專利名稱：：一種殼聚糖的層層自組裝蛋白質(zhì)印跡聚合物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于高分子化學(xué)和蛋白質(zhì)選擇性吸附和分離領(lǐng)域，特別是涉及一種具有蛋白質(zhì)選擇性吸附和分離功能的殼聚糖的層層自組裝蛋白質(zhì)印跡聚合物的制備方法。
背景技術(shù)：
：目前，生物大分子特別是蛋白質(zhì)分子的高效選擇性吸附分離作為一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的研究領(lǐng)域受到研究者的極大關(guān)注。近年來，蛋白質(zhì)分子印跡方法已經(jīng)成為一種新穎有效的蛋白質(zhì)選擇性吸附分離技術(shù)，顯示出重要的應(yīng)用價(jià)值和廣泛的發(fā)展前景。目前利用分子印跡技術(shù)來分離蛋白質(zhì)主要有包埋法、表面印跡法以及抗原決定基法[化學(xué)通報(bào)，2005，7:504-509]。然而，這些蛋白質(zhì)印跡的方法仍然存在一些問題，例如，制備時(shí)易導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性失去活性，模板蛋白質(zhì)難以洗脫等。因此，這就要求努力尋找一種制備條件溫和、操作簡(jiǎn)便的蛋白質(zhì)印跡方法來解決上述問題。層層自組裝技術(shù)(LBL)，是一種基于靜電力作用依次吸附上帶異種電荷聚電解質(zhì)的自組裝超分子技術(shù)。它具有工藝簡(jiǎn)單，條件溫和，組裝范圍廣泛等優(yōu)點(diǎn)，不僅可以自組裝合成的聚電解質(zhì)，也可以自組裝荷電的蛋白質(zhì)、多糖等生物大分子[高分子通報(bào)，2006，8:58-63]，利用層層自組裝方法構(gòu)筑多糖與蛋白質(zhì)的多層膜的研究已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道[J.Phys.Chem.B，2004，108(35):13144-13152]。另外，由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，易變性失去活性，因此在印跡過程中選用合適的功能單體來保持蛋白質(zhì)活性很重要。值得注意的是，天然聚合物殼聚糖是一種良好的蛋白質(zhì)分子印跡功能單體，其具有良好的生物相容性，有利于保持蛋白質(zhì)的生物活性和空間構(gòu)象。此外，殼聚糖分子鏈上帶有大量與蛋白質(zhì)結(jié)合的氨基，容易形成識(shí)別位點(diǎn)，因此已應(yīng)用于蛋白質(zhì)分離領(lǐng)域[高分子材料科學(xué)與工程，2007，23(2):235-237]。如前所述，在制備蛋白質(zhì)印跡聚合物的現(xiàn)有技術(shù)中存在著制備過程較復(fù)雜，且容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)的變性失活等問題。因此，這就要求努力尋找一種制備條件溫和、操作簡(jiǎn)便的蛋白質(zhì)印跡方法來解決上述問題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種殼聚糖的層層自組裝蛋白質(zhì)印跡聚合物的制備方法，該方法制備的殼聚糖的層層自組裝蛋白質(zhì)印跡聚合物具有良好的選擇性吸附模板蛋白質(zhì)的能力，并且具有良好的蛋白質(zhì)選擇性分離功能，同時(shí)，該制備方法較簡(jiǎn)單，制備條件溫和，具有較好的可重復(fù)利用性能。