本發(fā)明涉及以抑制和/或強(qiáng)化的方式改變規(guī)定基因的表達(dá)，還涉及導(dǎo)入了規(guī)定基因的重組酵母、以及使用該重組酵母的物質(zhì)生產(chǎn)方法。

背景技術(shù)：
作為與使用酵母的物質(zhì)生產(chǎn)相關(guān)的技術(shù)，主要可列舉設(shè)計(jì)以乙酰輔酶A為中間體的物質(zhì)生產(chǎn)途徑的方法。例如，作為代表性脂肪酸的油酸，需要以9分子的乙酰輔酶A為原料，作為代表性二萜的胡蘿卜素，需要以12分子的乙酰輔酶A為原料。這樣，已知利用酵母內(nèi)所蓄積的乙酰輔酶A來(lái)合成作為藥品和/或精細(xì)化學(xué)品有用的脂肪酸的技術(shù)(專(zhuān)利文獻(xiàn)1)、合成萜類(lèi)的技術(shù)(專(zhuān)利文獻(xiàn)2)、合成聚酮類(lèi)化合物的技術(shù)(專(zhuān)利文獻(xiàn)3)。另外，作為以乙酰輔酶A為中間體合成的物質(zhì)，可列舉作為生物燃料收到關(guān)注的丁醇(專(zhuān)利文獻(xiàn)4)、異丙醇(專(zhuān)利文獻(xiàn)5)和法呢烷(專(zhuān)利文獻(xiàn)5)。但是，在酵母中，乙酰輔酶A是在菌體外生產(chǎn)的乙醇被攝入體內(nèi)，由所攝入的乙醇合成的。如果由酵母生產(chǎn)的乙醇變?yōu)楦邼舛?，則酵母自身的生長(zhǎng)被抑制。因此，通過(guò)提高酵母的乙醇生產(chǎn)能力，或者提高酵母的乙醇攝入量這樣的方法來(lái)提高菌體內(nèi)的乙酰輔酶A量是困難的。更具體地，專(zhuān)利文獻(xiàn)2公開(kāi)了由乙酰輔酶A合成法呢烷的技術(shù)，但其收率為理論收率的25％左右。另外，專(zhuān)利文獻(xiàn)6公開(kāi)了由乙酰輔酶A合成6-甲基水楊酸的技術(shù)，但其收率為理論收率的20％左右。這樣，在由乙酰輔酶A的物質(zhì)生產(chǎn)中，存在生產(chǎn)性顯著低這樣的問(wèn)題。現(xiàn)有專(zhuān)利文獻(xiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)1：日本特開(kāi)昭63-287491號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)2：WO2008/045555專(zhuān)利文獻(xiàn)3：日本特開(kāi)2008-22865專(zhuān)利文獻(xiàn)4：WO2008/137406專(zhuān)利文獻(xiàn)5：US2008/0293125專(zhuān)利文獻(xiàn)6：US2006/0148052

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
發(fā)明要解決的課題于是，本發(fā)明鑒于上述事實(shí)，目的在于特別通過(guò)在酵母中導(dǎo)入由葡萄糖6磷酸合成乙酰輔酶A或乙酸的代謝途徑，從而提供物質(zhì)生產(chǎn)性?xún)?yōu)異的重組酵母和使用該酵母的物質(zhì)生產(chǎn)方法。用于解決課題的方法為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明者們進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過(guò)對(duì)酵母在削弱參與糖酵解系統(tǒng)的基因的同時(shí)導(dǎo)入磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶基因，從而乙酸、乙酰輔酶A和來(lái)自乙酰輔酶A的物質(zhì)的生產(chǎn)性提高，從而完成了本發(fā)明。此外，磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶是催化將木酮糖5-磷酸轉(zhuǎn)換成乙酰磷酸和甘油醛3-磷酸的反應(yīng)的酶。即，本發(fā)明包含以下(1)～(7)。(1)重組酵母，其中，削弱了磷酸果糖激酶基因，且導(dǎo)入了磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶基因。(2)根據(jù)(1)所述的重組酵母，其特征在于，強(qiáng)化了葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因和/或D-核酮糖-5-磷酸-3-差向異構(gòu)酶基因的表達(dá)。(3)根據(jù)(1)所述的重組酵母，其特征在于，導(dǎo)入了磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因，和/或強(qiáng)化了乙酰輔酶A合成酶基因的表達(dá)。(4)根據(jù)(1)所述的重組酵母，其特征在于，強(qiáng)化了參與以乙酰輔酶A為底物合成乙酸乙酯的反應(yīng)的醇乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)。(5)根據(jù)(1)所述的重組酵母，其特征在于，導(dǎo)入了參與以乙酰輔酶A為底物合成異丙醇的反應(yīng)的乙酰乙酸脫羧酶基因、丁酸-乙酰乙酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶的亞基A基因、丁酸-乙酰乙酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶的亞基B基因、乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶基因和異丙醇脫氫酶基因。(6)物質(zhì)的制造方法，包括將上述(1)～(5)的任一項(xiàng)所述的重組酵母用培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的工序。(7)根據(jù)(6)所述的物質(zhì)的制造方法，其特征在于，上述物質(zhì)是選自由乙酸、乙酰輔酶A、來(lái)自乙酰輔酶A的乙酸乙酯和來(lái)自乙酰輔酶A的異丙醇組成的組中的1種。發(fā)明的效果本發(fā)明的重組酵母，將果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)換為果糖-1,6-二磷酸的活性被削弱，且被賦予了將木酮糖5-磷酸轉(zhuǎn)換為乙酰磷酸的活性。由此，通過(guò)利用本發(fā)明的重組酵母，可以提高乙酸和/或來(lái)自乙酰輔酶A的物質(zhì)的生產(chǎn)性。附圖說(shuō)明圖1是顯示包含在本發(fā)明的酵母中削弱的磷酸果糖激酶基因所參與的代謝途徑的糖酵解系統(tǒng)的一部分的特性圖。圖2是顯示包含在本發(fā)明的酵母中導(dǎo)入的磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶基因所參與的代謝途徑的戊糖磷酸系統(tǒng)的一部分的特性圖。圖3是對(duì)于來(lái)自各種生物的磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶基因顯示分子系統(tǒng)樹(shù)分析的結(jié)果的特性圖。圖4是顯示由乙酰磷酸和乙酸合成乙酰輔酶A的途徑和由乙酰輔酶A合成其他物質(zhì)的途徑的特性圖。圖5是對(duì)于來(lái)自各種生物的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因顯示分子系統(tǒng)樹(shù)分析的結(jié)果的特性圖。圖6是用于制作pESC-HIS-ZWF1-RPE1載體的流程圖。圖7是用于制作pESC-Leu-PKT載體和pESC-Leu-PKT-PTA載體的流程圖。圖8是用于制作pESC-Trp-ATF1載體的流程圖。圖9是用于制作PFK1基因破壞用載體的流程圖。圖10是用于制作PFK2基因破壞用載體的流程圖。圖11是顯示乙酸生產(chǎn)試驗(yàn)的結(jié)果的特性圖。圖12是顯示乙酸乙酯生產(chǎn)試驗(yàn)的結(jié)果的特性圖。圖13是顯示異丙醇生產(chǎn)試驗(yàn)的結(jié)果的特性圖。圖14是顯示利用CE-TOFMS的酵母的代謝組分析的結(jié)果的特性圖。具體實(shí)施方式以下使用附圖和實(shí)施例更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。本發(fā)明的重組酵母，通過(guò)削弱編碼參與糖酵解系統(tǒng)的酶的基因，并且導(dǎo)入磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶基因，而具有將木酮糖5-磷酸轉(zhuǎn)換為乙酰磷酸的活性。作為可以用作宿主的酵母，不特別限定，可列舉休哈塔假絲酵母(CandidaShehatae)等假絲酵母(Candida)屬酵母、樹(shù)干畢赤酵母(Pichiastipitis)等畢赤酵母(Pichia)屬酵母、嗜鞣管囊酵母(Pachysolentannophilus)等管囊酵母(Pachysolen)屬酵母、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等酵母(Saccharomyces)屬酵母和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)等裂殖酵母(Schizosaccharomyces)屬酵母，特別優(yōu)選釀酒酵母。另外，作為酵母，既可以是為了實(shí)驗(yàn)方面的方便性而使用的實(shí)驗(yàn)株，也可以是為了實(shí)用方面的有用性而使用的工業(yè)株(實(shí)用株)。作為工業(yè)株，可列舉例如，用于制作紅酒、清酒或燒酎的酵母株。這里，作為編碼參與糖酵解系統(tǒng)的酶的基因、即削弱對(duì)象的基因，可列舉磷酸果糖激酶基因。此外，作為參與糖酵解系統(tǒng)的酶，除了磷酸果糖激酶以外，還已知己糖激酶、葡萄糖磷酸異構(gòu)酶、醛縮酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸變位酶、烯醇化酶和丙酮酸激酶。也可以削弱這些編碼磷酸果糖激酶以外的酶的基因。磷酸果糖激酶基因如圖1所示，在糖酵解系統(tǒng)中，編碼將果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)換成果糖-1,6-二磷酸的酶。削弱磷酸果糖激酶基因是指使磷酸果糖激酶活性有意義地降低，換言之，是指使糖酵解系統(tǒng)中的果糖-1,6-二磷酸的合成量有意義地降低。