檢測粉塵螨過敏原特異性IgE抗體的試劑盒及方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)療器械生物類免疫體外診斷領域，特別是涉及一種檢測粉塵螨過敏 原特異性IgE抗體的試劑盒及方法。
【背景技術(shù)】
[0002] IgE抗體介導的I型過敏反應性疾病相當普遍，世界各國變態(tài)反應疾病的總發(fā)病 率約為15%_30%，我國大約有5-10%的人受過敏原的襲擾，是當前世界性的重大衛(wèi)生學問 題，被世界衛(wèi)生組織（WHO)列為二十一世紀重點防治的三大疾病之一。
[0003] 過敏性疾病是患者吸入、攝食入或者注入含有致敏成分的物質(zhì)（稱為過敏原或變 應原，Allergen)后觸發(fā)機體的B細胞產(chǎn)生特異性免疫球蛋白E(Immunoglobulin E, IgE)， 從而引發(fā)過敏反應(或稱變態(tài)反應，Allergy)的疾病及相關癥狀，如過敏性哮喘、枯草熱、蕁 麻疹、過敏性鼻炎、濕疹、結(jié)膜炎及胃腸道I型過敏性疾病及嚴重過敏反應等。上述過敏性 疾病的發(fā)生，IgE抗體起關鍵作用。
[0004] 粉塵螨中重要的致敏蛋白組分為Der Π和Der f2。塵螨既有共同的過敏原組分， 也有種屬特異性的過敏原組分。螨的一些致敏蛋白組分與無脊椎動物具有廣泛的交叉反應 性。
[0005] 在國內(nèi)，粉塵螨過敏原特異性IgE抗體（D2)檢測臨床上主要以國外進口試劑和免 疫組化試劑應用為主，國外進口試劑價格非常昂貴，給患者帶來很大的經(jīng)濟負擔，不利于在 基層普及。具有自主知識產(chǎn)權(quán)的國產(chǎn)粉塵螨過敏原特異性IgE抗體（D2)免疫化學發(fā)光檢 測試劑盒目前還沒有。
[0006] 因此，有待開發(fā)對粉塵螨過敏原特異性IgE抗體（D2)檢測靈敏度高與可靠性并能 降低檢測成本的檢測技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測粉塵螨過敏原特異性IgE抗體的試 劑盒及方法，該試劑盒性能可靠，靈敏度高，線性范圍寬，可配合全自動儀器使用，能提高檢 測靈敏度及可靠性，并降低成本，延長有效期。
[0008] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的一個技術(shù)方案是：提供一種粉塵螨過敏原特 異性IgE抗體的試劑盒，包括的試劑有：校準品、質(zhì)控品、生物素標記的粉塵螨過敏原溶液、 堿性磷酸酶標記的鼠抗人IgE二抗溶液、鏈霉親和素標記的納米磁微粒懸浮液。
[0009] 在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述生物素標記的粉塵螨過敏原溶液的濃度為 0. 1~1. 0 ug/ml ;所述鏈霉親和素標記的納米磁微粒懸浮液的濃度為0. 1~1. 0 mg/ml ;所述 堿性磷酸酶標記的鼠抗人IgE二抗溶液的濃度為0. 1~2. 0 ug/ml。
[0010] 在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述校準品的濃度為：0 IU/ml、0. 35 IU/ml、0. 7 IU/ml、3.5 IU/ml、17.5 IU/ml、50 IU/ml、100 IU/ml，所述校準品是 IgE 蛋白與 0·1Μ、ρΗ值 為7. 4的Tris-HCl緩沖液配制得到的；所述質(zhì)控品的濃度為：0. 7 IU/ml、17. 5 IU/ml，所述 質(zhì)控品是IgE蛋白與0. 1M、pH值為7. 4的Tris-HCl緩沖液配制得到的。
[0011] 在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述粉塵螨過敏原為能與人體內(nèi)粉塵螨特異性IgE 蛋白結(jié)合的抗原，所述生物素標記的粉塵螨過敏原溶液的制備過程為：將粉塵螨過敏原按 1:20摩爾比加入到溶于二甲基甲酰胺的生物素中，再用0. 1Μ、ρΗ值為7. 4的磷酸鹽緩沖液 透析得到。
