含一個DNA結(jié)合域，所述RB多肽包含一個生長抑制域。在一些實(shí)施方案中，一種組織特異性的啟動子操縱性地連接到編碼該融合多肽的DNA上。所述組織特異性啟動子可以是一種平滑肌α-肌動蛋白啟動子。
本發(fā)明的另一方面是一種用于治療高增殖性疾病的方法，包括給予患者治療有效量的一種E2F-RB融合多肽。所述高增殖性疾病可以是癌癥。在一些實(shí)施方案中，所述高增殖性疾病是再狹窄。所述融合多肽和編碼該融合多肽的核酸可用于包被血管成形術(shù)所使用的裝置。
附圖簡述

圖1A描述了預(yù)測的E2F的氨基酸序列。
圖1B描述了轉(zhuǎn)錄因子E2F的核苷酸序列。
圖2A描述了如Lee等人(Nature 329642-645(1987))公開的pRB的核苷酸序列。
圖2B描述了預(yù)測的pRB的氨基酸序列。
圖3是pCTM的圖示。
圖4描述了質(zhì)粒pCTM的核苷酸序列。
圖5是pCTMI的圖示。
圖6描述了pCTMI的核苷酸序列。
圖7是質(zhì)粒pCTMIE的圖示。
圖8描述了pCTMIE的核苷酸序列。
圖9是一個簡圖，描述了實(shí)施例中使用的E2F-RB融合構(gòu)成物。所有的E2F構(gòu)成物都起始于氨基酸95并且缺失部分細(xì)胞周期蛋白A結(jié)合域。E2F-437包含DNA結(jié)合域(黑)、異二聚化域(白)以及反式激活域(條紋)。E2F-194僅包含DNA結(jié)合域。E2F-286包含DNA結(jié)合域以及DP-1異二聚化域。為產(chǎn)生E2F-194-RB56-5s和E2F-286-RB56-5s，將E2F構(gòu)成物符合讀框地融合到RB的密碼子379上。C706F是一個致失活點(diǎn)突變。
圖10是一個簡圖，描述了E2F-RB融合構(gòu)成物引起的轉(zhuǎn)錄阻抑。
圖11(A-D)描述了在哺乳類細(xì)胞系中E2F-RB融合蛋白的表達(dá)。由E2-CAT報(bào)道分析或FACS分析中使用的細(xì)胞制備提取物，并使用一種抗RB的單克隆抗體進(jìn)行分析。板A顯示了用以下轉(zhuǎn)染C33A細(xì)胞得到的結(jié)果(3)RB56-H209，(4)RB56野生型，(5)RB56-5s，(6)E2F286-5s，(7)E2F194-5s，(8)E2F194，(9)E2F286，(10)E2F437。泳道(1)是RB56蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。泳道(2)是一個模擬轉(zhuǎn)染。板B顯示了用以下轉(zhuǎn)染Saos-2細(xì)胞得到的結(jié)果(1)RB56，(2，3)E2F194-5s，以及(4，5)E2F286-5s。板C顯示了用以下轉(zhuǎn)染5637細(xì)胞得到的結(jié)果(2，3)RB56野生型，(4，5)RB56-5s；(6，7)E2F194-5s；(7，8)E2F286-5s。泳道(1)是RB56蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。板D顯示了用以下轉(zhuǎn)染NIH-3T3得到的結(jié)果(3)RB56，(4)E2F286-5s，(5)E2F194-5s。泳道(1)是RB56標(biāo)準(zhǔn)品；泳道(2)是RB110標(biāo)準(zhǔn)品。
圖12描述了對表達(dá)RB的NIH-3T3細(xì)胞使用流式細(xì)胞術(shù)得到的頻率分布圖分析。
圖13的組A描述了在大鼠平滑肌細(xì)胞系A(chǔ)7R5中進(jìn)行的一個3H-胸苷攝入分析中，CMV驅(qū)動的重組腺病毒(ACN56)以及人類平滑肌α-肌動蛋白驅(qū)動的E2F-p56融合構(gòu)成物的兩個分離物與一種對照病毒(ACN)的效應(yīng)的比較，其中所述E2F-p56融合構(gòu)成物包含直接或符合讀框地連接到p56(RB cDNA的氨基酸379-928)上的E2F氨基酸95到286。組B描述了同樣的構(gòu)成物在大鼠平滑肌細(xì)胞系A(chǔ)10中的效應(yīng)。
圖14描述了圖13所述各種病毒在非肌細(xì)胞中的效應(yīng)的比較。組(A)描述了在乳腺癌細(xì)胞系MDA MB468中的結(jié)果。組(B)描述了在非小細(xì)胞肺細(xì)胞癌細(xì)胞系H358中的結(jié)果。
圖15上面的一組描述了腺病毒對不同細(xì)胞系的相對感染性，其中相對感染性是在用等量的一種由CMV啟動子驅(qū)動表達(dá)β-gal的重組腺病毒感染細(xì)胞后，根據(jù)β-半乳糖苷酶(β-gal)染色的水平來進(jìn)行判定。H358是非小細(xì)胞肺細(xì)胞癌細(xì)胞系；MB468是一種乳腺癌細(xì)胞系；A7R5和A10是平滑肌細(xì)胞系。圖的下半部分描述了在用重組腺病毒ACN56感染的與上述相同的細(xì)胞系中，p56蛋白表達(dá)的相對水平，其中p56cDNA由非組織特異性的CMV啟動子驅(qū)動。
圖16描述了在用平滑肌α-肌動蛋白啟動子驅(qū)動的E2F-p56融合構(gòu)成物(ASN286-56)感染的細(xì)胞中，蛋白的相對水平。UN表示未被感染；50、100、250和500是指感染復(fù)數(shù)(MOI)。
圖17是一個柱狀圖，描述了在受損傷并用表達(dá)β-gal、RB(ACNRB)或p56(ACN56)的重組腺病毒進(jìn)行治療的大鼠頸動脈橫截面切片(n＝9)上血管內(nèi)膜面積與血管中層面積的比例(作為對新內(nèi)膜形成的抑制的衡量)，其中所述重組腺病毒中β-gal、RB或p56的表達(dá)都置于CMV啟動子的控制之下。
圖18是一個系列的三張照片，描述了在一個大鼠血管成形術(shù)模型中的再狹窄。左邊的一幅描述了從正常動物得到的數(shù)據(jù)；中間的一幅描述了從受傷然后使用一種表達(dá)β-gal的重組病毒治療的動物得到的數(shù)據(jù)；右邊的一幅描述了從受傷然后使用一種表達(dá)p56的重組腺病毒(ACN56)治療的動物得到的數(shù)據(jù)。
圖19描述了平滑肌α-肌動蛋白啟動子的組織特異性，這種組織特異性表現(xiàn)為其在肌細(xì)胞而不在非肌細(xì)胞中表達(dá)β-gal轉(zhuǎn)基因的選擇性能力。左邊的組比較了在用CMV驅(qū)動β-gal(ACNBGAL)以MOI＝1或平滑肌啟動子構(gòu)成物(ASNBGAL)以MOI＝100感染的乳腺癌細(xì)胞系MB468中，β-gal的表達(dá)。右邊的組描述了用ACNBGAL以MOI＝1或ASNBGAL以MOI＝50感染的大鼠平滑肌細(xì)胞系A(chǔ)7R5中β-gal的表達(dá)。在該肌細(xì)胞系中觀察到了從ASNBGAL的表達(dá)，而在非肌細(xì)胞中缺乏表達(dá)，盡管ASNBGAL對非肌細(xì)胞系具有更高的感染性。
圖20描述了表達(dá)RB的重組腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)大鼠頸動脈的能力。在氣囊損傷(balloon injury)和感染兩天后收獲用重組腺病毒治療的動脈(1×109pfu)。固定橫截面切片，使用一種RB特異性抗體檢測組織中RB蛋白的存在。使用的對照病毒是ACN。在ACNRB處理過的樣品中，特別是在高放大倍數(shù)下，RB蛋白染色是明顯的。
圖21描述了一種CMV驅(qū)動的p56重組腺病毒(ACN56E4)、一種人類平滑肌α-肌動蛋白啟動子驅(qū)動的E2F-p56融合構(gòu)成物(ACN286-56)以及包含沒有下游轉(zhuǎn)基因的CMV或平滑肌α-肌動蛋白啟動子(分別顯示了ACNE3或ASBE3-2分離物)的對照腺病毒構(gòu)成物的效應(yīng)的比較。分析是在一種平滑肌細(xì)胞系(A7R5)或一種非肌細(xì)胞系(MDA-MB468，乳腺癌)中的3H-胸苷攝入分析。結(jié)果顯示了使用平滑肌α-肌動蛋白啟動子的肌肉組織特異性，以及p56和E2F-p56轉(zhuǎn)基因與它們各自的對照相比的特異性抑制。
