專利名稱：可生物降解的交聯(lián)聚乙烯亞胺及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一類可用于體外各種細(xì)胞和體內(nèi)組織或器官的生物活性物的傳輸載體和實(shí)施方法，是將各種藥物，蛋白，多肽，特別是DNA，RNA，及編碼治療基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞或組織和器官。本發(fā)明還涉及此傳輸載體的制備和用途。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種基因遞送的組合物及方法，其中基因載體是可生物降解的和生物相容的。
背景技術(shù)：
基因治療是指將外源基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)部，通過恢復(fù)或增添基因表達(dá)以糾正人自身基因結(jié)構(gòu)或功能上的錯(cuò)亂，阻止病變的發(fā)展，殺滅病變的細(xì)胞，或抑制外源病原體遺傳物質(zhì)的復(fù)制，從而達(dá)到治病的目的。目前基因治療被認(rèn)為是一個(gè)非常有前景的治療方法，它不僅能夠治療遺傳缺陷性疾病，而且可以發(fā)展出治療或防止慢性病，例如癌癥，心血管病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等的方法。基因治療包括三個(gè)重要的環(huán)節(jié)，即目的基因，轉(zhuǎn)基因載體和靶細(xì)胞。安全高效的基因傳遞系統(tǒng)是成功進(jìn)行基因治療的技術(shù)核心?；蛑委煹妮d體主要有病毒載體和非病毒載體，盡管病毒載體轉(zhuǎn)染效率高，但由于病毒載體有一些嚴(yán)重的缺點(diǎn)，例如包裝容量有限，制備復(fù)雜，有免疫原性(體內(nèi)不能反復(fù)使用)和潛在的安全危險(xiǎn)。人工合成的非病毒載體受到了極大的關(guān)注[1]，非病毒載體具有安全性高，免疫原性低，易于對DNA進(jìn)行操作等優(yōu)點(diǎn)，所以近來人們越來越重視人工合成的非病毒載體的研究[2]。目前已經(jīng)合成了多種非病毒載體，其中聚合物基因載體占有重要的地位。研究較多的聚合物基因治療體系主要有陽離子多聚物型載體、非縮聚型聚合物體系、可生物降解的聚合物體系、多復(fù)合脂質(zhì)體體系、熱敏感聚合物體系及聚合型膠束體系等。盡管在非病毒載體研究的早期，人們的主要興趣放在脂質(zhì)體上，但是近幾年來的研究發(fā)現(xiàn)，陽離子型的脂質(zhì)體基因載體，在重復(fù)的使用中被發(fā)現(xiàn)有很高的細(xì)胞毒性，并且，在體內(nèi)有潛在的抗炎性表現(xiàn)，和淋巴細(xì)胞在體內(nèi)長期培養(yǎng)，脂質(zhì)體會產(chǎn)生很高的毒性。最近也有研究表明它也有一些結(jié)構(gòu)上的缺點(diǎn)。比如脂質(zhì)體的疏水基團(tuán)決定了它的形狀，大小，在水相的穩(wěn)定性以及同其他脂質(zhì)體、細(xì)胞膜、DNA等的相互作用。這最終就影響了脂質(zhì)體聚合物的轉(zhuǎn)染效率[3，4]。正因?yàn)榭刂浦|(zhì)體的大小比較困難而使它的性質(zhì)隨著時(shí)間的變化而變得不穩(wěn)定[5]。還有脂質(zhì)體的復(fù)合物在應(yīng)用時(shí)，為了提高其轉(zhuǎn)染效率，常常需要一些輔助物[6]?？傊?，脂質(zhì)體作為基因轉(zhuǎn)導(dǎo)媒介，從整體上看，在人體中轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低，缺乏有效的染色體整合機(jī)制。脂質(zhì)體特別是陽離子脂質(zhì)體作為基因載體具有一定潛力，但基因表達(dá)效率低，體內(nèi)不穩(wěn)定一直是困擾醫(yī)學(xué)界的難題。由于病毒載體以及陽離子脂質(zhì)體所存在的局限性，因而，人們對陽離子聚合物作為基因載體的興趣越來越高。研究得比較多的陽離子型轉(zhuǎn)基因載體有聚賴氨酸(PLL)、聚乙烯亞胺(PEI)以及以乙二胺為核的聚酰胺-胺樹枝狀高分子(EDA-PAMAM)，其中樹枝狀高分子和聚乙烯亞胺(PEI)的應(yīng)用尤其受到重視。富含胺基的樹枝狀高分子(Dendrimer)和分枝狀聚乙烯亞胺(PEI)是近年來引起重視的高分子材料，在正常生理環(huán)境下，由于胺基質(zhì)子化從而帶上正電荷會與帶負(fù)電的DNA相互作用，形成納米尺寸的超分子復(fù)合物，而樹枝狀和分枝狀的獨(dú)特結(jié)構(gòu)，使得它們與DNA形成的復(fù)合物極易進(jìn)入細(xì)胞，從而將基因轉(zhuǎn)入。如果對它們進(jìn)行修飾，如連接特定蛋白、受體，攜帶磁性等，便可以使基因轉(zhuǎn)移具有靶向性。實(shí)驗(yàn)中通過控制它們與DNA相互作用的配比，控制其與DNA復(fù)合物的大小，引入對細(xì)胞膜有親和性的基團(tuán)，調(diào)整它們的親水親油平衡值，均可顯著提高基因轉(zhuǎn)移效率。然而，樹枝狀聚合物合成方法相對復(fù)雜，每步反應(yīng)需要準(zhǔn)確控制，合成中隨著分子量的增加，每一代樣品的分離和純化都會變得越來越困難。而PEI有多種結(jié)構(gòu)和分子量的產(chǎn)品可供選擇，各種線性，分枝狀和超高分枝狀的PEI的合成技術(shù)和工藝成熟，因此以PEI為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)可以很方便地設(shè)計(jì)并合成出一系列新型的基因載體。
