專利名稱：一種應(yīng)用于蛋白質(zhì)分離純化的納米磁性復(fù)合微球的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及納米制品制備，具體涉及一種應(yīng)用于蛋白質(zhì)分離純化的納米磁性 復(fù)合微球的制備方法。
背景技術(shù)：
從樣品中分離、提純與檢測各種蛋白質(zhì)是生命科學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)中的一個重要 環(huán)節(jié)，傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)分離方法如鹽析、有機溶劑沉淀法、膜分離技術(shù)、和柱層析 技術(shù)等，是通過改變PH值、溫度、離子強度、介電常數(shù)等因素來達到分離的目
的。但上述方法存在一些缺陷，如分離過程繁雜、儀器成本高、蛋白質(zhì)損失大 等，從而使它們的應(yīng)用受到限制。以磁性微球為固相介質(zhì)對蛋白質(zhì)進行提純是一 項新興的蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)。它是通過對磁性微球表面的改性，共價結(jié)合上能 被目標蛋白質(zhì)識別和可逆結(jié)合的配基，當(dāng)目標蛋白質(zhì)與磁性微球緊密結(jié)合后，利 用外部磁場對蛋白質(zhì)進行分離。同傳統(tǒng)方法相比，蛋白質(zhì)的磁分離純化技術(shù)具有 操作簡單、快速、高效富集、高收率等優(yōu)點。
目前磁性微球的制備方法主要包括化學(xué)沉淀法，包埋法，高分子微球磁化法， 單體共聚法等?；瘜W(xué)沉淀法是將鐵離子和亞鐵離子在堿性條件下分散于高分子溶 液中，通過乳化復(fù)合技術(shù)，透析、干燥等手段得到生物高分子磁性微球。中國發(fā)
明專利申請公開號CN137630A公開了用共沉淀法制備瓊脂糖微球。但所得到 的微球磁響應(yīng)性較弱，形狀不規(guī)則。包埋法是制備磁性微球較早的一種方法，它 是指將磁性粒子分散在高分子溶液中，通過霧化、絮凝、沉積、蒸發(fā)等手段得到 磁性高分子復(fù)合微球。此方法制備的磁性復(fù)合微球所需條件簡單，易于進行，但 所得微球粒徑較大，單分散性較差，形狀難以控制。高分子微球磁化法是指以高 分子聚合單體為原料，通過高分子聚合反應(yīng)，合成出的帶有多孔的高分子微球， 然后將微球反復(fù)浸漬在Fe^和F^+混和溶液中，在強堿性環(huán)境下，在高分子微球 的內(nèi)部形成具有順磁性微球，美國專利公開號USP4654267公開了一種高分子 微球磁化法。但這種方法需要重復(fù)多次，過程繁瑣，難以控制，所得微球的磁響
3應(yīng)程度低。單體共聚法通常是指采用兩種或兩種以上的單體在一定的條件下進行 聚合反應(yīng)，生成表面帶有功能基團的磁性復(fù)合微球，主要的聚合方法包括分散聚 合，乳液聚合，無皂乳液聚合，微乳液聚合法等。目前采用單體共聚法制備磁性 微球巳有文獻報道，但該制備技術(shù)還不成熟，所制備的微球單分散性不夠理想， 磁響應(yīng)性較弱，微球的生化活性以及分散穩(wěn)定性都有待提高，限制了其在蛋白質(zhì) 分離純化方面的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于克服上述不足之處，提供一種應(yīng)用于蛋白質(zhì)分 離純化的磁性微球，該微球具有磁響應(yīng)性強，表面功能團豐富，配基偶聯(lián)效率高， 分散穩(wěn)定性強的特點。
