一種表面富含鎳離子的核殼式磁性復(fù)合微球的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明為一種可用于分離組氨酸蛋白的核殼式磁性復(fù)合微球的制備方法及應(yīng)用。核殼式磁性復(fù)合微球的核為磁性四氧化三鐵納米粒子團(tuán)簇，殼為交聯(lián)的富含咪唑基團(tuán)的聚合物網(wǎng)絡(luò)，咪唑基團(tuán)和鎳離子螯合使微球表面固定上大量的鎳離子，通過(guò)固定的鎳離子與組氨酸中咪唑基團(tuán)的相互作用在中性條件快速分離天然組氨酸蛋白或含六個(gè)組氨酸標(biāo)記的重組蛋白。首先制備檸檬酸鈉穩(wěn)定的磁性納米粒子團(tuán)簇，接著采用溶膠凝膠法，使磁簇表面修飾上活性的乙烯基官能團(tuán)，然后通過(guò)回流沉淀聚合制備得到高磁響應(yīng)性單分散的表面富含咪唑基團(tuán)的核殼式磁性聚合物復(fù)合微球，再通過(guò)富電子的咪唑去絡(luò)合缺電子的鎳離子，最后進(jìn)行組氨酸蛋白的富集或去除。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單，過(guò)程可控，分離純化組氨酸蛋白的效率高，且可實(shí)現(xiàn)多次循環(huán)使用，應(yīng)用前景良好。
【專利說(shuō)明】一種表面富含鎳離子的核殼式磁性復(fù)合微球的制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于納米功能材料【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種表面富含鎳離子的核殼式磁性復(fù)合微球的制備方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)，有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化復(fù)合微球，尤其是磁性復(fù)合微球正受到人們的廣泛關(guān)注。由于磁性高分子微球同時(shí)具有有機(jī)高分子的表面可修飾性和無(wú)機(jī)磁性材料的磁響應(yīng)性，可以在外加磁場(chǎng)下方便、快速、高效的分離目標(biāo)生物分子。因此，在蛋白分離純化、細(xì)胞分離、磁共振成像和磁靶向載藥等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0003]目前，通過(guò)乳液聚合方法可以制備出不同結(jié)構(gòu)的磁性聚合物復(fù)合微球。但是乳液聚合對(duì)于結(jié)構(gòu)以及磁含量的控制相對(duì)較差，且對(duì)單體選擇性高。要獲得結(jié)構(gòu)較好、磁含量可控的復(fù)合微球，通常需要借助過(guò)渡層(如二氧化硅)，但是包覆中間的二氧化硅層會(huì)降低整個(gè)微球的磁飽和強(qiáng)度。另外由于乳液聚合大多采用過(guò)硫酸鉀等帶電水溶性引發(fā)劑，反應(yīng)結(jié)束后往往使微球帶上相應(yīng)的電荷，會(huì)一定程度上影響后續(xù)的應(yīng)用。并且該方法常常需要共聚疏水性單體，這會(huì)使得表面官能團(tuán)密度下降。為了解決這一問(wèn)題，回流沉淀聚合可以不用借助過(guò)渡層，直接在磁性納米粒子表面包覆聚合物殼層，可以用不帶電的油溶性引發(fā)劑，并且無(wú)需共聚其他單體，表面官能團(tuán)密度較大。該方法簡(jiǎn)便易行，成本低廉，開(kāi)發(fā)利用回流沉淀法直接包覆聚合物殼層是十分必要的。 [0004]磁性載體固定金屬離子親和色譜分離法是從生物混合體系中分離出高純度的目標(biāo)生物分子的方法，它將親和配基偶聯(lián)在磁性分離載體表面，在磁場(chǎng)定向控制下，通過(guò)親和吸附、清洗和解吸等操作步驟，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的分離純化。