專利名稱：發(fā)光聚合物的納米顆粒以及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及發(fā)光聚合物的納米顆粒及其制備方法。更具體地說，本發(fā)明涉及發(fā)光 聚合物的納米顆粒，其具有適合用作生物分子標(biāo)記、或用于細(xì)胞或體內(nèi)應(yīng)用的粒徑、發(fā)光性 能以及水相中的分散體，所以可以用作光學(xué)成像造影劑，并涉及該納米顆粒的制備方法。
背景技術(shù)：
在生命科學(xué)中，基于熒光的技術(shù)已廣泛用于定義各種基本的生命現(xiàn)象，從分子生 物學(xué)到疾病診斷。尤其是，基于熒光的技術(shù)使用各種實(shí)驗(yàn)參數(shù)，其包括激發(fā)光波長(zhǎng)、熒光波 長(zhǎng)、熒光壽命或熒光各向異性、以及熒光強(qiáng)度，從而使得可以多路傳輸來自多個(gè)靶的信號(hào)， 并提供納米級(jí)的分辨率以及單分子水平的靈敏度。熒光相關(guān)的光物理現(xiàn)象對(duì)周圍環(huán)境的變化是敏感的，并且存在各種分子可控現(xiàn)象 如熒光的消光或增加、能量轉(zhuǎn)移的產(chǎn)生等，其來自同質(zhì)或異質(zhì)材料之間的相互作用。這樣的 性能已用來開發(fā)智能型造影劑，用于研究生物分子之間的相互作用、以及疾病的早期診斷。已用作免疫標(biāo)記、或用于細(xì)胞或活體的造影劑的熒光材料包括有機(jī)熒光分子[D 1 =Kim et al. ,Prog. Polym. Sci. 32 1031-1053 (2007)]、熒光蛋白[D2 =Zhang et al. ,Nat. Rev. Mol. Cell. Bio. 3 :906_918 (2002)]、以及無機(jī)量子點(diǎn)[D3 =Seydack et al.，Biosens. Bioelectron. 20 :2454_2469(2005)，D4 :Gao et al.，Nat. Biotechnol. 22 :969_976(2004)， 以及 D5 =Michalet et al.，Science 307:538-544(2005)]。基于熒光的分子檢測(cè)和成像的性能取決于熒光標(biāo)記材料或造影劑的光學(xué)特性，尤 其是熒光強(qiáng)度和光學(xué)穩(wěn)定性。限定信號(hào)檢測(cè)的靈敏度限度的熒光強(qiáng)度是由熒光材料的熒光 效率和吸收系數(shù)的乘積來確定。尤其是，激發(fā)光的吸收系數(shù)應(yīng)較高，以將熒光材料施用于細(xì) 胞或活體，其中由于光的散射或吸收和自身熒光干擾嚴(yán)重使得激發(fā)光的密度較低。有機(jī)熒光分子或包含有機(jī)熒光分子的納米顆粒的激發(fā)光的吸收系數(shù)取決于分子 的化學(xué)結(jié)構(gòu)。有機(jī)熒光分子如熒光素、若丹明、花青(菁藍(lán))等，如在[D6 Aesch-Genger et al. , Nat. Method 5:763-775(2008)]中所描述的，具有 2· 5 X IO4 至 2· 5 X IO5IT1Cnr1 的 摩爾吸收系數(shù)(ε )，其對(duì)于臨床應(yīng)用是不夠的。此外，有機(jī)熒光分子如香豆素、若丹明等 在激發(fā)光的連續(xù)照射下具有相當(dāng)?shù)偷墓鈱W(xué)穩(wěn)定性，如在Eggeling et al.，Anal. Chem. 70 2651-2659(1998) (D7)中所描述的。與此同時(shí)，如在D4、5、以及6中描述的，無機(jī)量子點(diǎn)如CdS、CdSe、CdTe、InP、PbS 等具有5X IO5至5X IO6M-1CnT1的摩爾吸收系數(shù)(ε )，其是有機(jī)熒光分子的摩爾吸收系數(shù)的 值的二十倍，并且是光學(xué)上穩(wěn)定的。然而，如在Derfus et al. ,Nano Lett. 4 :11_18 (2004) (D8)中所描述的，應(yīng)用于細(xì)胞或體內(nèi)應(yīng)用有其局限性，這是起因于由重金屬成分引起的潛 在毒性問題。此外，ACS Nano 2 =2415-2423(2008) (D9)披露了 π -共軛聚合物，其在納米顆粒 狀態(tài)(直徑約15nm)具有IXlO9M-1CnT1或更高的吸收系數(shù)(O，并在連續(xù)激發(fā)光照射下 和有機(jī)熒光染料相比具有IO3倍或更高的改善的光學(xué)穩(wěn)定性。