最佳實(shí)施方案的描述本發(fā)明提供了RB融合構(gòu)成物，包括融合多肽和編碼它們的載體，以及提供使用這樣的構(gòu)成物治療高增殖性疾病的方法。在本發(fā)明的一些最佳實(shí)施方案中，一種RB多肽與一種E2F多肽融合?？梢允褂萌魏蜤2F種類，一般是E2F-1、-2、-3、-3、或-5(參見如Wu等人，Mol.Cell.Biol.152536-2546(1995)；Ivey-Hoyle等人，Mol.Cell.Biol.137802(1993)；Vairo等人，Genes and Dev.9869(1995)；Beijersbergen等人，Genes and Dev.82680(1994)；Ginsberg等人，Genes and Dev.82665(1994)；Buck等人，Oncogene 1131(1995))，更一般的是E2F-1。一般所述E2F多肽至少包含E2F的DNA結(jié)合域，并且可以可任選地包含細(xì)胞周期蛋白A結(jié)合域、異二聚化域和/或反式激活域。細(xì)胞周期蛋白A結(jié)合域最好是沒有功能的。本文所提到的E2F的核苷酸序列和氨基酸序列是Genbank HUME2F的核苷酸序列和氨基酸序列，如圖1A和圖1B所示。編碼這樣的一種E2F多肽的核酸，最好是DNA，符合讀框地與一種RB多肽融合。所述RB多肽可以是任何一種RB多肽，包括保守氨基酸變異體、等位變異體、發(fā)生了氨基酸取代、缺失或插入的突變體、或上述多肽的片段。所述RB多肽上的生長抑制域，即氨基酸殘基379-928最好是有功能的(Hiebert等人，MCB 133384-3391(1993)；Qin等人，Genes and Dev.6953-964(1992))。在一些實(shí)施方案中使用了野生型pRB110。更優(yōu)選使用一種被截短的RB，即RB56。RB56包含pRB110的氨基酸殘基379-928(Hiebert等人，MCB 133384-3391(1993)；Qin等人，Genes and Dev.6953-964(1992))。在一些實(shí)施方案中，單獨(dú)或組合使用了RB在位點(diǎn)2、608、612、788、807或811上的氨基酸變異體。變異體RB-5s包含在608、612、788、807和811位上具有丙氨酸取代的野生型RB56。RB氨基酸和核苷酸的編號是根據(jù)Lee等人(Nature 329642-645(1987))所公開的RB序列，為所有目的，特此通過引用全部結(jié)合到本文中(圖2)。
編碼本發(fā)明的多肽的核酸可以是RNA或DNA。詞組“編碼核酸序列”是指指導(dǎo)特定蛋白或多肽表達(dá)的核酸。所述核酸序列包含轉(zhuǎn)錄成RNA的DNA鏈序列以及翻譯成蛋白的RNA序列。所述核酸序列包括全長的核酸序列以及全長的核酸序列衍生出的非全長的序列。更進(jìn)一步地說，所述序列包括一種或多種天然序列的簡并密碼子，可以將這些簡并密碼子引入以在特定的宿主細(xì)胞中提供密碼子優(yōu)先(codonpreference)。
本文使用的術(shù)語“載體”是指病毒表達(dá)系統(tǒng)、自主自我復(fù)制型環(huán)狀DNA(質(zhì)粒)，并且包括表達(dá)質(zhì)粒和非表達(dá)質(zhì)粒，當(dāng)敘述一種重組微生物或細(xì)胞培養(yǎng)物中帶有一種“表達(dá)載體”時，這就包括染色體外環(huán)狀DNA和已經(jīng)插入宿主染色體的DNA。當(dāng)一種載體由一種宿主細(xì)胞保持時，所述載體可以或作為一種自主結(jié)構(gòu)在有絲分裂期間由宿主細(xì)胞穩(wěn)定地復(fù)制，或插入宿主的基因組中。一種載體包含位置取向或順序取向的多個遺傳元件，即操縱性地連接其它必需遺傳元件以便載體中的編碼本發(fā)明的構(gòu)成物的核酸可以在被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄，并且在必要時翻譯。
本文使用的術(shù)語“基因”規(guī)定是指編碼多肽的核酸序列。這個定義包括各種序列多態(tài)性、變異和/或序列變異體，其中這樣的改變并不影響該基因產(chǎn)物的功能。術(shù)語“基因”規(guī)定不僅包括編碼序列，還包括調(diào)節(jié)區(qū)，如啟動子、增強(qiáng)子和終止區(qū)。這個術(shù)語還包括從mRNA轉(zhuǎn)錄物剪接得到的所有內(nèi)含子和其它DNA序列、以及由其它可選剪接位點(diǎn)得到的變異體。
術(shù)語“質(zhì)?！笔侵改茉诩?xì)胞中復(fù)制的自主環(huán)狀DNA分子，包括表達(dá)型和非表達(dá)型。當(dāng)敘述一種重組微生物或細(xì)胞培養(yǎng)物中帶有一種“表達(dá)質(zhì)?！睍r，這就包括染色體外環(huán)狀DNA分子和已經(jīng)插入宿主染色體的DNA。當(dāng)一種質(zhì)粒由一種宿主細(xì)胞保持時，所述質(zhì)?；蚴亲鳛橐环N自主結(jié)構(gòu)在有絲分裂期間由宿主細(xì)胞穩(wěn)定地復(fù)制，或是插入宿主基因組中。
詞組“重組蛋白”或“重組產(chǎn)生的蛋白”是指使用非天然細(xì)胞產(chǎn)生的肽或蛋白，其中所述非天然細(xì)胞并不具有能表達(dá)所述蛋白的DNA的內(nèi)源拷貝。由于已經(jīng)通過向所述細(xì)胞引入合適的核酸序列而進(jìn)行了遺傳改變，因此所述細(xì)胞能產(chǎn)生所述蛋白。不會發(fā)現(xiàn)所述重組蛋白結(jié)合與產(chǎn)生該蛋白的細(xì)胞正常結(jié)合的蛋白和其它亞細(xì)胞組分。本文中術(shù)語“蛋白”和“多肽”可以互換使用。
一般來說，本發(fā)明的構(gòu)成物是在一種表達(dá)載體中提供的，所述表達(dá)載體包含下列為有功能的表達(dá)以適當(dāng)距離順序連接的元件一個組織特異性啟動子、一個轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、一個3′非翻譯區(qū)、一段5′mRNA前導(dǎo)序列、一段編碼本發(fā)明的一種多肽的核酸序列以及一個多聚腺苷酸化信號。這樣的連接被稱為“操縱性地連接”。所述表達(dá)載體中也可以包括其它輔助表達(dá)和/或分泌的序列。所述載體中可以包括附加基因，如編碼抗藥性的基因以進(jìn)行選擇或篩選重組載體的存在。這樣的附加基因可以包括如，編碼新霉素抗性、多抗藥性、胸苷激酶、β-半乳糖苷酶、二氫葉酸還原酶(DHFR)和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因。
在本發(fā)明中，本發(fā)明的RB構(gòu)成物的組織特異性表達(dá)最好是通過使用一種目的組織中偏愛使用的啟動子而實(shí)現(xiàn)。組織特異性啟動子的例子包括肌酸激酶的啟動子和B細(xì)胞中用于自殺基因表達(dá)的免疫球蛋白重鏈或輕鏈啟動子(Maxwell等人，Cancer Res.514299-4304(1991))，其中肌酸激酶的啟動子已經(jīng)用于指導(dǎo)肌肉組織和心臟組織中肌營養(yǎng)不良蛋白cDNA的表達(dá)(Cox等人，Nature 364725-729(1993))。也已經(jīng)確定了一種內(nèi)皮細(xì)胞特異性調(diào)節(jié)區(qū)的特征(Jahroudi等人，Mol.Cell.Biol.14999-1008(1994))。已經(jīng)構(gòu)建了兼嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，分別攜帶置于清蛋白啟動子或甲胎蛋白啟動子控制下的單純皰疹病毒胸苷激酶基因(Huber等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.888039-8043(1991))到肝譜系細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的靶細(xì)胞中?？梢栽谀孓D(zhuǎn)錄病毒載體(Hartzoglou等人，J.Biol.Chem.26517285-17293(1990))和腺病毒載體(Friedman等人，Mol.Cell.Biol.63791-3797(1986)；Wills等人，Cancer Gene Therapy3191-197(1995))中使用這樣的組織特異性啟動子，而仍然保持它們的組織特異性。
在本發(fā)明中，一種為外源基因的組織特異性表達(dá)所優(yōu)選的啟動子是人類平滑肌α-肌動蛋白啟動子。Reddy等人(J.Cell Biology 2651683-1687(1990))公開了這種啟動子的分離及其核苷酸序列，而Nakano等人(Gene 99285-289(1991))公開了人類平滑肌(主動脈型)α-肌動蛋白基因5′上游的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件和第一個內(nèi)含子區(qū)。
Petropoulos等人(J.Virol.663391-3397(1992))公開了操縱性地連接到雞骨骼肌α-肌動蛋白啟動子或胞質(zhì)β-肌動蛋白啟動子上的細(xì)菌氯霉素轉(zhuǎn)移酶(CAT)的表達(dá)的比較。這些構(gòu)成物在一種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中提供并用于感染雞蛋。