以往的基因載體與病毒載體相比其轉(zhuǎn)染效率較低，同時(shí)一般都有較大的細(xì)胞毒性，部分原因可能是其缺少生物降解性，因此近年來人們開始致力于研究生物可降解性載體[7-12]，理想的基因載體應(yīng)該是在其高效轉(zhuǎn)染的使用劑量下是低毒性或無毒性，同時(shí)為了能避免在體內(nèi)應(yīng)用時(shí)產(chǎn)生毒副作用，生物可降解性是非常重要的。但目前研究的可降解陽離子聚合物只取得了有限的成功[13-15]。聚乙烯亞胺是迄今為止轉(zhuǎn)染效率最高的非病毒載體之一，其轉(zhuǎn)染效率在一些細(xì)胞上可以與病毒載體媲美，因此目前經(jīng)常被用來做為新的基因轉(zhuǎn)染載體評價(jià)物，將新設(shè)計(jì)與新開發(fā)的基因轉(zhuǎn)染載體與之比較。但它的高轉(zhuǎn)染效率往往伴隨著較大的細(xì)胞毒性。一般來說2000Da以下的聚乙烯亞胺無細(xì)胞毒性，但也沒有轉(zhuǎn)染效率[16，17]，25kDa聚乙烯亞胺有較高的轉(zhuǎn)染效率，但有較大的細(xì)胞毒性[18]。因此許多研究集中于對其進(jìn)行化學(xué)修飾使其偶聯(lián)各種糖基，環(huán)糊精等，從而降低細(xì)胞毒性。近來許多研究采用各種交聯(lián)劑對無毒副作用小分子聚乙烯亞胺進(jìn)行交聯(lián)，從而獲得高效低毒性的可生物降解的聚乙烯亞胺[9，10，15]。但是與大多數(shù)陽離子聚合物及聚乙烯亞胺相似，這些交聯(lián)的聚乙烯亞胺在生理?xiàng)l件下與DNA形成復(fù)合物后容易聚集為較大的顆粒[19-22]。Daniel G..[23]將各種雙丙烯酸酯與各種小分子胺類化合物進(jìn)行交聯(lián)合成了上千種聚合物，研究發(fā)現(xiàn)含有羥基的胺類單體與憎水性雙丙稀酸酯交聯(lián)劑交聯(lián)所得到的產(chǎn)品具有最高的轉(zhuǎn)染效率。Zhong Z的研究發(fā)現(xiàn)在聚合物中增加疏水片段能夠加強(qiáng)其與細(xì)胞膜的疏水相互作用，從而提高其對細(xì)胞膜的親和性，但這種與細(xì)胞膜的疏水相互作用同時(shí)也對細(xì)胞膜有損害[24]。因此合理地調(diào)控所合成的聚合物的親水親油平衡值是非常重要的。

發(fā)明內(nèi)容
我們分析后，認(rèn)為細(xì)胞膜表面有許多糖基受體，糖分子中有許多羥基，與之相似在聚合物中引入羥基可能增加了其對細(xì)胞膜的親和性，而交聯(lián)劑的憎水性也促進(jìn)了聚合物與細(xì)胞膜的疏水相互作用，所以提高了轉(zhuǎn)染效率。我們采用200-100000Da的線性，分枝狀和超高分枝狀聚乙烯亞胺和各種二酸的縮水甘油酯，丙烯酸/甲基丙烯酸縮水甘油酯進(jìn)行交聯(lián)，由于交聯(lián)劑中的環(huán)氧基在交聯(lián)反應(yīng)時(shí)生成羥基，交聯(lián)劑中的脂肪鏈具有憎水性，雙鍵與環(huán)氧鍵的反應(yīng)條件相似，所以可以在分枝狀聚乙烯亞胺中同時(shí)引入羥基和憎水性的脂肪鏈從而改善聚乙烯亞胺在生理?xiàng)l件下溶解性。由于小分子聚乙烯亞胺富含各種胺基，所以與Daniel G.的研究工作相比，這種交聯(lián)更容易提高產(chǎn)物的轉(zhuǎn)染效率。將以上交聯(lián)方法與各種多元醇(多元縮醇)的丙烯酸/甲基丙烯酸的多元酯復(fù)合使用可以調(diào)節(jié)所合成的聚合物的親水親油平衡值從而制備高效低毒的基因載體。由于所合成的這些高效低毒的基因載體含有羥基和胺基，所以可以非常容易地將各種靶向分子偶聯(lián)上，這些研究目前尚未見報(bào)道。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種生物可降解的交聯(lián)聚乙烯亞胺，及其合成方法和使用方案。
所說的可生物降解的交聯(lián)聚乙烯亞胺，是由線性或分枝狀的聚乙烯亞胺與交聯(lián)劑反應(yīng)而合成，聚乙烯亞胺與交聯(lián)劑的摩爾比是0.1∶1-5∶1；所說的聚乙烯亞胺的分子量是200-100000Da，優(yōu)選600-20000Da；所說的交聯(lián)劑含有在生理?xiàng)l件下可降解的酯鍵，分子量是50-50000Da，優(yōu)選100-20000Da。
這種交聯(lián)聚乙烯亞胺可以將藥物或各種生物活性物例如各種蛋白，多肽，特別是DNA，RNA，及編碼治療基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入體外各種細(xì)胞和體內(nèi)各種組織或器官。盡管小分子(200-2000Da)的聚乙烯亞胺對細(xì)胞或組織器官沒有毒性，但同時(shí)也基本上沒有轉(zhuǎn)染性能。采用各種含有生物可降解鍵的交聯(lián)劑交聯(lián)這些富含各種胺基的小分子聚乙烯亞胺從而獲得較高分子量的聚乙烯亞胺。這種合成產(chǎn)物由于具有聚乙烯亞胺的結(jié)構(gòu)和合適的分子量，所以具有高效的基因傳遞性能，同時(shí)由于其本身無細(xì)胞毒性以及進(jìn)入細(xì)胞后在生理?xiàng)l件下可以降解為無細(xì)胞毒性的小分子聚乙烯亞胺，所以在其使用中毒性很小。
上述所說的含有在生理?xiàng)l件下可降解酯鍵的交聯(lián)劑，包括各種二酸的縮水甘油酯、丙烯酸/甲基丙烯酸縮水甘油酯或各種多元醇或多元縮醇的丙烯酸/甲基丙烯酸的多元酯中的一種或幾種的復(fù)合物。
小分子量(200-20000Da)的線性或分枝狀聚乙烯亞胺與各種二酸的縮水甘油酯或烯酸縮水甘油酯交聯(lián)可以在聚乙烯亞胺結(jié)構(gòu)中引入羥基，從而改善其生理?xiàng)l件下的溶解性和提高對細(xì)胞膜的親和性。小分子量(200-20000Da)的線性或分枝狀聚乙烯亞胺與各種多元醇或多元縮醇的丙烯酸/甲基丙烯酸的多元酯交聯(lián)可以在聚乙烯亞胺結(jié)構(gòu)中引入適當(dāng)?shù)氖杷?親水結(jié)構(gòu)，從而改善交聯(lián)產(chǎn)物對細(xì)胞膜的疏水相互作用。如果將聚乙烯亞胺與多元醇的丙烯酸/甲基丙烯酸的多元酯(例如季戊四醇三丙烯酸酯或季戊四醇四丙烯酸酯)反應(yīng)可以增加交聯(lián)產(chǎn)物的枝化度，從而調(diào)節(jié)降解速率，實(shí)現(xiàn)藥物或生物活性物質(zhì)的控制釋放。將聚乙烯亞胺與以上三種交聯(lián)劑的復(fù)合物反應(yīng)可以進(jìn)一步地調(diào)節(jié)產(chǎn)物的親水親油平衡值、枝化度，從而合成出各種結(jié)構(gòu)的基因轉(zhuǎn)染載體。
