專利名稱：一種透明質(zhì)酸與瓊脂糖凝膠連接的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種透明質(zhì)酸與瓊脂糖凝膠Sepharose 4B連接的方法，屬于有機化學(xué)合成領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
透明質(zhì)酸廣泛存在于人和動物的結(jié)締組織中。各種測定方法的不斷涌現(xiàn)，使透明質(zhì)酸含 量測定達(dá)到精確的程度，清楚地反映出類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肝病、某些腫瘤和硬皮病患者樣品 內(nèi)透明質(zhì)酸均明顯增高，尤其透明質(zhì)酸測定在肝硬化診斷上優(yōu)于所有常規(guī)肝功試驗，肝硬化 患者血清中透明質(zhì)酸較正常人升高10-100倍。國內(nèi)有人報導(dǎo)在慢性肝病、肝硬化中，透明質(zhì) 酸增高幅度大于in型前膠原肽和板層素(LamPl),在慢性活動性肝炎組中透明質(zhì)酸增高大于III 型前膠原肽，在遷延性肝炎中則與對照組無差別。因此，透明質(zhì)酸測定是一項極有價值的肝 病診斷指標(biāo)。在人或動物體內(nèi)，存在多種可與透明質(zhì)酸特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，主要分布在基質(zhì)和細(xì)胞 膜上，統(tǒng)稱為透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白。透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白可以用來測定人體內(nèi)透明質(zhì)酸的含量，主要原理是其反應(yīng)體系是先將樣品和透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白(限量)結(jié)合，再加入1251標(biāo)記的透明 質(zhì)酸，競爭剩余透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白，再加入第一抗體，即抗透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白，最后加入相 應(yīng)第二抗體，以使復(fù)合物沉淀，測定沉淀放射性計數(shù)。透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白分布廣泛，利用其 與透明質(zhì)酸的結(jié)合特性，可以將其從大量蛋白中分離，再進(jìn)行凝膠電泳，即可得到純化的透 明質(zhì)酸結(jié)合蛋白；也可以利用透明質(zhì)酸-瓊脂糖凝膠進(jìn)行一次性反應(yīng)。后者所需要的透明質(zhì)酸 -瓊脂糖凝膠需要將透明質(zhì)酸連接到瓊脂糖凝膠上，反應(yīng)比較復(fù)雜， 一般的方法效果不佳。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種可以將透明質(zhì)酸與瓊脂糖凝膠Sepharose 4B連接的方法，步 驟簡單，成本較低。本發(fā)明的原理是透明質(zhì)酸分子上含有羧基，可以與己二酸二酰肼的酰肼基進(jìn)行反應(yīng)， 反應(yīng)后還可以保留一個酰肼基，這個酰肼基可以與活化后的瓊脂糖凝膠分子上的醛基反應(yīng)， 相當(dāng)于將透明質(zhì)酸通過己二酸二酰肼連接到瓊脂糖凝膠上。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)透明質(zhì)酸與己二酸二酰肼反應(yīng)，合成透明質(zhì)酸-己二酸二酰肼衍生物；使用高碘酸鈉對瓊脂糖凝膠Sepharose 4B進(jìn)行活化，得到含有醛基的瓊脂糖凝膠；將透明質(zhì)酸-己二酸二酰肼衍生物與含有醛基的瓊脂糖凝膠Sepharose 4B進(jìn)行反應(yīng)， 最后用硼氫化鈉還原，得到透明質(zhì)酸與瓊脂糖凝膠Sepharose 4B連接物。