典型的肝臟組織特異性表達(dá)元件包括但不限于HMG-CoA還原酶啟動子(Luskey，Mol.Cell.Biol.7(5)1881-1893(1987))；固醇調(diào)節(jié)元件1(SRE-1；Smith等人，J.Biol.Chem.265(4)2306-2310(1990))；烯醇丙酮酸磷酸羥激酶(PEPCK)啟動子(Eisenberger等人，Mol.Cell.Biol.12(3)1396-1403(1992))；人類C-反應(yīng)性蛋白(CRP)啟動子(Li等人，J.Biol.Chem.265(7)4136-4142(1990))；人類葡糖激酶啟動子(Tanizawa等人，Mol.Endocrinology6(7)1070-81(1992))；膽固醇7-α水解酶(CYP-7)啟動子(Lee等人，J.Biol.Chem.269(20)14681-9(1994))；β-半乳糖苷酶α-2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶啟動子(Svensson等人，J.Biol.Chem.265(34)20863-8(1990))；胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBP-1)啟動子(Babajko等人，Biochem Biophys.Res.Comm.196(1)480-6(1993))；醛縮酶B啟動子(Bingle等人，Biochem J.294(Pt2)473-9(1993))；人類運(yùn)鐵蛋白啟動子(Mendelzon等人，Nucl.Acids Res.18(19)5717-21(1990))；I型膠原蛋白啟動子(Houglum等人，J.Clin.Invest.94(2)808-14(1994))。
典型的前列腺組織特異性表達(dá)元件包括但不限于前列腺烷酸磷酸酶(PAP)啟動子(Banas等人，Biochim.Biophys.Acta.1217(2)188-94(1994))；前列腺分泌蛋白94(PSP94)啟動子(Nolet等人，BiochimBiophys.ACTA 1098(2)247-9(1991))；前列腺特異性抗原復(fù)合物啟動子(Casper等人，J.Steroid Biochem.Mol.Biol.47(1-6)127-35(1993))；人類腺激肽釋放激素基因啟動子(hgt-1)(Lilja等人，World J.Urology11(4)188-91(1993))。
典型的胃組織組織特異性表達(dá)元件包括但不限于人類H+/K+-ATP酶α-亞單位啟動子(Tanura等人，F(xiàn)EBS Letters 298(2-3)137-41(1992))。
典型的胰組織特異性表達(dá)元件包括但不限于胰炎相關(guān)蛋白啟動子(PAP)(Dusetti等人，J.Biol.Chem.268(19)14470-5(1993))；彈性蛋白酶1轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子(Kruse等人，Genes and Development 7(5)774-86(1993))；胰特異性淀粉酶和彈性蛋白酶增強(qiáng)子啟動子(Wu等人，Mol.Cell.Biol.11(9)4423-30(1991)；Keller等人，Genes and Dev.4(8)1316-21(1990))；胰膽固醇酯酶基因啟動子(Fontaine等人，Biochemistry 30(28)7008-14(1991))。
典型的子宮內(nèi)膜組織特異性表達(dá)元件包括但不限于子宮珠蛋白啟動子(Helftenbein等人，Annal.NY Acad.Sci.62269-79(1991))。
典型的腎上腺細(xì)胞組織特異性表達(dá)元件包括但不限于膽固醇側(cè)鏈切割(SCC)啟動子(Rice等人，J.Biol.Chem.26511713-20(1990))。
典型的全身神經(jīng)系統(tǒng)組織特異性表達(dá)元件包括但不限于γ-γ烯醇化酶(神經(jīng)元特異性烯醇化酶，NSE)啟動子(Forss-Petter等人，Neuron5(2)187-97(1990))。
典型的腦組織特異性表達(dá)元件包括但不限于神經(jīng)絲重鏈(NF-H)啟動子(Schwartz等人，J.Biol.Chem.269(18)13444-50(1994))。
典型的淋巴細(xì)胞組織特異性表達(dá)元件包括但不限于人類CGL-1/粒酶B啟動子(Hanson等人，J.Biol.Chem.266(36)24433-8(1991))；末端脫氧轉(zhuǎn)移酶(TdT)、λ-5、Vpre B和lck(淋巴細(xì)胞特異性酪氨酸蛋白激酶p56lck)啟動子(Lo等人，Mol.Cell.Biol.11(10)5229-43(1991))；人類CD2啟動子及其3′轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子(Lake等人，EMBO J.9(10)3129-36(1990))和人類NK細(xì)胞和T細(xì)胞特異性激活(NKG5)啟動子(Houchins等人，Immunogenetics 37(2)102-7(1993))。
典型的結(jié)腸組織特異性表達(dá)元件包括但不限于pp60c-src酪氨酸激酶啟動子(Talamonti等人，J.Clin.Invest 91(1)53-60(1993))；器官特異性新抗原(OSN)、分子量40kDa(p40)啟動子(Ilantzis等人，Microbiol.Immunol.37(2)119-28(1993))；結(jié)腸特異性抗原P啟動子(Sharkey等人，Cancer 73(增刊3)864-77(1994))。
典型的胸腺細(xì)胞組織特異性表達(dá)元件包括但不限于人類α-乳清蛋白啟動子(Thean等人，British J.Cancer.61(5)773-5(1990))。
其它在目的組織中幫助表達(dá)的特異性的元件包括分泌型前導(dǎo)序列、增強(qiáng)子、核定位信號、內(nèi)體裂解(endosmolytic)肽等等。這些元件最好是從目的組織中得來以幫助特異性。
對本發(fā)明所述核酸序列進(jìn)行核酸操作的技術(shù)，如將編碼多肽的核酸序列亞克隆進(jìn)表達(dá)載體、探針標(biāo)記、DNA雜交等等，一般如Sambrook等人，Molecular Cloning—A Laboratory Manual(第二版)，第1-3卷，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，(1989)所述，這些通過引用結(jié)合到本文中。這份手冊下文稱為“Sambrook等人”。
一旦分離和克隆了編碼目的序列的DNA，就可以在各種重組工程化的細(xì)胞中表達(dá)所編碼的蛋白。預(yù)期本領(lǐng)域技術(shù)人員對可得到的多種用于表達(dá)編碼DNA的表達(dá)系統(tǒng)有足夠的知識。這里并不準(zhǔn)備詳細(xì)地描述已知的用于在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中表達(dá)蛋白的各種方法。
總的來說，編碼所關(guān)注序列的天然或合成核酸的表達(dá)的實(shí)現(xiàn)，一般是通過將所述DNA或cDNA操縱性地連接一個啟動子(不是組成型就是誘導(dǎo)型)，然后將其插入一個表達(dá)載體。所述載體可以是在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中適于復(fù)制和整合的。典型的表達(dá)載體包含轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子、起始序列和對調(diào)節(jié)所關(guān)注多核苷酸序列的表達(dá)有用的啟動子。為獲得一個克隆基因的高水平表達(dá)，有必要構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，所述表達(dá)質(zhì)粒至少包含一個指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)啟動子、一個用于翻譯起始的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和一個轉(zhuǎn)錄/翻譯終止子。所述表達(dá)載體還可以包含遺傳表達(dá)盒以及適于原核系統(tǒng)和真核系統(tǒng)的選擇標(biāo)記，其中所述遺傳表達(dá)盒至少包含一個獨(dú)立的終止子序列、以及允許質(zhì)粒在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞兩者中復(fù)制的序列，即穿梭質(zhì)粒。參見Sambrook等人。