以上所述的多元醇或多元縮醇的丙烯酸/甲基丙烯酸的多元酯包括乙氧基化1，6-己二醇二丙烯酸酯(EO-HDDA)，二縮三丙二醇二丙烯酸酯(TPGDA，二丙二醇二丙烯酸酯(DPGDA，丙二醇二丙烯酸酯(PGDA，新戊二醇二丙烯酸酯(NPGDA，丙氧基化(2)新戊二醇二丙烯酸酯(PO-NPGDA)，乙二醇雙丙烯酸酯(EGDA)，二乙二醇雙丙烯酸酯(DEGDA)，三乙二醇雙丙烯酸酯(TEGDA)，四乙二醇雙丙烯酸酯(TEGDA)，1，6-己二醇二丙烯酸酯(HDDA)，1，4-丁二醇二丙烯酸酯(BDDA)，季戊四醇四丙烯酸酯，季戊四醇三丙烯酸酯，雙季戊四醇五丙烯酸酯，聚乙二醇(200)雙丙烯酸酯[PEG 200 DA]，聚乙二醇(400)雙丙烯酸酯[PEG 400)DA]，新戊二醇二甲基丙烯酸酯(NPGDMA，三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TMPTMA)，二縮三丙二醇二甲基丙烯酸酯(TPGDMA，二丙二醇二甲基丙烯酸酯(DPGDMA，丙二醇二甲基丙烯酸酯(PGDMA，二甲基丙烯酸乙二醇酯(GDMA)，二乙二醇二甲基丙烯酸酯(DEGDMA)，三乙二醇雙甲基丙烯酸酯(TRGDMA)，四乙二醇雙甲基丙烯酸酯(TEGDMA)，季戊四醇三甲基丙烯酸酯(PETMA，季戊四醇四甲基丙烯酸酯，1，6-己二醇二甲基丙烯酸酯(HDDMA)，1，4-丁二醇二甲基丙烯酸酯，甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)，丙烯酸縮水甘油酯(GA)，聚乙二醇(200)二甲基丙烯酸酯，聚乙二醇(400)二甲基丙烯酸酯，1，3-丁二醇二甲基丙烯酸酯，鄰苯二甲酸二甘醇二丙烯酸酯。
本發(fā)明還提供了上述生物可降解的交聯(lián)聚乙烯亞胺的衍生物，是將可生物降解的交聯(lián)聚乙烯亞胺，進(jìn)一步地被糖基化、聚己二醇化、酰基化或烷基化，從而獲得各種交聯(lián)聚乙烯亞胺的衍生物。
本發(fā)明還公開了基于上述生物可降解的交聯(lián)聚乙烯亞胺及其衍生物的各種靶向交聯(lián)聚乙烯亞胺。
基于高分子材料的非病毒基因載體不僅安全，而且具有大量的活性官能基團(tuán)易于被修飾的特性，可以通過特定的修飾反應(yīng)，賦予基因載體細(xì)胞間靶向傳遞的能力。由于合成的產(chǎn)品中含有胺基和羥基，所以這些基團(tuán)可以直接的或經(jīng)適當(dāng)?shù)倪B接臂與靶向配體偶聯(lián)，這些連接分子是聚乙二醇(PEG)鏈、聚琥玻酸、聚癸二酸(PSA)、聚-L-谷氨酸、寡糖、氨基酸鏈、或其他任何適合的連接物。在特定的聚合物或聚合反應(yīng)中，可以有多種類型的連接物。優(yōu)選表示由碳與氧構(gòu)成的線性或支化的聚合物，其中適當(dāng)也可含有環(huán)狀的，星型的或樹狀的結(jié)構(gòu)，例如象線性PEG殘基，多側(cè)枝的接枝PEG，星型PEG，但優(yōu)選線性及多側(cè)枝的接枝及星型PEG。后者可從Aldrich，F(xiàn)luka，Sigma及Nectar(shearwater)商業(yè)途徑得到。
靶向分子可為一種針對特定的相互作用并吸收進(jìn)入目標(biāo)器官組織或細(xì)胞的配體，例如轉(zhuǎn)鐵蛋白，脫唾液酸糖蛋白(ASGP)，抗體/抗體片段，低密度脂蛋白，白細(xì)胞介素，GM-CSF，G-CSF，M-CSF，干細(xì)胞生長因子，促紅細(xì)胞生成素(EPO)，表皮生長因子(EGF)，胰島素，葉酸，乳糖，半乳糖，脫唾液酸血清類粘蛋白，甘露糖，甘露糖-6-磷酸，N-己?；樘前?，凝血調(diào)節(jié)蛋白，融合劑，血凝素HA2和核定位信號(nucleus localization signals NLS)。
本發(fā)明的交聯(lián)聚乙烯亞胺能夠通過肝細(xì)胞表面上的半乳糖基受體介導(dǎo)所選擇的核酸通過胞吞有效地傳遞肝細(xì)胞或肝臟組織。靶向其他組織的基因傳遞可以通過偶聯(lián)相應(yīng)的靶向分子實(shí)施，例如甘露糖-6-磷酸(定向單核細(xì)胞)、甘露糖(定向巨噬細(xì)胞和某些B-細(xì)胞)、N-乙?；樘前?定向T-細(xì)胞)、半乳糖(定向黑素瘤細(xì)胞)、葡萄糖(定向結(jié)腸癌細(xì)胞)和凝血調(diào)節(jié)蛋白(定向小鼠肺內(nèi)皮細(xì)胞)等。
在基因傳遞系統(tǒng)中，顆粒大小的優(yōu)化是非常關(guān)鍵的，因?yàn)轭w粒大小經(jīng)?？刂企w內(nèi)的轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞毒性和組織定向。參見Haensler，J.and Szoka，F(xiàn).C.，Jr.Bioconiugate Chem.1993，4，372-379。通常，基因遞送顆粒的尺寸不應(yīng)超過病毒的大小，從而使得基因遞送顆粒能夠有效地滲透到組織中。本發(fā)明中，通過使用交聯(lián)劑與聚合物的不同組合可以容易地改變顆粒的大小。單個(gè)聚合物的尺寸和結(jié)構(gòu)決定聚集數(shù)-即聚集形成膠束的單個(gè)共聚物的數(shù)目。因此，尺寸和結(jié)構(gòu)部分控制聚合物與核酸形成的復(fù)合物-即膠束的顆粒大小。而顆粒大小又可以進(jìn)一步由制備顆粒的條件和方法控制。通過改變所合成的陽離子聚合物的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)、分子量和電荷密度，可以容易地控制聚合物與核酸形成的復(fù)合物的顆粒大小和電荷密度。本發(fā)明的優(yōu)勢在于所合成的基因載體與DNA形成的復(fù)合物的粒徑，電荷密度易于控制。由于轉(zhuǎn)染復(fù)合物的粒徑大小對轉(zhuǎn)染效率，細(xì)胞毒性及復(fù)合物體內(nèi)分布和組織靶向性有較大的影響，所以為了能有效進(jìn)入細(xì)胞或穿透組織，一般轉(zhuǎn)染復(fù)合物的粒徑要小于病毒顆粒的大小。本發(fā)明通過采用各種交聯(lián)劑組合交聯(lián)小分子PEI，控制合成聚合物的親水親油平衡值，從而調(diào)節(jié)復(fù)合物的粒徑的尺寸。具體為優(yōu)化所合成的基因載體組成及其與DNA形成復(fù)合物的比例后，所形成的復(fù)合物的粒徑范圍是20-200納米。據(jù)悉不同大小的粒子被注射到體內(nèi)時(shí)會在體內(nèi)不同的器官里積聚。例如小于150納米的粒子經(jīng)系統(tǒng)給藥后，能夠透過肝臟內(nèi)皮的竇狀小管的薄膜開口，停留在脾，骨髓及腫瘤等組織中。利用本發(fā)明所生產(chǎn)的新型陽離子多聚物與各種質(zhì)粒或寡核苷酸作用，其所形成的微顆粒粒徑大小是完全可控的，具有極好的分散度，從而具有良好的組織或器官靶向性。業(yè)內(nèi)普遍認(rèn)為微粒、納米球和微球在被注射到體內(nèi)之后，它們在不同器官的相對分布比率取決于其顆粒大小。例如，對于粒徑低于150nm大小的微粒，系統(tǒng)注射后，它可以透過肝臟內(nèi)皮的竇狀小管的薄膜開口，進(jìn)而可以到達(dá)胰臟、骨髓及腫瘤組織。對于粒徑在100nm-200nm之間的微粒，靜脈、動脈或者腹腔注射后，通常容易被血流中來自于網(wǎng)狀內(nèi)皮組織的巨噬細(xì)胞吞噬。