本發(fā)明提供了一種應(yīng)用于蛋白質(zhì)分離純化的磁性微球的制備方法。
本發(fā)明方法首先制備磁性納米粒子，并通過帶有雙鍵結(jié)構(gòu)的硅烷偶聯(lián)劑對其 進行表面改性，然后將改性粒子與高分子單體混合物進行乳液聚合制得表面帶有 羧基的磁性復(fù)合微球，最后通過偶聯(lián)劑使磁性復(fù)合微球表面連接上特定的配基， 即得到應(yīng)用于蛋白質(zhì)分離純化的磁性微球。 具體包括下列步驟-
步驟l:磁性納米粒子的制備及表面改性
磁性納米粒子為粒徑小于30nm的鐵鋅氧體、四氧化三鐵、鈷鐵氧體、，三 氧化二鐵中的一種，可采用共沉淀法、氧化還原法、高溫裂解法中的任何一種制 備。
由于磁性納米粒子表面親水，為了增強其與非極性高分子單體的相容性與反 應(yīng)性，選用帶有雙鍵的硅垸偶聯(lián)劑對粒子進行表面改性，可以是Y-(甲基丙烯 酰氧)丙基三甲氧基硅烷，乙烯基三乙氧基硅烷，乙烯基三甲氧基硅烷中的一種。 改性時首先將硅垸偶聯(lián)劑、磁性納米粒子、去離子水、無水乙醇配成混合液，其 中無水乙醇占混合液總質(zhì)量的10-50%，磁性納米粒子占25-50%,硅烷偶聯(lián)劑 占1.25-15%，去離子水占20-60%，并用乙酸將混合液PH值調(diào)至5.5，在配有回 流冷凝管、機械攪拌器，通有氮氣的容器中加熱到7(TC恒溫反應(yīng)l-5小時后，然 后用去離子水洗滌多次，磁分離，最后經(jīng)減壓干燥即得硅烷偶聯(lián)劑修飾的磁性納米顆粒。
步驟2:制備羧基磁性復(fù)合微球
將硅烷偶聯(lián)劑修飾的磁性納米粒子與功能單體馬來酸酐或甲基丙烯酸，共聚 單體苯乙烯，交聯(lián)劑二乙烯基苯混合，然后加入到含有表面活性劑十二烷基硫酸 鈉的水相中。超聲乳化均勻后，加入引發(fā)劑過硫酸鉀或過氧化苯鉀酰中的一種或 混合物，所得混合相中各組分的質(zhì)量分數(shù)為共聚單體7-13%，硅烷偶聯(lián)劑修飾
的磁性納米粒子1-13%，功能單體0. 5-6%，交聯(lián)劑0. 1-1%，表面活性劑0. 3-4%， 引發(fā)劑0.05-0. 4%,去離子水75%-88%。接著將混合相在配有回流冷凝管、機械 攪拌器，通有氮氣的容器中，70-8(TC恒溫反應(yīng)10-20小時。最終得到表面羧基 化的磁性復(fù)合微球。
本發(fā)明方法制得的磁性復(fù)合微球應(yīng)用于目標蛋白的分離純化時作微球表面 偶聯(lián)配基處理
通過偶聯(lián)劑使磁性復(fù)合微球表面連接上特定的配基，利用這些配基與目 標蛋白質(zhì)的親和性，在磁場下實現(xiàn)對目標蛋白的分離純化。表面連接的配基可以 是(1)蛋白A、蛋白G、凝集素、或(2) Ni-NTA中的一種。
(1) 偶聯(lián)蛋白A、蛋白G或凝集素 用去離子水將羧基磁性微球洗滌三次并磁分離，取10-40mg磁性微球分散