本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用以下的技術(shù)方案一種殼聚糖的層層自組裝蛋白質(zhì)印跡聚合物的制備方法，其特征在于它包括如下步驟1)制備交聯(lián)殼聚糖球形粒子基材①按殼聚糖乙酸溶液氫氧化鈉溶液=a.53.o)g:(50ioo)mL:(l2)L，選取殼聚糖、乙酸溶液和氫氧化鈉溶液，其中，乙酸溶液的質(zhì)量百分比為2%，氫氧化鈉溶液的濃度為2mol/L;將殼聚糖加入到乙酸溶液中，攪拌至殼聚糖充分溶解后，超聲除去氣泡后得到殼聚糖溶液；再用注射器將殼聚糖溶液以24mL/min的滴加速度逐滴加入到上述氫氧化鈉溶液中，溶液中出現(xiàn)白色球形粒子，待白色球形粒子沉淀到底部后，分離白色球形粒子并用去離子水沖洗46次，直到溶液pH值至7;然后分離，得到殼聚糖球形粒子；②按殼聚糖去離子水環(huán)氧氯丙烷=(1.53.O)g:(50150)mL:0.30.6g，選取去離子水和環(huán)氧氯丙烷，并將所述去離子水裝于錐形瓶中；將殼聚糖球形粒子轉(zhuǎn)到裝有去離子水的錐形瓶中，并用24mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值至10，再向溶液中加入環(huán)氧氯丙烷作為交聯(lián)劑，在室溫下反應(yīng)48h，反應(yīng)完成后，用去離子水沖洗46次以洗去未反應(yīng)的環(huán)氧氯丙烷，得到交聯(lián)殼聚糖球形粒子；取上述交聯(lián)殼聚糖球形粒子置于燒杯中，加入0.012mol/L鹽酸溶液處理1020min，然后分離出球形粒子用去離子水沖洗46次，得到交聯(lián)殼聚糖球形粒子基材；2)牛血清白蛋白與殼聚糖在交聯(lián)殼聚糖球形粒子基材表面的自組裝①配制含氯化鈉濃度為0.14mol/L的牛血清白蛋白磷酸緩沖溶液(溶劑為去離子水)，其中含牛血清白蛋白的濃度為lmg/mL;配制含氯化鈉濃度為O.14mol/L的殼聚糖溶液(溶劑為去離子水)，其中含殼聚糖的濃度為1.5mg/mL;②將上述交聯(lián)殼聚糖球形粒子基材置于牛血清白蛋白磷酸緩沖溶液中1520min，再將粒子分離出后用0.14mol/L氯化鈉溶液清洗46次，然后將粒子置于殼聚糖溶液中1520min，再將粒子分離出后用0.14mol/L氯化鈉溶液清洗46次，完成交聯(lián)殼聚糖球形粒子基材表面的第一個(gè)雙分子層自組裝，得到含一個(gè)雙分子層的表面自組裝殼聚糖粒子；③重復(fù)上述步驟2)的②的過程，交聯(lián)殼聚糖球形粒子基材在牛血清白蛋白磷酸緩沖溶液和殼聚糖溶液中交替自組裝5次，得到殼聚糖為最外層的含五個(gè)雙分子層的表面自組裝殼聚糖粒子；3)牛血清白蛋白在自組裝殼聚糖基材表面的印跡①按殼聚糖去離子水環(huán)氧氯丙烷=(1.53.O)g:(50100)mL:0.30.6g，選取去離子水和環(huán)氧氯丙烷，并將所述去離子水裝于錐形瓶中；②將上述表面自組裝殼聚糖粒子轉(zhuǎn)移到裝有去離子水的錐形瓶中，并用24mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值至10，加入環(huán)氧氯丙烷在室溫下反應(yīng)48h，反應(yīng)結(jié)束后，分離出粒子，用去離子水沖洗46次，得到殼聚糖粒子；4)模板蛋白質(zhì)的洗脫將上述步驟3)中得到的殼聚糖粒子用十二烷基硫酸鈉與乙酸的混合溶液進(jìn)行洗脫，以脫除模板蛋白質(zhì)牛血清白蛋白，采用紫外-可見分光光度計(jì)在280nm波長(zhǎng)處檢測(cè)洗脫液中蛋白質(zhì)的濃度，直至洗脫液中蛋白質(zhì)吸光值為O，得到殼聚糖的層層自組裝蛋白質(zhì)印跡聚合物。步驟2)中，配制的牛血清白蛋白磷酸緩沖溶液的pH值為6;配制的殼聚糖溶液的pH值為6。步驟4)中，十二烷基硫酸鈉與乙酸的混合溶液中十二烷基硫酸鈉的質(zhì)量百分比為4.8%、乙酸的質(zhì)量百分比為2%，水的質(zhì)量百分比為93.2%。