作為削弱磷酸果糖激酶基因的方法，不特別限定，可列舉破壞磷酸果糖激酶基因或使其缺失、破壞磷酸果糖激酶基因的表達(dá)控制區(qū)或使其缺失、添加磷酸果糖激酶的抑制物質(zhì)(例如檸檬酸)、或者利用siRNA等的RNA干涉的方法，和/或通過(guò)反義法來(lái)抑制磷酸果糖激酶基因的表達(dá)這樣的方法。此外，作為釀酒酵母的內(nèi)在的磷酸果糖激酶基因，已知PFK1基因和PFK2基因(THEJOURNALOFBIOLOGICALCHEMISTRY,Vol.275,No.52,IssueofDecember29,pp.40952-40960,2000)。在作為本發(fā)明的重組酵母的宿主利用釀酒酵母的情況下，可以削弱上述PFK1基因和PFK2基因的任一者，也可以削弱兩者。此外，對(duì)于除釀酒酵母以外的酵母，內(nèi)在的磷酸果糖激酶基因是公知的，可以參照現(xiàn)有的Genbank、DDBJ、EMBL等數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)特定。這樣，通過(guò)特定各種酵母中內(nèi)在的磷酸果糖激酶基因，可以削弱通過(guò)上述的方法和/或手段特定的磷酸果糖激酶基因。另外，本發(fā)明的重組酵母通過(guò)外源地導(dǎo)入磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶基因(PKT基因)，從而獲得將木酮糖5-磷酸轉(zhuǎn)換成乙酰磷酸的能力。此外，木酮糖5-磷酸是作為酵母本來(lái)具有的戊糖磷酸系統(tǒng)中的代謝物質(zhì)由核酮糖-5-磷酸合成的(圖2)。通過(guò)磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶合成的乙酰磷酸，通過(guò)酵母本來(lái)具有的乙酸激酶而轉(zhuǎn)換成乙酸。因此，在削弱磷酸果糖激酶基因的同時(shí)導(dǎo)入了磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶基因的重組酵母中，向培養(yǎng)基的乙酸的分泌生產(chǎn)性大幅提高。作為磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶基因，不特別限定，例如，優(yōu)選使用來(lái)自具有異質(zhì)乳酸發(fā)酵的代謝途徑的乳酸菌和/或雙歧桿菌的磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶基因。這里，異質(zhì)乳酸發(fā)酵是指由葡萄糖經(jīng)過(guò)糖酵解系統(tǒng)而生成的丙酮酸不僅被代謝為乳酸，還被代謝為乙醇和/或乙酸和二氧化碳的發(fā)酵。在異質(zhì)乳酸發(fā)酵中，由通過(guò)磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶生成的乙酰磷酸，合成乙醇和/或乙酸。更具體地，作為磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶基因，如圖3所示，可以使用來(lái)自各種微生物的磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶基因。此外，分配在圖3所示的分子系統(tǒng)樹(shù)中的編號(hào)與微生物的對(duì)應(yīng)關(guān)系示于下述表1。表1另外，作為磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶基因，優(yōu)選使用在圖3所示的分子系統(tǒng)樹(shù)中被分類(lèi)于虛線框內(nèi)的磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶基因。分類(lèi)于這一組的磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶基因主要來(lái)自具有異質(zhì)乳酸發(fā)酵的代謝途徑的乳酸菌和/或雙歧桿菌。即，作為磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶基因，如圖3所示的分子系統(tǒng)樹(shù)中被分類(lèi)于虛線框內(nèi)那樣，優(yōu)選使用來(lái)自作為雙歧桿菌的雙歧桿菌(Bifidobacterium)屬微生物、作為乳酸菌的乳酸菌(Lactobacillus)屬微生物和/或明串珠菌(Leuconostoc)屬微生物的基因。更詳細(xì)地，作為在圖3所示的分子系統(tǒng)樹(shù)中被分類(lèi)于虛線框內(nèi)的磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶基因，可以使用編碼包含序列號(hào)1～19的任一項(xiàng)所記載的氨基酸序列的磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶的基因。序列號(hào)1的氨基酸序列是由來(lái)自動(dòng)物雙歧桿菌(Bifidobacteriumanimalis)的磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶基因所編碼的氨基酸序列。序列號(hào)2～19所示的氨基酸序列分別依次是由來(lái)自長(zhǎng)雙岐桿菌(Bifidobacteriumlongum)、青春雙岐桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)、雞源雙歧桿菌(Bifidobacteriumpullorum)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)、清酒乳桿菌(Lactobacillussakei)、唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)、約氏乳桿菌(Lactobacillusjohnsonii)、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、格氏鏈球菌(Streptococcusgordonii)、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)和無(wú)乳支原體(mycoplasmaagalactiae)的磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶基因所編碼的氨基酸序列。即，在本發(fā)明中，優(yōu)選使用編碼序列號(hào)1～19的任一項(xiàng)所記載的氨基酸序列的磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶基因。其中，作為磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶基因，最優(yōu)選使用動(dòng)物雙歧桿菌(Bifidobacteriumanimalis)(序列號(hào)1)、長(zhǎng)雙岐桿菌(Bifidobacteriumlongum)(序列號(hào)2)、青春雙岐桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)(序列號(hào)3)和雞源雙歧桿菌(Bifidobacteriumpullorum)(序列號(hào)4)。此外，作為磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶基因，也可以是包含編碼下述蛋白質(zhì)的多核苷酸的基因，所述蛋白質(zhì)包含在序列號(hào)1～19的任一氨基酸序列中缺失、替換、添加或插入了1或數(shù)個(gè)氨基酸的氨基酸序列，且具有磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶活性。這里，數(shù)個(gè)氨基酸是指例如2～100個(gè)、優(yōu)選為2～80個(gè)、更優(yōu)選為2～55個(gè)、進(jìn)一步優(yōu)選為2～15個(gè)氨基酸。另外，作為磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶基因，還可以是包含編碼下述蛋白質(zhì)的多核苷酸的基因，所述蛋白質(zhì)包含相對(duì)于序列號(hào)1～19的任一氨基酸序列具有80％以上、優(yōu)選為85％以上、更優(yōu)選為90％以上、進(jìn)一步優(yōu)選為98％以上的序列類(lèi)似性的氨基酸序列，且具有磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶活性。這里，序列類(lèi)似性是指以默認(rèn)的設(shè)定使用BLAST、PSI-BLAST、HMMER等序列類(lèi)似性檢索軟件作為顯示2個(gè)氨基酸序列之間的類(lèi)似性的值而算出的值。這里，磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶活性是將木酮糖-5-磷酸轉(zhuǎn)換為乙酰磷酸的活性。因此，規(guī)定的蛋白質(zhì)是否具有磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶活性，可以利用含有木酮糖-5-磷酸作為底物的反應(yīng)液通過(guò)乙酰磷酸的合成量來(lái)判定(例如，JOURNALOFBACTERIOLOGY,Vol.183,No.9,May2001,p.29292936)。另外，本發(fā)明的重組酵母可以通過(guò)強(qiáng)化參與圖2所示的戊糖磷酸系統(tǒng)的酶基因的表達(dá)，來(lái)提高利用導(dǎo)入的磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶基因的乙酰磷酸的合成量，其結(jié)果可以提高乙酸的合成量。作為在圖2所示的戊糖磷酸系統(tǒng)中強(qiáng)化表達(dá)的對(duì)象的基因，不特別限定，可列舉葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因和核酮糖-5-磷酸-3-差向異構(gòu)酶基因。此外，既可以強(qiáng)化這些基因中的一種基因的表達(dá)，也可以強(qiáng)化兩種基因的表達(dá)。此外，作為釀酒酵母中內(nèi)在的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因，已知ZWF1基因。另外，作為釀酒酵母中內(nèi)在的核酮糖-5-磷酸-3-差向異構(gòu)酶基因，已知RPE1基因。