專利名稱：：新型ft－0554物質(zhì)及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及適用于治療寄生蟲(尤其蠕蟲)侵染的新型FT-0554物質(zhì)及其生產(chǎn)方法。衛(wèi)生條件的改善和抗蠕蟲藥的發(fā)展使寄生蟲病日益減少。但是近來，輸入寄生蟲病(importparasitosis)、動物傳染病性寄生蟲病、機會性寄生蟲病(opportunisticparasitosis)和源自易腐食品的寄生蟲病正在流行并且成為嚴重問題。此外，寄生蟲病對牲畜飼養(yǎng)和農(nóng)業(yè)產(chǎn)生大的經(jīng)濟負擔。就寄生蟲中的蠕蟲侵染來說，目前，應(yīng)用除蟲菌素、甲苯達唑、吡喹酮和其它藥物處理蠕蟲。目前應(yīng)用的抗蠕蟲藥(例如除蟲菌素、甲苯達唑和吡喹酮)在有效性和毒性方面不總是足以令人滿意，所以迫切需要能解決這些問題的抗蠕蟲藥。因此，本發(fā)明提供了新型FT-0554物質(zhì)(它能滿足上述需要)及其生產(chǎn)。我們研究了NADH-反丁烯二酸還原酶(它是在蠕蟲的電子傳遞體系中的有希望的對抗抗蠕蟲藥的目標物質(zhì)之一)，并且探索了微生物培養(yǎng)中的篩選。我們發(fā)現(xiàn)了，新型FT-0554物質(zhì)具有NADH-反丁烯二酸還原酶抑制活性，于是根據(jù)該認識完成了本發(fā)明。本發(fā)明一個目的是提供由式[Ⅰ]化合物所示的FT-0554物質(zhì)本發(fā)明另一目的是提供一種生產(chǎn)式[Ⅰ]的FT-0554物質(zhì)的方法該方法包括培養(yǎng)屬于真菌并且具有FT-0554物質(zhì)生產(chǎn)活性的微生物，在培養(yǎng)基中積累FT-0554物質(zhì)，以及從培養(yǎng)基分離FT-0554物質(zhì)。本發(fā)明又一個目的是提供一種上述方法中用到的微生物，它屬于真菌并且具有FT-0554物質(zhì)生產(chǎn)活性，即黑曲霉(Aspergillusniger)FT-0554。本發(fā)明還有一個目的是提供一種微生物，它屬于真菌并且具有FT-0554物質(zhì)生產(chǎn)活性，即黑曲霉FT-0554。生產(chǎn)FT-0554物質(zhì)的微生物是一種具有FT-0554物質(zhì)生產(chǎn)活性的真菌且不受限制。用于生產(chǎn)FT-0554的微生物優(yōu)選的實例是本發(fā)明人從最近收集的多孔動物(sponge)分離的真菌菌株FT-0554。所述微生物的分類學特性被闡述如下。菌株FT-0554的分類學特性。(1)在各種培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特性肉眼觀察該微生物菌株在25℃下培養(yǎng)7天后的結(jié)果如表1中所示。表1(2)形態(tài)特性本發(fā)明的微生物在下列培養(yǎng)基上表現(xiàn)為良好的生長含海水50％(鹽含量3．4％)的蔡氏-酵母提取物瓊脂培養(yǎng)基，麥芽提取物瓊脂培養(yǎng)基，含蔗糖20％的蔡氏-酵母提取物瓊脂培養(yǎng)基，以及馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，有大量分生孢子。對生長在蔡氏-酵母提取物瓊脂培養(yǎng)基上的茵落顯微觀察顯示有間隔的透明茵絲，基內(nèi)菌絲體上筆直生長了長度為500μm～2．5mm的分生孢子梗，以及基質(zhì)中的足細胞。分生孢子梗的頂部是肥大的球形至近球形結(jié)構(gòu)，形成直徑為35～60μm的泡囊。很多曲霉(aspergillae)由尺寸分別為8．4～11．4×2．4～3．4μm和5．4～8．6×2．8～3．3μm的?；推抗?gòu)成。所有的泡囊都被?；采w，形成從球形到圓柱形分節(jié)的分生孢子頭。分生孢子是具有光滑至粗糙表面、直徑尺寸為3～4．5μm的球形物。(3)生理特性1)最佳生長條件該菌株的最佳生長條件是pH5～7、溫度16～36℃和海水濃度1)50～100％。1)應(yīng)用了鹽濃度為3．4％的天然海水2)生長條件該菌株的生長范圍是pH3～10、溫度12～45℃和海水濃度2)0～100％。2)應(yīng)用了鹽濃度為3．4％的天然海水3)性質(zhì)需氧的如上所示，將該微生物菌株FT-0554的培養(yǎng)條件、分類學特性和生理特性與已知的微生物菌株作了比較。