本發(fā)明先制備交聯(lián)殼聚糖球形粒子基材，通過化學(xué)交聯(lián)方法使其具有穩(wěn)定的機(jī)械性能，再利用其帶有的氨基使其表面具有正電荷，再在一定PH條件下，通過層層自組裝的方法將帶負(fù)電的模板蛋白質(zhì)BSA和帶正電的殼聚糖交替吸附，通過靜電作用將模板蛋白質(zhì)及殼聚糖交替自組裝到交聯(lián)殼聚糖球形粒子基材的表面，再進(jìn)行模板蛋白質(zhì)分子的印跡，然后采用洗脫劑脫除模板蛋白質(zhì)分子，從而使基材的表面留下可以與模板蛋白質(zhì)相互識(shí)別的位點(diǎn)及空穴結(jié)構(gòu)，使其具有蛋白質(zhì)選擇性吸附和分離功能，通過上述方法得到一種殼聚糖的層層自組裝蛋白質(zhì)印跡聚合物。本發(fā)明利用的殼聚糖是一種天然高分子聚電解質(zhì)，在制備蛋白質(zhì)印跡聚合物的過程中，有利于減少蛋白質(zhì)分子的變性和保持蛋白質(zhì)分子的活性；采用具有良好生物相容性的殼聚糖，利用帶正電荷的殼聚糖與帶負(fù)電荷的模板蛋白質(zhì)交替吸附作用在基材表面進(jìn)行層層自組裝，然后再進(jìn)行模板蛋白質(zhì)分子的印跡制備蛋白質(zhì)印跡聚合物。此外，本發(fā)明使用的層層自組裝技術(shù)，其制備條件溫和，易于實(shí)施，能夠有效增加蛋白質(zhì)與殼聚糖之間的特異性識(shí)別位點(diǎn)，因此可以賦予該蛋白質(zhì)印跡聚合物更好的蛋白質(zhì)選擇性吸附和分離功能，并且有利于保持蛋白質(zhì)的活性。該蛋白質(zhì)印跡聚合物對(duì)于模板蛋白質(zhì)牛血清白蛋白(BSA)的吸附量為13.67mg/g，相對(duì)于未印跡殼聚糖的BSA吸附量上升了27.7倍，并且該蛋白質(zhì)印跡聚合物對(duì)不同蛋白質(zhì)的選擇性吸附和分離效果明顯，該蛋白質(zhì)印跡聚合物具有較好的可重復(fù)利用性能，而且由于蛋白質(zhì)印跡發(fā)生在基材的表面，更利于模板蛋白質(zhì)的洗脫與吸附。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明制備的殼聚糖的層層自組裝蛋白質(zhì)印跡聚合物具有良好的選擇性吸附模板蛋白質(zhì)的能力，并且具有良好的蛋白質(zhì)選擇性分離功能，同時(shí)，該制備方法較簡(jiǎn)單，制備條件溫和，具有較好的可重復(fù)利用性能，成本低廉。本發(fā)明在蛋白質(zhì)選擇性吸附和分離領(lǐng)域具有廣泛的用途。圖1是非印跡聚合物(CS)以及實(shí)施例1得到的殼聚糖的層層自組裝蛋白質(zhì)印跡聚合物(L-CS)對(duì)模板蛋白質(zhì)牛血清白蛋白(BSA)的吸附量對(duì)比圖，其中BSA為牛血清白蛋白，Lys為溶菌酶，0VA為卵清蛋白。圖2是實(shí)施例1得到的殼聚糖的層層自組裝蛋白質(zhì)印跡聚合物(L-CS)經(jīng)過重復(fù)洗脫后對(duì)模板蛋白質(zhì)牛血清白蛋白(BSA)的吸附量圖。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明制備方法作進(jìn)一步說明，但不限定本發(fā)明。實(shí)施例1:—種殼聚糖的層層自組裝蛋白質(zhì)印跡聚合物的制備方法，它包括如下步驟1)制備交聯(lián)殼聚糖球形粒子基材①稱取1.5g殼聚糖，加入到50mL的質(zhì)量百分比為2X乙酸溶液中(質(zhì)量百分比為2%表示100g乙酸溶液中含2g乙酸)，攪拌至殼聚糖充分溶解后，超聲除去氣泡后得到3mg/mL的殼聚糖溶液；再用醫(yī)用注射器(7#針頭)以2mL/min的滴加速度逐滴加入到2L的2mol/L氫氧化鈉溶液中，溶液中出現(xiàn)白色球形粒子，待白色球形粒子沉淀到底部后，分離出白色球形粒子并用去離子水反復(fù)沖洗6次，直到溶液pH值至7;然后分離，得到殼聚糖球形粒子；②分離出的殼聚糖粒子轉(zhuǎn)到裝有50mL去離子水的錐形瓶中，并用2mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值至IO，再向溶液中加入環(huán)氧氯丙烷O.3g作為交聯(lián)劑，在室溫下反應(yīng)48h，殼聚糖球形粒子用去離子水反復(fù)沖洗6次以洗去未反應(yīng)的環(huán)氧氯丙烷，得到交聯(lián)殼聚糖球形粒子；取上述交聯(lián)殼聚糖球形粒子置于200mL燒杯中，加入0.012mol/L鹽酸溶液處理20min，然后分離出球形粒子用去離子水反復(fù)沖洗6次，得到交聯(lián)殼聚糖球形粒子基材。