對(duì)于除釀酒酵母以外的酵母，內(nèi)在的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因和/或核酮糖-5-磷酸-3-差向異構(gòu)酶基因也是公知的，可以參照現(xiàn)有的Genbank、DDBJ、EMBL等數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)特定。這里，強(qiáng)化基因的表達(dá)是指有意義地提高由成為對(duì)象的基因所編碼的酶的活性，是包含有意義地提高該基因的表達(dá)量的含義。作為強(qiáng)化基因的表達(dá)的方法，可以列舉有意義地提高該基因的表達(dá)量的方法。作為提高特定的基因的表達(dá)量的方法，不特別限定，可列舉改變?nèi)旧w中內(nèi)在的基因的表達(dá)控制區(qū)的方法、導(dǎo)入在活性高的啟動(dòng)子的下游配置了該基因的載體的方法。另一方面，本發(fā)明的重組酵母除了磷酸果糖激酶基因的削弱和磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶基因的導(dǎo)入之外，如圖4所示，可以通過(guò)進(jìn)一步導(dǎo)入磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因(PTA基因)，或進(jìn)一步強(qiáng)化乙酰輔酶A合成酶基因(ACS基因)，來(lái)提高乙酰輔酶A的合成量。磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因是本來(lái)酵母不具有的基因，作為外來(lái)基因而被導(dǎo)入。作為磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因，不特別限定，可以廣泛應(yīng)用在各種細(xì)菌中被稱(chēng)為PTA基因的基因。更具體地，作為磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因，如圖5所示，可以使用來(lái)自各種微生物的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因。此外，分配在圖5所示的分子系統(tǒng)樹(shù)中的編號(hào)與微生物的對(duì)應(yīng)關(guān)系示于下述表2。表21Bacillus_subtilis2Bacillus_amyloliquefaciens3Bacillus_licheniformis4Geobacillus_thermodenitrificans5Listeria_innocua6Staphylococcus_aureus7Lactococcus_lactis8Carnobacterium_sp．9Mycobacterium_vanbaalenii10Clostridium_perfringens11Enterococcus_faecalis12Leuconostoc_mesenteroides13Clostridium_acetobutylicum14Bifidobacterium_animalis_lactis15Corynebacterium_glutamicum16Escherichia_coli_K-1217Escherichia_coli_5363818Vibrio_vulnificus19Haemophilussomnus20Yersinia_pestis21Shigella_sonnei將由來(lái)自圖5和表2所示的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的PTA基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于序列號(hào)20，將由來(lái)自解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)的PTA基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于序列號(hào)21，將由來(lái)自地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)的PTA基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于序列號(hào)22，由來(lái)自嗜熱脫氮土壤芽孢桿菌(Geobacillusthermodenitrificans)的PTA基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于序列號(hào)23，由來(lái)自無(wú)害李斯特菌(Listeriainnocua)的PTA基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于序列號(hào)24，由來(lái)自金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的PTA基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于序列號(hào)25，由來(lái)自乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)的PTA基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于序列號(hào)26，由來(lái)自肉桿菌屬(Carnobacteriumsp.)的PTA基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于序列號(hào)27，由來(lái)自Mycobacteriumvanbaalenii的PTA基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于序列號(hào)28，由來(lái)自產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)的PTA基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于序列號(hào)29，由來(lái)自糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)的PTA基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于序列號(hào)30，由來(lái)自腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)的PTA基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于序列號(hào)31，由來(lái)自丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)的PTA基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于序列號(hào)32，由來(lái)自動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種(Bifidobacteriumanimalis_lactis)的PTA基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于序列號(hào)33，由來(lái)自谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)的PTA基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于序列號(hào)34，由來(lái)自大腸桿菌(Escherichiacoli)K-12的PTA基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于序列號(hào)35，由來(lái)自大腸桿菌(Escherichiacoli)53638的PTA基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于序列號(hào)36，由來(lái)自創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)的PTA基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于序列號(hào)37，由來(lái)自睡眠嗜血桿菌(Haemophilussomnus)的PTA基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于序列號(hào)38，由來(lái)自鼠疫耶爾森氏菌(Yersiniapestis)的PTA基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于序列號(hào)39，由來(lái)自索氏志賀菌(Shigellasonnei)的PTA基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于序列號(hào)40。此外，作為磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因，也可以是包含編碼下述蛋白質(zhì)的多核苷酸的基因，所述蛋白質(zhì)包含在序列號(hào)20～40的任一氨基酸序列中缺失、替換、添加或插入了1或數(shù)個(gè)氨基酸的氨基酸序列，且具有磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶活性。這里，數(shù)個(gè)氨基酸是指例如2～35個(gè)、優(yōu)選為2～25個(gè)、更優(yōu)選為2～15個(gè)、進(jìn)一步優(yōu)選為2～10個(gè)氨基酸。另外，作為磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因，也可以是包含編碼下述蛋白質(zhì)的多核苷酸的基因，所述蛋白質(zhì)包含相對(duì)于序列號(hào)20～40的任一氨基酸序列具有80％以上、優(yōu)選為85％以上、更優(yōu)選為90％以上、進(jìn)一步優(yōu)選為98％以上的序列類(lèi)似性的氨基酸序列，且具有磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶活性。