根據(jù)本發(fā)明得到的可生物降解的生物相容性的交聯(lián)聚乙烯亞胺及其衍生物，是無免疫原性和無毒的。本文公開的優(yōu)選聚合物降解成為可由腎排泄的無毒小分子，該聚合物在所要求的基因表達(dá)期間是惰性的。通過簡單的水解反應(yīng)進(jìn)行降解。當(dāng)聚合物主鏈包含酯鍵時(shí)，以簡單水解進(jìn)行的降解作用占主導(dǎo)地位的。通過使用不同種類和分子量的交聯(lián)劑，可以改變降解期的長短。因此，可以用生物降解性聚合物進(jìn)行基因傳遞，以解決聚陽離子基因載體相關(guān)的毒性問題。眾所周知，大多數(shù)聚陽離子基因載體具有嚴(yán)重的細(xì)胞毒性，如果在體內(nèi)長期存在會引起嚴(yán)重后果。因此，優(yōu)選的基因載體應(yīng)在完成作用之后能夠降解成為無毒產(chǎn)物。本發(fā)明使用可生物降解的含有酯鍵的交聯(lián)聚乙烯亞胺，所述的這些聚合物具有安全的、可生物相容的降解途徑。這樣的聚合物有利于制備注射用的可以持久和連續(xù)釋放的包裹藥物的配方。本發(fā)明的高度支鏈化的分子結(jié)構(gòu)可以進(jìn)一步降低細(xì)胞毒性，因?yàn)橹T如樹枝狀的聚酰胺型胺類的分支聚陽離子的細(xì)胞毒性比線性聚陽離子的細(xì)胞毒性低。參見Haensler，J.and Szoka，F(xiàn).C.，Jr.Bioconjugate Chem.1993，4，372-379。因而，由于降低了細(xì)胞毒性，本發(fā)明的聚合物的有利組分和結(jié)構(gòu)將是人們所期待的。


圖1是交聯(lián)PEI在PBS(140mM NaCl，2.7 mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH7.4)中的降解情況。將合成的交聯(lián)PEI溶解于PBS中，在37℃下放置一段時(shí)間，采用毛細(xì)管粘度方法測定分子量并將聚合物的分子量與時(shí)間作圖。
圖2是交聯(lián)PEI/DNA復(fù)合物的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明所合成的交聯(lián)PEI與PEI 25 kDa有一致的結(jié)合DNA的能力。Lane 1DNA only；from lane 2 to 7，the polymer∶DNA ratio(w/w)is 0.1∶1(lane 2)，0.2∶1(lane 3)，0.3∶1(lane 4)，0.35∶1(lane 5)，0.4∶1(lane 6)and 0.45∶1(lane 7).(A)Cross-linked PEI(B)25kDa PEI。
圖3表明，當(dāng)交聯(lián)PEI與DNA在PBS中形成的復(fù)合物用含血清的完全培養(yǎng)基稀釋后，能夠穩(wěn)定該復(fù)合物對抗鹽誘導(dǎo)的聚集。
圖4是交聯(lián)PEI與25kDa PEI對細(xì)胞的毒性的對比，結(jié)果表明所合成的交聯(lián)PEI的細(xì)胞毒性明顯地小于25kDa PEI。
圖5是各種轉(zhuǎn)染試劑在最佳轉(zhuǎn)染條件下進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染后，HEK293細(xì)胞存活百分率對比圖6是交聯(lián)PEI介導(dǎo)GFP質(zhì)粒在各種細(xì)胞中轉(zhuǎn)染24小時(shí)后的熒光照片、白光照片和二者疊加照片。
圖7是所合成的交聯(lián)PEI對不同細(xì)胞轉(zhuǎn)染24小時(shí)后用流式細(xì)胞儀分析其轉(zhuǎn)染效率。
圖8是CLPEI和Gal-PEI對不同細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率的比較。
圖9是CLPEI和FOL-PEI對不同細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率的比較。
圖10是在各自優(yōu)化的轉(zhuǎn)染條件下，交聯(lián)的PEI與各種商業(yè)化的轉(zhuǎn)染試劑及25kDa PEI分別介導(dǎo)GFP在NIH 3T3細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率比較。
圖11RT-PCR分析交聯(lián)PEI介導(dǎo)EGFR的RNA干擾質(zhì)粒影響EGFR的mRNA水平情況。其中1PBS/PBS；2CLPEI/PBS；3CLPEI/干擾質(zhì)粒4CLPEI/對照于擾質(zhì)粒圖12Western blotting分析交聯(lián)PEI介導(dǎo)Erk的RNA干擾質(zhì)粒影響Erk蛋白表達(dá)情況。其中1A549；2A549+siRNA；3Hela；4Hela+siRNA圖13Western blotting分析交聯(lián)PEI介導(dǎo)PTEN的RNA干擾片段影響PTEN蛋白表達(dá)情況其中1CLPEI/化學(xué)合成的干擾片段對照；2CLPEI/化學(xué)合成的干擾片段3CLPEI/化學(xué)合成的干擾片段對照；4CLPEI/化學(xué)合成的干擾片段。其中1和2為A549細(xì)胞，3和4為Hela細(xì)胞。
圖14是交聯(lián)PEI介導(dǎo)GFP在C57小鼠肌肉部位轉(zhuǎn)染三天后的熒光照片、白光照片和二者疊加照片。
圖15是交聯(lián)PEI介導(dǎo)GFP在C57小鼠B16F10腫瘤部位轉(zhuǎn)染三天后的熒光照片和白光照片。
具體實(shí)施例方式
現(xiàn)在對本發(fā)明進(jìn)行一般性的描述，結(jié)合下面的實(shí)施例可以更容易的理解本發(fā)明，這些實(shí)施例只是用來解釋本發(fā)明的特定方面和實(shí)施方案，而不是用來限制本發(fā)明。
聚乙烯亞胺可根據(jù)自己的需要采用廣為人知的方式來制備或從商業(yè)途徑得到，從BASF商品名稱為Lupasol或以聚乙烯亞胺或乙烯亞胺聚合物為名稱，以不同的分子量從200到200000克/摩爾(從Aldrich，sigma，F(xiàn)luka，Polysciences或直接從BASF)。優(yōu)選具有分子量為400到20000克/摩爾的聚乙烯亞胺，特別優(yōu)選400到5000克/摩爾的聚乙烯亞胺為原料。
