專利名稱：：葡聚糖的制備的制作方法葡聚糖的制備
背景技術(shù)：
：本申請要求2006年6月15日提交的美國序列號60/813,971、題為葡聚糖的制備的權(quán)益。本發(fā)明涉及包含(3-葡聚糖的組合物。更具體地i兌，本發(fā)明涉及可溶性P-葡聚糖組合物及其在干細(xì)胞動員中的用途。葡聚糖往往被描述為葡萄糖的聚合物，并衍生自酵母、細(xì)菌、真菌和植物，例如燕麥或大麥。已知含卩(l-3)-連接的吡喃葡萄糖主鏈的葡聚糖具有生物學(xué)活性，尤其是，已經(jīng)表明它們調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，更近期地，介導(dǎo)造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞(HSPC)的動員。各種癌癥的治療日益涉及減少細(xì)胞數(shù)的治療，包括高劑量化療或放射療法。這些治療使患者的白細(xì)胞數(shù)下降，抑制骨髓造血活性，并增加他們感染和/或出血的風(fēng)險。因此，接受減少細(xì)胞數(shù)的治療的患者也必須接受治療，以重新恢復(fù)骨髓功能(造血作用)。盡管在干細(xì)胞動員和技術(shù)方面取得進(jìn)展，高達(dá)20-25%的患者表現(xiàn)出不良的動員，并不能進(jìn)行自體移植。PGG(3-葡聚糖是可溶性酵母衍生的多糖，先前已經(jīng)表現(xiàn)出介導(dǎo)造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞(HSPC)的動員。發(fā)明概述在本發(fā)明中，酵母被培養(yǎng)、收獲和純化，生成基本不含污染有揮發(fā)性有機(jī)化合物(VOCs)的微粒P-葡聚糖。通過使酵母細(xì)胞或其片段經(jīng)受去除宿主細(xì)胞雜質(zhì)的一系列的堿、表面活性劑和酸提取，制備微粒(3-葡聚糖。經(jīng)以上工藝或經(jīng)現(xiàn)有工藝方法生產(chǎn)的微粒P-葡聚糖在升高的溫度和壓力下可溶解于酸性溶液。然后，澄清和先后采用疏水相互作用的3層析(HIC)、凝膠滲透層析(GPC)純化所生成的可溶性(3-葡聚糖。作為藥劑，以較高劑量給予可溶性p-葡聚糖，而無增加的或?qū)嶋H上減少的可觀察到的副作用或不利結(jié)果。圖的簡述圖l是生產(chǎn)微粒(3-葡聚糖的方法的示意圖。圖2是生產(chǎn)可溶性p-葡聚糖的方法的示意圖。發(fā)明詳述4效粒[3-葡聚糖圖1是從酵母生產(chǎn)不溶的或微粒p-葡聚糖的方法10的概況，它包括步驟12-22。在步驟12中，酵母培養(yǎng)基典型地在搖瓶或發(fā)酵桶中生長。用于本發(fā)明的酵母林可為任何抹，其實例包括釀酒酵母f5"acc/wcw少c^sf5".」cerevz'w.ae」、德爾布酵母(S.<sfe/6rw￡ch"、羅斯酵母(5".小橢圓酵母(S.w/croe〃/jwo(ias」、卡爾酵母(51.car/Aergera/s)、二孢酵母(51.^pon^、發(fā)酵性酵母CS./eme"to^)、魯酵母(S.raiaz"、粟酒裂殖酵母(iSc/^osacc/wtra附少cey/cw^e)、乳酸克魯維酵母(A7w_yveram_ycMfK)&"Ay)、脆壁克魯維酵母(K/ra&to)、多孢克魯維酵母(人'.po/"porw力、白假絲酵母f"Ow^/afC.,a仿/cam;;、陰道假絲酵母(C.c/oac"e)、熱帶假絲酵母(C.fra/,:ca/W、產(chǎn)朊假絲酵母(C.w"fc)、溫奇漢遜酵母(/Zam'e"w/af7/Jw/"取0、am/漢遜酵母(H.