經(jīng)鑒定，該菌株屬于黑曲霉并稱之為黑曲霉FT-0554。該微生物菌株已作為“黑曲霉FT-0554FERMP-16399”于1997年9月1日被保藏在國立生命科學和人體技術(shù)研究所，工業(yè)科學和技術(shù)署，國際科學和技術(shù)部，1～3，Higashi1-chome，Tsukuba-shi，lbaraki-ken，日本。此外，于1998年7月31日將該微生物菌株按布達佩斯條約轉(zhuǎn)到國立生命科學和人體技術(shù)研究所中的微生物保藏機構(gòu)，工業(yè)科學和技術(shù)署，國際科學和技術(shù)部，1～3，Higashi1-chome，Tsukuba-shi，lbaraki-ken，日本，并被所述國際保藏機構(gòu)給予保藏號“FERMBP-6443”。本發(fā)明的FT-0554物質(zhì)的生產(chǎn)可這樣進行培養(yǎng)屬于具有FT-0554物質(zhì)生產(chǎn)活性的真菌的微生物，從培養(yǎng)的物質(zhì)中分離并且純化該產(chǎn)品。在本發(fā)明中應(yīng)用的微生物菌株可以是上述微生物菌株，它的變種和突變株，以及屬于真菌、具有FT-0554物質(zhì)生產(chǎn)活性的所有菌株。用于生產(chǎn)上述FT-0554物質(zhì)的營養(yǎng)源可以是真菌的營養(yǎng)源。氮源的實例有商業(yè)上可獲得的蛋白胨、肉汁、玉米漿、棉籽粉、花生粉、大豆粉、酵母提取物、NZ胺、酪蛋白水解物、硝酸鈉、硝酸銨和硫酸銨。碳源的實例有碳水化合物，例如甘油、淀粉、葡萄糖、半乳糖和甘露糖，或者例如脂肪和油這樣的碳源，以及無機鹽，例如氯化鈉、磷酸鹽、碳酸鈣和硫酸鎂?？蓱?yīng)用這些物質(zhì)或其組合。如果需要的話，可添加痕量金屬鹽和動物油、植物油或礦物油作為防沫劑?？墒褂媚切┠鼙凰錾a(chǎn)菌株同化并且適用于生產(chǎn)FT-0554物質(zhì)的物質(zhì)?？蓱?yīng)用培養(yǎng)真菌的所有已知培養(yǎng)基。大量生產(chǎn)FT-0554物質(zhì)可以優(yōu)選通過液體培養(yǎng)基進行?？蓱?yīng)用的培養(yǎng)溫度處于微生物生產(chǎn)菌株的生長和FT-0554物質(zhì)的生產(chǎn)的范圍內(nèi)?？赏ㄟ^根據(jù)FT-0554物質(zhì)生產(chǎn)菌株的性質(zhì)選擇合適的條件而進行培養(yǎng)。FT-0554物質(zhì)可通過水不溶混的有機溶劑(例如氯仿和乙酸乙酯)從培養(yǎng)液提取。除了上述提取方法之外，還可應(yīng)用用于親脂性物質(zhì)的已知分離方法來獲得純化的物質(zhì)，例如吸附色譜法、凝膠過濾色譜法、從薄層層析劃痕、離心式逆流層析、HPLC等，應(yīng)用或不應(yīng)用其組合或重復操作。本發(fā)明的FT-0554物質(zhì)的物理化學特性如下所示。(1)性質(zhì)白色粉末或無定形(2)分子量361．2374(M+H，高分辨快原子轟擊質(zhì)譜)(3)分子式C22H32O4(4)比旋光(c=0．1，1-丙醇)(5)UV吸收極大值(在1-丙醇中)如圖1中所示，極大吸收在205nm(肩峰，ε=10800)和231nm(ε=21000)處。(6)IR吸收極大值(KBr壓片)如圖2中所示，極大吸收在3430，2960，2920，2850，1740，1660，1460，1400，1380，1180，1120和1000cm-1處。(7)1H-NMR在含氘氯仿中的化學位移(ppm)和自旋-自旋耦合常數(shù)(Hz)見表2(8)13C-NMR在含氘氯仿中的化學位移(ppm)見表2(9)在溶劑中的溶解性能溶于氯仿、乙醇、1-丙醇、甲苯和乙酸乙酯，不溶于水和正己烷(10)顏色反應(yīng)對硫酸和碘呈陽性。表2<tablesid="table1"num="001"><table>13C1H170．6s145．2d5．79dd(1H，J=6．9，15．2)138．9d5．46dd(1H，J=7．6，15．2)137．9d6．37dd(1H，J=10．2，15．2)133．7s127．0d5．76d(1H，J=10．9Hz)126．0d6．02dd(1H，J=10．2，15．2)124．6d6．17dd(1H，J=10．9，15．