然而，π-共軛聚合物如聚[2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)_1，4-亞苯基亞乙烯基](MEH-PPV)、聚[2，5_ 二(3，7_ 二 甲基辛基)亞苯基-1，4-亞乙炔基](PPE)、聚[{9，9_ 二辛基-2，7-二亞乙烯基-亞芴 基}-{2_甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-1，4_亞苯基}]交替共聚物(PFPV)、聚[(9，9-二辛 基芴基-2，7-二基)-(1，4_苯并{2，1'，3}-噻二唑)]共聚物(PFBT)等，在溶液中呈現(xiàn)更 高熒光效率(Φ)，而在固相(如納米顆粒、薄膜等)中熒光效率則通常顯著降低。Jtl^hGREENHAM et al. , Nature 365 :628_630 (1993) (DlO)和 GREENHAM et al.， Chem. Phys. Lett. 241 =89-96(1995) (Dll)披露了氰基取代的聚(亞苯基亞乙烯基)類。這 些材料是在它們的結(jié)構(gòu)中具有氰基亞乙烯基基團(tuán)的η -共軛聚合物，已報(bào)道其在固體薄膜 中呈現(xiàn)0. 35或更高的熒光效率(Φ)。然而，DlO和Dll僅將具有氰基亞乙烯基基團(tuán)的π-共 軛聚合物用來制備用于電子設(shè)備的薄膜，而沒有提示將該聚合物用作注入細(xì)胞或活體中的 生物分子標(biāo)記、或光學(xué)圖像造影劑。

發(fā)明內(nèi)容
因此，為了解決上述問題，已設(shè)想了本文描述的各種特點(diǎn)。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供發(fā)光聚合物的納米顆粒，其可以用作用于細(xì)胞或活體的 基于純有機(jī)物質(zhì)的發(fā)光造影劑，其具有適合用作生物分子標(biāo)記、或應(yīng)用于細(xì)胞或活體的粒 徑、發(fā)光性能以及水相中的分散體，并與目前用于體內(nèi)熒光檢測(cè)和成像的現(xiàn)有技術(shù)的有機(jī) 熒光分子或無機(jī)量子點(diǎn)相比呈現(xiàn)顯著改善的熒光強(qiáng)度，同時(shí)并不包含任何對(duì)活體有毒的化 學(xué)元素，如重金屬或鹵素等，本發(fā)明還提供了其制備方法?？梢酝ㄟ^提供發(fā)光聚合物的納米顆粒及其制備方法來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，其 中上述納米顆粒具有用生物相容性表面活性劑加以穩(wěn)定的表面，并具有適合于用作生物分 子標(biāo)記或應(yīng)用于細(xì)胞或活體的粒徑、發(fā)光性能以及水相中的分散體。因此，本發(fā)明提供了發(fā)光聚合物的納米顆粒，其包含由以下化學(xué)式1表示的氰基 取代的聚(芳撐亞乙烯基)聚合物(或聚(亞芳基亞乙烯基)聚合物)的納米顆粒；以及 生物相容性表面活性劑，其吸附于化學(xué)式1的聚合物的納米顆粒的表面以穩(wěn)定納米顆粒的 表面。化學(xué)式1 其中η是 ο至10，000的整數(shù)；且Ar1和Ar2是芳基基團(tuán)，獨(dú)立地選自由苯基、聯(lián)苯 基、三聯(lián)苯基、萘基、蒽基、芴基、二苯基芴基、咔唑基、苯硫基、呋喃基或嘌呤基、吡咯基、喹 啉基、喹喔啉基、噁二唑、二苯基噁二唑、吲哚基(氮茚基)以及吲唑基組成的組，其是未取 代的或由直鏈的或支鏈的C1,烷基、烷氧基或硫代烷氧基基團(tuán)取代。本發(fā)明還提供了制備發(fā)光聚合物的納米顆粒的方法，包括(1)均勻混合由通式 OHC-Ar1-CHCKAri是芳基，選自由苯基、芴基和噻吩基組成的組，其是未取代的或由直鏈的或 支鏈的C1,烷基、烷氧基或硫代烷氧基基團(tuán)取代)表示的單體、由通式NC-Ar2-CMAr2是芳 基，選自由苯基、芴基和噻吩基組成的組，其是未取代的或由直鏈的或支鏈的C1,烷基、烷氧基或硫代烷氧基基團(tuán)取代)表示的單體、以及液體表面活性劑；(2)將水加入至所得的混 合物中以制備含水膠束分體散；以及(3)將聚合催化劑加入至所得的含水膠束分體散，接 著在室溫和大氣壓下進(jìn)行膠體聚合。根據(jù)以下本發(fā)明的詳細(xì)描述并參照附圖，本發(fā)明的上述和其它目的、特點(diǎn)、方面以 及優(yōu)點(diǎn)將變得更加顯而易見。