其具體步驟為1、 透明質(zhì)酸-己二酸二酰肼衍生物的制備將透明質(zhì)酸溶于雙蒸水中，加入10倍透明質(zhì) 酸質(zhì)量的己二酸二酰肼，攪拌，用0.1M的HCl調(diào)節(jié)pH值4.0-5.5，加入5倍透明質(zhì)酸質(zhì)量的 L(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，用0.1M的HCl調(diào)節(jié)pH值，使之維持在 4.0-5.5，反應(yīng)2小時后，用1M的NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0。將反應(yīng)后產(chǎn)物用雙蒸水透析，透 析4次，每次1升雙蒸水透析18小時，透析后冷凍干燥。2、 含有醛基的瓊脂糖凝膠Sepharose 4B的制備將瓊脂糖凝膠Sepharose 4B用蒸餾水洗 凈，加入1/5瓊脂糖凝膠Sepharose 4B體積的新配制的0.2M的NaI04，室溫攪拌反應(yīng)5小時， 反應(yīng)后的凝膠用蒸餾水洗凈。3、 透明質(zhì)酸與瓊脂糖凝膠Sepharose 4B連接物的制備將冷凍干燥后的透明質(zhì)酸-己二酸 二酰肼衍生物加入雙蒸水中溶解，溶解后倒入5倍體積的含有醛基的瓊脂糖凝膠Sepharose 4B 中，室溫攪拌12-16個小時，按1毫克/毫升瓊脂糖凝膠Sepharose 4B體積慢慢加入硼氫化鈉 粉末，繼續(xù)攪拌2小時后，用雙蒸水洗凈。本方法所獲得的產(chǎn)物與瓊脂糖凝膠Sepharose 4B外觀一致，為有彈性的半透明凝膠微球， 可以用于提取透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白。本發(fā)明的有益效果是反應(yīng)條件溫和，步驟簡單，成本低廉。
具體實施方式
結(jié)合具體實施例說明本發(fā)明。實施例一1、 透明質(zhì)酸-己二酸二酰肼衍生物的制備稱取100毫克透明質(zhì)酸，溶于50毫升雙蒸水 中，加入l克己二酸二酰肼，攪拌，用0.1M的HCl調(diào)節(jié)pH值5.0，加入0.5克EDC，用0.1M 的HCl調(diào)節(jié)pH值，使之維持在5。反應(yīng)2小時后，用1M的NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0。將反 應(yīng)后產(chǎn)物用雙蒸水透析，透析4次，每次1升雙蒸水透析18小時，透析后冷凍干燥。2、 含有醛基的瓊脂糖凝膠Sepharose 4B的制備量取50毫升瓊脂糖凝膠Sepharose 4B， 用蒸餾水洗凈，加入10毫升新配制的0.2M的Na104，室溫攪拌反應(yīng)5小時，反應(yīng)后的凝膠 用蒸餾水洗凈。3、 透明質(zhì)酸與瓊脂糖凝膠Sepharose 4B連接衍生物的制備稱取20毫克冷凍干燥后的透 明質(zhì)酸-己二酸二酰肼衍生物，加入10毫升雙蒸水中，溶解后倒入含有醛基的瓊脂糖凝膠 Sepharose 4B 50毫升中，室溫攪拌12小時，慢慢加入50毫克硼氫化鈉粉末，繼續(xù)攪拌2小。 實施例二1、 透明質(zhì)酸-己二酸二酰肼衍生物的制備稱取lg透明質(zhì)酸，溶于500毫升雙蒸水中， 加入10克己二酸二酰肼，攪拌，用0.1M的HCl調(diào)節(jié)pH值5.0，加入5克EDC，用0.1M的 HCl調(diào)節(jié)pH值，使之維持在5。反應(yīng)2小時后，用1M的NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0。將反應(yīng)后 產(chǎn)物用雙蒸水透析，透析4次，每次1升雙蒸水透析18小時，透析后冷凍干燥。2、 含有醛基的瓊脂糖凝膠Sepharose 4B的制備量取500毫升瓊脂糖凝膠Sepharose 4B， 用蒸餾水洗凈，加入100毫升新配制的0，2M的Na104，室溫攪拌反應(yīng)5小時，反應(yīng)后的凝膠 用蒸餾水洗凈。3、 透明質(zhì)酸與瓊脂糖凝膠Sepharose 4B連接物的制備稱取200毫克冷凍干燥后的透明 質(zhì)酸-己二酸二酰肼衍生物，加入100毫升雙蒸水中，溶解后倒入含有醛基的瓊脂糖凝膠 Sepharose 4B 500毫升中，室溫攪拌16小時，慢慢加入500亳克硼氫化鈉粉末，繼續(xù)攪拌2 小時后，用雙蒸水洗凈。