2)122．0d5．48dd(1H，J=7．9，15．2)80．2d4．92d(1H，J=7．9)68．0d4．57s(1H)58．5d3．52s(1H)58．2s47．2t1．96dd(1H，J=7．7，13．7)2．09dd(1H，J=7．1，13．7)38．6d2．06m(1H)34．8d2．42m(1H)29．8t1．31dq(2H，J=7．1，7．3)20．2q0．98d(3H，J=6．8)19．4q0．97d(3H，J=6．8)17．8q1．45s(3H)16．5q1．69s(3H)11．8q0．85t(3H，J=7．3)</table></tables>在表2中，S單峰，d雙峰，t三重峰，q四重峰，m多重峰，H質(zhì)子數(shù)，以及J自旋-自旋耦合常數(shù)(Hz)。由于詳細檢定了FT-0554物質(zhì)的物理化學特性和光譜數(shù)據(jù)，所以確定FT-0554物質(zhì)具有如下化學結(jié)構(gòu)。如上所示，詳細解釋了FT-0554物質(zhì)的物理化學特性，但是，尚未報導具有相同特性的化合物。因此，F(xiàn)T-0554物質(zhì)被定義為新物質(zhì)。本發(fā)明FT-0554的NADH-反丁烯二酸還原酶抑制活性被解釋如下。將Ascarissuum的肌肉在120mM磷酸鈉溶液(pH7．0)中均化并在3，000×g下離心10分鐘，收集上清液。將上清液在10，000×g下進一步離心20分鐘，收集沉淀。將該沉淀懸浮于120mM磷酸鈉溶液(pH7．0)而得線粒體級分。在將10μl溶于50％二甲亞砜溶液的試驗樣品加入96孔小平板后，往其中添加含0．35mMNADH、7．2mM反丁烯二酸二鈉和18mg／ml牛血清白蛋白的120mM磷酸鈉溶液(pH7．0)，在37℃下的小平板讀出器ELx808(Bio-TekIndustriesCo．)中預(yù)保溫5分鐘。將Ascarissuum的線粒體級分10μl(蛋白質(zhì)含量0．3mg)加到其中，在37℃下保溫10分鐘。每15秒測定NADH在340nm處的吸收。定量測定NADH-反丁烯二酸還原酶活性的結(jié)果(用340nm處的吸光度斜率的降低表示)，結(jié)果測得FT-0554物質(zhì)實現(xiàn)50％抑制NADH-反丁烯二酸還原酶活性時是2．8μM。所以，F(xiàn)T-0554物質(zhì)有望用作治療或預(yù)防蠕蟲病的藥物。本發(fā)明的FT-0554物質(zhì)的抗微生物活性如下。將本發(fā)明化合物的氯仿溶液(1mg／ml)10μl蘸在濾紙圓片(AdvantecCo．，直徑6mm)上，使它風干而脫除溶劑。該風干脫除溶劑。將干燥的圓片放在含試驗生物體的瓊脂板上，在37℃或27℃下保溫24小時，測量濾紙圓片周圍抑制區(qū)的直徑。結(jié)果如表3中所示。表3<tablesid="table2"num="002"><table>試驗生物體抑制區(qū)直徑(mm)大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)KB213(NIHJ)-大腸埃希氏菌KB176(NIHJJC-2，IF012734)-銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)P-3KBi05+水稻黃單胞菌(Xanthomonasoryzae)KB888-藤黃微球菌(Micrococcusluteus)KB40(PCI1001)-金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)KB210-恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis)KB42(ATCC607)-枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)KB27(PCI219)-脆弱擬桿菌(Bacteroidesfragilis)KB169(ATCC23745)-萊氏無膽甾原體(Acholeplasmalaidrawii)KB174-白假絲酵母(Candidaalbicans)KF112釀酒酵母(Saccharomycescervisiae)KF26-黑曲霉KF103(ATCC6275)-PyriculariaoryzaeKF180±總狀毛霉(Mucorracemosus)KF223(IFO4581)10</table></tables>如表3中所示，本發(fā)明的FT-0554物質(zhì)對某些微生物具有弱的生長抑制活性。