圖1是生物相容性共軛聚合物的納米顆粒的制備方法的示意圖，其中通過根據(jù)本 發(fā)明的膠體聚合方法；圖2a和2b示出根據(jù)本發(fā)明的發(fā)光聚合物(1) CN-PFPV、⑵CN-PBPV、(3) CN-PPV和 (4)CN-D0PPV的納米顆粒的吸收光譜(圖2a)和熒光光譜(圖2b)，以及圖2c是在上述四 種類型的納米顆粒的水相中的分散體的每一種被皮下注入小鼠以后在365nm紫外線燈下 在實(shí)驗(yàn)小鼠的體外用肉眼觀察的熒光彩色照片；圖3是在根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例1中制備的發(fā)光聚合物(CN-D0PPV)的納米顆粒的 透射電子顯微鏡照片；圖4示出在根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例1中制備的發(fā)光聚合物(CN-D0PPV)的納米顆粒 的水相中的分散體的粒徑分布，借助于動(dòng)態(tài)光散射法加以確定；圖5a和5b是活癌細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)(其中內(nèi)在化了在根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例1中 制備的發(fā)光聚合物CN-D0PPV(圖5a)和CN_PPV(圖5b)的納米顆粒)的光學(xué)照片圖像，其 中“DIC”是明場(chǎng)圖像作為差示干涉反差圖像，“FL”是熒光圖像，以及“重疊”是通過重疊DIC 和FL所獲得的圖像。圖6是當(dāng)在根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例1中制備的發(fā)光聚合物(CN-D0PPV)的納米顆粒 被注入時(shí)哨兵淋巴結(jié)作圖(mapping)行為的體內(nèi)近紅外熒光照片圖像；以及圖7a和7b是在根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例1中制備的發(fā)光聚合物(CN-D0PPV)的納米 顆粒被注入以后，在365nm紫外線燈下在體外(圖7a)和在手術(shù)期間(圖7b)用肉眼觀察 到的哨兵淋巴結(jié)的熒光彩色照片。
具體實(shí)施例方式為了將發(fā)光聚合物的納米顆粒用作生物分子標(biāo)記、或用于細(xì)胞中或體內(nèi)成像的發(fā) 光造影劑，發(fā)射自納米顆粒的光強(qiáng)度應(yīng)滿足臨床應(yīng)用的水平，即現(xiàn)有技術(shù)的熒光造影劑水 平的102或103倍，為此，發(fā)光聚合物的納米顆粒對(duì)于激發(fā)光的摩爾吸收系數(shù)(e )應(yīng)至少為 lXKfM—icnT1，熒光效率(①)應(yīng)至少為0.2，并且可以形成穩(wěn)定的水相中的分散體。本發(fā)明 提供了滿足所有上述要求的發(fā)光聚合物的納米顆粒。因此，本發(fā)明涉及發(fā)光聚合物的納米顆粒，其包含由以下化學(xué)式1表示的氰基取 代的聚(芳撐亞乙烯基)類聚合物的納米顆粒；以及生物相容性表面活性劑，其吸附于化學(xué) 式1的聚合物的納米顆粒表面?；瘜W(xué)式1 其中n是10至10，000的整數(shù)；且Ar:和Ar2是芳基基團(tuán)，該芳基基團(tuán)獨(dú)立地選 自由苯基、聯(lián)苯基、三聯(lián)苯基、萘基、蒽基、芴基、二苯基芴基、咔唑基、苯硫基、呋喃基或嘌呤 基、吡咯基、喹啉基、喹喔啉基、噁二唑基、二苯基噁二唑基、吲哚基以及吲唑基組成的組，這 些基團(tuán)是未取代的或由直鏈的或支鏈的烷基、烷氧基或硫代烷氧基基團(tuán)取代。在本發(fā)明中，化學(xué)式1的氰基取代的聚(芳撐亞乙烯基)聚合物與生物相容性表 面活性劑之間的比率按重量計(jì)為1 7至1 12。根據(jù)本發(fā)明的發(fā)光聚合物的納米顆粒具有5nm至500nm的直徑，其適合于摻入細(xì) 胞和體內(nèi)循環(huán)。根據(jù)本發(fā)明的發(fā)光聚合物的納米顆粒具有300nm至800nm的吸收波長(zhǎng)，其適合于 傳送到活體的組織。在激發(fā)光照射以后，發(fā)射自發(fā)光聚合物的納米顆粒的光的波長(zhǎng)為400nm至900nm， 其屬于可見光和近紅外區(qū)域。當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的納米顆粒應(yīng)用于體內(nèi)熒光成像時(shí)，發(fā)射光的波長(zhǎng)優(yōu)選為600nm至 900nm。如果發(fā)射光的波長(zhǎng)短于600nm，它會(huì)與發(fā)射自熒光材料(其固有地存在于活體內(nèi)) 的熒光(自身熒光)的波長(zhǎng)重疊，其導(dǎo)致難以進(jìn)行高靈敏度的檢測(cè)。與此同時(shí)，如果發(fā)射光 的波長(zhǎng)長(zhǎng)于900nm，則難以獲得高發(fā)光效率，尤其是，它是不利的，因?yàn)橛审w內(nèi)存在的過量水 的吸收所引起的干擾會(huì)增加。生物相容性表面活性劑優(yōu)選為液體表面活性劑。該表面活性劑在活體內(nèi)環(huán)境中 為發(fā)光聚合物的納米顆粒提供分散穩(wěn)定性和生物相容性。合適的表面活性劑的實(shí)例包括 但不限于Tween類表面活性劑(例如，Tween 20、Tween 60、Tween 80等可獲 自 Crodalnternational PLC)、Triton 類(例如，Triton X-100 等，可獲自 DowChemical Company)、Span ^ ( M