^ro'),亨利漢遜酵母(/f.&em"/cf/、美國漢遜酵母(//.amen'c朋a)、加拿大漢遜酵母(//.ca"a&'m^)、碎囊漢遜酵母(〃.ca戸w/ato)、多形漢遜酵母(//./x力wwp/a)、克魯弗畢赤酵母(Wc/^fv)Ww"m')、巴斯德畢赤酵母(尸.pwto/力)、多形畢赤酵母(尸.；w/;^or/7/2fl)、羅丹畢赤酵母(尸.Ao^"e^)、奧默畢赤酵母(尸.o/zwe〃')>牛球擬酵母(7bra/o戸,:s(T-」6ov/wa)々光滑球擬酵母(r.g/Wrato)。在批量生產(chǎn)的一個實施方案中，從酵母培養(yǎng)開始，經(jīng)搖動燒瓶培養(yǎng)基逐步擴(kuò)大到250-L規(guī)模的生產(chǎn)發(fā)酵桶。酵母在富含維生素，例如葉酸、肌醇、煙酸、泛酸(鈣和鈉鹽)、吡。多醇HC1和胸腺嗜啶HC1和來自化合物例如氯化鐵六水合物；氯化鋅；氯化^5二水合物；鉬酸；硫酸銅五水合物和硼酸的微量金屬的葡萄糖-硫S交銨培養(yǎng)基中生長。在約0.02%濃度時，也可加入消泡劑，例如防沫劑(Antifoam)204。以補(bǔ)料分批培養(yǎng)方式(fedbatchmode)將生產(chǎn)培養(yǎng)基維持在葡萄糖限制下。在種子發(fā)酵期間，在接種生產(chǎn)發(fā)酵桶之前，定時取樣，測量培養(yǎng)基的光密度。在生產(chǎn)發(fā)酵期間，仍定時取樣，以測量培養(yǎng)基的光密度。在發(fā)酵結(jié)束時，取樣測量光密度、干重量和微生物純度。如果需要，可通過提高培養(yǎng)基pH到至少11.5或經(jīng)離心培養(yǎng)基以從生長介質(zhì)中分離細(xì)胞，終止發(fā)酵。此外，可根據(jù)想要得到的經(jīng)純化的(3-葡聚糖的規(guī)格和形式，采取分裂或破碎酵母細(xì)胞的各個步驟?？刹捎萌魏我阎幕瘜W(xué)、酶或機(jī)械方法，或它們的任何組合，分裂或破碎酵母細(xì)胞。在步驟M,收獲含P-葡聚糖的酵母細(xì)胞。當(dāng)批量生產(chǎn)p-葡聚糖時，典型地采用連續(xù)流式離心收獲酵母細(xì)胞。步驟16表示用一種或多種4^溶液、表面活性劑或它們的組合初步提取酵母細(xì)胞。例如，適用的堿溶液是0.1M-5MNaOH。適用的表面活性劑包括，例如，辛基硫葡糖香、LubroiPX、TritonX-100、月桂基硫酸鈉(SDS)、NonidetP-40、吐溫20等。也可釆用離子型(陰離子、陽離子、兩性)表面活性劑(例如，磺酸烷基酯、苯扎氯銨等)和非離子型表面活性劑(例如，聚氧乙烯氫化篦麻油、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯脫水山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯甘油脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基苯基醚等)。表面活性劑的濃度會有所不同，并部分地取決于所用的表面活性劑。酵母細(xì)胞材料可被提^f又一次或多次。提取通常在介于約70°C-約90。C的溫度下進(jìn)行。根據(jù)溫度、所用試劑及其濃度，每次提取的持續(xù)時間介于約30分鐘-約3小時之間。