2)牛血清白蛋白與殼聚糖在交聯(lián)殼聚糖球形粒子基材表面的自組裝①配制含氯化鈉濃度為0.14mol/L的牛血清白蛋白磷酸緩沖溶液(pH=6)，其中含牛血清白蛋白的濃度為lmg/mL;配制含氯化鈉濃度為0.14mol/L的殼聚糖溶液(pH=6)，其中含殼聚糖的濃度為1.5mg/ml;②將上述交聯(lián)殼聚糖球形粒子基材置于牛血清白蛋白磷酸緩沖溶液中20min，再將粒子分離出后用0.14mol/L氯化鈉溶液反復(fù)清洗6次，然后將粒子置于殼聚糖溶液中20min，再將粒子分離出后用0.14mol/LNaCl反復(fù)清洗6次，完成殼聚糖粒子表面的第一個(gè)雙分子層自組裝，得到含一個(gè)雙分子層的表面自組裝殼聚糖粒子；③重復(fù)上述步驟2)的②的過程，交聯(lián)殼聚糖球形粒子基材在牛血清白蛋白磷酸緩沖溶液和殼聚糖溶液中交替自組裝5次，得到殼聚糖為最外層的含五個(gè)雙分子層的表面自組裝殼聚糖粒子。3)牛血清白蛋白在自組裝殼聚糖基材表面的印跡將上述表面自組裝殼聚糖粒子轉(zhuǎn)移到裝有50mL去離子水的錐形瓶中，并用2mo1/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值至10，加入環(huán)氧氯丙烷0.3g室溫下反應(yīng)48h，反應(yīng)結(jié)束后，分離出粒子，用去離子水反復(fù)沖洗6次，得到殼聚糖粒子。4)模板蛋白質(zhì)的洗脫①混合溶液的準(zhǔn)備十二烷基硫酸鈉與乙酸的混合溶液中十二烷基硫酸鈉的質(zhì)量百分比為4.8%、乙酸的質(zhì)量百分比為2%，水的質(zhì)量百分比為93.2%;②將上述步驟3)中得到的殼聚糖粒子用十二烷基硫酸鈉與乙酸的混合溶液進(jìn)行洗脫，以脫除模板蛋白質(zhì)牛血清白蛋白，采用紫外_可見分光光度計(jì)在280nm波長(zhǎng)處檢測(cè)洗脫液中蛋白質(zhì)的濃度，直至洗脫液中蛋白質(zhì)吸光值為O，得到殼聚糖的層層自組裝蛋白質(zhì)印跡聚合物。實(shí)施例2:—種殼聚糖的層層自組裝蛋白質(zhì)印跡聚合物的制備方法，它包括如下步驟1)制備交聯(lián)殼聚糖球形粒子基材①稱取3.0g殼聚糖，加入到100mL的質(zhì)量百分比為2%乙酸溶液中，攪拌至殼聚糖充分溶解后，超聲除去氣泡后得到3mg/mL的殼聚糖溶液；再用醫(yī)用注射器(7#針頭)以4mL/min的滴加速度逐滴加入到2L的2mol/L氫氧化鈉溶液中，溶液中出現(xiàn)白色球形粒子，待白色球形粒子沉淀到底部后，分離出白色球形粒子并用去離子水反復(fù)沖洗6次，直到溶液pH值至7;然后分離，得到殼聚糖球形粒子；②分離出的殼聚糖球形粒子轉(zhuǎn)到裝有150mL去離子水的錐形瓶中，并用4mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值至lO，再向溶液中加入環(huán)氧氯丙烷O.6g作為交聯(lián)劑，在室溫下反應(yīng)48h，殼聚糖球形粒子用去離子水反復(fù)沖洗6次以洗去未反應(yīng)的環(huán)氧氯丙烷，得到交聯(lián)殼聚糖球形粒子；取上述交聯(lián)殼聚糖球形粒子置于200mL燒杯中，加入0.012mol/L鹽酸溶液處理20min，然后分離出球形粒子用去離子水反復(fù)沖洗6次，得到交聯(lián)殼聚糖球形粒子基材。