磁性載體固定金屬離子親和色譜分離法具有分離速度快、選擇性好、載體不易污染、回收率高等顯著優(yōu)勢(shì)，在生物產(chǎn)品大規(guī)模分離純化方面具有重要的發(fā)展?jié)摿Α＝瓿Ｓ脕?lái)富集組氨酸蛋白的金屬離子是鎳離子或者銅離子，而用來(lái)固定這些離子的配體通常是氨三乙酸或者亞氨基二乙酸，但作為配體前者價(jià)格較為昂貴，而后者效果相比前者絡(luò)合鎳離子的能力較差，開(kāi)發(fā)一種新型的效果較好且成本低廉的配體用于固定金屬離子是很有必要的。這里我們用乙烯基咪唑作為單體，通過(guò)回流沉淀制備表面富含咪唑基團(tuán)的殼層，然后通過(guò)咪唑基團(tuán)作為配體來(lái)絡(luò)合鎳離子。相比以前的后修飾上配體而言，該方法能將一整個(gè)殼層的配體直接包覆于磁簇上再螯合鎳離子，官能團(tuán)密度大大增加，可實(shí)現(xiàn)高選擇性地分離純化組氨酸蛋白。
[0005]組氨酸蛋白最常見(jiàn)的是血液中的血紅蛋白和血清蛋白，這兩種高豐度蛋白在動(dòng)物體內(nèi)大量存在。而目前很多癌癥的生物標(biāo)志物都是低豐度蛋白，由于大量高豐度蛋白的存在，這些低豐度的蛋白信號(hào)常常會(huì)被掩蓋，所以先把高豐度蛋白去除有利于低豐度蛋白的分析和檢測(cè)。該類微球能高效去除高豐度蛋白，意義重大。6個(gè)組氨酸標(biāo)記的蛋白是目前最為常見(jiàn)的重組蛋白之一，這些蛋白通常是有功能性的，比如重組纖維素酶，對(duì)纖維素水解意義重大，而這些蛋白在自然界中含量極微，要獲得相對(duì)大量的蛋白必須通過(guò)大腸桿菌等表達(dá)，但是表達(dá)出來(lái)的蛋白需要從復(fù)雜的體系中純化出來(lái)，就需要某種材料來(lái)達(dá)成這個(gè)富集分離的目標(biāo)，所以開(kāi)發(fā)這樣一種新型的表面富含鎳離子的核殼結(jié)構(gòu)微球?qū)τ诟哓S度組氨酸蛋白的去除和低豐度組氨酸標(biāo)記蛋白的富集分離都有著巨大的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提出一種制備時(shí)間短，過(guò)程簡(jiǎn)單高效，磁含量高，能大量特異性富集組氨酸蛋白的富含鎳離子的核殼式磁性復(fù)合微球的制備方法及其應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明針對(duì)【背景技術(shù)】中所存在的問(wèn)題，提出了無(wú)需過(guò)渡層直接制備以磁簇為核，聚乙烯基咪唑?yàn)闅拥暮藲な酱判詮?fù)合微球的制備方法，并進(jìn)一步進(jìn)行鎳離子的絡(luò)合，由于鎳離子和組氨酸中的咪唑基團(tuán)有很強(qiáng)的配位絡(luò)合作用，且表面純凈無(wú)雜質(zhì)，都是鎳離子，所以能高效循環(huán)的富集組氨酸蛋白。本發(fā)明提出的富含鎳離子的核殼式磁性復(fù)合微球的制備方法，具體步驟為:
1、首先，以六水合三氯化鐵、醋酸鹽和檸檬酸鹽為原料制備檸檬酸鈉穩(wěn)定的磁性納米粒子團(tuán)簇(簡(jiǎn)稱磁簇);
2、接著，使用溶膠凝膠法對(duì)磁簇表面進(jìn)行修飾，使其表面帶上活性的乙烯基官能團(tuán)；
3、然后，以表面含有乙烯基的磁簇為種子，通過(guò)回流沉淀聚合的方法在磁簇表面包覆一層致密的含咪唑基團(tuán)的聚合物交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，得到以磁簇為核、含咪唑基團(tuán)的聚合物網(wǎng)絡(luò)為殼的磁性聚合物復(fù)合微球；