在每次提取后，采用離心或連續(xù)流式離心收集含有(3-葡聚糖的固相，并為后繼步驟而再懸浮。離心期間，在液相中除去已溶解的污染物，同時使(3-葡聚糖保存于不溶的細(xì)胞壁材料中。在一個實施方案中，進(jìn)行四次提取。在第一次提取中，使已收獲的酵母細(xì)胞與1.0MNaOH混合，并加熱至90°C約60分鐘。第二次提取是堿/表面活性劑提取，借此，使不溶材料再懸浮于O.lMNaOH和約0.5%-0.6%TritonX-100中,并加熱至90。C約120分鐘。第三次提取類似于第二次提取，除了TritonX-100濃度為約0.05%,和持續(xù)時間縮短至約60分鐘之外。在第四次提取中，使不溶材料再懸浮于約0.50/oTriton-X100中，并加熱至75。C約60分鐘。堿和/或表面活性劑提取物溶解并去除某些無關(guān)酵母細(xì)胞材料。堿溶液水解蛋白、核酸、甘露聚糖和脂質(zhì)。表面活性劑促進(jìn)脂質(zhì)和其它疏水雜質(zhì)的去除，這為生成改進(jìn)的P-葡聚糖產(chǎn)物提供額外的優(yōu)點。先前的純化程序生成含有微量揮發(fā)性有機(jī)化合物(VOCs)的|3-葡聚糖。在先研究已經(jīng)表明，脂肪作為脂肪酸釋放，再快速分解為各種VOCs，生成VOCs。大部分情況下，檢測出的量不足以造成危害，但，給予人或其它動物的產(chǎn)物基本不含任何VOCs顯然是有益的。需氧和厭氧生長產(chǎn)生的釀酒酵母(&cc/arowycescerev/w'ae)的月旨肪含量介于約3%-約8%。脂肪含量隨酵母的生長條件而變化。表l提供釀酒酵母的典型脂肪組成的概況。數(shù)據(jù)來自以下參考文獻(xiàn)Blagovic,B.,J.Rpcuc，M.Meraric,K.Georgia和V.Marie.2001.啤酒酵母的脂質(zhì)組成.FoodTechnol.Biotechnol.39:175-181.Shulze.1995.釀酒酵母的厭氧生理學(xué).哲學(xué)博士論文，丹麥科技大學(xué).6VanDerRest,M.E.，A.H.Kamming，ANakano,Y.Anrak，B.Poolman和W.N.Koning.1995.釀酒酵母的質(zhì)膜結(jié)構(gòu)、功能和生物合成.Microbiol.Rev.59:304-322.表1脂肪酸Shulze(1995)Blagovic等(2001)(厭氧生長)VanDerRest等(1995)10:0癸酸1.1%12:0和12:1月桂酸4.8%7.3%14:0和14:1肉豆蔻酸8.8%5,1%7.0%*16:0棕櫚酸26.8%44.2%12.8%16:1棕櫚油酸16.6%16,9%32.3%18:0硬脂酸6,1%13.9%8.0%18:1油酸25.7%7.3%28,00/o18:2和高級亞油酸、花生四埽酸和其它酸10.1%5.3%9.4%*包括脂質(zhì)10:0-14:1根據(jù)酵母類型和生長條件，酵母細(xì)胞壁材料典型地含有10-25%脂肪。目前，在將酵母細(xì)胞壁材料加工成(3-葡聚糖期間，某些，但不是全部脂肪經(jīng)離心和洗滌步驟除去。因此，典型的產(chǎn)生可能得到3-7%的脂肪含量。制備工藝典型地涉及去除酵母細(xì)胞壁的甘露糖蛋白(mannoproteins)、脂質(zhì)和其它不希望的組分的步驟。常見于該方法的某些關(guān)鍵步驟是在各獨立的洗滌步驟中采用酸和堿釋放某些細(xì)胞壁成分的各種洗滌步驟。