如，Span 20、Span 60、Span 80 等，可獲自 Croda
International PLC) 0下文詳細(xì)描述根據(jù)本發(fā)明的發(fā)光聚合物的納米顆粒的制備方法。根據(jù)本發(fā)明的發(fā)光聚合物的納米顆粒的制備方法采用了膠體聚合，其中在通過生 物相容性表面活性劑形成的水相中的分散體均勻膠束中聚合單體，同時(shí)形成聚合物的納米 顆粒，從而制備發(fā)光聚合物的所期望的納米顆粒，其具有5nm至500nm的直徑，并借助于生 物相容性表面活性劑以生態(tài)和生物友好方式(沒有使用對(duì)人體有害的有機(jī)溶劑)使表面穩(wěn) 定化。圖1說明根據(jù)本發(fā)明的發(fā)光聚合物的納米顆粒的制備過程。在步驟(1)中，均勻混合由通式OHC-ArrCHO表示的二醛單體、由通式NC_Ar2_CN 表示的二氰化物單體和液體表面活性劑。所用的二醛單體和二氰化物單體的摩爾比率為 1 1，并且按單體總重量計(jì)液體表面活性劑的用量為20至100倍。在步驟(1)中，因?yàn)橐后w表面活性劑可以均勻地溶解用作單體的疏水性聚合單 體，g卩，二醛單體和二氰化物單體，所以在本發(fā)明制備發(fā)光聚合物的納米顆粒過程中沒有必 要使用任何溶劑。
7
在步驟(2)中，將水，優(yōu)選去離子水，加入至在步驟(1)所得的混合物，以形成含水 膠束分散體。優(yōu)選使用去離子水，因?yàn)榭梢栽谛纬杉{米顆粒時(shí)將離子和雜質(zhì)的影響降低到
最小程度。在步驟(3)中，添加聚合催化劑，并在室溫和大氣壓下進(jìn)行膠體聚合，以形成發(fā)光 聚合物的納米顆粒，其具有吸附有生物相容性表面活性劑的表面。聚合催化劑可以包括四 烷基氫氧化銨，例如，四丁基氫氧化銨(TBAH)、四甲基氫氧化銨、四乙基氫氧化銨等。本發(fā)明的發(fā)光聚合物的納米顆粒的制備方法可以進(jìn)一步包括將在步驟(3)所得 的發(fā)光聚合物的納米顆粒進(jìn)行滲析，用于除去過量的表面活性劑、催化劑和未反應(yīng)單體，以 收集發(fā)光聚合物的納米顆粒，該納米顆粒具有用吸附于其上的生物相容性表面活性劑加以 穩(wěn)定的表面。在本發(fā)明中，化學(xué)式1的發(fā)光聚合物的是變化的，借此可以調(diào)節(jié)發(fā)射自 發(fā)光聚合物的光的光吸收和波長(zhǎng)范圍，以對(duì)應(yīng)于可見光和近紅外區(qū)域。圖2a和2b表明，本發(fā)明改變了單體的芳族結(jié)構(gòu)，從而制備發(fā)光聚合物的納米顆 粒，其具有350nm至600nm的吸收波長(zhǎng)(參見圖2a)和450nm至800nm的熒光波長(zhǎng)(參見 圖2b)，同時(shí)具有5nm至300nm的窄粒徑分布(通過動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)得)。在圖2a和2b中， 曲線(1)至(4)指示出了本發(fā)明的發(fā)光聚合物納米顆粒，其中Ar2都是苯基，而Ari選自由 以下化學(xué)式2表示的基團(tuán)中的一種化學(xué)式2 圖3是根據(jù)本發(fā)明的發(fā)光聚合物的納米顆粒的透射電鏡照片。
如圖2和3所示，在本發(fā)明中，可以制備這樣的發(fā)光聚合物的納米顆粒，其具有各 種熒光波長(zhǎng)同時(shí)具有恒定的粒徑大小，這是本發(fā)明區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)的無機(jī)量子點(diǎn)的特點(diǎn)， 其中無機(jī)量子點(diǎn)的吸收和熒光波長(zhǎng)取決于它們的粒徑大小。 圖5至7表明根據(jù)本發(fā)明的發(fā)光聚合物的納米顆粒可用作圖像造影劑，這通過對(duì) 細(xì)胞和小動(dòng)物進(jìn)行的光學(xué)成像實(shí)驗(yàn)得到證實(shí)。如圖5至7所示，根據(jù)本發(fā)明的發(fā)光聚合物 的納米顆粒具有與現(xiàn)有技術(shù)的熒光造影劑相比顯著更高的熒光強(qiáng)度，和適用于細(xì)胞成像和 哨兵淋巴結(jié)作圖(mapping)的粒徑。尤其是，與用于檢測(cè)哨兵淋巴結(jié)的現(xiàn)有技術(shù)的同位素 示蹤物和藍(lán)色染料相比，根據(jù)本發(fā)明的發(fā)光聚合物的納米顆粒可以快速到達(dá)淋巴結(jié)并停留在那里足夠長(zhǎng)的時(shí)間。