各類交聯(lián)劑可根據(jù)自己的需要從商業(yè)途徑得到(從Aldrich，sigma，F(xiàn)luka，或直接從生產(chǎn)廠家)，如果需要，有些交聯(lián)劑也可以采用文獻(xiàn)的方法來制備，例如己二酸二縮水甘油酯(DA)可以采用文獻(xiàn)方法合成(Zondler，H.Helv.Chim.Acta 1977，60，1845-1860)實(shí)施例一交聯(lián)PEI的合成及性質(zhì)1克PEI(Mw2000 Daltons)溶于3ml新蒸餾的二氯甲烷中，然后加入合適比例的己二酸二縮水甘油酯和己二醇雙丙烯酸酯，在40℃下，反應(yīng)適當(dāng)時(shí)間后，溶液逐漸變黃。然后將溶液轉(zhuǎn)移到spectra/PorMwco 10,000膜中，在4℃下，用雙蒸水透析4天。然后凍干去水，得到淺色的固體(CLPEI)。存放于-70℃。采用不同的交聯(lián)劑和PEI組合可以得到各種交聯(lián)的PEI聚合物(表1)，反應(yīng)組合示意于式1，所得到的聚合物結(jié)構(gòu)示意于式2。產(chǎn)物進(jìn)行HNMR(varian 300MHz，D2O)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物中不存在原料中的雙鍵氫(5.5-6.0ppm CH2＝CH-)的吸收峰，但有3.4ppm(HO-CH2)，2.95ppm(PEI-NH-CH2-)和2.69ppm(-CH2-C＝O)的吸收峰。
式1.可能發(fā)生的交聯(lián)反應(yīng) 式2.交聯(lián)的聚乙烯亞胺的可能結(jié)構(gòu)交聯(lián)PEI(CLPEI)的分子量的測定和降解性實(shí)驗(yàn)將已知分子量的PEI標(biāo)準(zhǔn)品或合成的交聯(lián)PEI樣品配成一系列濃度的PBS溶液，pH調(diào)為7.4。記錄每個(gè)樣品的溶液在大氣壓下流過毛細(xì)管粘度計(jì)的時(shí)間，溶液的特性粘度(inherent viscosity)ηinh＝lnηrel/c，這里ηrel相對粘度(relative viscosity)ηrel＝tsolution/tsolvent，聚合物溶液流出毛細(xì)管的時(shí)間與溶劑流出毛細(xì)管的時(shí)間的比值，c是聚合物的濃度。合成的聚合物的分子量由下面的公式計(jì)算得到，ηlnh＝KMa，這里M是分子量，K and a是Mark-Houwink參數(shù)，K and a的數(shù)值可由已知分子量的PEI標(biāo)準(zhǔn)品采用上述公式計(jì)算得到。將合成的交聯(lián)PEI溶解于PBS中，在37℃下放置一段時(shí)間，按上述方法測定分子量并將聚合物的分子量與時(shí)間作圖。所得聚合物的分子量和其降解性結(jié)果如圖1所示，結(jié)果表明聚合物的分子量為13000，約50小時(shí)后降解為分子量為2000的小分子原料。
表1各種合成的交聯(lián)聚乙烯亞胺性質(zhì)


實(shí)施例二交聯(lián)PEI的乳糖酸和葉酸修飾交聯(lián)PEI通過EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide)活化氨基與乳糖酸以酰胺鍵相連接。200mg例一中所合成的交聯(lián)PEI溶于6ml 10mM TEMED/HCl緩沖液中。然后加入180mg EDC，25℃下攪拌24小時(shí)。然后加入適量的乳糖酸，25℃下攪拌72小時(shí)。最后所得產(chǎn)物用雙蒸水透析4天，凍干去水，即得到半乳糖基修飾的交聯(lián)PEI(Gal-PEI)。
10mg葉酸和適當(dāng)量DCC溶于新蒸餾的二甲亞砜DMSO中低溫反應(yīng)一段時(shí)間，然后加入200mg例一中所合成的PEI。攪拌下反應(yīng)12小時(shí)后，在4℃下，用雙蒸水透析4天。然后凍干去水，即得到葉酸修飾的交聯(lián)PEI(Fol-PEI)。
實(shí)施例三交聯(lián)PEI與pEGFP-Cl復(fù)合物的制備及表征復(fù)合物的制備將實(shí)施例一中所合成的可生物降解的交聯(lián)PEI或PEI 25kDa分別溶于PBS(140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH 7.4)中，配成1mg/ml的儲備液。將質(zhì)粒DNA用ddH2O稀釋為1mg/ml儲備液。按一定的PEI/DNA(質(zhì)量比)配制交聯(lián)PEI或PEI 25kDa的PEI與DNA的復(fù)合物，例如配制交聯(lián)PEI/DNA＝2∶1的復(fù)合物，具體過程如下取1μl質(zhì)粒DNA的溶液(1mg/ml)溶于50μl PBS中，輕輕混勻，再取2μl交聯(lián)PEI溶于50μl PBS中，輕輕混勻，然后將二者混合，振蕩10秒鐘，室溫靜置10-15分鐘，即可用于表征其性能和細(xì)胞轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)。
電泳阻滯實(shí)驗(yàn)以一系列交聯(lián)PEI與DNA的質(zhì)量比(0∶1，0.1∶1，0.2∶1，0.3∶1，0.35∶1，0.4∶1，0.45∶1)配制交聯(lián)PEI及PEI 25kDa與DNA復(fù)合物，每份含2.5μg(0.1μg/μl)的質(zhì)粒DNA(pEGFP-Cl)和一定量的交聯(lián)聚合物的PBS溶液，總體積50μl，這個(gè)溶液室溫下放置10-15分鐘。取其中10μl與2μl上樣緩沖液混合，然后加入0.8％瓊脂糖(含0.5μg/ml溴乙錠)凝膠中，電壓5V/cm進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖2所示，交聯(lián)PEI與PEI 25kDa有同樣的結(jié)合DNA能力，它們都在PEI/DNA＝0.35∶1時(shí)完全包裹DNA分子，從而使DNA分子在電泳中無法遷移。