數(shù)種步驟采用堿洗滌工藝，其中堿，通常是氫氧化鈉，被加至液體細(xì)胞壁懸液中。堿的用途之一是通過形成脂質(zhì)的游離脂肪酸去除脂質(zhì)。結(jié)果是(3-葡聚糖的脂肪含量下降。一般用于生產(chǎn)酵母P-葡聚糖的堿洗滌步驟留下殘余的已經(jīng)減少反應(yīng)性的脂肪酸和部分降解的脂肪甘油三酯。堿洗滌工藝的直接的結(jié)果是釋放反應(yīng)性游離脂肪酸，其快速分解為脂肪分解的各種氧化產(chǎn)物。大多數(shù)研究者已經(jīng)詳述多不飽和脂肪在貯存期間分解的事實。盡管甘油三酯可在氧氣的存在下自氧化，但更常見的是游離脂肪酸經(jīng)氧化分解。在脂質(zhì)，也稱為甘油三酯的分解中的正常步驟是從甘油三酯中釋放游離脂肪酸。游離脂肪酸事實上不存在于活著的生物體的組織，而當(dāng)有機(jī)體因進(jìn)一步加工而死亡或收獲時，例如隨含油種子出現(xiàn)和在提練動物脂肪中，通常分解(Nawar,W.W.4章.脂質(zhì).在食品化學(xué).1985.編輯者OwenR,Fennema.MarcelDekker，Inc.;DeMan，J.M.2章.脂質(zhì).在食品化學(xué)原理1985.AVIPublishingCo.，Inc.)。在許多甘油三酯中，甘油酯分子的2-位被不飽和脂肪所占據(jù)。在堿處理(3-葡聚糖的情況下，釋放如下所述般分解的不飽和脂肪酸的皂化是熟知的工藝。脂肪氧化過程有幾種機(jī)理。最常見的機(jī)理是自氧化。該過程經(jīng)從烯烴去除氫開始，產(chǎn)生自由基。氫的去除發(fā)生于脂肪中挨著雙鍵的碳原子。通過各種自由基生成因素，例如UV光、金屬、單線態(tài)氧等，誘發(fā)該反應(yīng)。RH—R'+H'(生成自由基電子)第二個步驟是加入氧氣，引起過氧自由基生成，其通過從另一個不飽和脂肪酸提取氬傳遞鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。R'+02—-1102'(生成反應(yīng)性氧化自由基)R02'+RH~>ROOH+R'(ROOH是反應(yīng)性過氧化氬，它分解為第二種反應(yīng)產(chǎn)物，例如VOCs)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)繼續(xù)，直到自由基自身合并生成非反應(yīng)性產(chǎn)物而終止。R'+R—R-RR'+R02'4R02R以下是導(dǎo)致VOCS形成的化學(xué)反應(yīng)。用亞油酸作為化學(xué)模型，但其它不飽和脂肪酸存在于酵母細(xì)胞壁和酵母P-葡聚糖制劑中，其產(chǎn)生相同的最終產(chǎn)物。ROOH->RO+OH-RO'~>裂解反應(yīng)物形成醛、烷基(它形成烴和醇)、酯、醇和烴。實例<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>同樣地，如果環(huán)氧化物形成于2和3碳鍵之間，則化學(xué)導(dǎo)致<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>(2，4-癸二烯醛的2，3環(huán)氧化物)+乙醇和2-辛烯趁o以類似的方式，通過隨脂肪酸氧化期間形成的反應(yīng)性種類的過氧化物的分解而產(chǎn)生的自氧化反應(yīng)，可引起(3-葡聚糖制備中鑒定的VOCs的形成。