這里，序列類(lèi)似性是指以默認(rèn)的設(shè)定使用BLAST、PSI-BLAST、HMMER等序列類(lèi)似性檢索軟件作為顯示2個(gè)氨基酸序列之間類(lèi)似性的值而算出的值。這里，磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶活性是指向乙酰磷酸轉(zhuǎn)移輔酶A的活性。因此，規(guī)定的蛋白質(zhì)是否具有磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶活性，可以利用含有乙酰磷酸和輔酶A的反應(yīng)液通過(guò)乙酰輔酶A的合成量來(lái)判定。另外，圖4所示的乙酰輔酶A合成酶基因是酵母本來(lái)具有的基因。因而為了強(qiáng)化乙酰輔酶A合成酶基因，可以應(yīng)用改變?nèi)旧w內(nèi)在的該基因的表達(dá)控制區(qū)的方法、導(dǎo)入在活性高的啟動(dòng)子的下游配置了該基因的載體的方法。此外，作為釀酒酵母中內(nèi)在的乙酰輔酶A合成酶基因，已知ACS1基因和ACS2基因。對(duì)于除釀酒酵母以外的酵母，內(nèi)在的乙酰輔酶A合成酶基因也是公知的，可以參照現(xiàn)有的Genbank、DDBJ、EMBL等數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)特定。如上，本發(fā)明的重組酵母，乙酰磷酸的合成量即乙酸的合成量顯著提高(圖2)，或者乙酰輔酶A的合成量顯著提高(圖4)。因此，本發(fā)明的重組酵母可以在以乙酸或乙酰輔酶A為生產(chǎn)對(duì)象時(shí)使用?；蛘?，本發(fā)明的重組微生物可以為了能夠以乙酰輔酶A為底物制造其他物質(zhì)(圖4中表述為來(lái)自乙酰輔酶A的物質(zhì))而作為用于進(jìn)行進(jìn)一步改變的宿主使用。具體地，作為來(lái)自乙酰輔酶A的物質(zhì)，不特別限定，可以合成丁醇、烷烴、丙醇、脂肪酸、脂肪酸酯、丙酮、乙酰乙酸、乙酸乙酯、聚酮化合物、氨基酸和萜類(lèi)。以這些作為生產(chǎn)對(duì)象的物質(zhì)時(shí)，通過(guò)利用本發(fā)明的重組酵母，可以大幅提高生產(chǎn)對(duì)象的物質(zhì)的生產(chǎn)性。以異丙醇作為生產(chǎn)對(duì)象物質(zhì)時(shí)，例如，可以通過(guò)參照APPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY,Dec.2007,p.7814-7818,Vol.73,No.24來(lái)特定應(yīng)在本發(fā)明的重組微生物中進(jìn)一步導(dǎo)入的基因。另外，以聚酮類(lèi)化合物作為生產(chǎn)對(duì)象物質(zhì)時(shí)，可以通過(guò)參照Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.95,pp.505-509,January1998來(lái)特定應(yīng)在本發(fā)明的重組微生物中進(jìn)一步導(dǎo)入的基因。進(jìn)而，在以脂肪酸為生產(chǎn)對(duì)象物質(zhì)時(shí)，例如，可以通過(guò)參照Eur.J.Biochem.112,p.431-442(1980)或MICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGYREVIEWS,Sept.2004,p.501-517來(lái)特定應(yīng)在本發(fā)明的重組微生物中進(jìn)一步導(dǎo)入、或強(qiáng)化的基因(例如，F(xiàn)AS基因)。進(jìn)一步，在以烷烴作為生產(chǎn)對(duì)象物質(zhì)時(shí)，對(duì)于參與由脂肪酸合成醛、進(jìn)一步由醛合成烷烴的基因，例如，可以通過(guò)參照Sciencevol32930julyp559-562來(lái)特定應(yīng)在本發(fā)明的重組微生物中進(jìn)一步導(dǎo)入的基因。另外，通過(guò)進(jìn)一步強(qiáng)化酵母中內(nèi)在的醇乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(ATF1基因)的表達(dá)，可以提高由乙酰輔酶A的乙酸乙酯的合成量。即，以乙酸乙酯作為生產(chǎn)對(duì)象物質(zhì)時(shí)，優(yōu)選強(qiáng)化內(nèi)在的ATF1基因的表達(dá)。另外，如上所述，在強(qiáng)化規(guī)定基因的表達(dá)時(shí)，使用轉(zhuǎn)錄活性高的適當(dāng)啟動(dòng)子。作為這樣的啟動(dòng)子，不特別限定，可以利用例如甘油醛3磷酸脫氫酶基因(TDH3)的啟動(dòng)子、3-磷酸甘油酸酯激酶基因(PGK1)的啟動(dòng)子、高滲透壓應(yīng)答7基因(HOR7)的啟動(dòng)子等。其中丙酮酸脫羧酶基因(PDC1)的啟動(dòng)子使下游的目的基因高表達(dá)的能力高，因此優(yōu)選。此外，通過(guò)使用gal1啟動(dòng)子、gal10啟動(dòng)子、熱休克蛋白質(zhì)啟動(dòng)子、MFα1啟動(dòng)子、PHO5啟動(dòng)子、GAP啟動(dòng)子、ADH啟動(dòng)子、AOX1啟動(dòng)子等，可以使下游的基因強(qiáng)表達(dá)。另外，作為導(dǎo)入上述的基因的方法，還可以應(yīng)用作為酵母的轉(zhuǎn)化方法已知的現(xiàn)有公知的任何方法。具體地，例如，可以通過(guò)電穿孔法“Meth.Enzym.,194,p182(1990)”、原生質(zhì)球法“Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75p1929(1978)”、乙酸鋰法“J.Bacteriology,153,p163(1983)”、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75p1929(1978)、Methodsinyeastgenetics,2000Edition:AColdSpringHarborLaboratoryCourseManual等所記載的方法來(lái)實(shí)施，但不限于此。在使用以上所說(shuō)明的重組酵母來(lái)制造物質(zhì)時(shí)，用含有適當(dāng)?shù)奶荚吹呐囵B(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。更具體地，按照常規(guī)方法用培養(yǎng)基培養(yǎng)進(jìn)行了前培養(yǎng)的重組酵母，生產(chǎn)目的物質(zhì)。例如，制造丁醇、烷烴、丙醇、脂肪酸、脂肪酸酯、丙酮、乙酰乙酸、乙酸酯、聚酮化合物、氨基酸和萜類(lèi)作為目的物質(zhì)時(shí)，這些目的物質(zhì)在培養(yǎng)基中合成，可以通過(guò)離心分離等手段，由從培養(yǎng)基分離菌體后的上清級(jí)分中分離物質(zhì)。為了由上清級(jí)分中分離物質(zhì)，例如，可以在上清級(jí)分中添加乙酸乙酯和甲醇等有機(jī)溶劑，充分?jǐn)嚢?。分離成水層和溶劑層，可以從溶劑層提取物質(zhì)。實(shí)施例以下，通過(guò)實(shí)施例更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明的技術(shù)范圍不限于以下實(shí)施例。在本實(shí)施例中，制作在野生型的酵母和異丙醇生產(chǎn)酵母中在削弱內(nèi)在的磷酸果糖激酶基因的同時(shí)導(dǎo)入磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶基因而得的重組酵母、和進(jìn)一步導(dǎo)入或強(qiáng)化了其他基因的重組酵母，對(duì)于乙酸、乙酸乙酯和異丙醇的生產(chǎn)性進(jìn)行研究?！膊牧虾头椒ā乘拗魇褂肊COSCompetentE.coliJM109(ニッポンジーン社制)、作為野生型酵母的釀酒酵母(S.cerevisiae)YPH499(stratagene社制)和作為異丙醇生產(chǎn)酵母的后述參考例所公開(kāi)的＃15-10株。質(zhì)粒＜pESCpgkgap-HIS的制作＞在以下條件下進(jìn)行PCR。(引物)EcoRI-Pgap-F：5’-CACGGAATTCCAGTTCGAGTTTATCATTATCAA-3’(序列號(hào)41)BamHI-Pgap-R：5’-CTCTGGATCCTTTGTTTGTTTATGTGTGTTTATTC-3’(序列號(hào)42)(PCR條件)模板：pDI626質(zhì)粒1ng(參照日本特開(kāi)2005-52046號(hào)公報(bào))引物：50pmol引物DNA,反應(yīng)液：包含1xPfuUltraIIreactionbuffer(Stratagene社制)、10nmoldNTP和1μlPfuUltraIIfusionHSDNApolymerase(Stratagene社制)的50μl溶液反應(yīng)：95℃2分鐘-(95℃30秒、55℃30秒、72℃2分鐘)×25個(gè)循環(huán)-72℃3分鐘-4℃存放在上述條件下進(jìn)行PCR后，使用QIAGEN社制的MinElutePCRpurificationkit來(lái)純化反應(yīng)液所含的PCR產(chǎn)物。然后，將PCR產(chǎn)物用限制性酶BamHI和EcoRI消化。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切下686bp的片段并使用QIAGEN社制MiniEluteGelextractionkit進(jìn)行純化。另外，與用限制性酶BamHI和EcoRI消化后的pESC-HIS載體連接。將這樣得到的質(zhì)粒命名為pESCgap-HIS。接著在以下條件下進(jìn)行PCR。(引物)MunI-Ppgk1-F：5’-TAGGCAATTGCAAGAATTACTCGTGAGTAAGG-3’(序列號(hào)43)EcoRI-Ppgk1-R：5’-ATAAGAATTCTGTTTTATATTTGTTGTAAAAAGTAG-3’(序列號(hào)44)(PCR條件)模板：pDI626PGK質(zhì)粒1ng引物：50pmol引物DNA反應(yīng)液：包含1xPfuUltraIIreactionbuffer(Stratagene社制)、10nmoldNTP和1μlPfuUltraIIfusionHSDNApolymerase(Stratagene社制)的50μl溶液反應(yīng)：95℃2分鐘-(95℃30秒、55℃30秒、72℃2分鐘)×25個(gè)循環(huán)-72℃3分鐘-4℃存放在上述條件下進(jìn)行PCR后，使用QIAGEN社制MinElutePCRpurificationkit來(lái)純化反應(yīng)液所含的PCR產(chǎn)物。