因此，如果根據(jù)本發(fā)明的發(fā)光聚合物的納米顆粒和簡(jiǎn)單的熒光檢測(cè) 器(如在 JP 2001-299676A,JP 2004-269439A 和 US 7，181，266B2 中所提出的)一起使用， 則即使是非技術(shù)人員也可以快速、準(zhǔn)確并容易地檢測(cè)哨兵淋巴結(jié)，所以根據(jù)本發(fā)明的發(fā)光 聚合物的納米顆?？梢詫?shí)際用于癌癥手術(shù)、哨兵淋巴結(jié)活檢(SLNB)。此外，不同于常規(guī)的淋 巴系閃爍造影術(shù)，根據(jù)本發(fā)明的發(fā)光聚合物的納米顆粒并不包括輻射，處理簡(jiǎn)單，且并不需 要對(duì)于哨兵淋巴結(jié)活檢的大型設(shè)施，其使得即使在小醫(yī)院也可以借助于哨兵淋巴結(jié)活檢將 發(fā)光聚合物的納米顆粒用于腫瘤切除手術(shù)。實(shí)施例現(xiàn)將詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，其僅是說明性的，而不是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。實(shí)施例1 發(fā)光聚合物納米顆粒的制備(1)氰基取代的聚[{2-二辛氧基-1，4_ 二亞乙烯基-亞苯基}-{1，4_亞苯基}] 交替共聚物(CN-D0PPV)納米顆粒的制備按照?qǐng)D1所示的方法制備化學(xué)式1的聚合物(CN-D0PPV)的納米顆粒，其中Ari是 被兩個(gè)辛氧基基團(tuán)取代的苯基，而Ar2是苯基，其表面借助于表面活性劑加以穩(wěn)定。它的詳 細(xì)制備過程如下將25. 8mg的2，5_ 二(辛氧基)對(duì)苯二甲醛(Adrich)和10. 3mg對(duì)苯二甲基二腈 (TCI)加入lg的Tween 80(購買自Sigma Co.)，用熱空氣加熱所得的混合物以均勻溶 解，然后使其冷卻至室溫。將5mL去離子水(Milli-Q，18. 2MQcm)加入至0. 3g所得的溶液 中以形成透明的膠束分散體的水溶液。將0.2mL的1.0M的四丁基氫氧化銨(TBAH)的甲醇 (Aldrich)溶液加入至膠束分散體的水溶液，然后在室溫和大氣壓下進(jìn)行膠體聚合。在12 小時(shí)以后，通過用去離子水的滲析(纖維素酯，MW i= 300kDa)純化反應(yīng)溶液兩天，以獲得 6. 7g的cn-doppv納米顆粒的水分散體(在水相中的分散體)，其表面用Tween 80加以 穩(wěn)定。為了確定CN-D0PPV納米顆粒的水分散體的組成，分別測(cè)量在冷凍干燥3mL反應(yīng)溶 液以后獲得的CN-D0PPV納米顆粒水分散體的總重量和在通過用乙醇洗滌而除去表面活性 劑Tween 以后純cn-doppv納米顆粒的重量。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)，無表面活性劑的情況下，可以 用過量Tween 80 (40. 4mg)穩(wěn)定4. lmg(聚合產(chǎn)率89% )純CN-D0PPV納米顆粒。(2)氰基取代的聚[{9，9-二辛基-2，7-二苯基-二芴-4'，4〃 -二基}_{1，4_二 亞乙烯基-亞苯基}]交替共聚物(CN-PFPV)、氰基取代的聚[{4，4' -二亞乙烯基-二亞 苯基}-{1，4_亞苯基}]交替共聚物(CN-PBPV)以及氰基取代的聚(1，4_亞苯基亞乙烯基) (CN-PPV)的納米顆粒的制備以與實(shí)施例1的(1)中描述的相同方式，分別使用4，4 ‘ _(9，9_ 二辛 基-911-芴-2，7-二基)二苯甲醛和對(duì)苯二甲基二腈、4，4'-聯(lián)苯基二甲醛和對(duì)苯二甲基 二腈、以及對(duì)苯二甲醛和對(duì)苯二甲基二腈作為單體，制備了 CN-PFPV、CN-PBPV以及CN-PPV 納米顆粒。實(shí)施例2 發(fā)光聚合物納米顆粒的特性的評(píng)價(jià)(1)發(fā)光聚合物納米顆粒的顆粒特征的評(píng)價(jià)用透射電子顯微鏡(CM30，F(xiàn)EI/Philips,200kV)觀測(cè)在實(shí)施例1的(1)中制備的 CN-D0PPV納米顆粒(其表面用表面活性劑加以穩(wěn)定)的形狀和大小，結(jié)果示在圖3中。此外，通過動(dòng)態(tài)光散射法(BI-9000AT數(shù)字自相關(guān)儀，Brookhaven)確定了在水相中的分散體 的顆粒大小分布，結(jié)果示在圖4中。CN-D0PPV納米顆粒由球形顆粒構(gòu)成，其平均粒徑為約 34nm，如圖3所示，而它們?cè)谒嘀械姆稚Ⅲw的平均粒徑為59士5nm，如圖4所示。