因此，不僅就脂肪而言，而且就VOC污染而言，從卩-葡聚糖生產(chǎn)中除去盡可能多的脂肪，產(chǎn)生更純的產(chǎn)物?；氐綀D1,純化工藝中的下一個步驟是示于步驟1.8的去除糖原的酸提取。通過調(diào)節(jié)堿/表面活性劑提取的材料的pH至介于約5和9之間，并于介于約70。C-100。C的溫度下，使材料混合于約0.05M-約1.0M乙酸中約30分鐘-約12小時，實現(xiàn)一種或多種酸提取。在一個實施方案中，使堿/表面活性劑提取物離心后保留的不溶性材料再懸浮于水中，用濃HCl調(diào)節(jié)溶液的pH至約7。使材料與充足的冰醋酸混合，制備0.1M醋酸溶液，加熱約5小時至90。C。在步驟20,洗滌不溶性材料。在典型的洗滌步驟中，在約室溫下，使材料混合于純凈水中最少約20分鐘。用水洗滌兩次。再如步驟22所示的那樣，收集經(jīng)純化P-葡聚糖產(chǎn)物。此外，典型地通過離心或連續(xù)流式離心進(jìn)^^收集。此時，生成經(jīng)純化的微粒p-葡聚糖產(chǎn)物。根據(jù)起始原料，產(chǎn)物可呈完整葡聚糖顆?；蚱淙魏尾糠值男问?。此外，大粒徑顆?？杀黄扑槌筛〉念w粒。產(chǎn)物范圍包括已經(jīng)在體內(nèi)基本保持形態(tài)學(xué)(完整葡聚糖顆粒)下至亞微大小顆粒的(3-葡聚糖顆粒。如本領(lǐng)域所熟知的，微粒j3-葡聚糖用于許多食品、補(bǔ)品和藥品應(yīng)用中?；蛘撸⒘?3-葡聚糖可進(jìn)一步加工成含水的可溶性j3-葡聚糖。可溶性B-葡聚糖圖2是生產(chǎn)含水可溶性(3-葡聚糖的方法24的概況，它包括步驟26-32。用于方法24的起始原料是微粒p-葡聚糖，它可通過方法10生產(chǎn)，或通過前面采用的多種方法中的任何一種生產(chǎn)。微粒(3-葡聚糖起始原料的大小可介于完整葡聚糖顆粒下至亞微大小顆粒的范圍。在步驟26中，在減壓和升高的溫度下，微粒p-葡聚糖經(jīng)酸處理，產(chǎn)生可溶性P-葡聚糖。在可密封的反應(yīng)容器中，使小球狀的微粒p-葡聚糖再懸浮并混合于緩沖溶液中，達(dá)到pH3.6。加入緩沖試劑，使每升總體積的最終懸液混合物含有約0.61g乙酸鈉、5.24ml冰醋酸和430g小球狀微粒(3-葡聚糖。用氦氣吹洗容器，除去氧氣，并增加反應(yīng)容器內(nèi)的壓力。在特定實施方案中，使容器內(nèi)的壓力至35PSI，加熱懸液至約135°C維持約4.5-5.5小時。發(fā)現(xiàn)在這些條件下，P-葡聚糖將溶解。隨著溫度從135。C下降，溶解量也下降。應(yīng)該注意，只在剛剛描述的實施方案中需要該溫度和壓力。如果改變?nèi)魏畏磻?yīng)條件和/或試劑，可能需要優(yōu)化溫度和壓力。通過實際上從工藝中消除對有害化學(xué)品的使用，增加的壓力和溫度賦予超過現(xiàn)有技術(shù)用于溶解P-葡聚糖的工藝的優(yōu)點。先前已經(jīng)采用的有害化學(xué)品包括，例如，易燃VOCS，例如醚和乙醇，極強(qiáng)酸，例如曱酸和硫酸和極高pH的苛性堿溶液。本方法不僅通過減少所用的大量不同化學(xué)品和所涉及的多個步驟而更加安全，而且更加經(jīng)濟(jì)。典型地通過取樣反應(yīng)器內(nèi)容物和進(jìn)行凝膠滲透層析(GPC)分析，進(jìn)行實驗以確定熱處理的精確的持續(xù)時間。目的是使?jié)M足高折分-GPC(HR-GPC)分布(profile)規(guī)格和雜質(zhì)水平的可溶性材料的得率最大化，這在下面討論。