權(quán)利要求
1、一種透明質(zhì)酸與瓊脂糖凝膠Sepharose 4B連接的方法，其特征在于包含以下步驟A透明質(zhì)酸與己二酸二酰肼合成透明質(zhì)酸-己二酸二酰肼衍生物；B用高碘酸鈉對瓊脂糖凝膠Sepharose 4B進(jìn)行活化，得到含有醛基的瓊脂糖凝膠Sepharose 4B；C將透明質(zhì)酸-己二酸二酰肼與含有醛基的瓊脂糖凝膠Sepharose 4B進(jìn)行反應(yīng)，用硼氫化鈉還原，得到透明質(zhì)酸與瓊脂糖凝膠Sepharose 4B連接物。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于透明質(zhì)酸-己二酸二酰肼衍生物的制備過稱是 將透明質(zhì)酸溶于雙蒸水中，加入10倍透明質(zhì)酸質(zhì)量的己二酸二酰肼，攪拌，用0.1M的 HC1調(diào)節(jié)pH值4.0-5.5，加入5倍透明質(zhì)酸質(zhì)量的l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽 酸鹽，用0.1M的HCl調(diào)節(jié)pH值，使之維持在4.0-5.5，反應(yīng)2小時，用lM的NaOH調(diào) 節(jié)pH值至7.0，將反應(yīng)后產(chǎn)物用雙蒸水透析，透析后冷凍干燥。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是含有醛基的瓊脂糖凝膠Sepharose 4B的制備過稱 是將瓊脂糖凝膠Sepharose 4B用蒸餾水洗凈，加入1/5瓊脂糖凝膠Sepharose 4B體積的 新配制的0.2M的Na104，室溫攪拌反應(yīng)5小時，反應(yīng)后的凝膠用蒸餾水洗凈。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是透明質(zhì)酸與瓊脂糖凝膠Sepharose 4B連接物的制 備將冷凍千燥后的透明質(zhì)酸-己二酸二酰肼衍生物加入雙蒸水中溶解，溶解后倒入5倍 體積的含有醛基的瓊脂糖凝膠Sepharose 4B中，室溫攪拌12-16個小時，按1毫克/毫升瓊 脂糖凝膠Sepharose 4B體積慢慢加入硼氫化鈉粉末，繼續(xù)攪拌2小時后，用雙蒸水洗凈。
5、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于雙蒸水透析過程為透析4次，每次l升雙蒸水透 析18小時。
全文摘要
本發(fā)明屬于有機化學(xué)合成領(lǐng)域，涉及一種透明質(zhì)酸與瓊脂糖凝膠連接的方法，其步驟為透明質(zhì)酸與己二酸二酰肼合成透明質(zhì)酸-己二酸二酰肼衍生物，用高碘酸鈉對瓊脂糖凝膠Sepharose 4B進(jìn)行活化，得到含有醛基的瓊脂糖凝膠，將透明質(zhì)酸-己二酸二酰肼與含有醛基的瓊脂糖凝膠Sepharose 4B用硼氫化鈉還原，得到透明質(zhì)酸與瓊脂糖凝膠Sepharose 4B連接物。本發(fā)明反應(yīng)條件溫和，步驟簡單，成本低廉。
文檔編號C08G81/00GK101591441SQ20091006791
公開日2009年12月2日 申請日期2009年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月23日
發(fā)明者董全文 申請人:協(xié)和生物制藥(天津)有限公司