可以通過各種方法，將本發(fā)明的E2F-RB融合構(gòu)成物在體內(nèi)或離體引入目的組織。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，通過如顯微注射、磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)體融合或生物發(fā)射(biolistics)等方法，將所述核酸、最好是DNA引入細(xì)胞中。在其它實(shí)施方案中，由目的組織直接攝入所述DNA。在其它實(shí)施方案中，將所述構(gòu)成物包裝進(jìn)一個病毒載體系統(tǒng)以利于將其引入細(xì)胞。
本發(fā)明的實(shí)踐中有用的病毒載體系統(tǒng)包括腺病毒、皰疹病毒、腺伴隨病毒、小鼠微小病毒(MVM)、HIV、新培斯病毒、和逆轉(zhuǎn)錄病毒如勞斯肉瘤病毒以及MoMLV。一般將本發(fā)明的構(gòu)成物插入這樣的載體中，以便包裝所述E2F-RB表達(dá)構(gòu)成物(一般是與伴行病毒DNA一起)，感染一種敏感的宿主細(xì)胞并表達(dá)所述E2F-RB基因。一種特別有利的載體是Wills等人，Human Gene Therapy 51079-1088(1994)公開的腺病毒載體。
在本發(fā)明其它的實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組DNA構(gòu)成物通過一個DNA連接部分連接到一種細(xì)胞受體的配體上以利于攝取(如有被小窩的內(nèi)陷和內(nèi)體的內(nèi)化)(Wu等人，J.Biol.Chem.26314621-14624(1988)；WO 92/06180)。例如，本發(fā)明的DNA構(gòu)成物可以通過一個多聚賴氨酸部分連接脫唾液酸-oromucocid，即肝細(xì)胞脫唾液酸糖蛋白受體的配體。
相似的，可以通過加入受體的配體或特異性針對一種受體的抗體，對用于包裝本發(fā)明構(gòu)成物的病毒被膜進(jìn)行改變，以利用受體介導(dǎo)的胞飲作用進(jìn)入特定細(xì)胞(如WO 93/20221，WO 93/14188；WO94/06923)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的DNA構(gòu)成物連接到病毒蛋白，如腺病毒顆粒上，以利于胞飲作用(Curiel等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.888850-8854(1991))。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的分子綴合物可以包括微管抑制劑(WO 94/06922)；模擬流感病毒血凝素的合成肽(Plank等人，J.Biol.Chem. 26912918-12924(1994))；和核定位信號，如SV40T抗原(WO 93/19768)。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，直接將本發(fā)明的多肽給予需要治療的患者?！爸委熡行У摹眲┝渴侵缸阋灶A(yù)防或減弱高增殖性疾病的嚴(yán)重性的多肽的劑量。本文使用的術(shù)語“高增殖性的細(xì)胞”包括但不限于具有自主生長能力的細(xì)胞，即其獨(dú)立于正常調(diào)節(jié)機(jī)制之外生存和繁殖。高增殖性疾病可以被歸類為病理性的，即不同于正常細(xì)胞并且其特征構(gòu)成疾??；或者可以被歸類為非病理性的，即不同于從正常細(xì)胞但與疾病狀態(tài)無關(guān)。病理性高增殖性細(xì)胞是以下疾病狀態(tài)的特征再狹窄、糖尿病性視網(wǎng)膜病、甲狀腺增生、突眼性甲狀腺腫、牛皮癬、良性前列腺肥大、Li-Fraumeni綜合征包括乳腺癌、肉瘤和其它腫瘤、膀胱癌、結(jié)腸癌、肺癌、各種白血病和淋巴瘤。例如，在哺乳發(fā)育期間的哺乳類導(dǎo)管上皮細(xì)胞中和在與損傷修復(fù)有關(guān)的細(xì)胞中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了非病理性高增殖性細(xì)胞的例子。病理性高增殖性疾病細(xì)胞特征性地顯示出接觸抑制的喪失以及其選擇性粘附能力的衰減，而這種衰減意味著細(xì)胞通訊的衰減。這些改變包括進(jìn)行分裂的刺激和分泌蛋白水解酶的能力。
在對各種癌癥和其它RB的給予是有利的病理狀況的治療中，本發(fā)明的構(gòu)成物是有用的，其中所述病理狀況包括但不限于外周血管疾病和糖尿病性視網(wǎng)膜病。雖然任何組織都可作為靶組織并且可以鑒定針對性的某種組織特異性表達(dá)元件，如啟動子，但人們特別關(guān)注的是針對高增殖性疾病(如再狹窄)組織特異性地給予一種RB構(gòu)成物，為此平滑肌肌動蛋白啟動子是優(yōu)選的。
為采用本領(lǐng)域內(nèi)已知并且是對哺乳類受治療者、最好是人類的給藥所接受的方法給藥，配制本發(fā)明的組合物。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，可以將本發(fā)明的組合物通過注射直接給予一種組織，或通過給予為目的組織供血的血管而給藥。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，將本發(fā)明的組合物“局域性”給藥，即膀胱內(nèi)、損傷內(nèi)和/或局部給藥。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，通過注射、吸入、栓劑、經(jīng)皮傳遞等方法系統(tǒng)地給予本發(fā)明的組合物。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，通過導(dǎo)管或其它裝置給予所述組合物，以便能達(dá)到目的遠(yuǎn)處的組織，如內(nèi)臟。也可以在貯存型裝置、植入物或膠囊制劑中給予本發(fā)明的組合物，以便能緩慢或持續(xù)地釋放所述組合物。
本發(fā)明提供給藥組合物，其中所述組合物包括溶解或懸浮于一種可接受的載體、最好是一種水性載體中的本發(fā)明的組合物的溶液。可以使用各種水性載體，如水、緩沖水、0.8％鹽水、0.3％甘氨酸、透明質(zhì)酸等等?？梢允褂贸Ｒ?guī)的、廣為人知的滅菌技術(shù)對這些組合物進(jìn)行滅菌，或可以使用除菌過濾。可以將得到的水溶液原樣包裝使用，或?qū)⑵鋬龈?，并在給藥前將凍干制劑與一種無菌溶液混合。所述組合物中可以根據(jù)需要含有藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)以接近生理?xiàng)l件，如pH調(diào)整劑和緩沖劑、張力調(diào)整劑、潤濕劑等等，例如，醋酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、山梨糖醇-單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等等。
在藥用制劑中本發(fā)明組合物的濃度可以變化很大，即從少于0.1％(重量)直到20％到50％(重量)或更多，通常是大約2％或至少2％(重量)，這主要依據(jù)選定特定給藥模式，根據(jù)流體體積、粘度等等進(jìn)行選擇。
也可以脂質(zhì)體給予本發(fā)明的組合物。脂質(zhì)體包括乳液、泡沫、微團(tuán)、不溶的單分子層、液晶、磷脂分散體、片層等等。在這些制劑中，把要傳送的本發(fā)明組合物作為脂質(zhì)體的一部分加入或是單獨(dú)加入，或是與一種結(jié)合既定目標(biāo)的分子(如抗體)、或是與其它治療組合物或免疫原性組合物結(jié)合加入。這樣，本發(fā)明的填充或布置有本發(fā)明組合物的脂質(zhì)體，可以被系統(tǒng)地傳送到、或可以被定向到一種目的組織，然后脂質(zhì)體就在所述組織中傳遞選定的治療/免疫原性肽組合物。
本發(fā)明中使用的脂質(zhì)體是從標(biāo)準(zhǔn)的小泡形成脂質(zhì)來形成。脂質(zhì)體一般包括中性和帶負(fù)電荷的磷脂和一種固醇，如膽固醇。脂質(zhì)選擇的一般指導(dǎo)是考慮如在血流中脂質(zhì)體的大小、脂質(zhì)體的酸不穩(wěn)定性和穩(wěn)定性。已經(jīng)有各種可用的制備脂質(zhì)體的方法，如Szoka等人，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9467(1980)，美國專利第4,235,871號、4,501,728號、4,837,028號和5,019,369號中所述，這些都通過引用結(jié)合到本文中。
可以采用靜脈內(nèi)、局部、表面等途徑給予包含本發(fā)明組合物的脂質(zhì)體懸浮液，給藥劑量尤其根據(jù)給藥方式、所傳送的本發(fā)明組合物和所治療的疾病的階段而變。
對于固體組合物來說，可以使用常規(guī)的無毒固相載體，包括如藥物級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等等。對于口服給藥，通過加入任何一種通常使用的賦形劑，如前面所列出的那些載體，以及通常是10-95％、更優(yōu)選是25％-75％的濃度的活性成分，即一種或多種本發(fā)明的組合物，可以制成藥學(xué)上可接受的無毒組合物。