復(fù)合物的粒徑分析復(fù)合物的粒徑用光散射法在25℃下測定，所用的儀器為Brookhaven 90 PLUS particle sizeanalyzer(Brookhaven Instruments Corporation，Holtsville，NY，USA)。波長660nm，恒定角90°，在基于重量分析的基礎(chǔ)上，假設(shè)交聯(lián)PEI/DNA復(fù)合物是對數(shù)正態(tài)分布時(shí)，其尺寸表示為有效直徑。復(fù)合物的制備方法同上，只是復(fù)合物的總體積可以等比例地增加至1ml。具體為10μg DNA溶于500μl的PBS中，適當(dāng)量(依據(jù)PEI/DNA質(zhì)量比要求)的交聯(lián)PEI溶入500μl PBS中，然后將二者混合，室溫下振蕩10秒鐘，靜置45分鐘后，進(jìn)行光散射實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表示為平均粒徑±SD，n＝3。為了研究血清對復(fù)合物穩(wěn)定性的影響，其對比實(shí)驗(yàn)為1μl質(zhì)粒DNA的溶液(1mg/ml)溶于50μl PBS中，再取適當(dāng)量(依據(jù)PEI/DNA質(zhì)量比要求)的交聯(lián)PEI溶入50μl PBS中，然后將二者混合，振蕩10秒鐘，室溫靜置10-15分鐘后，加入0.9ml的含10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，30分鐘后進(jìn)行光散射實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表示為平均粒徑±SD，n＝3。如圖3所示，沒有加入含有血清的完全培養(yǎng)基的交聯(lián)PEI與DNA的復(fù)合物45分鐘后已經(jīng)發(fā)生了聚集，粒徑達(dá)到400nm左右，而加入完全培養(yǎng)基后能明顯地抑制交聯(lián)PEI與DNA所形成的復(fù)合物的聚集，同樣條件下其粒徑僅為150nm以下，且能維持?jǐn)?shù)小時(shí)。
細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)交聯(lián)聚合物的細(xì)胞毒性通過四唑鹽(MTT)比色法測定，并與PEI 25kDa比較。3T3和293T細(xì)胞培養(yǎng)在含10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液(含100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素)中，并放置于37℃，5％CO2的孵箱中生長。取處于對數(shù)生長期的3T3和293T細(xì)胞，用含0.02％EDTA和0.25％胰蛋白酶消化液消化后以每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，每孔體積為100μl。將培養(yǎng)板移入37℃，5％CO2的孵箱中培養(yǎng)過夜。除去培液，用1×PBS洗，每孔加入不同劑量的合成聚合物或PEI25kDa及無血清培液，培養(yǎng)5小時(shí)。除去培液，1×PBS洗，每孔加入100μl完全培液繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。按著每孔加入20μl(5mg/ml)MTT溶液，37℃反應(yīng)4小時(shí)。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入100μl二甲亞砜(DMSO)，室溫溫育30分鐘。振蕩后通過酶標(biāo)儀(Bio-RAD，MicroplateReader3550)測定各孔在570nm的光吸收值。
細(xì)胞存活率(％)＝(OD570樣品/OD570對照)×100結(jié)果如圖4和圖5所示，圖4表明對293T和3T3二個(gè)細(xì)胞系，所合成的交聯(lián)PEI比25kDa PEI細(xì)胞毒性小許多，而且在最佳轉(zhuǎn)染條件下(2μg/ml)，交聯(lián)PEI的細(xì)胞毒性很小，細(xì)胞存活率均達(dá)到95％以上。圖5表明與其他商業(yè)化的轉(zhuǎn)染試劑比較，所合成的交聯(lián)PEI細(xì)胞毒性也較小。
實(shí)施例四交聯(lián)PEI轉(zhuǎn)染性能的測定細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)各種細(xì)胞培養(yǎng)在含10％新生牛血清的DMEM或RPMI1640培養(yǎng)液(含100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素)中，并放置37℃，5％CO2的孵箱中生長。交聯(lián)PEI或PEI 25kDa與DNA的復(fù)合物轉(zhuǎn)染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)具體步驟如下轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，用含0.02％EDTA和0.25％胰蛋白酶消化液消化后以每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于24孔板，每孔加0.5ml完全培養(yǎng)液，將培養(yǎng)板移入孵箱，培養(yǎng)24小時(shí)。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到70-80％時(shí)，除去培液，采用前述方法制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物，具體為取1μl質(zhì)粒DNA的溶液(1mg/ml)溶于50μl PBS中，輕輕混勻，再取2μl交聯(lián)PEI溶于50μl PBS中，輕輕混勻，然后將二者混合，振蕩10秒鐘，室溫靜置10-15分鐘，然后加入900μl含10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，混勻后得到共計(jì)1000μl的轉(zhuǎn)染液，然后加入一個(gè)孔中。37℃下，培養(yǎng)24小時(shí)，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。結(jié)果如圖6所示，所合成的交聯(lián)PEI對293T，A549和B16F10三個(gè)細(xì)胞系均有較高的轉(zhuǎn)染效率，其中對293T和B16F10二個(gè)細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染效率高達(dá)90％以上，對A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率近70％。