于lml緩沖溶液中，接著向溶液中加入0.8mg-20mg偶聯(lián)劑EDC.HC1，震蕩均勻， 即得到表面羧基被活化的磁性微球。再將表面活化的lml磁性微球和lml含有 l-5mg蛋白A、蛋白G或凝集素的緩沖溶液混合，在25'C的搖床中反應(yīng)2-4小 時，經(jīng)磁性分離，用緩沖溶液洗滌2次。然后將微球分散于含乙醇胺或BSA的緩 沖溶液中，封閉活性位點，再用緩沖液洗滌微球兩次并重新分散，即得到表面偶 聯(lián)有蛋白A、蛋白G或凝集素的磁性微球。該磁性微球適用于體液、細胞、腹 水或組織等樣品中分離與純化相應(yīng)的蛋白質(zhì)。偶聯(lián)中所用的緩沖溶液為PBS
(PH=7.4)、磷酸鈉緩沖液(0.01-0.05mol/l, PH=7.0-9.0 )、硼酸鈉緩沖液
(0.01-0.05mol/l， PH=7.0-9.0)中的一種。
(2) 偶聯(lián)Ni-NTA
用去離子水將羧基磁性微球洗滌三次，磁分離后分散于MES(0.05 M; pH6.5) 緩沖液中，微球濃度lxl()S個/ml。向每毫升微球中加入0.1 mgNHS和1 mgEDC，
5在22°C下攪拌10 min，活化羧基。活化后的羧基微球磁分離后以lxl()S個/ml 重懸于HEPES中(0.1M, pH8.0)，然后向每毫升中加入5xl0^分子NTA，在22°C 下溫育18 h后，磁分離,羧基微球分散于Tris緩沖液(0.05 M; pH 8)，封閉多余的羧 基。然后用PBS(PH二7.4)緩沖液洗滌微球兩次，再將微球于NiCl2溶液(500uM) 中22。C溫育2h，最后以PBS洗滌三次后，重新分散保存于4。C，即得表面偶聯(lián) 有Ni-NTA配基的磁性微球。該磁性微球適用于純化帶組氨酸標簽的蛋白質(zhì)。
制備的磁性微球單分散性好，微球粒經(jīng)小表面積大連接配基的量大(是傳統(tǒng) 方法的2 10倍)，而且磁含量高、磁響應(yīng)性強，又因其具有順磁性，在外磁場作 用下，固液相的分離十分簡單，可省去離心、過濾等繁雜的操作，實現(xiàn)樣品的快 速、高效的分離純化。
具體實施例方式
實施例1:
采用共沉淀法制備Fe304納米磁性粒子，取16gFeCb和19gFeS04，7H20，溶 于50ml去離子水中，然后加入到250ml三口燒瓶中，在氮氣保護，300rpm下， 升溫至7(TC，接著加入NaOH調(diào)節(jié)PH值至8-9，持續(xù)反應(yīng)半小時，然后用去離 子水，無水乙醇分別洗滌三次，最后將Fe304納米磁性粒子分散于無水乙醇中， 配成固含量50wt。/Q的混合液。取40g混合液，加入4g乙烯基三乙氧基硅烷，20g 去離子水，并用乙酸將混合液PH值調(diào)至5.5，在配有回流冷凝管、機械攪拌器， 通有氮氣的三口燒瓶中加熱到7(TC恒溫反應(yīng)2小時后，然后用去離子水洗滌多 次，磁分離，最后經(jīng)減壓干燥即得平均粒徑10nm左右的經(jīng)修飾的Fe3O4納米粒 子。
稱取10g苯乙烯，0.2g二乙烯基苯，1.4g馬來酸肝和4g硅烷偶聯(lián)劑修飾的 Fe304納米粒子，混合后加入到含有l(wèi)g十二烷基硫酸鈉的水相中，超聲乳化均勻 后，加入O.lg引發(fā)劑過硫酸鉀，在配有回流冷凝管、機械攪拌器，通有氮氣的 三口燒瓶中，7(TC恒溫反應(yīng)20小時。最終得到表面羧基化的磁性復(fù)合微球。該 微球平均粒徑100納米左右，具有較強的磁響應(yīng)性。