然后，將PCR產(chǎn)物用限制性酶MunI和EcoRI消化。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切下718bp的片段并使用QIAGEN社制MinEluteGelextractionkit進(jìn)行純化。另外，與經(jīng)限制性酶EcoRI消化、BAP處理的pESCgap-HIS載體連接。將這樣得到的質(zhì)粒命名為pESCpgkgap-HIS。＜pESCpgkgap-LEU的制作＞將上述pESCpgkgap-HIS用限制性酶BamHI和NotI消化后，切下1427bp的片段，與同樣地用限制性酶BamHI和NotI消化后的pESC-LEU載體(Stratagene社制)連接。＜pESCpgkgap-TRP的制作＞將上述pESCpgkgap-HIS用限制性酶BamHI和NotI消化后，切下1427bp的片段，與同樣地用限制性酶BamHI和NotI消化后的pESC-TRP載體(Stratagene社制)連接。＜pESCpgkgap-URA的制作＞將上述pESCpgkgap-HIS用限制性酶BamHI和NotI消化后，切下1427bp的片段，與同樣地用限制性酶BamHI和NotI消化后的pESC-URA載體(Stratagene社制)連接。＜其他載體的制作＞在制作用于強(qiáng)化ZWF1基因和RPE1基因的表達(dá)的pESC-HIS-ZWF1-RPE1載體、用于導(dǎo)入PKT基因的pESC-Leu-PKT載體、用于導(dǎo)入PKT基因和PTA基因的pESC-Leu-PKT-PTA載體、用于強(qiáng)化ATF1基因的表達(dá)的pESC-Trp-ATF1載體、和PFK1基因以及PFK2基因破壞用載體時(shí)，在以下的組成和條件下進(jìn)行PCR。此外，DNA聚合物使用KOD-Plus-Ver.2(TOYOBO社制)。表3<組成>表4<PCR條件>94℃2分鐘→98℃10秒、Tm-5℃30秒、68℃5分鐘(×30)→68℃5分鐘將制作pESC-HIS-ZWF1-RPE1載體的流程示于圖6。將制作pESC-Leu-PKT載體和pESC-Leu-PKT-PTA載體的流程示于圖7。將制作pESC-Trp-ATF1載體的流程示于圖8。將制作PFK1基因破壞用載體的流程示于圖9。將制作PFK2基因破壞用載體的流程示于圖10。在圖6～10所示的載體制作流程中使用的引物歸納于表5。表5此外，PCR產(chǎn)物的純化使用QIAquickPCRPurificationKit(QIAGEN社制)。另外，在圖6～10所示的載體制作流程中，PCR產(chǎn)物的TOPO克隆使用ZeroBluntTOPOPCRcloningkit(invitrogen社制)。另外，pAUR135由タカラバイオ(株)購(gòu)入。在圖6～10所示的載體制作流程中，使用QIAquickGelExtractionKit(QIAGEN社制)從瓊脂糖凝膠切下DNA片段。在圖6～10所示的載體制作流程中，載體與DNA片段的連接通過(guò)利用Ligation-convenienceKit(ニッポンジーン社制)的連接反應(yīng)、或利用In-FusionDry-DownPCRCloningKit(クロンテック社制)的注入反應(yīng)來(lái)進(jìn)行。另外，在圖7所示的載體制作流程中，表述為pBSK-PKT和pBSK-PTA的載體是合成5種PKT基因和3種PTA基因并插入pBluescriptIISK(+)的SmaI位點(diǎn)而制作的。此外，這5種PKT基因和3種PTA基因全部最優(yōu)化成釀酒酵母用密碼子。5種PKT基因是來(lái)自動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)的磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶基因(序列號(hào)63和64)、來(lái)自米曲霉(Aspergillusoryzae)RIB40的磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶I基因(序列號(hào)65和66)、來(lái)自米曲霉(Aspergillusoryzae)RIB40的磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶II基因(序列號(hào)67和68)、來(lái)自點(diǎn)狀念珠藻(Nostocpunctiforme)ATCC29133的磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶基因(序列號(hào)69和70)、來(lái)自異養(yǎng)型水油海桿菌(Marinobacteraquaeolei)ATCC700491的磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶基因(序列號(hào)71和72)。另外，3種PTA基因是來(lái)自枯草芽孢桿菌枯草亞種168株(Bacillussubtilissubsp.subtilisstr.168)的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因(序列號(hào)73和74)、來(lái)自動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)AD011的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因(序列號(hào)75和76)和來(lái)自大腸桿菌(Escherichiacoli)K-12MG1655的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因(序列號(hào)77和78)。轉(zhuǎn)化大腸桿菌的轉(zhuǎn)化按照ECOSCompetentE.coliJM109(ニッポンジーン社制)所附帶的方案進(jìn)行。酵母的轉(zhuǎn)化按照Frozen-EZYeastTransformationIIKit(ザイモリサーチ社制)所附帶的方案進(jìn)行。使用PFK1基因以及PFK2基因破壞用載體的酵母的基因破壞按照pAUR135DNA(タカラバイオ社制)所附帶的方案進(jìn)行。乙酸生產(chǎn)試驗(yàn)轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)如下進(jìn)行：在SD-His，Leu瓊脂培養(yǎng)基中制作活性菌落，在裝入了15ml容量試驗(yàn)管中的2ml的SD-His，Leu培養(yǎng)基中接菌并在30℃進(jìn)行一夜培養(yǎng)(オリエンタル技研工業(yè)制IFM型，130轉(zhuǎn)/分鐘)得到前培養(yǎng)液，將前培養(yǎng)液以1％容量接種于裝入了500ml容量三角燒瓶中的100ml的SD-His，Leu培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。將培養(yǎng)液進(jìn)行離心(6000×g、15分鐘、室溫)，將其上清1ml加入玻璃制小玻璃瓶中，將其作為分析用樣品。乙酸乙酯生產(chǎn)試驗(yàn)轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)如下進(jìn)行，在SD-His，Leu，Trp瓊脂培養(yǎng)基中制作活性菌落，接種于裝入了15ml容量試驗(yàn)管中的2ml的SD-His，Leu，Trp培養(yǎng)基并在30℃進(jìn)行一夜培養(yǎng)(130轉(zhuǎn)/分鐘)得到前培養(yǎng)液，將前培養(yǎng)液以1％容量接種于裝入了500ml容量三角燒瓶中的100ml的SD-His，Leu，Trp培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)液進(jìn)行離心(6000×g、15分鐘、室溫)，將其上清1ml裝入玻璃制小玻璃瓶中，將其作為分析用樣品。異丙醇生產(chǎn)試驗(yàn)轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)如下進(jìn)行：在SD-His，Leu，Ura，Trp瓊脂培養(yǎng)基中制作活性菌落，接種于裝入了15ml容量試驗(yàn)管中的2ml的SD-His，Leu，Ura，Trp培養(yǎng)基中并在30℃進(jìn)行一夜培養(yǎng)(130轉(zhuǎn)/分鐘)得到前培養(yǎng)液，將前培養(yǎng)液以1％容量接種于裝入了500ml容量三角燒瓶中的50ml的SD-His，Leu，Ura，Trp培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。將培養(yǎng)液進(jìn)行離心(6000×g、15分鐘、室溫)，將其上清1ml裝入玻璃制小玻璃瓶中，將其作為分析用樣品。GC分析條件標(biāo)準(zhǔn)品使用乙酸(ナカライテスク社制)、乙酸乙酯(ナカライテスク社制)、異丙醇(ナカライテスク社制)。分析儀器、分析條件對(duì)于全部乙酸生產(chǎn)試驗(yàn)、乙酸乙酯生產(chǎn)試驗(yàn)和異丙醇生產(chǎn)試驗(yàn)為以下條件。表6利用CE-TOFMS的酵母的代謝組分析＜前處理＞在SD-His，Leu，Ura，Trp培養(yǎng)基中進(jìn)行菌體的培養(yǎng)(30℃)，加樣使得樣品量為15OD單位。將其通過(guò)過(guò)濾迅速抽濾。接著用Milli-Q水10mL抽濾、洗滌2次。將在過(guò)濾器上被集菌的酵母菌體浸漬于含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)5μM的甲醇2mL中，然后將1.6mL移至沉降管。在其中加入1600μL的氯仿和640μL的Milli-Q水進(jìn)行攪拌，進(jìn)行離心分離(2,300×g、4℃、5分鐘)。離心分離后，移取水相至6根250μL超濾管(MILLIPORE社制、ウルトラフリーMCUFC3LCC離心式過(guò)濾器元件5KDa)中。將其離心(9,100×g、4℃、120分鐘)，進(jìn)行超濾處理。使濾液干固，再溶解于50μL的Milli-Q水中供測(cè)定。＜測(cè)定＞本試驗(yàn)中陰離子性代謝物質(zhì)(陰離子模式)的測(cè)定在以下所示的條件(參照參考文獻(xiàn)1)～3))下進(jìn)行。