(2)發(fā)光聚合物納米顆粒的光學(xué)特性的評(píng)價(jià)用去離子水將實(shí)施例1的(1)中制備的CN-D0PPV納米顆粒的水相中的分散體 稀釋20倍，然后借助于UV-vis.光譜儀(Agilent 8453)和熒光分光光度計(jì)(Hitachi F-7000)確定吸收和熒光光譜，其結(jié)果示在圖2a和2b中。在圖2a和2b中標(biāo)明為(4)的曲 線是CN-D0PPV納米顆粒的水相中的分散體的光學(xué)特性的結(jié)果?；谌舻っ鰾的乙醇溶液 計(jì)算的CN-D0PPV納米顆粒的相對(duì)熒光效率為0. 25。因此，發(fā)現(xiàn)，在本發(fā)明的實(shí)施例1中制 備的發(fā)光聚合物的納米顆粒具有熒光效率，其適合用作生物分子標(biāo)記、或用于細(xì)胞內(nèi)成像 和體內(nèi)成像的發(fā)光造影劑。以與針對(duì)CN-D0PPV納米顆粒相同的方式評(píng)價(jià)CN-PFPV、CN_PBPV以及CN-PPV納米 顆粒的光學(xué)特性，結(jié)果也提供在圖2a和2b中。在圖2a和2b中，曲線(1)、⑵以及(3)分 別對(duì)應(yīng)于 CN-PFPV、CN-PBPV 以及 CN-PPV。實(shí)施例3 發(fā)光聚合物納米顆粒的體內(nèi)熒光的觀測(cè)將在實(shí)施例1中制備的CN-DOPPV、CN-PFPV、CN_PBPV以及CN-PPV納米顆粒的水相 中的分散體各50 yL皮下注入實(shí)驗(yàn)小鼠，對(duì)其照射365nm的手持紫外線燈(其具有l(wèi)_2mW/ cm2的輻射率)。用肉眼觀察到的熒光照片圖像提供在圖2c中。圖2c表明，從本發(fā)明的發(fā) 光聚合物的注射納米顆粒斑點(diǎn)觀察到強(qiáng)烈的熒光色。實(shí)施例4 借助于發(fā)光聚合物納米顆粒的細(xì)胞成像和哨兵淋巴結(jié)的熒光檢測(cè)(1)細(xì)胞成像將在實(shí)施例1和2中制備的CN-D0PPV和CN-PPV納米顆粒的水相中的分散體 各100 iiL放入活癌細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)培養(yǎng)基，然后其被摻入細(xì)胞三小時(shí)。用熒光顯微鏡 (AppliedPrecision，裝備有60x油透鏡(oli lens), Olympus)觀察摻入納米顆粒的細(xì)胞 的光學(xué)圖像。結(jié)果提供在圖5a和5b中，其表明，在癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中觀察到CN-D0PPV(圖 5a)和CN-PPV(圖5b)納米顆粒的強(qiáng)烈熒光。(2)哨兵淋巴結(jié)的體內(nèi)近紅外熒光成像圖2a和2b表明，在實(shí)施例1中制備的CN-D0PPV納米顆粒在700nm或更高的近紅 外區(qū)呈現(xiàn)強(qiáng)烈熒光，其適用于體內(nèi)熒光成像。因此，在10yL的CN-D0PPV水相中的分散體 被皮下注入腹膜麻醉(peritoneal-anesthetized)雄性小鼠(BALB/c，5 周齡，Instituteof Medical Science, Tokyo)的前爪墊以后，立即在535nm光照射下獲得如圖6所示的近紅外 熒光圖像，其中利用裝備有近紅外區(qū)濾光片(e700WA)的成像裝置(Kodak Image Station 400MM)。注射以后，立即通過體外熒光圖像追蹤C(jī)N-D0PPV納米顆粒沿淋巴管的移動(dòng)。如圖 6所示，CN-D0PPV納米顆粒在1分鐘內(nèi)快速達(dá)到腋哨兵淋巴結(jié)(axillery sentinel lymph node)，并在5分鐘內(nèi)高質(zhì)量地獲得非常強(qiáng)烈和鮮明的哨兵淋巴結(jié)圖像。CN-D0PPV納米顆粒 停留在哨兵淋巴結(jié)70分鐘以上，沒有觀測(cè)到流向下游淋巴結(jié)。(3)在體外和在分離表皮以后哨兵淋巴結(jié)的熒光彩色成像在完成實(shí)施例4的(2)的實(shí)驗(yàn)以后，在365nm便攜式紫外線燈(具有l(wèi)-2mW/cm2的 照射)下用普通數(shù)碼相機(jī)獲得熒光彩色照片圖像，如圖7a和7b所示。圖7a是體外獲得的