[0012] 在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述標記的鼠抗人IgE二抗為能與人體內(nèi)IgE蛋 白特異結(jié)合的抗體，所述堿性磷酸酶標記的鼠抗人IgE二抗溶液的制備過程為：將濃度為 1. 0-5. Omg/mL的堿性磷酸酶溶液與鼠抗人IgE二抗按摩爾比為2-10 :1進行混合后并純 化，得到堿性磷酸酶標記的鼠抗人IgE二抗，所述純化是用pH為8-9的碳酸氫鹽緩沖液平 衡并洗脫，再紫外檢測和記錄純化圖譜，再用〇. 05M、pH值為6. 0的MES緩沖液對堿性磷酸 酶標記的鼠抗人IgE抗體稀釋。
[0013] 在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述鏈霉親和素標記的納米磁微粒懸浮液的制備過 程為：將鏈霉親和素標記的納米磁微粒用磁分離器沉淀，再用0. 01M、pH值為7. 4的磷酸鹽 緩沖液重懸，混勻磁分離沉淀，并重復清洗，清洗后的納米磁微粒分散于〇. 〇1Μ、ρΗ值為7. 4 的磷酸鹽緩沖液。
[0014] 提供一種納米磁微粒化學發(fā)光法定量檢測血清粉塵螨過敏原特異性IgE抗體的 方法，包括步驟為： (1) 將磁微粒試劑、生物素標記的粉塵螨過敏原和待檢樣本混勻并反應，反應后置于磁 場中靜置并去上清，得到第一溶液； (2) 向所述第一溶液中加入堿性磷酸酶標記的鼠抗人IgE二抗混勻并反應，反應后置 于磁場中靜置并去上清，得到第二溶液； (3) 向所述第二溶液中加入發(fā)光底物并反應，測發(fā)光強度； (4) 利用已知濃度的校準品繪制發(fā)光強度標準曲線，根據(jù)步驟（3)得到的發(fā)光強度對照 所述標準曲線，計算得出待測血清樣本中粉塵螨特異性IgE的含量。
[0015] 在本發(fā)明一個較佳實施例中，步驟（1)中所述反應的條件為37°C下反應15分鐘， 所述靜置的時間為3分鐘；步驟（1)中還包括對所述第一溶液用清洗液進行清洗，置于磁場 中靜置并去上清，清洗重復2次；步驟（2)中所述反應的條件為37°C下反應15分鐘，所述靜 置的時間為3分鐘；步驟（2)中還包括對所述第二溶液用清洗液進行清洗，置于磁場中靜置 并去上清，清洗重復2次；步驟（3)中所述反應的條件為37°C下反應5分鐘，在化學發(fā)光分 析/測定儀中測定發(fā)光強度。
[0016] 在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述方法在全自動化學發(fā)光儀Lumiray系列上進 行，所述 Lumiray 系列為 Lumiray 1200、Lumiray 1220、Lumiray 1260 或 Lumiray 1280。
[0017] 在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述方法包括步驟為： (1) 將所述試劑盒放入全自動化學發(fā)光儀的試劑倉里并進行識別； (2) 將校準品置于所述全自動化學發(fā)光儀的儀器樣本倉，識別校準品信息，分配校準品 位置； (3) 將質(zhì)控物或待測樣本置于儀器樣本倉，編輯檢測信息； (4) 啟動運行程序，所有校準品/質(zhì)控物/待測樣本自動進行處理得到結(jié)果。
[0018] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的檢測粉塵螨過敏原特異性IgE抗體的試劑盒及方 法，試劑盒中各試劑組分穩(wěn)定性良好，有效期可至一年以上，檢測靈敏度高、特異性能好、變 異小。經(jīng)過大量實驗的工藝優(yōu)化，得到完善統(tǒng)一工藝，并嚴格按照標準生產(chǎn)操作規(guī)程和質(zhì)量 控制規(guī)程進行生產(chǎn)。用戶僅需按照操作說明進行規(guī)范操作，就可得到可靠的結(jié)果。在臨床 研究中與國外進口試劑的符合相關性高達90 %以上，且費用僅為其1/2。
【附圖說明】
[0019] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案，下面將對實施例描述中所需要使 用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于 本領域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它 的附圖，其中： 圖1是本發(fā)明的實施例一中檢測粉塵螨過敏原特異性IgE抗體（D2)的試劑盒的標準 曲線圖； 圖2是本發(fā)明的粉塵螨過敏原特異性IgE抗體（D2)檢測試劑盒與進口試劑的性能對 比圖。