裝置：AgilentCE-TOFMSsystem(AgilentTechnologies社)Capillary:Fusedsilicacapillaryi.d.50μm×80cm測(cè)定條件：Runbuffer:AnionBufferSolution(p/n:H3302-1021)Rinsebuffer:AnionBufferSolution(p/n:H3302-1022)Sampleinjection:Pressureinjection50mbar,25secCEvoltage:Positive,30kVMSionization:ESINegativeMScapillaryvoltage:3,500VMSscanrange:m/z50-1,000Sheathliquid:HMTSheathLiquid(p/n:H3301-1020)＜參考文獻(xiàn)、資料＞1)T.Soga,D.N.Heiger:Aminoacidanalysisbycapillaryelectrophoresiselectrosprayionizationmassspectrometry.Anal.Chem.72:1236-1241,2000.2)T.Soga,Y.Ueno,H.Naraoka,Y.Ohashi,M.Tomitaetal.:Simultaneousdeterminationofanionicintermediatesfor枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)metabolicpathwaysbycapillaryelectrophoresiselectrosprayionizationmassspectrometry.Anal.Chem.74:2233-2239,2002.3)T.Soga,Y.Ohashi,Y.Ueno,H.Naraoka,M.Tomitaetal.:Quantitativemetabolomeanalysisusingcapillaryelectrophoresismassspectrometry.J.ProteomeRes.2:488-494,2003.4)http://vanted.ipk-gatersleben.de/〔結(jié)果〕乙酸生產(chǎn)試驗(yàn)供乙酸生產(chǎn)試驗(yàn)的酵母歸納于表7，試驗(yàn)結(jié)果示于圖11。表7表中，PKT(1)是來(lái)自動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)的磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶基因，PKT(2)是來(lái)自米曲霉(Aspergillusoryzae)RIB40的磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶I基因，PKT(3)是來(lái)自米曲霉(Aspergillusoryzae)RIB40的磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶II基因，PKT(4)是來(lái)自點(diǎn)狀念珠藻(Nostocpunctiforme)ATCC29133的磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶基因，PKT(5)是來(lái)自異養(yǎng)型水油海桿菌(Marinobacteraquaeolei)ATCC700491的磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶基因。由圖11所示的結(jié)果可明確，通過(guò)在削弱成為宿主的酵母中內(nèi)在的磷酸果糖激酶基因的同時(shí)導(dǎo)入磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶基因，提高向不是糖酵解系統(tǒng)而是戊糖磷酸系統(tǒng)(圖2)的流量，能夠高生產(chǎn)乙酸。另外，作為磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶基因，來(lái)自雙歧桿菌的基因、特別是來(lái)自動(dòng)物雙歧桿菌(Bifidobacteriumanimalis)的基因在乙酸的生產(chǎn)性方面優(yōu)異。由該結(jié)果可明確，作為磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶基因，在圖3所示的系統(tǒng)樹(shù)中位于虛線框內(nèi)的磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶基因在乙酸生產(chǎn)性的方面更優(yōu)選。進(jìn)而，由圖11所示的結(jié)果可明確，在為了削弱向糖酵解系統(tǒng)的流量而削弱磷酸果糖激酶基因的情況下，優(yōu)選破壞PFK1基因和PFK2基因兩者。此外，明確了可以通過(guò)強(qiáng)化參與戊糖磷酸系統(tǒng)(圖2)的酶基因，從而進(jìn)一步提高向戊糖磷酸系統(tǒng)(圖2)的流量，從而更高生產(chǎn)乙酸。乙酸乙酯生產(chǎn)試驗(yàn)供乙酸乙酯生產(chǎn)試驗(yàn)的酵母歸納于表8，試驗(yàn)結(jié)果示于圖12。表8表中，PTA(1)是來(lái)自枯草芽孢桿菌枯草亞種168株(Bacillussubtilissubsp.subtilisstr.168)的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因，PTA(2)是來(lái)自動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)AD011的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因，PTA(3)是來(lái)自大腸桿菌(Escherichiacoli)K-12MG1655的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因。此外，在本試驗(yàn)中，PKT基因使用來(lái)自動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)的磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶基因。如圖12所示，在野生株(YPH499株)中導(dǎo)入了ATF1基因的對(duì)照株中，與野生株相比乙酸乙酯的生產(chǎn)性也提高。但是，判明了通過(guò)在削弱成為宿主的酵母中內(nèi)在的磷酸果糖激酶基因的同時(shí)導(dǎo)入磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶基因，進(jìn)一步導(dǎo)入磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因(PTA基因)或強(qiáng)化乙酰輔酶A合成酶基因(ACS基因)，與對(duì)照相比乙酸乙酯的生產(chǎn)性進(jìn)一步提高。由該結(jié)果和圖4所示的概略代謝圖譜顯示，通過(guò)在削弱內(nèi)在的磷酸果糖激酶基因的同時(shí)導(dǎo)入磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶基因，進(jìn)一步導(dǎo)入磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因(PTA基因)或強(qiáng)化乙酰輔酶A合成酶基因(ACS基因)，乙酰輔酶A的合成量顯著提高。并且顯示，合成的乙酰輔酶A通過(guò)ATF1酶而作為乙酸乙酯在菌體外高蓄積。特別是，判明了作為導(dǎo)入的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因，來(lái)自枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的基因從乙酰輔酶A生產(chǎn)性的觀點(diǎn)出發(fā)是優(yōu)選的。另外，判明了強(qiáng)化的乙酰輔酶A合成酶基因，在ACS1基因和ACS2基因中，更優(yōu)選ACS1基因。進(jìn)而，由圖12所示的結(jié)果可知，在為了減弱向糖酵解系統(tǒng)的流量而削弱磷酸果糖激酶基因的情況下，優(yōu)選破壞PFK1基因和PFK2基因兩者。此外，明確了通過(guò)強(qiáng)化參與戊糖磷酸系統(tǒng)(圖2)的酶基因，可以進(jìn)一步提高向戊糖磷酸系統(tǒng)(圖2)的流量，從而更高生產(chǎn)乙酸乙酯。異丙醇生產(chǎn)試驗(yàn)供異丙醇生產(chǎn)試驗(yàn)的酵母歸納于表9，試驗(yàn)結(jié)果示于圖13。表9表中，PTA(1)～(3)表示與表8相同的基因。如圖13所示，判明了通過(guò)在野生株(YPH499株)中導(dǎo)入ctfA基因、ctfB基因、adc基因和ipdh基因，可以賦予酵母以異丙醇生產(chǎn)能力。并且判明了，通過(guò)在削弱內(nèi)在的磷酸果糖激酶基因的同時(shí)導(dǎo)入磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶基因，進(jìn)一步導(dǎo)入磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因(PTA基因)或強(qiáng)化乙酰輔酶A合成酶基因(ACS基因)，與對(duì)照相比異丙醇的生產(chǎn)性顯著提高。由該結(jié)果和圖4所示的概略代謝圖譜顯示，通過(guò)在削弱內(nèi)在的磷酸果糖激酶基因的同時(shí)導(dǎo)入磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶基因，進(jìn)一步導(dǎo)入磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因(PTA基因)或強(qiáng)化乙酰輔酶A合成酶基因(ACS基因)，乙酰輔酶A的合成量顯著提高。并且顯示，合成的乙酰輔酶A通過(guò)ctfA、ctfB、adc和ipdh而作為異丙醇在菌體外高蓄積。特別是判明了作為導(dǎo)入的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因，來(lái)自枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的基因從乙酰輔酶A生產(chǎn)性的觀點(diǎn)出發(fā)是優(yōu)選的。