2)牛血清白蛋白與殼聚糖在交聯(lián)殼聚糖球形粒子基材表面的自組裝①配制含氯化鈉濃度為0.14mol/L的牛血清白蛋白磷酸緩沖溶液(pH=6)，其中含牛血清白蛋白的濃度為lmg/mL;配制含氯化鈉濃度為0.14mol/L的殼聚糖溶液(pH=6)，其中含殼聚糖的濃度為1.5mg/mL;②將上述交聯(lián)殼聚糖球形粒子基材置于牛血清白蛋白磷酸緩沖溶液中20min，再將粒子分離出后用0.14mol/L氯化鈉溶液反復(fù)清洗6次，然后將粒子置于殼聚糖溶液中20min，再將粒子分離出后用0.14mol/L氯化鈉溶液反復(fù)清洗6次，完成殼聚糖粒子表面的第一個(gè)雙分子層自組裝，得到含一個(gè)雙分子層的表面自組裝殼聚糖粒子；③重復(fù)上述步驟2)的②的過程，交聯(lián)殼聚糖球形粒子基材在牛血清白蛋白磷酸緩沖溶液和殼聚糖溶液中交替自組裝5次，得到殼聚糖為最外層的含五個(gè)雙分子層的表面自組裝殼聚糖粒子。3)牛血清白蛋白在自組裝殼聚糖基材表面的印跡將上述表面自組裝殼聚糖粒子轉(zhuǎn)移到裝有l(wèi)OOmL去離子水的錐形瓶中，并用4mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值至IO，加入環(huán)氧氯丙烷O.6g室溫下反應(yīng)48h，反應(yīng)結(jié)束后，分離出粒子，用去離子水反復(fù)沖洗6次，得到殼聚糖粒子。4)模板蛋白質(zhì)的洗脫①混合溶液的準(zhǔn)備十二烷基硫酸鈉與乙酸的混合溶液中十二烷基硫酸鈉的質(zhì)量百分比為4.8%、乙酸的質(zhì)量百分比為2%，水的質(zhì)量百分比為93.2%;②將上述步驟3)中得到的殼聚糖粒子用十二烷基硫酸鈉與乙酸的混合溶液進(jìn)行洗脫，以脫除模板蛋白質(zhì)牛血清白蛋白，采用紫外_可見分光光度計(jì)在280nm波長(zhǎng)處檢測(cè)洗脫液中蛋白質(zhì)的濃度，直至洗脫液中蛋白質(zhì)吸光值為O，得到殼聚糖的層層自組裝蛋白質(zhì)印跡聚合物。實(shí)施例3:—種殼聚糖的層層自組裝蛋白質(zhì)印跡聚合物的制備方法，它包括如下步驟1)制備交聯(lián)殼聚糖球形粒子基材①稱取1.5g殼聚糖，加入到50mL的質(zhì)量百分比為2%乙酸溶液中，攪拌至殼聚糖充分溶解后，超聲除去氣泡后得到3mg/mL的殼聚糖溶液；再用醫(yī)用注射器(7#針頭)以2mL/min的滴加速度逐滴加入到1L的2mol/L氫氧化鈉溶液中，溶液中出現(xiàn)白色球形粒子，待白色球形粒子沉淀到底部后，分離出白色球形粒子并用去離子水反復(fù)沖洗4次，直到溶液pH值至7;然后分離，得到殼聚糖球形粒子；②分離出的殼聚糖球形粒子轉(zhuǎn)到裝有50mL去離子水的錐形瓶中，并用2mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值至IO，再向溶液中加入環(huán)氧氯丙烷O.3g作為交聯(lián)劑，在室溫下反應(yīng)48h，殼聚糖球形粒子用去離子水反復(fù)沖洗4次以洗去未反應(yīng)的環(huán)氧氯丙烷，得到交聯(lián)殼聚糖球形粒子；取上述交聯(lián)殼聚糖球形粒子置于200mL燒杯中，加入0.012mol/L鹽酸溶液處理10min，然后分離出球形粒子用去離子水反復(fù)沖洗4次，得到交聯(lián)殼聚糖球形粒子8基材。2)牛血清白蛋白與殼聚糖在交聯(lián)殼聚糖球形粒子基材表面的自組裝①配制含氯化鈉濃度為0.14mol/L的牛血清白蛋白磷酸緩沖溶液(pH=6)，其中含牛血清白蛋白的濃度為lmg/mL;配制含氯化鈉濃度為0.14mol/L的殼聚糖溶液(pH=6)，其中含殼聚糖的濃度為1.5mg/mL;②將上述交聯(lián)殼聚糖球形粒子基材置于牛血清白蛋白磷酸緩沖溶液中15min，再將粒子分離出后用0.14mol/L氯化鈉溶液反復(fù)清洗4次，然后將粒子置于殼聚糖溶液中15min，再將粒子分離出后用0.14mol/L氯化鈉溶液反復(fù)清洗4次，完成殼聚糖粒子表面的第一個(gè)雙分子層自組裝，得到含一個(gè)雙分子層的表面自組裝殼聚糖粒子；③重復(fù)上述步驟2)的②的過程，交聯(lián)殼聚糖球形粒子基材在牛血清白蛋白磷酸緩沖溶液和殼聚糖溶液中交替自組裝5次，得到殼聚糖為最外層的含五個(gè)雙分子層的表面自組裝殼聚糖粒子。