對于氣霧劑給藥，最好將本發(fā)明的組合物以良好分散的形式并與一種表面活性物質(zhì)以及拋射劑一起提供。本發(fā)明的組合物的一般百分比是0.01％-20％(重量)，最好是1％-10％。當(dāng)然，所述表面活性劑必須是無毒的，并且最好可溶于拋射劑中。這樣的介質(zhì)的代表是包含6到22個碳原子的脂肪酸(如己酸、辛酸、月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、olesteric acid和油酸)與一種脂肪族多元醇或其環(huán)酐形成的酯或部分酯。可以使用混合酯，如混合的或天然的甘油酯。所述表面活性劑可以構(gòu)成組合物的0.1％-20％(重量)，最好是0.25-5％。組合物的剩余部分通常是拋射劑。可以按照需要再包括一種載體，如包括卵磷脂以進(jìn)行鼻內(nèi)傳遞。
此外，可以使用本領(lǐng)域內(nèi)廣為人知的技術(shù)，在貯存型系統(tǒng)、膠囊化形式或植入物中傳遞本發(fā)明的組合物。同樣，可以通過一個泵將所述構(gòu)成物傳遞給目的組織。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，將本發(fā)明的組合物離體給予從患者移出的細(xì)胞或組織，然后將所述細(xì)胞或組織移植回患者?；蛑委煒?gòu)成物離體給予的例子包括Arteaga等人，Cancer Research 56(5)1098-1103(1996)；Nolta等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(6)2414-9(1996)；Koc等人，Seminars in Oncology 23(1)46-65(1996)；Raper等人，Annals ofSurgery 223(2)116-26(1996)；Dalesandro等人，J.Thorac.Cardi.Surg.11(2)416-22(1996)；和Makaroy等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(1)402-6(1996)。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，在氣囊血管成形術(shù)之后將本發(fā)明的構(gòu)成物給予心臟動脈，以防止或減弱再狹窄的嚴(yán)重性。本發(fā)明的構(gòu)成物可以用于包被血管成形術(shù)所使用的裝置(例如，參見Willart等人，Circulation 892190-2197(1994)；French等人，Circulation 902402-2413(1995))。在其它實(shí)施方案中，可以以相同方法使用本發(fā)明的融合多肽。
下面的實(shí)施例以舉例說明的目的包括入本文中，并且不應(yīng)該被認(rèn)為是限制本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例IE2F-RB融合體A.介紹在這個實(shí)施例中，構(gòu)建了編碼與RB56多肽融合的E2F的不同區(qū)段的表達(dá)質(zhì)粒。RB56是全長的RB的一種亞片段，包含對于生長抑制所必需的“袋”域(Hiebert等人，MCB 133384-3391(1993)；Qin等人，Genesand Rev.6953-964(1992))。E2F194包含E2F氨基酸95-194。這個片段僅包含E2F的DNA結(jié)合域。E2F286包含DNA結(jié)合域和DP-1異二聚化域。這兩種E2F片段都缺失N末端細(xì)胞周期蛋白A-激酶結(jié)合域，而這個域似乎向下調(diào)節(jié)E2F的DNA結(jié)合活性(Krek等人，Cell 83149-1158(1995)；Krek等人，Cell 78161-172(1994))。B.載體的構(gòu)建質(zhì)粒pCTM包含一個CMV啟動子、一段側(cè)翼為T7啟動子和SP6啟動子的三聯(lián)腺病毒前導(dǎo)序列、一個多克隆位點(diǎn)，并且在多克隆位點(diǎn)下游還有一個牛生長激素(BGH)多腺苷酸化位點(diǎn)和一個SV40多腺苷酸化位點(diǎn)。圖3提供了pCTM的一個圖示。圖4提供了pCTM的DNA序列。
用Xho I和Not I消化pCTM并從一個pCTM-β-gal載體(Clonetech)亞克隆一個180bp的內(nèi)含子Xho I-Not I片段，從pCTM構(gòu)建pCTMI。圖5提供了pCTMI的一個圖示。圖6提供了pCTMI的DNA序列。
在一個聚合酶鏈反應(yīng)中從SV40病毒DNA擴(kuò)增SV40增強(qiáng)子，構(gòu)建pCTMIE。將擴(kuò)增產(chǎn)物用Bgl II消化，插入用BamH I消化的pCTMI，并在BamH I的存在下進(jìn)行連接。圖7圖解描述了該質(zhì)粒。圖8提供了pCTMIE的DNA序列。
如下制備pCTM-RB。將pETRBc(Huang等人，Nature 350160-162(1991))的一段3.2KB的包含全長人RB cDNA的Xba I-Cla I片段與用Xba I-Cla I消化的pCTM連接。將消化過的pCTM連接到一個1.7KB的包含RB56編碼序列的XbaI-ClaI片段上，制備pCTM-RB56。使用同樣方法構(gòu)建PCTMI-RB、pCTMIE-RB、pCTMI-RB56(氨基酸381-928)和pCTMIE-RB56(氨基酸381-928)。C. RB-E2F融合構(gòu)成物圖9描述了在這些研究中使用的融合構(gòu)成物。這些E2F構(gòu)成物起始于氨基酸95并且缺少部分細(xì)胞周期蛋白A結(jié)合域。E2F437包含DNA結(jié)合域(黑)、異二聚化域(白)和反式激活域(條紋)。E2F194僅包含DNA結(jié)合域。E2F286包含DNA結(jié)合域和DP-1異二聚化域。RB56-5s是指一種在氨基酸殘基606、612、788、807和811具有丙氨酸取代的RB變異體。在E2F194-RB56-5s和E2F286-RB56-5s中，E2F片段符合讀框地融合到RB-5s的密碼子379上。RB56-C706F包含一個致失活點(diǎn)突變(Kaye等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.876922-6926(1990))。
如下所述構(gòu)建pCMV-E2F194和pCMV-E2F437。在一個聚合酶鏈反應(yīng)中擴(kuò)增編碼E2F的氨基酸95-194(包含DNA結(jié)合域)或氨基酸95-437的DNA，用Hind II消化，然后連接進(jìn)用Sma I/Hind II消化的pCMV-RB56載體。將pCMV-E2F437用Afl II消化，用DNA聚合酶I(克列諾片段)處理末端并在Afl II的存在下重新連接，從而構(gòu)建pCMVE2F286。平端連接在287位產(chǎn)生了一個終止密碼子。將Afl II(平端)/Hind III消化的pE2F437與一個包含RB56-5s編碼序列的Sal I(平端)-Hind III片段連接，構(gòu)建pCMV-E2F286-5s。通過將EcoR I-EcoR V消化的pCTMIE(4.2KB)連接到從pCMV-E2F194-RB5s或pCMV-E2F286-RB5s得到的Hind III(平端)/EcoR I片段上，構(gòu)建pCTMIE-E2F194-5s和pCTMIE-E2F286-RB5s。D.啟動子阻抑為衡量E2F-RB融合蛋白的效應(yīng)，用等量的E2F194-RB56或E2FRB56與一個E2-CAT報(bào)道質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞系C33A(ATCC#HTB-31)(參見，如Weintraub等人，Nature 358259-261(1992))。
在C33A分析中，在6孔組織培養(yǎng)板的每個孔中接種250,000個C33A細(xì)胞并使其粘附過夜。每孔分別用5μg的pCMV-RB56、pCMV-E2FRB56或pCMV-E2F質(zhì)粒與5μg指示的報(bào)道基因構(gòu)成物(E2-CAT或SVCAT)以及2.5μg β-gal質(zhì)粒(pCMV-β，Clonetech)共轉(zhuǎn)染(磷酸鈣法，MBS轉(zhuǎn)染試劑盒，Stratagene)，并進(jìn)行雙份實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染后72小時收獲細(xì)胞并制備提取物。