10照片，而圖7b則是分離表皮以后獲得的照片。圖7a和7b表明，CN-D0PPV納米顆粒具有高 熒光強(qiáng)度，以致在一般手持紫外線燈下用肉眼就可以觀察納米顆粒積聚的哨兵淋巴結(jié)，而 無需專用成像設(shè)備，如用于在實(shí)施例4的(2)的實(shí)驗(yàn)中。在分離表皮以后，觀察到更強(qiáng)烈的 熒光，從而說明，在操作期間可以快速和準(zhǔn)確地確定哨兵淋巴結(jié)。如上所述，本發(fā)明提供了本發(fā)明的發(fā)光聚合物的納米顆粒，其具有適合用作生物 分子標(biāo)記或應(yīng)用于細(xì)胞或活體的粒徑、發(fā)光性能和水中的分散相，是純的有機(jī)物質(zhì)，既不包 含鹵素原子也不包含重金屬，并且呈現(xiàn)顯著改善的熒光強(qiáng)度(和現(xiàn)有技術(shù)的熒光造影劑相 比)，從而借助于少量注射就可以提供熒光圖像。此外，在本發(fā)明中，可以以生態(tài)和生物友好的方式來制備發(fā)光聚合物的納米顆粒 而不使用有機(jī)溶劑；因此，本發(fā)明的方法不存在現(xiàn)有技術(shù)的無機(jī)量子點(diǎn)的潛在毒性問題，因 而它提供了發(fā)光聚合物的納米顆粒用于實(shí)際臨床應(yīng)用的可能性。在通過膠體聚合方法的發(fā) 光聚合物的納米顆粒的制備方法中，最終產(chǎn)物是由單體通過一步聚合反應(yīng)直接獲得。因此， 和現(xiàn)有技術(shù)方法相比，本發(fā)明的方法是簡(jiǎn)單和容易的，即，如在D9中描述的沉淀法，該方法 包括溶解通過溶液聚合在有機(jī)溶劑中獲得的發(fā)光聚合物，接著在具有稀釋濃度的水中沉淀 聚合物，以獲得聚合物的納米顆粒。另外，本發(fā)明提供了以更高濃度大規(guī)模制備納米顆粒的 穩(wěn)定水相中的分散體的可能性。在該沉淀法中，不能制備具有低溶解度的發(fā)光聚合物的納 米顆粒，因?yàn)樵诔恋磉^程以前，聚合物應(yīng)被均勻溶解在有機(jī)溶劑中，而在根據(jù)本發(fā)明的膠體 聚合方法中，對(duì)于要獲得的聚合物的溶解度沒有限制，因?yàn)榧{米顆粒以最終產(chǎn)物的形式而 制備，因而不需要在有機(jī)溶劑中的任何再溶解過程。因此，根據(jù)本發(fā)明的膠體聚合方法是有 利的，因?yàn)橹灰ＷC單體在液體表面活性劑中的可溶性，可以制備甚至具有低溶解度的發(fā) 光聚合物的納米顆粒。
權(quán)利要求
一種發(fā)光聚合物的納米顆粒，包含由以下化學(xué)式1表示的氰基取代的聚(芳撐亞乙烯基)聚合物的納米顆粒；以及吸附于所述聚合物的所述納米顆粒的表面的生物相容性表面活性劑化學(xué)式1其中n是10至10,000的整數(shù)，Ar1和Ar2是芳基基團(tuán)，獨(dú)立地選自由苯基、聯(lián)苯基、三聯(lián)苯基、萘基、蒽基、芴基、二苯基芴基、咔唑基、苯硫基、呋喃基或嘌呤基、吡咯基、喹啉基、喹喔啉基、噁二唑基、二苯基噁二唑基、吲哚基以及吲唑基組成的組，上述基團(tuán)是未取代的或由直鏈的或支鏈的C1-10烷基、烷氧基或硫代烷氧基基團(tuán)取代。F2009101804786C0000011.tif
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米顆粒，其中，由化學(xué)式1表示的氰基取代的聚(芳撐亞乙 烯基)聚合物的納米顆粒與所述生物相容性表面活性劑的比率按重量計(jì)為1 7至1 12。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米顆粒，其中，所述表面活性劑是液體表面活性劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米顆粒，其中，所述表面活性劑選自由Tween 20、 Tween 60,Tween 80,Triton x-loo、Span 20,Span 60 以及Span 80 組成的組。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米顆粒，具有5nm至500nm范圍的粒徑。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米顆粒，具有300nm至800nm范圍的吸收波長(zhǎng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米顆粒，具有400nm至900nm范圍的發(fā)光波長(zhǎng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米顆粒，其中，Ari是選自由以下化學(xué)式2表示的基團(tuán)中的