4、再利用六水合氯化鎳與前述表面富含咪唑基團(tuán)的核殼式復(fù)合微球進(jìn)行鎳離子的絡(luò)合，使其表面具有大量鎳離子；
5、最后用該表面富含鎳離子的磁性微球，進(jìn)行富集分離組氨酸蛋白的實(shí)驗(yàn)。
[0008]本發(fā)明提出的富含鎳離子的核殼式磁性復(fù)合微球的制備方法，所述核殼式磁性復(fù)合微球的核為磁性四氧化三鐵納米粒子團(tuán)簇，殼為交聯(lián)的富含咪唑基團(tuán)的聚合物網(wǎng)絡(luò)，鎳離子和咪唑基團(tuán)絡(luò)合反應(yīng)進(jìn)行表面修飾，通過(guò)表面固定的大量鎳離子可以快速分離組氨酸蛋白；具體步驟如下:
(1)將I~30g六水合三氯化鐵、r60g醋酸鹽和0.1~20g檸檬酸鹽溶解在2(T500mL乙二醇中，在10(T20(TC下機(jī)械攪拌0.5飛h，然后置于含有聚四氟乙烯內(nèi)襯的不銹鋼高壓反應(yīng)釜中，將該釜放置于10(T30(TC的烘箱中反應(yīng)l(T50h，取出，用自來(lái)水使其冷卻至室溫；用磁鐵分離出產(chǎn)物磁簇，并用無(wú)水乙醇洗滌除去未反應(yīng)的反應(yīng)物，最后將產(chǎn)物磁簇分散在無(wú)水乙醇中，備用；
(2)將步驟⑴得到的IOOmg~5g磁簇、2(T400mL無(wú)水乙醇、5~IOOmL去離子水、
0.5~20mL氨水以及0.2~20g帶雙鍵的硅烷偶聯(lián)劑加入三口燒瓶中，在反應(yīng)溫度為5(Tl50°C下機(jī)械攪拌l(T50h，使磁簇表面修飾上活性的乙烯基官能團(tuán)；反應(yīng)結(jié)束后，用磁分離得到表面修飾有乙烯基的磁簇，并用無(wú)水乙醇除去過(guò)量的硅烷偶聯(lián)劑；然后放入真空烘箱進(jìn)行干燥； (3)將步驟(2)得到的25飛OOmg得到的表面修飾有乙烯基的磁簇、0.f IOmL側(cè)鏈帶咪唑基團(tuán)的烯類單體、2mg飛g % 亞甲基雙丙烯酰胺、f IOOmg 2，2-偶氮二異丁腈以及溶劑2(T400ml乙腈加入5(T1000ml單口燒瓶中，超聲使其混合均勻；將燒瓶連接到裝有精餾柱的回流裝置上；從室溫升溫到沸騰狀態(tài)，然后控制反應(yīng)在9(T16(TC保持0.r5h ;反應(yīng)結(jié)束后用磁分離，并用無(wú)水乙醇進(jìn)行洗滌，得到表面帶咪唑基團(tuán)的磁性復(fù)合微球；所述的側(cè)鏈帶咪唑基團(tuán)的烯類單體為乙烯基咪唑；
(4)將步驟(3)得到的核殼結(jié)構(gòu)磁性復(fù)合微球加到濃度為10-1000 mg/mL的10-200mL鎳鹽溶液中，超聲分散，在室溫下攪拌反應(yīng)1-24 h。反應(yīng)結(jié)束后，用去離子水反復(fù)清洗微球，將微球保存在去離子水中備用。所述的鎳鹽為氯化鎳、硫酸鎳、乙酸鎳或硝酸鎳中的一種。
[0009]本發(fā)明中，步驟(1)中所述的醋酸鹽可為醋酸鈉、醋酸鋰、醋酸鉀、醋酸銨或醋酸鎂中的一種，所述的檸檬酸鹽可為檸檬酸或檸檬酸鈉中的一種。
[0010]本發(fā)明中，步驟(2)中所述帶雙鍵的硅烷偶聯(lián)劑為KH570。[0011]本發(fā)明中，步驟(3)中所述側(cè)鏈帶咪唑基團(tuán)的烯類單體及％ Λ/'-亞甲基雙丙烯酰胺的濃度之和為0.001 wt%到10 wt%。
[0012]本發(fā)明中，步驟(3)中所述的％ 亞甲基雙丙烯酰胺的用量與％ 亞甲基雙丙烯酰胺用量和側(cè)鏈帶咪唑基團(tuán)的烯類單體用量總和的百分比值為大于等于10 Wt %。
[0013]利用本發(fā)明制備方法獲得的磁性聚合物復(fù)合微球應(yīng)用于分離富集組氨酸蛋白方面，效果優(yōu)良。