用去離子水將羧基磁性微球洗滌三次并磁分離，取10mg磁性微球分散于 lmlPBS (PH=7.4)緩沖溶液中，接著向溶液中加入2mg偶聯(lián)劑EDCHC1，震蕩均勻。再將磁性微球和lml含有l(wèi)mg蛋白A的PBS (PH=7.4)緩沖溶液混合， 在25。C的搖床中反應(yīng)2小時，磁性分離去上清，用PBS (PH=7.4)緩沖溶液洗 滌2次。接著將微球分散于BSA中，封閉多余的羧基，然后用以PBS (PH=7.4) 緩沖液洗滌微球兩次并重新分散，即得到表面偶聯(lián)有蛋白A的磁性微球。該磁 性微球適用于血漿、腹水或克隆細胞培養(yǎng)上清等樣品中IgG的分離與純化。 實施例2:
操作方法和條件同實施例1，不同在于硅烷偶聯(lián)劑為Y -(甲基丙烯酰氧)丙 基三甲氧基硅垸。
實施例3:
操作方法和條件同實施例1，不同在于硅垸偶聯(lián)劑為乙烯基三甲氧基硅垸。
實施例4:
操作方法和條件同實施例1，不同在于緩沖溶液為磷酸鈉緩沖液 (0.01-0.05mol/l， PH=7.0-9.0) 實施實例5:
操作方法和條件同實施例1，不同在于緩沖溶液為硼酸鈉緩沖液 (0.01-0.05mol/l， PH=7.0-9.0)。 實施例6:
操作方法和條件同實施例1，不同在于偶聯(lián)的配基為蛋白G或凝集素。 實施例7:
制備表面偶聯(lián)Ni-NTA的磁性微球，其中羧基磁性復(fù)合微球的制備過程同實 施實例l。偶聯(lián)Ni-NTA的步驟為用去離子水將羧基磁性微球洗漆三次，磁分 離后分散于MES(0.05M;pH6.5)緩沖液中，微球濃度1><108個/1111。向每毫升微球 中加入O.lmgNHS禾卩l(xiāng)mgEDC,在22°C下攪拌10 min，活化羧基?；罨蟮?羧基微球磁分離后以lxl()S個/ml重懸于HEPES中(0.1M， pH 8.0)，然后向每毫升 中加入5x 1010個分子NTA (N-(5-amino-l-carboxypentyl)iminodiacetic acid)，在 22°C下溫育18 h后，磁分離，羧基微球分散于Tris緩沖液(0.05 M; pH 8),封閉多余 的羧基。然后用PBS(PH-7.4)緩沖液洗滌微球兩次，再將微球于NiCl2溶液(500 uM)中22°C溫育2h，最后以PBS洗滌三次后，重新分散保存于4。C，即得表面 偶聯(lián)有Ni-NTA配基的磁性微球。該磁性微球適用于純化帶組氨酸標簽的蛋白質(zhì)。實施例8:
用于蛋白質(zhì)的分離純化，將0.5mL兔血清用O.Olmol/L的磷酸鹽溶液稀釋為 5mL，加入100mg實施實例1中制得的表面偶聯(lián)有蛋白A的磁性微球，搖勻， 在室溫下反應(yīng)10分鐘后，將反應(yīng)液置于磁鐵上兩分鐘后，棄去上清液。用 0.01mol/LpH=7.4的磷酸鹽緩沖液洗滌磁性顆粒，至上清液在波長為280nrn處的 吸光光度值小于O.Ol。加入0.05mol/LpH-2.3的甘氨酸緩沖液作解離劑，將結(jié)合 在磁性顆粒上的兔IgG洗脫下來，在4。C下用0.02mol/L， pH=7.4的磷酸鹽緩沖 液透析處理，得到純化的兔免疫球蛋白(IgG)。用紫外分光光度計測定兔IgG 濃度，用SDS—PAGE電泳分析兔IgG的純度，純度大于98%。
權(quán)利要求