在5637分析中，如上所述每孔接種250,000個5637細(xì)胞。使用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑(BRL，Bethesda，Maryland)按照廠家的介紹，用RB或E2F-RB融合體質(zhì)粒、E2-CAT或SV-CAT報(bào)道質(zhì)粒以及pCMV-β-半乳糖苷酶各1μg共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
使用20μl(C33A)或50μl(5637)細(xì)胞提取物進(jìn)行CAT分析(Gorman等人，Mol.Cell.Biol.21044(1982))。在一臺Phosphoimager SF(Molecular Dynamics)上分析TLC 。用根據(jù)每種提取物中β-半乳糖苷酶活性，對于轉(zhuǎn)染效率將CAT活性歸一化。如Rosenthal等人(Meth.Enzym.152704(1987))所述分析提取物的β-半乳糖苷酶活性。
這些研究的結(jié)果如下所示。單獨(dú)E2-CAT報(bào)道質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染，或在無功能的對照RB56-H209突變體的存在下E2F-CAT的轉(zhuǎn)染，產(chǎn)生了相對高的CAT活性。與野生型RB56或變異體RB56-5s的共轉(zhuǎn)染導(dǎo)致CAT活性10到12倍的阻抑，這表明RB56或RB56-5s都能有效阻抑依賴于E2F的轉(zhuǎn)錄。E2F194-RB5s和E2F286-RB5s大約50倍地阻抑轉(zhuǎn)錄。由于E2F194和E2F286的表達(dá)并不介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄阻抑，因此轉(zhuǎn)錄阻抑需要融合蛋白的RB56成分和E2F成分。使用E2F-RB構(gòu)成物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時并不發(fā)生對SV40-CAT轉(zhuǎn)錄的阻抑，這就顯示了E2FRB針對E2啟動子的轉(zhuǎn)錄阻抑的特異性。圖10圖解描繪了這些結(jié)果。E.細(xì)胞周期的停滯已經(jīng)探索了E2F-RB融合多肽在Saos-2(RB-/-細(xì)胞)(ATCC #HTB-85)和C33A細(xì)胞中導(dǎo)致G1停滯的能力。以前的研究已經(jīng)顯示，RB介導(dǎo)的啟動子阻抑和G1停滯在Saos-2細(xì)胞中是相關(guān)的，但是在C33A(RB突變)細(xì)胞中是無關(guān)的(Xu等人，PNAS 921357-1361(1992))。在PBS中沖洗細(xì)胞并在1ml-20℃70％乙醇中固定30分鐘。離心收集細(xì)胞，重懸浮于0.5ml含10μg/ml RNase A的2％血清中，于37℃溫育30分鐘。在每個樣品中加入0.5ml含碘化丙錠(100μg/ml)的PBS，混合，然后用一個FACS管帽過濾器(tube capstrainer)過濾細(xì)胞。在一臺FACS-Scan(Becton-Dickenson)中使用雙峰鑒別(doublet discrimination)進(jìn)行FACS分析。分析5,000-10,000個CD20+細(xì)胞。使用Modfit模造軟件確定處于G0/G1、S1和G2/M的細(xì)胞的百分比。
這個實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如下所示。全長的RB110和被截短的RB110，即RB56，在Saos-2細(xì)胞中導(dǎo)致G1停滯，但對照突變體RB-H209并不顯示這種活性(表1)。相似地，RB56-5s、E2F-194-RB56-5s和E2F286-RB56-5s都能使細(xì)胞停滯在G0/G1期。DNA結(jié)合域，即E2F194的轉(zhuǎn)染在Saos-2中并不阻斷細(xì)胞進(jìn)入S期，如以前針對嚙齒類細(xì)胞所述(Dobrowolski等人，Oncogene 92605-2612(1994))。與此相比，RB110、RB56和E2F-RB融合蛋白并不能使C33A細(xì)胞系停滯，這表明在這些細(xì)胞中觀察到的轉(zhuǎn)錄阻抑并不能說明G1停滯。
也已經(jīng)探索了E2F-RB融合蛋白使5637細(xì)胞停滯的能力(表2)。RB56和RB56-5s都有效地使細(xì)胞停滯在G0/G1期(大約90％的細(xì)胞處于G0-G1期)，而E2F194-RB56-5s和E2F286-RB56-5s在促進(jìn)G0/G1停滯上效果稍差一些(大約80％的細(xì)胞處于G0/G1)。由于沒有被任何一種理論限制，E2F-RB融合蛋白對Saos-2細(xì)胞和5637細(xì)胞的有效性稍差一些的阻滯作用看來是由于在這些細(xì)胞中產(chǎn)生的穩(wěn)態(tài)蛋白水平低(圖11，板b和板c)。表1RB和E2F-RB在RB融合蛋白陰性細(xì)胞中的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)
表2RB和E2F-RB融合蛋白導(dǎo)致5637膀胱細(xì)胞的生長抑制
F.在有功能的RB背景中融合蛋白的活性然后測定在一個包含有功能的RB的細(xì)胞背景中E2F-RB融合蛋白的活性。用RB56或E2F-RB56融合體轉(zhuǎn)染NIH-3T3細(xì)胞，然后用抗RB的單克隆抗體3C8染色(Wen等人，J，Immuno.Meth.169231-240(1994))。對這些表達(dá)RB的細(xì)胞進(jìn)行FACS分析。圖12顯示了結(jié)果。非門控群體(non-gated population)(g)顯示了NIH-3T3細(xì)胞的特征性細(xì)胞周期分布(60％G0期，28％S期，10％G2/M期)。與此相比，在用RB56(a，b)或E2F-RB融合蛋白(c-f)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，多于90％的表達(dá)RB的細(xì)胞被停滯在G0/G1期。這些數(shù)據(jù)表明，RB和E2F-RB56融合體使細(xì)胞停滯在G0/G1期的能力并不限于RB陰性腫瘤細(xì)胞。還探索了在被轉(zhuǎn)染的NIH-3T3細(xì)胞中表達(dá)的蛋白的相對水平。RB110在這些細(xì)胞中并不能有效地表達(dá)。
因此，這些數(shù)據(jù)表明，E2F-RB融合蛋白是比單獨(dú)的pRB或RB56更有效的轉(zhuǎn)錄阻抑物，并且RB能通過保持結(jié)合E2F、而不是直接阻斷E2F的反式激活域而阻抑轉(zhuǎn)錄。這些數(shù)據(jù)支持在RB+細(xì)胞和RB陰性或RB突變細(xì)胞中使用E2F-RB融合體作為RB激動劑。實(shí)施例IIE2F-RB融合體的組織特異性表達(dá)A.重組腺病毒的構(gòu)建在這個實(shí)驗(yàn)中，產(chǎn)生了重組腺病毒，所述重組腺病毒包含處于一個CMV啟動子或平滑肌α-肌動蛋白啟動子控制之下的RB多肽。
通過PCR從一個基因組文庫中分離平滑肌α-肌動蛋白啟動子(堿基-670到+5，Reddy等人，“人平滑肌α-肌動蛋白基因的結(jié)構(gòu)”J.Biol.Chem.2651683-1687(1990)，Nakano等人，“人平滑肌(主動脈型)α-肌動蛋白編碼基因5’上游的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件和第一個內(nèi)含子”Gene99285-289(1991))，并為克隆目的加入5′Xho I和Avr II和3′Xha I、Cla I和Hind III限制酶位點(diǎn)。將所述片段作為一個Xho I、Hind III片段亞克隆進(jìn)一個質(zhì)粒，進(jìn)行測序以證實(shí)其堿基組成。一個融合構(gòu)成物286-56作為Xha I、Cla I片段亞克隆進(jìn)平滑肌α-肌動蛋白啟動子的直接下游，將該表達(dá)盒消化出來，作為一個Xba I到Ayr II和Cla I片段克隆進(jìn)質(zhì)粒pAd/ITR/IX-，產(chǎn)生質(zhì)粒pASN286-56，其中所述融合構(gòu)成物286-56包含連接到p56(全長RB的氨基酸379-928)上的E2F-1的DNA結(jié)合域和異二聚化域(氨基酸95-286)。這個質(zhì)粒包含處于pBR322背景中的腺病毒5型的末端反向重復(fù)(ITR)、包裝信號和Ela增強(qiáng)子，其后是人類平滑肌α-肌動蛋白啟動子和286-56盒，然后是Ad 2序列4021-10462 (包含Elb/蛋白IX polyA信號)。使用標(biāo)準(zhǔn)程序產(chǎn)生重組腺病毒。