圖1示出本發(fā)明的FT-0554物質(zhì)在1-丙醇溶液(50μM)中的UV譜。圖2示出本發(fā)明的FT-0554物質(zhì)(KBr壓片)的IR譜。如下實施例闡述了本發(fā)明，但不能認為是限制本發(fā)明。實施例將一菌杯在瓊脂斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)的黑曲霉FT-0554(FERMBP-6443)接種入含下列物質(zhì)的液體培養(yǎng)基(pH7．0)葡萄糖2．0％，聚胨(NihonSeiyakuCo．)0．5％，瓊脂0．1％，酵母提取物(OrientalYeastCo．)0．2％，硫酸鎂七水合物0．05％和磷酸二氫鉀0．1％(溶于50％天然海水(應(yīng)用了鹽濃度為3．4％的天然海水)中)，分成100ml盛于500ml錐形瓶中，在27℃下?lián)u合培養(yǎng)2天。將每1ml該種子培養(yǎng)液接種入含馬鈴薯葡萄糖肉汁(DifcoInc．)2．4％(溶于50％天然海水(應(yīng)用了鹽濃度為3．4％的天然海水)中)的液體培養(yǎng)基，分成各100ml盛于500ml錐形瓶(×30瓶)中，在27℃下?lián)u合培養(yǎng)96小時。將培養(yǎng)后的液體培養(yǎng)基離心，用乙醇3升提取得到的菌絲體。真空除去乙醇。再次用正己烷提取菌絲體，真空濃縮而得1．9g粗物質(zhì)Ⅰ。將該物質(zhì)加到填充了正己烷的硅膠(95g，MerckArt．7734)柱上，用正己烷-乙酸乙酯(10∶1)的混合物洗滌，再用正己烷-乙酸乙酯(10∶2)洗脫。真空濃縮洗脫液而得22．7mg粗物質(zhì)Ⅱ。將粗物質(zhì)Ⅱ裝填在硅膠薄層板(MerckArt，5744)上，用正己烷-乙酸乙酯(1∶1)展開。將活性級分刮下，用氯仿-甲醇(2∶1)洗脫。真空濃縮洗脫液而得13．4mg粗物質(zhì)Ⅲ。再將物質(zhì)Ⅲ加到SephadexLH-20柱上，用氯仿-甲醇(1∶2)洗脫。真空濃縮洗脫液而得10．0mgFT-0554物質(zhì)(白色粉末)。如上文闡釋的那樣，本發(fā)明的FT-0554物質(zhì)有望成為治療寄生蟲病的良好且有用的藥劑。權(quán)利要求1．式[Ⅰ]的FT-0554物質(zhì)2．一種生產(chǎn)式[I]的FT-0554物質(zhì)的方法，該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)屬于真菌并且具有FT-0554物質(zhì)生產(chǎn)活性的微生物，在所述培養(yǎng)基中積累FT-0554物質(zhì)，以及從所述培養(yǎng)物質(zhì)分離FT-0554物質(zhì)。3．權(quán)利要求2的方法，其中，所述屬于真菌并且具有FT-0554物質(zhì)生產(chǎn)活性的微生物是黑曲霉FT-0554。4．一種屬于真菌并且具有FT-0554物質(zhì)生產(chǎn)活性的微生物。5．權(quán)利要求4的微生物，其中，所述微生物是黑曲霉FT-0554。6．黑曲霉FT-0554FERMBP-6443。7．權(quán)利要求2的方法，其中，所述屬于真菌并且具有FT-0554物質(zhì)生產(chǎn)活性的微生物是黑曲霉FT-0554FERMBP-6443。8．權(quán)利要求4的微生物，其中，所述微生物是黑曲霉FT-0554PERMBP-6443。9．包含F(xiàn)T-0554物質(zhì)的NADH-反丁烯二酸還原酶抑制劑。全文摘要適用作體外寄生蟲病(尤其是蠕蟲病)的藥物的新物質(zhì)FT－0554;以及生產(chǎn)該物質(zhì)的方法,該方法包括:在培養(yǎng)基中培養(yǎng)一種微生物,該微生物屬于霉菌并能生產(chǎn)式(Ⅰ)表示的FT－0554,于是在培養(yǎng)物中積累FT－0554,以及從該培養(yǎng)物收獲FT－0554。文檔編號C07D493/04GK1278824SQ98811039公開日2001年1月3日申請日期1998年9月17日優(yōu)先權(quán)日1997年11月11日發(fā)明者大村智,鹽見和朗,增間碌郎,巖井讓申請人:社團法人北里研究所