P-葡聚糖一旦溶解，就冷卻混合物，停止反應(yīng)。此時，粗的經(jīng)溶解的(3-葡聚糖可被洗滌并用于某些用途，然而，藥物用途需要進(jìn)行進(jìn)一步純化?？刹捎靡环N或多種以下步驟的任何組合純化可溶性P-葡聚糖。如需要，也可采用本領(lǐng)域已知的其它方法。在步驟28,澄清可溶性P-葡聚糖。適用的澄清方法包括，例如，離心或連續(xù)流式離心(continuous-flowcentrifugation)。接著，可如步驟30所示，過濾可溶性p-葡聚糖。在一個實施方案中，例如，先后經(jīng)深度過濾器和0.2^m過濾器過濾所述材料。步驟32采用層析法進(jìn)一步純化。在層析制備中的步驟28或步驟30期間的某些點，可調(diào)節(jié)可溶性P-葡聚糖。例如，如果層析步驟包括疏水相互作用層析(HIC),則可用硫酸銨和醋酸鈉溶液調(diào)節(jié)可溶性p-葡聚糖至適當(dāng)?shù)碾妼?dǎo)率和pH。用來調(diào)節(jié)pH至5.5的適用的溶液是3.0M硫酸銨、O.IM醋酸鈉。在一個HIC實例中，將柱用TosahToyopearlButyl650M樹脂(或等價物)填充。根據(jù)廠商的推薦，充填和修飾(qualified)柱。在裝填前，針對pH、電導(dǎo)率和內(nèi)毒素分析對流經(jīng)柱的平tf液取樣。裝填經(jīng)用較高濃度的硫酸銨溶液調(diào)節(jié)過的可溶性(3-葡聚糖，再洗滌?？扇苄訮-葡聚糖的性質(zhì)使大多數(shù)產(chǎn)物結(jié)合至H1C柱。低分子量產(chǎn)物及某些高分子量產(chǎn)物被完全洗出。用緩沖液例如pH5.5的0.2M辟u酸銨、O.lM醋酸鈉洗脫保留于柱中的可溶性p-葡聚糖?？赡苄枰啻窝h(huán)，以確保己糖負(fù)荷未超出樹脂的容量。收集流分，分析可溶性卩-葡聚糖產(chǎn)物?？赡鼙徊捎玫牧硪环N層析步驟是凝膠滲透層析(GPC)。在GPC的一個實例中，TosahToyopearlHW55F樹脂或等價物被采用，并如制造商所推薦的那樣被填充和修飾。柱被平衡并用檸檬酸鹽緩沖的鹽水(0.14M氯化鈉、0.01M檸檬酸鈉，pH6.3)洗脫。在裝填前，對柱洗出樣品進(jìn)行pH、電導(dǎo)率和內(nèi)毒素分析。此外，可能需要多次層析循環(huán)，以確保負(fù)荷不超過柱的容量。按流分收集洗脫液，分析來自各流分的樣品的各種組合，以確定具有最佳分布的組合。例如，可經(jīng)HR-GPC分析樣品組合，得到具有最優(yōu)化HR-GPC分布的組合。在一個最優(yōu)化的分布中，超過380,000Da的可溶性P-葡聚糖的高分子量(HMW)雜質(zhì)的量少于或等于10%。<氐于25,000Da的低分子量(LMW)雜質(zhì)的量少于或等于17%。隨后合并所選擇的各流分的組合。此時，純化可溶性p-葡聚糖并備用?？蛇M(jìn)行進(jìn)一步過濾以對產(chǎn)物殺菌。如需要，可用無菌檸檬酸鹽緩沖鹽水調(diào)節(jié)產(chǎn)物的己糖濃度至約1.0±0.15mg/ml。上述純化技術(shù)生成改進(jìn)的可溶性P-葡聚糖，它具有作為藥劑的特殊的優(yōu)點(其在下文中討論)。如經(jīng)帶多角度光散射的HR-GPC(HR-GPC/MALS)和差示折射率檢測確認(rèn)的那樣，可溶性(3-葡聚糖的平均分子量介于約120,000Da-約205,000Da之間，及分子量分布(多分散性)不大于2.5。