EGFP的表達(dá)及流式細(xì)胞儀分析前述的轉(zhuǎn)染后已經(jīng)培養(yǎng)24小時(shí)的轉(zhuǎn)染表達(dá)體系，采用流式細(xì)胞儀(FACS Calibur)分析其EGFP的表達(dá)情況。具體為使用氬激光器，在488nm進(jìn)行分析，將未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的細(xì)胞做為背景，進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞用含0.02％EDTA和0.25％胰蛋白酶消化液消化后離心并重新懸浮于PBS中，然后進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。隨機(jī)收集10000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算其中的EGFP表達(dá)的細(xì)胞所占的比例，數(shù)據(jù)采用CellQuest(Becton Dickinson)處理，CLPEI對各種細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染結(jié)果如圖7所示，對所選擇的9種細(xì)胞，除C6細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染效率僅有30％左右，其他的細(xì)胞系均達(dá)到50％以上。
為了觀察Gal-PEI對肝臟來源的細(xì)胞膜上帶有脫唾液酸糖蛋白(ASGP)細(xì)胞系的選擇性，將Gal-PEI和CLPEI分別用來轉(zhuǎn)染帶有ASGR的SMMC-7721肝癌細(xì)胞系和不帶此受體的Hela細(xì)胞系。結(jié)果表明所合成的CLPEI經(jīng)半乳糖基修飾后所獲的Gal-PEI對帶有ASGR受體的細(xì)胞系有一定的選擇性，而且在低的交聯(lián)PEI與DNA重量比條件下，這種選擇性更明顯(圖8)。
為了觀察Fol-PEI對細(xì)胞膜上帶有的葉酸受體的細(xì)胞的選擇性，將Fol-PEI和CLPEI分別用來轉(zhuǎn)染過表達(dá)葉酸受體的KB細(xì)胞和不帶此受體的A549細(xì)胞。結(jié)果表明所合成的CLPEI經(jīng)葉酸修飾后所獲的Fol-PEI對帶有葉酸受體的細(xì)胞系有一定的選擇性，而且在低的交聯(lián)PEI與DNA重量比條件下，這種選擇性更明顯(圖9)。
為了比較各種商業(yè)化的轉(zhuǎn)染試劑與我們合成的交聯(lián)PEI對NIH 3T3細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，將各種轉(zhuǎn)染試劑在各自的最佳轉(zhuǎn)染條件下分別轉(zhuǎn)pEGFP-Cl質(zhì)粒到NIH 3T3細(xì)胞中，然后用流式細(xì)胞儀分析轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果如圖10所示，所合成的交聯(lián)PEI對3T3細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染效率明顯高于其他幾個(gè)商業(yè)化的轉(zhuǎn)染試劑。
實(shí)施例五交聯(lián)聚乙烯亞胺(CLPEI)介導(dǎo)的RNAi干擾實(shí)驗(yàn)1.交聯(lián)PEI介導(dǎo)表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的RNAi研究B16F10細(xì)胞培養(yǎng)在含10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液(含100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素)中，并放置37℃，5％CO2的孵箱中生長。將成功構(gòu)建的鼠EGFR干擾載體pBSU6-EGFR按照實(shí)例四中相同的方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞。48小時(shí)后收集細(xì)胞并且用Trizol(Invitrogen公司)抽提總mRNA，RT-PCR分析干擾作用后EGFR的mRNA水平的變化，設(shè)GAPDH為內(nèi)參。結(jié)果如圖11所示，所合成的交聯(lián)PEI能成功地介導(dǎo)EGFR干擾質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞導(dǎo)致EGFR的mRNA水平明顯地下調(diào)。
2.交聯(lián)PEI介導(dǎo)胞外信號調(diào)節(jié)的激酶(extracellular-signal regulatedkinase，Erk)的RNAi研究A549和Hela細(xì)胞培養(yǎng)在含10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液(含100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素)中，并放置37℃，5％CO2的孵箱中生長。將成功構(gòu)建的Erk干擾載體pBSU6-ERK1/2按照實(shí)例四中相同的方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞。48小時(shí)后收集細(xì)胞并抽提細(xì)胞總蛋白，利用Western-blot分析干擾作用后Erk的蛋白水平的變化，設(shè)Tubulin為內(nèi)參。結(jié)果如圖12所示，所合成的交聯(lián)PEI能成功地介導(dǎo)Erk干擾質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞導(dǎo)致Erk的蛋白水平明顯地下調(diào)。
3.交聯(lián)PEI介導(dǎo)的PTEN(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten)RNAi研究A549和Hela細(xì)胞培養(yǎng)在含10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液(含100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素)中，并放置37℃，5％CO2的孵箱中生長。將化學(xué)合成的小干擾RNAs混合物(siRNA/siABTMAssayKit，Upstate Catalog#60-036)按照實(shí)例四中相似的方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞。48小時(shí)后收集細(xì)胞并抽提細(xì)胞總蛋白，利用Western-blot分析干擾作用后PTEN的蛋白水平的變化，設(shè)Beta-actin為內(nèi)參。結(jié)果如圖13所示，所合成的交聯(lián)PEI能成功地介導(dǎo)PTEN干擾片段進(jìn)入細(xì)胞導(dǎo)致PTEN的蛋白水平明顯地下調(diào)。