3)牛血清白蛋白在自組裝殼聚糖基材表面的印跡將上述表面自組裝殼聚糖粒子轉(zhuǎn)移到裝有50mL去離子水的錐形瓶中，并用2mo1/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值至10，加入環(huán)氧氯丙烷0.3g室溫下反應(yīng)48h，反應(yīng)結(jié)束后，分離出粒子，用去離子水反復(fù)沖洗4次，得到殼聚糖粒子；4)模板蛋白質(zhì)的洗脫①混合溶液的準(zhǔn)備十二烷基硫酸鈉與乙酸的混合溶液中十二烷基硫酸鈉的質(zhì)量百分比為4.8%、乙酸的質(zhì)量百分比為2%，水的質(zhì)量百分比為93.2%;②將上述步驟3)中得到的殼聚糖粒子用十二烷基硫酸鈉與乙酸的混合溶液進(jìn)行洗脫，以脫除模板蛋白質(zhì)牛血清白蛋白，采用紫外_可見分光光度計(jì)在280nm波長(zhǎng)處檢測(cè)洗脫液中蛋白質(zhì)的濃度，直至洗脫液中蛋白質(zhì)吸光值為O，得到殼聚糖的層層自組裝蛋白質(zhì)印跡聚合物。上述實(shí)施例1得到的一種殼聚糖的層層自組裝蛋白質(zhì)印跡聚合物的應(yīng)用所述殼聚糖的層層自組裝蛋白質(zhì)印跡聚合物具有良好的蛋白質(zhì)選擇性吸附及分離功能，在作為蛋白質(zhì)選擇性吸附和分離功能材料中具有廣泛的用途。下表1為殼聚糖的層層自組裝蛋白質(zhì)印跡聚合物(L-CS)相對(duì)于非印跡聚合物(CS)對(duì)不同蛋白質(zhì)的吸附量比值圖，其中BSA為牛血清白蛋白，Lys為溶菌酶，OVA為卵清蛋白。測(cè)試過程為分別取0.5gCS及L-CS粒子置于含有8mLBSA(lmg/mL)、Lys(lmg/mL)、0VA(lmg/mL)、Hb(lmg/mL)四種蛋白質(zhì)溶液的燒杯中震蕩吸附，達(dá)到平衡后采用紫外_可見分光光度計(jì)在280nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各燒杯中的蛋白質(zhì)濃度，測(cè)試上述兩種聚合物粒子對(duì)于這四種蛋白質(zhì)的吸附量。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>在表l中，蛋白質(zhì)的相對(duì)選擇性由不同蛋白質(zhì)的吸附量比值來表示，從表中可以看出L-CS對(duì)BSA與Lys的吸附量的比值(BSA/Lys)相對(duì)于CS對(duì)于BSA與Lys的吸附量的比值(BSA/Lys)提高了9.55倍，說明制備的殼聚糖的層層自組裝蛋白質(zhì)印跡聚合物可以在BSA和Lys這兩種蛋白質(zhì)中很好的選擇性吸附模板蛋白質(zhì)牛血清白蛋白BSA;而以O(shè)VA和Hb為對(duì)比蛋白質(zhì)時(shí)，L-CS相比CS對(duì)于蛋白質(zhì)的相對(duì)選擇性分別提高了5.28和4.00倍，這些結(jié)果均表明殼聚糖的層層自組裝蛋白質(zhì)印跡聚合物L(fēng)-CS具有良好的選擇性識(shí)別模板蛋白質(zhì)的效果，對(duì)模板蛋白質(zhì)具有良好的選擇性吸附作用，可以作為蛋白質(zhì)選擇性吸附和分離功能材料。圖1是非印跡聚合物(CS)及殼聚糖的層層自組裝蛋白質(zhì)印跡聚合物(L-CS)對(duì)模板蛋白質(zhì)牛血清白蛋白(BSA)的吸附量對(duì)比圖。測(cè)試過程為分別稱取O.5g上述兩種聚合物粒子于兩個(gè)小燒杯中，然后向小燒杯中分別加入濃度為lmg/mL的模板蛋白質(zhì)(BSA)溶液8mL進(jìn)行震蕩吸附，達(dá)到平衡后，采用紫外-可見分光光度計(jì)在280nm波長(zhǎng)處檢測(cè)燒杯中的模板蛋白質(zhì)濃度，從而測(cè)試上述兩種聚合物粒子對(duì)于模板蛋白質(zhì)(BSA)的吸附量。