粉末X-射線衍射和幻角(magic-angle)自旋NMR確認(rèn)，產(chǎn)物由涉及三股螺旋的聚合物鏈組成?？扇苄訮-葡聚糖典型地不帶電荷，并因而不具有pKa。它可不受pH影響而溶于水，粘度隨濃度增加而增加。表2概述采用方法10生產(chǎn)的完整葡聚糖顆粒的可溶性P-葡聚糖產(chǎn)物中的雜質(zhì)的典型水平。12<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>比色分析法或通過測量釀酒酵母(^.cev/w'a^細(xì)胞蛋白的更加為文感的商業(yè)上的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)確定殘余蛋白(CygnusTechnologySouthport，NorthCarolina)?？赏ㄟ^采用280nm下檢測的反相高效液相色譜(RP-HPLC)評價麥角甾醇水平，監(jiān)測殘余脂質(zhì)。糖原是主要由a-l,4-連接的葡萄糖組成的多糖，可經(jīng)酶試i險確定它的存在。將該產(chǎn)物加至含有從糖原釋放葡萄糖的淀粉葡萄糖苷酶的酶反應(yīng)物中，生成還原糖。經(jīng)BCA試驗測定還原糖。甘露聚糖是帶a-l,2-和a-l，3-支鏈的a-，6-連接的甘露糖的支鏈聚合物，它如甘露糖一樣，通過其單糖組分監(jiān)測。將產(chǎn)物加至反應(yīng)物中，甘露糖經(jīng)三氟乙酸水解并經(jīng)HPLC分析。曱殼質(zhì)是用比色分析法監(jiān)測的(3-1,4-N-乙酰葡萄糖胺的聚合物。經(jīng)硫酸水解可溶性(3-葡聚糖，所生成的葡萄糖胺與Ehriich's試劑形成經(jīng)比色測量的復(fù)合物。這些和其它適用的試驗為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。源自制備過程中加入的組分的潛在的非酵母雜質(zhì)包括TritonX-100(表面活性劑)和Antifoam204(消泡劑)。280nm下檢測的反相HPLC(RP-HPLC)可用來鑒別任何殘余的TritonX-100。用正模式電噴霧質(zhì)語檢測器，經(jīng)用選擇性離子監(jiān)測的RP-HPLC方法評價消泡劑(Antifoam204)。某些產(chǎn)物規(guī)格建議采用可溶性(3-葡聚糖作為藥劑。這些規(guī)格列于表3。表3類別特征方法建議限度一般外觀目測透明，無色溶液pHpH計5.0-7.5克分子滲透壓重量濃度滲透壓力計260-312mOsm鑒別HR-GPC分布GPC-MALS符合標(biāo)準(zhǔn)；峰保留體積比0.8-1.214<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>**內(nèi)毒素單位如上所述，經(jīng)方法10和24生產(chǎn)的可溶性p-葡聚糖是優(yōu)于現(xiàn)有
技術(shù)領(lǐng)域：