1、一種應(yīng)用于蛋白質(zhì)分離純化的納米磁性復(fù)合微球的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)將硅烷偶聯(lián)劑、磁性納米粒子、去離子水、無水乙醇配成混合液，其中無水乙醇占混合液總質(zhì)量的10-50％，磁性納米粒子占25-50％，硅烷偶聯(lián)劑占1.25-15％，去離子水占20-60％；用乙酸將混合液pH值調(diào)至5.5，在配有回流冷凝管、機械攪拌器，通有氮氣的容器中加熱到70℃恒溫反應(yīng)1-5小時后，然后用去離子水洗滌多次，磁分離，最后經(jīng)減壓干燥即得硅烷偶聯(lián)劑修飾的磁性納米顆粒；(2)將步驟1得到的硅烷偶聯(lián)劑修飾的磁性納米顆粒與功能單體、共聚單體，交聯(lián)劑混合后加入到含有表面活性劑的水相中，超聲乳化均勻后，加入引發(fā)劑，然后在配有回流冷凝管、機械攪拌器，通有氮氣的容器中，70-80℃恒溫反應(yīng)10-20小時，得到表面功能化的磁性復(fù)合微球。
2、 根據(jù)權(quán)利1所述的一種應(yīng)用于蛋白質(zhì)分離純化的納米磁性復(fù)合微球的制備方 法，其特征在于步驟1所述的硅烷偶聯(lián)劑為帶端位雙鍵的Y-(甲基丙烯酰氧) 丙基三甲氧基硅垸、乙烯基三乙氧基硅烷或乙烯基三甲氧基硅垸。
3、 根據(jù)權(quán)利所述的一種應(yīng)用于蛋白質(zhì)分離純化的納米磁性復(fù)合微球的制備方法， 其特征在于步驟(1)所述的磁性納米粒子為其鐵鋅氧體、鐵鈷氧體、四氧化三 鐵或，三氧化二鐵，其平均粒徑5-30nm，飽和磁化強度40-60emu/g。
4、 根據(jù)權(quán)利1所述的一種應(yīng)用于蛋白質(zhì)分離純化的納米磁性復(fù)合微球的制備方 法，其特征在于步驟(2)所述的功能單體為馬為來酸酐或甲基丙烯酸，共聚單 體為苯乙烯；交聯(lián)劑為二乙烯基苯；引發(fā)劑為過硫酸鉀或過氧化苯鉀酰或它們的 混合物；表面活性劑為十二烷基硫酸鈉。
5、 根據(jù)權(quán)利1所述的一種應(yīng)用于蛋白質(zhì)分離純化的納米磁性復(fù)合微球的制備方 法，其特征在于步驟(2)所述硅垸偶聯(lián)劑修飾的磁性納米粒子、功能單體、共 聚單體、交聯(lián)劑、表面活性劑、引發(fā)劑的各組分占混合物的質(zhì)量百分比為硅垸 偶聯(lián)劑修飾的磁性納米粒子1-13%，功能單體0.5-6%，共聚單體7-13%，交聯(lián)劑 0.1-1%，表面活性劑0.3-4%，引發(fā)劑0.05-0.4%，去離子水75%-88%。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于蛋白質(zhì)分離純化的納米磁性復(fù)合微球的制備方法，通過制備磁性納米粒子，然后采用硅烷偶聯(lián)劑對粒子表面進行修飾，再將修飾后的粒子和高分子單體、交聯(lián)劑、引發(fā)劑混合分散于含有表面活性劑水相中，進行乳液聚合即得到磁性復(fù)合微球。本發(fā)明制備的納米磁性復(fù)合微球粒徑在50-500納米之間，表面功能基團豐富，在介質(zhì)中具有良好的分散穩(wěn)定性，免疫配基偶聯(lián)效率高，磁響應(yīng)性強，適合應(yīng)用于生物樣品中蛋白質(zhì)的快速分離及純化。
文檔編號C08K9/06GK101519482SQ200810034070
公開日2009年9月2日 申請日期2008年2月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月29日
發(fā)明者王曉川, 盛蓉生, 枰 賀, 峰 高 申請人:卡南吉醫(yī)藥科技(上海)有限公司;桑迪亞醫(yī)藥技術(shù)(上海)有限責(zé)任公司;上海聯(lián)友制藥技術(shù)有限公司;嘉興桑迪亞聯(lián)友制藥有限公司