實(shí)施例六交聯(lián)PEI的體內(nèi)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)EGFP在C57小鼠肌肉中的表達(dá)10μg pEGFP-Cl DNA(Clontech)的ddH2O溶液(1mg/ml)與交聯(lián)PEI的PBS溶液(1mg/ml)按1∶2混合均勻，配成總體積50μl的轉(zhuǎn)染復(fù)合物，室溫下靜置15分鐘，八周齡的C57小鼠(上海實(shí)驗(yàn)動物中心)在左右后腿上剪去腿毛，每只的左右后腿上分別注射50μl PBS和50μl上述轉(zhuǎn)染復(fù)合物。設(shè)置四組每組6只小鼠，分別在給藥后的第一天，第三天，第五天，第七天將其殺死，然后制作冰凍切片，在熒光顯微鏡下觀察其EGFP的表達(dá)情況。其結(jié)果如圖14所示，白光與熒光疊加表明轉(zhuǎn)染效率達(dá)到90％。
EGFP在C57小鼠腫瘤中的表達(dá)C57BL/6J小鼠(6至8周)背部皮下接種B16F10細(xì)胞5×105個(gè)/50μl，待腫瘤直徑達(dá)50mm3左右時(shí)將動物隨機(jī)分組。轉(zhuǎn)染組和空白對照組分別于腫瘤內(nèi)注射交聯(lián)PEI-質(zhì)粒復(fù)合物50μl(注射質(zhì)粒量為10μg/50μl)，對照組于瘤內(nèi)注射等體積0.9％的生理鹽水，第三天犧牲小鼠，取出皮下腫瘤，放在冷凍切片機(jī)內(nèi)冷凍，然后冷凍切片。在熒光顯微鏡下觀察其EGFP的表達(dá)情況。其結(jié)果如圖15所示，表明轉(zhuǎn)染效率達(dá)到近90％。
以PEI20000、PEI10000為原料，重復(fù)上述實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明同樣能實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動和修改，這些等價(jià)形式同樣落入本申請權(quán)利要求書所限定的范圍。
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權(quán)利要求
1.一種可生物降解的交聯(lián)聚乙烯亞胺，是由分子量為200-100000 Da的線性或分枝狀的聚乙烯亞胺與分子量為50-50000 Da的含有在生理?xiàng)l件下可降解酯鍵的交聯(lián)劑反應(yīng)而合成，其中聚乙烯亞胺與交聯(lián)劑的摩爾比是0.1∶1-5∶1。
2.如權(quán)利要求1所述的交聯(lián)聚乙烯亞胺，其特征是所說的交聯(lián)劑是各種二酸的縮水甘油酯、丙烯酸/甲基丙烯酸縮水甘油酯或各種多元醇或多元縮醇的丙烯酸/甲基丙烯酸的多元酯中的一種或幾種的復(fù)合物。
3.如權(quán)利要求1所述的可生物降解的交聯(lián)聚乙烯亞胺，可進(jìn)一步地被糖基化、聚己二醇化、酰基化或烷基化，從而獲得各種交聯(lián)聚乙烯亞胺的衍生物。
4.如權(quán)利要求1-3之一所述的交聯(lián)聚乙烯亞胺及其衍生物，進(jìn)一步偶聯(lián)各種靶向分子，從而獲得各種靶向交聯(lián)聚乙烯亞胺；所說的靶向分子為轉(zhuǎn)鐵蛋白，脫唾液酸糖蛋白，抗體/抗體片段，低密度脂蛋白，白細(xì)胞介素，GM-CSF，G-CSF，M-CSF，干細(xì)胞生長因子，促紅細(xì)胞生成素，表皮生長因子，胰島素，葉酸，乳糖，半乳糖，脫唾液酸血清類粘蛋白，甘露糖，甘露糖-6-磷酸，N-己?；樘前?，凝血調(diào)節(jié)蛋白，融合劑，血凝素HA2或核定位信號。
5.一種組合物，它含有權(quán)利要求1所說交聯(lián)聚乙烯亞胺和核酸。
6.如權(quán)利要求5所說的組合物，其中所述的核酸是指DNA、治療基因、RNA、催化活性核酸、反義寡核苷酸或修飾的核酸。
7.一種組合物，它含有權(quán)利要求4所說的靶向交聯(lián)聚乙烯亞胺和核酸。
8.一種用核酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法，它包括使細(xì)胞與權(quán)利要求1所說的交聯(lián)聚乙烯亞胺與核酸構(gòu)成的組合物接觸的步驟。
9.一種試劑盒，它含有權(quán)利要求1所說的交聯(lián)聚乙烯亞胺和指導(dǎo)將上述物質(zhì)和核酸結(jié)合用于核酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞的說明。
10.如權(quán)利要求1-4所述的交聯(lián)聚乙烯亞胺，在體外用于基因轉(zhuǎn)染試劑和體內(nèi)用于基因治療的藥物傳輸系統(tǒng)，也可以用做藥物，蛋白，多肽等生物活性劑的傳輸載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于輸送藥物和其他生物活性劑的可在生理?xiàng)l件下降解的交聯(lián)聚乙烯亞胺及其制備方法和應(yīng)用。具體為以各種二酸的縮水甘油酯、丙烯酸/甲基丙烯酸縮水甘油酯或各種多元醇或多元縮醇的丙烯酸/甲基丙烯酸的多元酯中的一種或上述幾種的復(fù)合物為交聯(lián)劑在適當(dāng)條件下與各種分子量的線型或分枝狀聚乙烯亞胺發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)合成出對各種細(xì)胞和生物體組織具有基因轉(zhuǎn)染功能的非病毒基因轉(zhuǎn)染載體。本發(fā)明提供的生物活性劑的傳輸載體可以用于藥物，特別是核酸或陰離子型的生物活性物質(zhì)的傳遞，使用本發(fā)明制備的載體可以在體外實(shí)現(xiàn)對各種細(xì)胞的高效，低毒性的轉(zhuǎn)染，在體內(nèi)可實(shí)施高效，低毒性的局部或系統(tǒng)給藥。
文檔編號C08K5/10GK1970591SQ200610097858
公開日2007年5月30日 申請日期2006年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月16日
發(fā)明者董偉, 成立珍 申請人:南京慧基生物技術(shù)有限公司