另外明確了，強(qiáng)化的乙酰輔酶A合成酶基因在ACS1基因和ACS2基因中更優(yōu)選ACS1基因。利用CE-TOFMS的酵母的代謝組分析對(duì)于在削弱野生型(YPH499株)、YPH499株中內(nèi)在的磷酸果糖激酶基因的同時(shí)強(qiáng)化了參與戊糖磷酸系統(tǒng)(圖2)的酶基因的株(表述為YPH499ΔPFKα/ZWF-RPE)、和在削弱YPH499株中內(nèi)在的磷酸果糖激酶基因的同時(shí)強(qiáng)化了參與戊糖磷酸系統(tǒng)(圖2)的酶基因、并導(dǎo)入了磷酸轉(zhuǎn)酮醇酶基因和磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因的株(表述為YPH499ΔPFKα/ZWF-RPE,PKT-PTA)，將代謝組分析的結(jié)果示于圖14。圖14中，關(guān)于YPH499株(野生株)的乙酰輔酶A量，是介由乙醇的乙酰輔酶A合成途徑和線粒體內(nèi)的乙酰輔酶A合成途徑的和。此外，酵母中乙酰輔酶A合成途徑存在上述介由乙醇的乙酰輔酶A合成途徑和線粒體內(nèi)的乙酰輔酶A合成途徑2種途徑。另一方面，在YPH499ΔPFKα/ZWF-RPE株中，介由乙醇的乙酰輔酶A合成途徑不發(fā)揮作用。這是因?yàn)?，由于ZWF而NADP被消耗，其結(jié)果造成催化由醛向乙酸的反應(yīng)的ALD2不發(fā)揮作用(參照乙酸生產(chǎn)試驗(yàn)(圖11)的對(duì)照株中的乙酸生產(chǎn)性)。因此，YPH499ΔPFKα/ZWF-RPE株中的乙酰輔酶A合成量的值對(duì)應(yīng)于線粒體內(nèi)的乙酰輔酶A合成途徑中生成的乙酰輔酶A量。此外，線粒體內(nèi)合成的乙酰輔酶A在線粒體內(nèi)被消耗，因而不能作為乙酸乙酯、異丙醇等物質(zhì)的原料使用。因此，如果不能在酵母細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中提高乙酰輔酶A的合成量，則不能提高使用合成的乙酰輔酶A的物質(zhì)的合成量。而且，YPH499ΔPFKα/ZWF-RPE,PKT-PTA株是通過(guò)在YPH499ΔPFKα/ZWF-RPE株中導(dǎo)入PKT基因和PTA基因而構(gòu)建了新的乙酰輔酶A合成途徑(參照?qǐng)D2和4)的突變株。因此，通過(guò)從YPH499ΔPFKα/ZWF-RPE,PKT-PTA株中的乙酰輔酶A合成量減去YPH499ΔPFKα/ZWF-RPE株中的乙酰輔酶A合成量，可以評(píng)價(jià)利用上述的新的乙酰輔酶A合成途徑的乙酰輔酶A的合成量。詳細(xì)地，由圖14所示的結(jié)果而得到了以下結(jié)論：通過(guò)新的乙酰輔酶A合成途徑，可以合成相當(dāng)于62-14=48pmol的乙酰輔酶A?！矃⒖祭吃诒緟⒖祭?，對(duì)于上述的實(shí)施例中使用的異丙醇生產(chǎn)酵母(＃15-10)的制作進(jìn)行說(shuō)明。異丙醇合成基因的取得將以下的4個(gè)基因由作為梭菌的丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)ATCC824株的基因組克隆到pT7Blue載體中。adc(乙酰乙酸脫羧酶，Acetoacetatedecarboxylase)ctfA(丁酸-乙酰乙酸輔酶A-轉(zhuǎn)移酶亞基A，Butyrate-acetoacetateCoA-transferasesubunitA)ctfB(丁酸-乙酰乙酸輔酶A-轉(zhuǎn)移酶亞基B，Butyrate-acetoacetateCoA-transferasesubunitB)thiA(乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶，Acetyl-CoAacetyltransferase)pT7Blue-ADC的制作在以下的條件下進(jìn)行PCR。引物adc-F：5’-ATGTTAAAGGATGAAGTAATTAAACAAATTAG-3’(序列號(hào)79)adc-R：5’-TTACTTAAGATAATCATATATAACTTCAGCTC-3’(序列號(hào)80)反應(yīng)條件模板：0.4μg的梭菌的基因組DNA引物：50pmol引物DNA,反應(yīng)液：包含1xPfuUltraIIreactionbuffer(Stratagene社制)、10nmoldNTP、1μlPfuUltraIIfusionHSDNApolymerase(Stratagene社制)的50μl溶液反應(yīng)：95℃5分鐘-(95℃30秒、60℃30秒、72℃2分鐘)×30個(gè)循環(huán)-72℃3分鐘-4℃存放將擴(kuò)增的735bp的片段使用Novagen社制PerfectlyBluntCloningKit平端克隆pT7Blue載體中。對(duì)克隆的序列進(jìn)行測(cè)序，確認(rèn)了是丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)ATCC824株的adc序列(CA-P0165)。將這樣得到的質(zhì)粒命名為pT7Blue-ADC。pT7Blue-CTFA的制作在以下的條件下進(jìn)行PCR。引物ctfA-F：5’-ATGAACTCTAAAATAATTAGATTTGAAAATTTAAGG-3’(序列號(hào)81)ctfA-R：5’-TTATGCAGGCTCCTTTACTATATAATTTA-3’(序列號(hào)82)反應(yīng)條件模板：0.4μg的梭菌的基因組DNA引物：50pmol引物DNA,反應(yīng)液：包含1xPfuUltraIIreactionbuffer(Stratagene社制)、10nmoldNTP、1μlPfuUltraIIfusionHSDNApolymerase(Stratagene社制)的50μl溶液反應(yīng)：95℃5分鐘-(95℃30秒、60℃30秒、72℃2分鐘)×30個(gè)循環(huán)-72℃3分鐘-4℃存放將擴(kuò)增的657bp的片段使用Novagen社制PerfectlyBluntCloningKit同樣地進(jìn)行克隆。對(duì)克隆的序列進(jìn)行測(cè)序，確認(rèn)了是丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)ATCC824株的ctfA序列(CA-P0163)。將這樣得到的質(zhì)粒命名為pT7Blue-CTFA。pT7Blue-CTFB的制作在以下的條件下進(jìn)行PCR。引物ctfB-F：5’-ATGATTAATGATAAAAACCTAGCGAAAG-3’(序列號(hào)83)ctfB-R：5’-CTAAACAGCCATGGGTCTAAGTTC-3’(序列號(hào)84)反應(yīng)條件模板：0.4μg的梭菌的基因組DNA引物：50pmol引物DNA反應(yīng)液：包含1xPfuUltraIIreactionbuffer(Stratagene社制)、10nmoldNTP、1μlPfuUltraIIfusionHSDNApolymerase(Stratagene社制)的50μl溶液反應(yīng)：95℃5分鐘-(95℃30秒、60℃30秒、72℃2分鐘)×30個(gè)循環(huán)-72℃3分鐘-4℃存放將擴(kuò)增的666bp的片段使用Novagen社制PerfectlyBluntCloningKit進(jìn)行克隆。對(duì)克隆的序列進(jìn)行測(cè)序，確認(rèn)了是丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)ATCC824株的ctfB序列(CA-P0164)。將這樣得到的質(zhì)粒命名為pT7Blue-CTFB。pDI626PGKpro的制作在以下的條件下進(jìn)行PCR。引物SacI-Ppgk1FW：5’-TAGGGAGCTCCAAGAATTACTCGTGAGTAAGG-3’(序列號(hào)85)SacII-Ppgk1RV：5’-ATAACCGCGGTGTTTTATATTTGTTGTAAAAAGTAG-3’(序列號(hào)86)反應(yīng)條件模板：0.4μg的酵母YPH499的基因組DNA引物：50pmol引物DNA,反應(yīng)液：包含1xPfuUltraIIreactionbuffer(Stratagene社制)、10nmoldNTP、1μlPfuUltraIIfusionHSDNApolymerase(Stratagene社制)的50μl溶液反應(yīng)：95℃5分鐘-(95℃30秒、55℃30秒、72℃2分鐘)×25個(gè)循環(huán)-72℃3分鐘-4℃存放將反應(yīng)液使用QIAGEN社制MinElutePCRpurificationkit進(jìn)行純化后，用限制性酶SacI和SacII消化。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切下712bp的片段并使用QIAGEN社制MinEluteGelextractionkit進(jìn)行純化。與同樣地用限制性酶SacI和SacII消化后的pDI626GAP((APP.Env.Micro.,2009,5536))載體連接。對(duì)所得的序列進(jìn)行測(cè)序，確認(rèn)制作了目的質(zhì)粒。將這樣得到的質(zhì)粒命名為pDI626PGKpro。pDI626PGK的制作在以下的條件下進(jìn)行PCR。引物SalI-Tpgk1FW：5’-TTAAGTCGACATTGAATTGAATTGAAATCGATAGATC-3’(序列號(hào)87)KpnI-Tpgk1RV2：5’-TTAAGGTACCGCTTCAAGCTTACACAACAC-3’(序列號(hào)88)反應(yīng)條件模板：0.4μg的酵母YPH499的基因組DNA引物：50pmol引物DNA,反應(yīng)液：包含1xPfuUltraIIreactionbuffer(Stratagene社制)、10nmoldNTP、1μlPfuUltraIIfusionHSDNApolymerase(Stratagene社制)的50μl溶液反應(yīng)：95℃5分鐘-(95℃30秒、55℃30秒、72℃2分鐘)×25個(gè)循環(huán)-72℃3分鐘-4℃存放將反應(yīng)液使用QIAGEN社制MinElutePCRpurificationkit純化后，用限制性酶SalI和KpnI消化。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切下330bp的片段并使用QIAGEN社制MinEluteGelextractionkit進(jìn)行純化。與用限制性酶SalI和KpnI消化后的pDI626PGKpro載體連接。