的可溶性p-葡聚糖材料的改進(jìn)產(chǎn)物。改進(jìn)見于臨床試驗結(jié)果，其中，與的現(xiàn)有技術(shù)的較低的最大劑量可溶性(3-葡聚糖相比，以很高件(AEs)。結(jié)果列于表4。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>最大單一劑量2.25mg/kg最大單一劑量6.0mg/kgBfl以商品名Betafectin,—種由Alpha-BetaTechnology,Inc開發(fā)的可溶性(3-葡聚糖產(chǎn)品而聞名。生產(chǎn)BetafectinTM的方法采用曱酸溶解微粒(3-葡聚糖材料。此外，在其純化過程中，Bfl不經(jīng)任何層析。用健康受治療者的志愿人群進(jìn)行研究。與Bfl相比，攝入改進(jìn)的可溶性P-葡聚糖的研究參與者報告更少的不良事件，即使最大劑量為Bfl的2.5倍。因此，可給予甚高劑量的改進(jìn)可溶性卩-葡聚糖，可產(chǎn)生至少不會增加的，反而實際上可能降低的副作用。此外，改進(jìn)的可溶性P-葡聚糖不會誘導(dǎo)引起炎性副作用的生物化學(xué)介質(zhì)，例如，白介素-1p和肺瘤壞死因子-a。本發(fā)明的方法提供超過現(xiàn)有技術(shù)方法的幾個優(yōu)點，并生成改進(jìn)的卩-葡聚糖產(chǎn)物。微粒P-葡聚糖基本不含有害VOCs。(3-葡聚糖的溶解更加安全和更加經(jīng)濟(jì)。此外，經(jīng)本方法制備的,效粒(3-葡聚糖的溶解生成具有改進(jìn)的藥物質(zhì)量的可溶性P-葡聚糖。盡管已經(jīng)用參考具體實施方案說明或描述本發(fā)明，但本領(lǐng)域的技術(shù)技術(shù)人員會明白，可進(jìn)行形式或細(xì)節(jié)方面的各種修改，而不背離所附權(quán)利要求書所嚢括的本發(fā)明的精神和范圍。權(quán)利要求1.一種生產(chǎn)具有免疫刺激性質(zhì)的可溶性β-葡聚糖的方法，該方法包括向微粒β-葡聚糖和酸的懸液施加約35PSI壓力；和以足以形成可溶性β-葡聚糖的時間加熱該懸液至約135℃。2.權(quán)利要求1的方法，其還包括澄清可溶性P-葡聚糖。3.權(quán)利要求2的方法，其中的可溶性(3-葡聚糖經(jīng)離心、過濾或它們的組合澄清。4.權(quán)利要求1的方法，其中的懸液在基本除去所有氧氣的容器中。5.權(quán)利要求4的方法，其中的氧氣通過用氮氣吹洗容器除去。6.權(quán)利要求1的方法，其還包括根據(jù)分子量分離進(jìn)入各流分的可溶性p-葡聚糖。7.權(quán)利要求6的方法，其中的可溶性(3-葡聚糖經(jīng)層析法分離。8.權(quán)利要求1的方法，其中的酸是乙酸。9.一種包含具有免疫刺激性質(zhì)的未衍化的、可溶性P-葡聚糖的組合物，它可以以至多約6mg/kg的單一劑量給予。10.權(quán)利要求9的組合物，其中所述未衍化的、可溶性(3-葡聚糖不是引起炎性副作用的生物化學(xué)介質(zhì)。11.權(quán)利要求10的組合物，其中的生物化學(xué)介質(zhì)是白介素-l卩、胂瘤壞死因子-a或二者。12.權(quán)利要求9的組合物，其中所述未衍化的、可溶性p-葡聚糖書亍生自酉良酒酵母(5Wcc/z(3raw7cescez-evz'w'ae)。13.權(quán)利要求9的組合物，其中所述未衍化的、可溶性P-葡聚糖介于約25,000Da和約380,000Da之間。全文摘要本發(fā)明涉及包含β-葡聚糖的組合物。更具體地說，本發(fā)明涉及生產(chǎn)可溶性β-葡聚糖的方法。文檔編號C08B37/00GK101553261SQ200780029944公開日2009年10月7日申請日期2007年6月15日優(yōu)先權(quán)日2006年6月15日發(fā)明者A·梅吉,J·羅爾克,楊仁德申請人:生物高聚物工程公司Dba生物治療公司