從圖1中可以看出，非印跡聚合物對(duì)BSA的吸附量較小(0.49mg/g);而殼聚糖的層層自組裝蛋白質(zhì)印跡聚合物吸附量有了顯著的增加，達(dá)到了13.67mg/g，L-CS對(duì)于模板蛋白質(zhì)對(duì)于模板蛋白質(zhì)(BSA)的吸附量相對(duì)于非印跡聚合物提高了27.7倍，這說明制備的殼聚糖的層層自組裝蛋白質(zhì)印跡聚合物(L-CS)有效增加了與蛋白質(zhì)的識(shí)別位點(diǎn)，經(jīng)過洗脫留下了與模板蛋白質(zhì)相匹配的孔穴結(jié)構(gòu)，有效提高了對(duì)模板蛋白質(zhì)BSA的吸附量。以上結(jié)果表明制備的殼聚糖的層層自組裝蛋白質(zhì)印跡聚合物具有良好的蛋白質(zhì)選擇性吸附作用，可以作為蛋白質(zhì)選擇性吸附和分離功能材料。圖2是實(shí)施例1得到的殼聚糖的層層自組裝蛋白質(zhì)印跡聚合物(L-CS)經(jīng)過重復(fù)洗脫后對(duì)模板蛋白質(zhì)牛血清白蛋白(BSA)的吸附量圖。測(cè)試過程為將吸附有模板蛋白質(zhì)牛血清白蛋白(BSA)的殼聚糖的層層自組裝蛋白質(zhì)印跡聚合物(L-CS)采用質(zhì)量百分比為4.8%的十二烷基硫酸鈉與質(zhì)量百分比為2%的乙酸混合溶液作為洗脫劑洗脫除去BSA后，再將洗脫后的L-CS浸入BSA溶液中進(jìn)行震蕩吸附直至達(dá)到吸附平衡，重復(fù)上述洗脫與吸附步驟，并采用紫外-可見分光光度計(jì)在280nm波長(zhǎng)處檢測(cè)溶液中的模板蛋白質(zhì)濃度，測(cè)試兩次模板蛋白質(zhì)牛血清白蛋白吸附量的變化。由圖2可以看出，經(jīng)過重復(fù)洗脫后，L-CS對(duì)模板蛋白質(zhì)的吸附量有所減少，但是仍然可達(dá)到7.65mg/g，為第一次洗脫后的模板蛋白質(zhì)吸附量的56%，這說明制備的L-CS具有較好的可重復(fù)利用性能。本發(fā)明各原料的上下限、區(qū)間取值，以及工藝參數(shù)(如滴加速度、時(shí)間等)的上下限、區(qū)間取值都能實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，在此不一一列舉實(shí)施例。權(quán)利要求一種殼聚糖的層層自組裝蛋白質(zhì)印跡聚合物的制備方法，其特征在于它包括如下步驟1)制備交聯(lián)殼聚糖球形粒子基材①按殼聚糖∶乙酸溶液∶氫氧化鈉溶液＝(1.5～3.0)g∶(50～100)mL∶(1～2)L，選取殼聚糖、乙酸溶液和氫氧化鈉溶液，其中，乙酸溶液的質(zhì)量百分比為2％，氫氧化鈉溶液的濃度為2mol/L；將殼聚糖加入到乙酸溶液中，攪拌至殼聚糖充分溶解后，超聲除去氣泡后得到殼聚糖溶液；再用注射器將殼聚糖溶液以2～4mL/min的滴加速度逐滴加入到上述氫氧化鈉溶液中，溶液中出現(xiàn)白色球形粒子，待白色球形粒子沉淀到底部后，分離白色球形粒子并用去離子水沖洗4～6次，直到溶液pH值至7；然后分離，得到殼聚糖球形粒子；②按殼聚糖∶去離子水∶環(huán)氧氯丙烷＝(1.5～3.0)g∶(50～150)mL∶0.3～0.6g，選取去離子水和環(huán)氧氯丙烷，并將所述去離子水裝于錐形瓶中；將殼聚糖球形粒子轉(zhuǎn)到裝有去離子水的錐形瓶中，并用2～4mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值至10，再向溶液中加入環(huán)氧氯丙烷作為交聯(lián)劑，在室溫下反應(yīng)48h，反應(yīng)完成后，用去離子水沖洗4～6次，得到交聯(lián)殼聚糖球形粒子；取上述交聯(lián)殼聚糖球形粒子置于燒杯中，加入0.012mol/L鹽酸溶液處理10～20min，然后分離出球形粒子用去離子水沖洗4～6次，得到交聯(lián)殼聚糖球形粒子基材；