對(duì)所得的序列進(jìn)行測(cè)序，確認(rèn)制作了目的質(zhì)粒。將這樣得到的質(zhì)粒命名為pDI626PGK。pDI626PGK-T的制作將pDI626PGK用限制性酶SbfI消化，將反應(yīng)液使用QIAGEN社制MinElutePCRpurificationkit進(jìn)行純化。然后，使用TaKaRaBIO社制Bluntingkit將末端平滑化，進(jìn)而用限制性酶KpnI消化。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切下3650bp的片段并使用QIAGEN社制MinEluteGelextractionkit進(jìn)行純化。將此作為用于連接的載體。接著將pRS524GAP(APP.Env.Micro.,2009,5536)用限制性酶PmaCI和KpnI消化。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切下765bp的片段并使用QIAGEN社制MinEluteGelextractionkit進(jìn)行純化作為插入片段。進(jìn)行它們的連接，對(duì)所得序列的連接點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序，確認(rèn)制作了目的質(zhì)粒。將這樣得到的質(zhì)粒命名為pDI626PGK-T。pCR2.1-iPDH的制作以登錄于GenBank(http://www.neb.nih.gov/Genbank/index.html)的來(lái)自拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)NRRLB593的adh：NADP-dependentalcoholdehydrogenase(NADP-依賴(lài)的醇脫氫酶)基因序列為基礎(chǔ)合成最適合釀酒酵母的密碼子的DNA序列(Operon社)。載體部分是pCR2.1(Invitrogen社制)。此外，將合成的DNA序列示于序列號(hào)89，將由合成的DNA序列所含的編碼區(qū)所編碼的氨基酸序列示于序列號(hào)90。將該質(zhì)粒命名為pCR2.1-iPDH。pDI626PGK-T-iPDH的制作將pCR2.1-iPDH用限制性酶SacII和SalI消化，切下1080bp的片段，與同樣地用限制性酶SacII和SalI消化后的pDI626PGK-T載體連接。對(duì)所得的序列進(jìn)行測(cè)序，確認(rèn)制作了目的質(zhì)粒。將這樣得到的質(zhì)粒命名為pDI626PGK-T-iPDH。pENT-ADC的制作以pDI626-ADC為模板，用以下的引物進(jìn)行PCR。引物08-189-adc-attB1-Fw：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCAGTTCGAGTTTATCATTATC-3’(序列號(hào)91)08-189-adc-attB4-Rv：5’-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGGTGGGCCGCAAATTAAAGCCTTC-3’(序列號(hào)92)將所得的1809bp的PCR產(chǎn)物通過(guò)gatewayBP反應(yīng)導(dǎo)入供體載體pDONR221P1-P4。進(jìn)行所得的克隆的測(cè)序，確認(rèn)了插入片段的全堿基序列中沒(méi)有突變位點(diǎn)。將這樣得到的質(zhì)粒命名為pENT-ADC。pENT-CTFA的制作以pDI626PGK-CTFA為模板，使用以下的引物進(jìn)行PCR。08-189-ctfA-attB4r-Fw：5’-GGGGACAACTTTTCTATACAAAGTTGGCTTCAAGCTTACACAACACGG-3’(序列號(hào)93)08-189-ctfA-attB3r-Rv：5’-GGGGACAACTTTATTATACAAAGTTGTCAAGAATTACTCGTGAGTAAGG-3’(序列號(hào)94)將所得的1823bp的PCR產(chǎn)物通過(guò)gatewayBP反應(yīng)導(dǎo)入供體載體pDONR221P4r-P3r中。進(jìn)行所得的克隆的測(cè)序，確認(rèn)了在插入片段的全堿基序列中沒(méi)有突變位點(diǎn)。將這樣得到的質(zhì)粒命名為pENT-CTFA。pDI626-CTFB的制作將pT7Blue-CTFB用限制性酶BamHI和SalI消化，切下771bp的片段，與同樣地用限制性酶BamHI和SalI消化的pDI626載體連接。對(duì)所得的序列進(jìn)行測(cè)序，確認(rèn)制作了目的質(zhì)粒。將這樣得到的質(zhì)粒命名為pDI626-CTFB(+A)。為了修正引物中的突變位點(diǎn)，使用以下的引物在以下的條件下進(jìn)行PCR。BamHI-ctfB-F：5’-TAGTGGATCCGATGATTAATGATAAAAACC-3’(序列號(hào)95)pDI626MCS-seqF：5’-CCTAGACTTCAGGTTGTCTAAC-3’(序列號(hào)96)反應(yīng)條件模板：1ng的pDI626-CTFB(+A)引物：50pmol引物DNA反應(yīng)液：包含1xPfuUltraIIreactionbuffer(Stratagene社制)、10nmoldNTP、1μlPfuUltraIIfusionHSDNApolymerase(Stratagene社制)的50μl溶液反應(yīng)：95℃2分鐘-(95℃30秒、55℃30秒、72℃1分鐘)×20個(gè)循環(huán)-72℃3分鐘-4℃存放將反應(yīng)液使用QIAGEN社制MinElutePCRpurificationkit純化后，用限制性酶BamHI和SalI消化。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切下702bp的片段并使用QIAGEN社制MinEluteGelextractionkit進(jìn)行純化。與用限制性酶BamHI和SalI消化后的pDI626載體連接。對(duì)所得的序列進(jìn)行測(cè)序，確認(rèn)了突變位點(diǎn)被修正。將這樣得到的質(zhì)粒命名為pDI626-CTFB。pENT-CTFB的制作以pDI626-CTFB為模板，使用以下的引物進(jìn)行PCR。08-189-ctfB-attB3-Fw：5’-GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGGGCCGCAAATTAAAGCCTTC-3’(序列號(hào)97)08-189-ctfB-attB2-Rv：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTACAGTTCGAGTTTATCATTATC-3’(序列號(hào)98)將所得的1737bp的PCR產(chǎn)物通過(guò)gatewayBP反應(yīng)導(dǎo)入供體載體pDONR221P3-P2中。進(jìn)行所得的克隆的測(cè)序，確認(rèn)了在插入片段的全堿基序列中沒(méi)有突變位點(diǎn)。將這樣得到的質(zhì)粒命名為pENT-CTFB。pDEST626(2008)的制作在以下的條件下進(jìn)行PCR。引物SacI-convA-F：5’-TAGGGAGCTCATCACAAGTTTGTACAAAAAAGCTG-3’(序列號(hào)99)KpnI-convA-R：5’-TTAAGGTACCATCACCACTTTGTACAAGAAAGC-3’(序列號(hào)100)反應(yīng)條件模板：0.5ng的RfA(Invitrogen社制；Gateway載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的閱讀框盒A)引物：50pmol引物DNA反應(yīng)液：包含1xPfuUltraIIreactionbuffer(Stratagene社制)、10nmoldNTP、1μlPfuUltraIIfusionHSDNApolymerase(Stratagene)的50μl溶液反應(yīng)：95℃2分鐘-(95℃30秒、55℃30秒、72℃1分30秒)×20個(gè)循環(huán)-72℃3分鐘-4℃存放將反應(yīng)液使用QIAGEN社制MinElutePCRpurificationkit純化后，用限制性酶SacI和KpnI消化。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切下1717bp的片段并使用QIAGEN社制MinEluteGelextractionkit純化后，與用限制性酶SacI和KpnI消化后的pDI626GAP載體(APP.Env.Micro.,2009,5536)連接。對(duì)所得的序列進(jìn)行測(cè)序，確認(rèn)制作了目的質(zhì)粒。pEXP(Ura)-ADC-CTFA-CTFB的制作將所得的3個(gè)入門(mén)克隆(pENT-ADC、pENT-CTFA、pENT-CTFB)通過(guò)GatewayLR反應(yīng)插入表達(dá)載體pDEST626(2008)中。對(duì)于所得的克隆通過(guò)PCR確認(rèn)插入片段大小，確認(rèn)了正確地進(jìn)行了重組。進(jìn)行測(cè)序，確認(rèn)了序列中無(wú)錯(cuò)誤。將這樣得到的質(zhì)粒命名為pEXP(Ura)-ADC-CTFA-CTFB。#3-17株的制作將表達(dá)載體pEXP(Ura)-ADC-CTFA-CTFB用限制性酶AatII、BssHII切割、線性化，乙醇沉淀后溶解于0.1×TE緩沖液中，使用FrozenEZyeasttransformationkit(Zymoresearch社制)轉(zhuǎn)化釀酒酵母YPH499(Stratagene社制)。將所得的克隆進(jìn)行菌落PCR，在25個(gè)克隆中確認(rèn)導(dǎo)入了adc、ctfA、ctfB基因。將丙酮生產(chǎn)量最多的株命名為＃3-17。＃15-10株的制作將作為期待由丙酮向異丙醇轉(zhuǎn)換的合成基因的ipdh基因的表達(dá)載體pDI626PGK-T-iPDH用限制性酶AatII和BssHII切割、線性化，乙醇沉淀后溶解于0.1×TE緩沖液中，使用FrozenEZyeasttransformationkit(Zymoresearch社制)轉(zhuǎn)化丙酮生產(chǎn)酵母＃3-17。將所得的14個(gè)克隆進(jìn)行菌落PCR，在13克隆中確認(rèn)了導(dǎo)入了ipdh基因。將異丙醇生產(chǎn)量最多的株命名為＃15-10。