將質(zhì)粒pASN286-56用Ngo MI線性化，并與用Cla I消化rAd34得到的大片段共轉(zhuǎn)染進(jìn)293細(xì)胞，其中所述用Cla I消化rAd34得到的大片段在腺病毒5型的E3和E4區(qū)都有缺失。Ad34是血清型5的一種衍生型，含有早期區(qū)3的一個1.9KB缺失和早期區(qū)4的一個1.4KB缺失，其中所述1.9KB缺失是由于Xba I限制片段的缺失所致，其坐標(biāo)從Ad5的28593延伸到30470，所述1.4KB缺失是由于E4的一個TaqI片段(坐標(biāo)為33055-35573)被一個包含E4 ORF6和6/7的cDNA置換所致。
分離用同源重組產(chǎn)生的重組腺病毒，并用限制酶消化分析進(jìn)行鑒定，進(jìn)一步地用有限稀釋法進(jìn)行純化。其它對照重組腺病毒在別處描述，并且包含對照病毒ACN(CMV啟動子，Wills等人，“肝細(xì)胞癌的基因治療HSV-1胸苷激酶基因的腺病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移賦予的化學(xué)敏感性”Cancer Gene Therapy 2191-197(1995))和ACN56(處于一個CMV啟動子控制下表達(dá)的RB)。
如下所述制備ACN56。用從質(zhì)粒pET 9a-RB56(Antelman等人，Oncogene 10697-704(1995))中分離到的包含p56 cDNA的1.7KBXbaI-BamHI片段，置換質(zhì)粒ACNP53(Wills等人，Human Gene Therapy51079-1088(1994))中的p53 cDNA，構(gòu)建一個包含p56 cDNA的質(zhì)粒。得到的質(zhì)粒包含p56的氨基酸381-928、Ad5的末端反向重復(fù)、病毒包裝信號和Ela增強(qiáng)子，其后是驅(qū)動p56表達(dá)的人類巨細(xì)胞病毒立即早期啟動子(CMV)和Ad 2三聯(lián)前導(dǎo)序列cDNA。p56 cDNA之后是處于pBR322背景中的Ad 2序列4021-10462。將這個質(zhì)粒用EcoR I線性化，并與bsp106消化DL327得到的大片段(缺失E3；Thimmappaaya等人，Cell31543-551(1982))或h5ile4(缺失E4；Hemstrom等人，J.Virol.623258-3264(1988))共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。進(jìn)一步用有限稀釋法純化重組病毒。B.細(xì)胞增殖在這個實(shí)驗(yàn)中，用重組腺病毒RB構(gòu)成物感染培養(yǎng)物中的細(xì)胞系，以確定所述RB多肽的相對表達(dá)和對細(xì)胞增殖的效應(yīng)。
將H358(ATCC #Crl 5807)細(xì)胞和MDA-MB468 (ATCC #HTB132，乳腺癌)細(xì)胞以5,000細(xì)胞/孔的細(xì)胞平板接種在96孔微量滴定板(Costar)的正常生長培養(yǎng)基中，在37℃，7％CO2條件下培育過夜。在生長培養(yǎng)基中連續(xù)稀釋病毒，并以指定劑量用病毒感染細(xì)胞48小時。在這個時刻加入3H-胸苷(Amersham，0.5μCi/孔)，并將細(xì)胞在收獲前在37℃下再培育3小時。將A7r5(ATCC CRL1444，大鼠平滑肌)細(xì)胞和A10(ATCC CRL 1476，大鼠平滑肌)細(xì)胞都以3,000細(xì)胞/孔的細(xì)胞平板分別接種到DME+0.5％FCS或DME+20％FCS中。在接種培養(yǎng)基中連續(xù)稀釋病毒，并以圖中指示劑量用病毒感染細(xì)胞。對A10細(xì)胞的感染和標(biāo)記程序與H358和MDA-MB468細(xì)胞同，但使用2μCi/孔的標(biāo)記物。在接種后48小時才用病毒感染A7r5細(xì)胞。感染后48小時，將血清濃度提高到10％FCS，并加入2μCi/孔的3H-胸苷，在收獲前繼續(xù)培育3小時。從孔中吸出培養(yǎng)基，胰蛋白酶消化細(xì)胞，并使用帶有一個Packard Top計(jì)數(shù)細(xì)胞收集器的96孔GF/C濾器進(jìn)行收獲，從而收獲全部細(xì)胞。結(jié)果在圖13和圖14中以培養(yǎng)基處理的對照增殖的平均百分比(+/-SD)對病毒劑量作圖。
這樣，圖13就描述了腺病毒p56構(gòu)成物對肌細(xì)胞A10和A7R5細(xì)胞的效應(yīng)的比較。CMV驅(qū)動的p56(ACN 56)病毒大約與肌動蛋白啟動子驅(qū)動的E2F-融合構(gòu)成物(ASN586-56 #25，26)同等程度地抑制A10生長。圖14描述了腺病毒構(gòu)成物抑制乳腺癌細(xì)胞系MDA MB468和非小細(xì)胞性肺癌細(xì)胞系H358的效應(yīng)。在這些實(shí)驗(yàn)中，對于抑制非平滑肌細(xì)胞的生長，肌動蛋白啟動子驅(qū)動的E2F-p56是無效的，而CMV啟動子驅(qū)動的p56是有效的。
為確定非平滑肌細(xì)胞是否比所使用的平滑肌細(xì)胞系更易受腺病毒感染，用一種表達(dá)β-半乳糖苷酶的腺病毒(AcβGL；Wills等人，HumanGene Therapy 51079-1088(1994))以MOI 5感染四個細(xì)胞系H358、MB468、A7R5和A10，并檢測β-gal染色的程度。如圖15(上)所示，非平滑肌細(xì)胞系顯著地比平滑肌細(xì)胞系更易被感染。在另一個實(shí)驗(yàn)中，用ACN56以更高的感染復(fù)數(shù)(50，100，250，500)感染細(xì)胞，然后用放射自顯影檢測被感染細(xì)胞中存在的p56的量。如在圖15(下)中可參見，非肌細(xì)胞系中顯著地有更多的p56存在，這是由于它們有更大的感染性，被感染的細(xì)胞具有更大的病毒負(fù)載，也就有更多的由非組織特異性CMV啟動子驅(qū)動的p56模板的拷貝。
在另一個實(shí)驗(yàn)中，確定了針對平滑肌肉組織的肌動蛋白平滑肌啟動子的特異性。在這個實(shí)驗(yàn)中，測量了用不同啟動子驅(qū)動的β-gal構(gòu)成物感染的細(xì)胞中β-gal表達(dá)的水平。如在圖19中可參見，盡管對這些平滑肌細(xì)胞的感染性較低，但只有使用平滑肌α-肌動蛋白啟動子在這些細(xì)胞中的表達(dá)是明顯的。
圖21描述了一個CMV驅(qū)動的p56重組腺病毒(ACN56E4)、一個人類平滑肌α-肌動蛋白啟動子驅(qū)動的E2F-p56融合構(gòu)成物(ASN286-56)、一個對照腺病毒構(gòu)成物的效應(yīng)的比較，其中所述對照腺病毒構(gòu)成物具有不含下游轉(zhuǎn)基因的CMV啟動子或平滑肌α-肌動蛋白啟動子(分別為顯示的ACNE3或ASBE3-2分離物)。分析是在一種平滑肌細(xì)胞系(A7R5)或一種非肌細(xì)胞系(MDA-MB468，乳腺癌)中進(jìn)行的3H-胸苷攝入分析。結(jié)果顯示了使用平滑肌α-肌動蛋白啟動子的肌肉組織特異性以及p56和E2F-p56轉(zhuǎn)基因相對于它們各自的對照的特異性抑制。C.對再狹窄的抑制氣囊損傷模型基于如Clowes等人(Clowes，Lab.Invest.49327-333(1983))所述模型。腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉(45mg/kg.Abbot Laboratories，North Chicago，Illnois)，麻醉重400-500g的雄性Sprague-Dawley大鼠。通過中線切開暴露左側(cè)頸總動脈杈并臨時結(jié)扎左側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈。將一根2F栓子切除術(shù)導(dǎo)管(Baxter Edwards HealthcareCrop.，Irvine，CA)引入頸外動脈并前進(jìn)至頸總動脈的遠(yuǎn)側(cè)結(jié)扎處。用鹽水灌注氣囊并將氣囊朝動脈切開術(shù)位點(diǎn)牽引3次以產(chǎn)生一個膨脹性去內(nèi)皮愈合損傷。然后取出導(dǎo)管。把一根插管在頸動脈杈附近插入動脈的臨時分離的區(qū)段。10μl腺病毒(1×109pfu的Ad-RB(ACNRb)或Ad-p56(ACN56))用15％(重量/體積)Poloxamer 407(BASF，Parsippany，N.J.)稀釋成100μl，將所述腺病毒或Ad-β-gal(1×109pfu，如上稀釋)通過所述插管注射進(jìn)去。將腺病毒溶液溫育20分鐘后，抽出病毒輸注液并取出導(dǎo)管。然后結(jié)扎近端頸外動脈并通過解開結(jié)扎恢復(fù)頸總動脈的血流。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)過機(jī)構(gòu)動物管理及使用委員會(Institutional Animal Care andUse Committee)批準(zhǔn)并且符合“實(shí)驗(yàn)動物護(hù)理(eare)和使用指南”(NIHPublication No.86-23，1985修訂)。