[0014]本發(fā)明制備得到的磁性聚合物復(fù)合微球，粒徑分布均一，結(jié)構(gòu)規(guī)整，并且具有高磁響應(yīng)性以及表面可修飾的特性。表面經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的修飾以后，能在中性條件下分離純化組氨酸蛋白，分離能力良好(富集容量為284 4 8蛋白/11^磁珠)。因此，該磁性核殼式復(fù)合微球是一種非常有應(yīng)用前景的生物磁性分離材料。
[0015]目前磁性復(fù)合微球主要存在粒徑分布不均一、磁含量低、表面缺乏足夠的活性官能團(tuán)等問(wèn)題。本發(fā)明通過(guò)回流沉淀聚合制備得到的具有核殼結(jié)構(gòu)的磁性復(fù)合微球，具有以下特點(diǎn):(1)粒徑分布均一，結(jié)構(gòu)規(guī)整；(2)磁性復(fù)合微球的磁含量高；(3)核殼式磁性復(fù)合微球的表面富含鎳離子；(4)核殼式磁性復(fù)合微球的制備時(shí)間短，過(guò)程簡(jiǎn)單、高效；(5)該微球可用于中性條件下分離富集組氨酸蛋白，且能多次循環(huán)使用，效果優(yōu)良，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1為實(shí)施例2中殼層厚度為80 nm左右，交聯(lián)度為20%的核殼式Fe304/PVM-Ni2+微球的透射電鏡照片；
圖2為實(shí)施例6中磁性材料富集組氨酸標(biāo)記蛋白前后跑出的電泳圖。其中泳道M為標(biāo)準(zhǔn)分子量的條帶，I為富集前的組氨酸標(biāo)記重組蛋白，2為富集后的上清液，3為洗脫液；
圖3為實(shí)施例7中磁性材料從復(fù)雜模型蛋白中富集組氨酸標(biāo)記重組蛋白前后跑出的電泳圖。其中泳道M為標(biāo)準(zhǔn)分子量的條帶，4為富集前的混合蛋白(HRP + Cyt c + His), 5為經(jīng)Fe304/PVM-Ni2+富集后的混合蛋白上清液，6為用酸性溶液洗脫后得到的洗脫液；
圖4為實(shí)施例8中磁性材料從復(fù)雜的大腸桿菌裂解液中分離組氨酸標(biāo)記重組蛋白的電泳圖。泳道M為標(biāo)準(zhǔn)分子量的條帶，7為富集前的大腸桿菌裂解液，8為經(jīng)Fe304/PVM-Ni2+富集后的上清液，9為用酸性溶液洗脫后得到的洗脫液；
圖5為實(shí)施例9中磁性材料從復(fù)雜模型蛋白中富集含組氨酸蛋白BSA及BHb前后跑出的電泳圖。泳道M為標(biāo)準(zhǔn)分子量的條帶，10為富集前的混合蛋白(BSA + HRP + MYO +BHb)，11為經(jīng)Fe304/PVM-Ni2+富集后的混合蛋白上清液，12為用酸性溶液洗脫后得到的洗脫液；
圖6為實(shí)施例10中磁性粒子除去復(fù)雜的胎牛血清體系中的BSA前后的電泳圖。泳道M為標(biāo)準(zhǔn)分子量的條帶，13為去除BSA前的胎牛血清，14為經(jīng)Fe304/PVM-Ni2+去除BSA后的胎牛血清上清，15為用酸性溶液洗脫后得到的洗脫液，16為經(jīng)Fe304/PMG-1DA-Ni2+去除BSA后的胎牛血清上清，17為用酸性溶液洗脫后得到的洗脫液；
圖7為實(shí)施例11中磁性粒子循環(huán)用于組氨酸標(biāo)記重組蛋白的分離富集實(shí)驗(yàn)。泳道M為標(biāo)準(zhǔn)分子量的條帶，18為組氨酸標(biāo)記蛋白被富集前的原液，19-25為Fe304/PVM-Ni2+循環(huán)富集使用7次每一次用酸性溶液洗脫后得到的洗脫液；
圖8為實(shí)施例12中磁性粒子循環(huán)用于組氨酸蛋白BSA的分離富集實(shí)驗(yàn)。泳道M為標(biāo)準(zhǔn)分子量的條帶，26為BSA被富集前的原液，27-33為Fe304/PVIM_Ni2+循環(huán)富集使用7次每一次用酸性溶液洗脫后得到的洗脫液。
【具體實(shí)施方式】