【具體實施方式】
[0020] 下面將對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施 例僅是本發(fā)明的一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通 技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其它實施例，都屬于本發(fā)明保護的范 圍。
[0021] 實施例一： 提供一種基于納米磁微粒全自動化學發(fā)光法定量檢測粉塵螨過敏原特異性IgE抗體 (D2)的試劑盒，包括如下試劑： (1) 生物素標記的粉塵螨過敏原溶液，濃度為0. 1-1. 0 ug/mL ; (2) 鏈霉親和素標記的納米磁微粒懸浮液，濃度為0. 1-1. 0 mg/mL ; (3) 堿性磷酸酶標記的鼠抗人IgE二抗溶液，濃度為0. 1-2. 0 ug/mL ; (4) 6個不同濃度水平的校準品：0 11]/1111，0.35 11]/1111，0.7 11]/1111，3.5 11]/1111，17.5 IU/ml,50 IU/ml,100 IU/ml ； (5) 2個不同濃度水平的質(zhì)控品：0. 7 IU/ml，17. 5 IU/ml。
[0022] 實施例二： 本發(fā)明提供的一種納米磁微粒全自動化學發(fā)光法定量檢測血清粉塵螨過敏原特異性 IgE抗體試劑盒的制備包括如下步驟： (1)配制緩沖液： 配制(λ 01M、pH值為L 4的磷酸鹽緩沖液，(λ 1Μ、ρΗ值為L 4的Tris-HCl緩沖液，(λ 05M、 pH值為6. 0的MES緩沖液。
[0023] 0· 01M、pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液的配制：取容量1L的燒杯，加入800ml去離子 水，稱取2. 56g Na2HP04*12H20、0. 44g NaH2P04*2H20和9g NaCl，加入到燒杯中，攪拌使其充 分溶解，用HC1或NaOH調(diào)節(jié)pH值至7. 4 ±0. 05,加入質(zhì)量分數(shù)為2%的甘露醇、質(zhì)量分數(shù)為 1%的甘油，攪拌0. 5h至完全溶解，加去離子水定容至1L。
[0024] 0· 1M、pH值為7· 4的Tris-HCl緩沖液的配制：取容量1L的燒杯，加入800ml去 離子水，稱取12. llg Tris (三羥甲基氨基甲烷）加入到燒杯中，攪拌使其充分溶解，用HC1 或NaOH調(diào)節(jié)pH值至7. 4±0. 05,加入質(zhì)量分數(shù)為2%的BSA、質(zhì)量分數(shù)為0. 3%的Proclin 300,攪拌0. 5h至完全溶解，加去離子水定容至1L。
[0025] 0· 05M、pH值為6. 0的MES緩沖液的配制：取容量1L的燒杯，加入800ml去離子水， 稱取9. 76g MES(2-(N-嗎啉代）乙磺酸)、9g NaCl加入到燒杯中，攪拌使其充分溶液，用HC1 或NaOH調(diào)節(jié)pH值至6. 0±0. 05,加入質(zhì)量分數(shù)為1%的BSA、質(zhì)量分數(shù)為0. 1%的Tween-20， 攪拌0. 5h至完全溶解，加去離子水定容至1L。
[0026] (2)制備生物素標記的粉塵螨過敏原溶液 將粉塵螨過敏原以1:20的比例加入到溶于二甲基甲酰胺的生物素中，室溫條件下充 分混合反應30分鐘，反應后的溶液用0. 1M、pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液透析。BCA法測定 生物素標記的粉塵螨過敏原溶液的濃度，并調(diào)整其濃度到〇. 1-1. 〇 ug/ml。
[0027] (3)制備鏈霉親和素標記的納米磁微粒懸浮液 將鏈霉親和素標記的納米磁微粒用磁分離器沉淀出來，用〇. 〇1Μ、ρΗ值為7. 4的磷酸鹽 緩沖液重懸，充分混勻15分鐘后磁分離沉出，棄去上清，再用0. 01M、pH值為7. 4的磷酸鹽 緩沖液重懸，如此重復清洗5次，清洗后的納米磁微粒分散于0. 01M、