2)牛血清白蛋白與殼聚糖在交聯(lián)殼聚糖球形粒子基材表面的自組裝①配制含氯化鈉濃度為0.14mol/L的牛血清白蛋白磷酸緩沖溶液，其中含牛血清白蛋白的濃度為1mg/mL；配制含氯化鈉濃度為0.14mol/L的殼聚糖溶液，其中含殼聚糖的濃度為1.5mg/mL；②將上述交聯(lián)殼聚糖球形粒子基材置于牛血清白蛋白磷酸緩沖溶液中15～20min，再將粒子分離出后用0.14mol/L氯化鈉溶液清洗4～6次，然后將粒子置于殼聚糖溶液中15～20min，再將粒子分離出后用0.14mol/L氯化鈉溶液清洗4～6次，完成交聯(lián)殼聚糖球形粒子基材表面的第一個(gè)雙分子層自組裝，得到含一個(gè)雙分子層的表面自組裝殼聚糖粒子；③重復(fù)上述步驟2)的②的過程，交聯(lián)殼聚糖球形粒子基材在牛血清白蛋白磷酸緩沖溶液和殼聚糖溶液中交替自組裝5次，得到殼聚糖為最外層的含五個(gè)雙分子層的表面自組裝殼聚糖粒子；3)牛血清白蛋白在自組裝殼聚糖基材表面的印跡①按殼聚糖∶去離子水∶環(huán)氧氯丙烷＝(1.5～3.0)g∶(50～100)mL∶0.3～0.6g，選取去離子水和環(huán)氧氯丙烷，并將所述去離子水裝于錐形瓶中；②將上述表面自組裝殼聚糖粒子轉(zhuǎn)移到裝有去離子水的錐形瓶中，并用2～4mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值至10，加入環(huán)氧氯丙烷在室溫下反應(yīng)48h，反應(yīng)結(jié)束后，分離出粒子，用去離子水沖洗4～6次，得到殼聚糖粒子；4)模板蛋白質(zhì)的洗脫將上述步驟3)中得到的殼聚糖粒子用十二烷基硫酸鈉與乙酸的混合溶液進(jìn)行洗脫，以脫除模板蛋白質(zhì)牛血清白蛋白，采用紫外-可見分光光度計(jì)在280nm波長(zhǎng)處檢測(cè)洗脫液中蛋白質(zhì)的濃度，直至洗脫液中蛋白質(zhì)吸光值為0，得到殼聚糖的層層自組裝蛋白質(zhì)印跡聚合物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種殼聚糖的層層自組裝蛋白質(zhì)印跡聚合物的制備方法，其特征在于步驟2)中，配制的牛血清白蛋白磷酸緩沖溶液的pH值為6;配制的殼聚糖溶液的pH值為6。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種殼聚糖的層層自組裝蛋白質(zhì)印跡聚合物的制備方法，其特征在于步驟4)中，十二烷基硫酸鈉與乙酸的混合溶液中十二烷基硫酸鈉的質(zhì)量百分比為4.8%、乙酸的質(zhì)量百分比為2%，水的質(zhì)量百分比為93.2%。全文摘要本發(fā)明涉及一種殼聚糖的層層自組裝蛋白質(zhì)印跡聚合物的制備方法。本發(fā)明先制備交聯(lián)殼聚糖球形粒子基材，再通過層層自組裝的方法將帶負(fù)電的模板蛋白質(zhì)BSA和帶正電的殼聚糖交替吸附，通過靜電作用將模板蛋白質(zhì)及殼聚糖交替自組裝到交聯(lián)殼聚糖球形粒子基材的表面，再進(jìn)行模板蛋白質(zhì)分子的印跡，然后采用洗脫劑脫除模板蛋白質(zhì)分子，從而使基材的表面留下可以與模板蛋白質(zhì)相互識(shí)別的位點(diǎn)及空穴結(jié)構(gòu)，使其具有蛋白質(zhì)選擇性吸附和分離功能，通過上述方法得到一種殼聚糖的層層自組裝蛋白質(zhì)印跡聚合物。該方法制備的聚合物具有良好的選擇性吸附模板蛋白質(zhì)的能力，并且具有良好的蛋白質(zhì)選擇性分離功能，同時(shí)，該制備方法較簡(jiǎn)單，制各條件溫和，具有較好的可重復(fù)利用性能。文檔編號(hào)C08L5/08GK101787143SQ201010100729公開日2010年7月28日申請(qǐng)日期2010年1月22日優(yōu)先權(quán)日2010年1月22日發(fā)明者徐敏,王立瑩,王藝峰,陳艷軍申請(qǐng)人:武漢理工大學(xué)