腹膜內(nèi)注射戊巴比妥(100mg/kg)處理14天后，處死大鼠。用鹽水灌注從肩胛舌骨肌近端緣到頸動脈杈的左側(cè)頸總動脈的最初氣囊損傷區(qū)段，并剖離周圍的組織。將該組織在100％甲醇中固定并包埋在石蠟中。從每個組織標(biāo)本切下幾個4-μm切片。將每個標(biāo)本中的一個切片用蘇木精和伊紅染色，另一個切片進(jìn)行Richardson’s組合彈性三色(elastic-trichrome)染色的常規(guī)光學(xué)顯微分析。
將蘇木精和伊紅染色的橫截面切片或彈性三色染色的動脈切片的組織學(xué)影像投影到一臺數(shù)字化板(Summagraphics)上，通過一個計(jì)算機(jī)化的繪圖程序(MACMEASURE，1.9版，National Institute of MentalHealth)進(jìn)行定量形態(tài)測量學(xué)分析，測量內(nèi)膜面積、中層面積和腔面積。
結(jié)果表示為平均值±S.E.M.。不同群體之間的差異用不配對雙尾Student’s t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。當(dāng)一個零效應(yīng)(null effect)的概率＜0.05時，就假設(shè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著性。
結(jié)果如圖17和18所示。在圖17中圖解描繪了對新內(nèi)膜形成的相對抑制，證明了p56和RB抑制新內(nèi)膜形成的能力。圖18提供了存在p56時新內(nèi)膜驚人減少的照片證據(jù)。
在氣囊損傷和感染2天后，從大鼠中收獲腺病毒處理的頸動脈。將組織在磷酸緩沖福爾馬林中固定并包埋在石蠟中。將組織切成4μm橫截面切片，并通過二甲苯和梯度乙醇脫蠟。用1％過氧化氫處理30分鐘，猝滅內(nèi)源過氧化物酶。在10mM檸檬酸鈉緩沖液，pH6.0中95℃下處理10分鐘，進(jìn)行抗原提取。加入含10μg/ml一種單克隆抗體(AB-5，Oncogene Sciences，Uniondale，New York)的PBS。在一個潮濕的室中4℃處理24小時。按照廠家的介紹使用Unitect∵鼠免疫組化試劑盒(Oncogene Sciences，Uniondale，New York)中的二級抗體。使用3，3’-二氨基聯(lián)苯胺(DAB，Vector Laboratories，Burlingame，CA)顯色抗體復(fù)合物。將載玻片用蘇木精薄層復(fù)染(thin counterstain)并封固。結(jié)果如圖20所描述。
為所有目的，本文提到的所有參考資料都通過引用完整地結(jié)合到本文中。
權(quán)利要求
1.一種多肽，包含一種轉(zhuǎn)錄因子和一種成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤(RB)多肽的融合體，其中所述轉(zhuǎn)錄因子包含一個DNA結(jié)合域，所述RB多肽包含一個生長抑制域。
2.編碼權(quán)利要求1的融合多肽的核酸。
3.權(quán)利要求2的核酸，其中所述核酸插入一種腺病毒載體中。
4.權(quán)利要求1的多肽，其中所述轉(zhuǎn)錄因子是E2F。
5.權(quán)利要求4的多肽，其中所述E2F的細(xì)胞周期蛋白A結(jié)合域缺失或是沒有功能的。
6.權(quán)利要求1的多肽，其中所述成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤多肽是RB56。
7.權(quán)利要求1的多肽，其中所述成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤多肽是野生型RB。
8.權(quán)利要求1的多肽，其中所述成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤多肽包含pRB的從約氨基酸殘基379到約氨基酸殘基928。
9.權(quán)利要求1的多肽，其中所述成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤多肽至少包含一個從以下選出的氨基酸殘基取代pRB的2、608、612、788、807和811。
10.權(quán)利要求5的多肽，其中所述E2F包含約氨基酸殘基95到約286。
11.權(quán)利要求4的多肽，其中所述E2F包含約氨基酸殘基95到約194。
12.權(quán)利要求1的多肽，其中所述融合體包含操縱性地連接到RB氨基酸殘基約379到約928上的EF2氨基酸殘基約95到約194。
13.一種包含編碼一種多肽的DNA的表達(dá)載體，其中所述多肽包含一種轉(zhuǎn)錄因子和一種成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤(RB)多肽的融合體，其中所述轉(zhuǎn)錄因子包含一個DNA結(jié)合域，所述RB多肽包含一個生長抑制域。
14.權(quán)利要求13的載體，包含操縱性地連接到編碼所述融合體的DNA上的一種組織特異性啟動子。
15.權(quán)利要求14的載體，其中所述組織特異性啟動子是一種平滑肌肌動蛋白啟動子。
16.治療患者的高增殖性疾病的方法，包括給予患者治療有效量的一種融合多肽，所述多肽包含一種轉(zhuǎn)錄因子和一種成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤(RB)多肽的融合體，其中所述轉(zhuǎn)錄因子包含一個DNA結(jié)合域，所述RB多肽包含一個生長抑制域。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述融合蛋白由傳遞給患者的一種核酸編碼。
18.權(quán)利要求16的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄因子是E2F。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述E2F的細(xì)胞周期蛋白A結(jié)合域缺失或是沒有功能的。
20.權(quán)利要求16的方法，其中所述RB是RB56。
21.權(quán)利要求16的方法，其中所述RB是野生型RB56。
22.權(quán)利要求16的方法，其中所述RB包含約氨基酸殘基379到約氨基酸殘基928。
23.權(quán)利要求16的方法，其中所述RB至少包含從以下選出的一個氨基酸殘基取代2、608、612、788、807和811。
24.權(quán)利要求18的方法，其中所述E2F包含約氨基酸殘基95到約286。
25.權(quán)利要求18的方法，其中所述E2F包含約氨基酸殘基95到約194。
26.權(quán)利要求16的方法，其中所述融合體包含操縱性地連接到RB氨基酸殘基約379到約928上的EF2氨基酸殘基約95到約194。
27.權(quán)利要求18的方法，其中所述E2F-RB融合多肽在一種組織特異性啟動子的控制下表達(dá)。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述組織特異性啟動子是一種平滑肌肌動蛋白啟動子。
29.權(quán)利要求16的方法，其中所述高增殖性疾病是癌癥。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述癌癥是膀胱癌。
31.權(quán)利要求29的方法，其中所述高增殖性疾病是再狹窄。
32.權(quán)利要求31的方法，其中在血管成形術(shù)之后給予所述E2F-RB融合多肽。
33.權(quán)利要求32的方法，其中將所述E2F-RB融合多肽作為血管成形術(shù)裝置上的涂層給予。
34.權(quán)利要求17的方法，其中在血管成形術(shù)之后給予所述核酸。
35.權(quán)利要求17的方法，其中將所述核酸作為血管成形術(shù)裝置上的涂層給予。
36.權(quán)利要求17的方法，其中所述核酸插入一種腺病毒載體中。
全文摘要
提供了轉(zhuǎn)錄因子E2F和成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白RB的融合體以及治療高增殖性疾病的方法。
文檔編號C07K14/82GK1244870SQ97181317
公開日2000年2月16日 申請日期1997年11月13日 優(yōu)先權(quán)日1996年11月15日
發(fā)明者D·安特爾曼, R·J·格雷戈里, K·N·維爾斯 申請人:坎吉有限公司