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米顆粒，其中，Ar2是苯基。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的納米顆粒，具有450nm或更高的發(fā)光波長(zhǎng)，并用作用于細(xì)胞 成像的熒光造影劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的納米顆粒，具有530nm或更高的發(fā)光波長(zhǎng)，并用作用于體內(nèi) 成像的熒光造影劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求7所述的納米顆粒，具有l(wèi)Onm至50nm的粒徑和600nm或更高的發(fā)光 波長(zhǎng)，并用作用于熒光檢測(cè)哨兵淋巴結(jié)的造影劑。
13.一種用于制備根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)光聚合物的納米顆粒的方法，包括(1)均勻混合由通式0HC-Ari-CH0表示的單體(Ari是芳基，選自由苯基、芴基和噻吩 基組成的組，并且是未取代的或由直鏈的或支鏈的烷基、烷氧基或硫代烷氧基基團(tuán)取 代)、由通式NC-Ar2-CN表示的單體(Ar2是芳基，選自由苯基、芴基和噻吩基組成的組，并且 是未取代的或由直鏈的或支鏈的烷基、烷氧基或硫代烷氧基基團(tuán)取代)、和液體表面活 性劑；(2)將水加入至所得的混合物中以制備水相中的膠束分體散；以及(3)將聚合催化劑加入至所述水相中的膠束分體散，接著在室溫和大氣壓下使所述獲 得的混合物實(shí)施膠體聚合，以獲得所述發(fā)光聚合物的所述納米顆粒，其中所述納米顆粒的 表面用所述表面活性劑加以穩(wěn)定。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，進(jìn)一步包括將在步驟(3)中獲得的所述發(fā)光聚合物 的所述納米顆粒進(jìn)行滲析，以除去過量的表面活性劑、催化劑和未反應(yīng)單體。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，在步驟(1)中由通式OHC-Ari-CHO表示的單體 和由通式NC-Ar2-CN表示的單體按1 1的摩爾比率使用，且所述液體表面活性劑的用量 為按所述單體的總重量計(jì)的20至100倍。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，在步驟⑴中，由通式OHC-Ari-CHO表示的單 體和由通式NC-Ar2-CN表示的單體均勻溶解在不含有機(jī)溶劑的液體表面活性劑中。
17.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的方法，其中，所述聚合催化劑選自由四丁基氫氧化銨、 四甲基氫氧化銨和四乙基氫氧化銨組成的組。
18.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，在步驟(3)中獲得的所述發(fā)光聚合物的所述納 米顆粒的粒徑在5nm至500nm范圍內(nèi)。
19.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，在步驟(3)中獲得的所述發(fā)光聚合物的所述納 米顆粒的吸收波長(zhǎng)在300nm至800nm范圍內(nèi)。
20.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，在步驟(3)中獲得的所述發(fā)光聚合物的所述納 米顆粒的發(fā)光波長(zhǎng)在400nm至900nm范圍內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明披露了發(fā)光聚合物的納米顆粒及其制備方法，所述納米顆粒包含氰基取代的聚(芳撐亞乙烯基)聚合物的納米顆粒；生物相容性表面活性劑，其吸附于聚合物納米顆粒的表面，所述方法包括(1)均勻混合由通式OHC-Ar1-CHO表示的二醛單體、由通式NC-Ar2-CN表示的二氰化物單體、和液體表面活性劑；(2)將水加入至所得的混合物中以制備水相中的膠束分散體；以及(3)將聚合催化劑加入水相中的膠束分散體中，接著在室溫和大氣壓下使所得的混合物實(shí)施膠體聚合。用生物相容性表面活性劑來穩(wěn)定本發(fā)明的發(fā)光聚合物的納米顆粒，以致它可以形成穩(wěn)定的水相中的分散體，并具有適合于生物分子標(biāo)記或細(xì)胞或體內(nèi)成像的顆粒大小和熒光效率；因而，它可以用作細(xì)胞或體內(nèi)發(fā)光造影劑。
文檔編號(hào)C08K5/103GK101885913SQ200910180478
公開日2010年11月17日 申請(qǐng)日期2009年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月13日
發(fā)明者崔貴元, 權(quán)翊贊, 林昌根, 金世勛, 金光明 申請(qǐng)人:韓國(guó)科學(xué)技術(shù)研究院