[0017]實(shí)施例1:殼層厚度為10 nm左右，交聯(lián)度為10 %的核殼式Fe304/PVM-Ni2+微球的制備
1、檸檬酸鈉穩(wěn)定的磁簇的制備
將1.3g六水合三氯化鐵(FeCl3*6H20)，3.8g醋酸銨(NH4Ac),0.4g檸檬酸鈉溶解在70mL乙二醇中后，加入15 0mL三口燒瓶中，然后升溫到170°C，攪拌反應(yīng)Ih后，將燒瓶中液體轉(zhuǎn)入容量為IOOmL的含有聚四氟乙烯內(nèi)襯的高壓反應(yīng)釜中，再將反應(yīng)釜放入200°C的烘箱反應(yīng)16h后取出，用自來(lái)水使其冷卻至室溫。用磁分離分離出產(chǎn)物，并用無(wú)水乙醇洗滌除去未反應(yīng)的反應(yīng)物，最后將產(chǎn)物分散在無(wú)水乙醇中備用；
2、對(duì)磁簇表面進(jìn)行活性乙烯基修飾
將以上得到的300mg磁簇、40mL無(wú)水乙醇、IOmL去離子水、1.5mL氨水以及0.6 g硅烷偶聯(lián)劑KH 570加入150mL三口燒瓶中，升溫到70°C，反應(yīng)24 h后，磁分離得到產(chǎn)物并用無(wú)水乙醇洗滌除去過(guò)量的硅烷偶聯(lián)劑。然后放入真空烘箱進(jìn)行干燥；
3、核殼式Fe304/PVM的制備
將以上干燥后得到的產(chǎn)物取約100 mg和80 mL乙腈一起加入200 mL單口燒瓶中分散，再加入450 UL乙烯基咪唑、50 mg N, 亞甲基雙丙烯酰胺、10 mg 2，2-偶氮二異丁腈，使其溶解在反應(yīng)體系中。然后將燒瓶連接到裝有精餾柱的回流裝置上。從室溫升溫到沸騰狀態(tài)，控制在110°C反應(yīng)10 min。反應(yīng)結(jié)束后磁分離得到產(chǎn)物，并用無(wú)水乙醇進(jìn)行洗滌，最終得到殼層厚度為10 nm左右的Fe304/PV頂微球；
4、絡(luò)合鎳離子的反應(yīng)
將以上得到的核殼結(jié)構(gòu)磁性復(fù)合微球加到濃度為100 mg/mL的50 mL鎳鹽溶液中，超聲分散，在室溫下攪拌反應(yīng)I h。反應(yīng)結(jié)束后，用去離子水反復(fù)清洗微球，將微球保存在去離子水中備用。
[0018]實(shí)施例2:殼層厚度為80 nm左右，交聯(lián)度為20%的核殼式Fe304/PVM-Ni2+微球的制備(透射電鏡照片見(jiàn)圖1);
1、檸檬酸鈉穩(wěn)定的磁簇的制備同實(shí)施例1-1中所述；2、對(duì)磁簇表面進(jìn)行活性乙烯基修飾同實(shí)施例1-2中所述；
3、核殼式Fe304/PVM的制備同實(shí)施例1-3中所述。所不同的是乙烯基咪唑、％亞甲基雙丙烯酰胺、2，2-偶氮二異丁腈的用量分別為400 μ LUOO mg、10 mg;
4、絡(luò)合鎳離子的反應(yīng)同實(shí)施例1-4中所述。
[0019]實(shí)施例3:殼層厚度為80nm左右，交聯(lián)度為40%的核殼式Fe304/PVM-Ni2+微球的制備
1、檸檬酸鈉穩(wěn)定的磁簇的制備同實(shí)施例1-1中所述；
2、對(duì)磁簇表面進(jìn)行活性乙烯基修飾同實(shí)施例1-2中所述；
3、核殼式Fe304/PVM的制備同實(shí)施例1-3中所述。所不同的是乙烯基咪唑、％亞甲基雙丙烯酰胺、2，2-偶氮二異丁腈的用量分別為300 μ L、200 mg、10 mg ；
4、絡(luò)合鎳離子的反應(yīng)同實(shí)施例1-4中所述。
[0020]實(shí)施例4:殼層厚度為80nm左右，交聯(lián)度為60%的核殼式Fe304/PVM-Ni2+微球的制備
1、檸檬酸鈉穩(wěn)定的磁簇的制備同實(shí)施例1-1中所述；
2、對(duì)磁簇表面進(jìn)行活性乙烯基修飾同實(shí)施例1-2中所述；
3、核殼式Fe304/PVM的制備同實(shí)施例1-3中所述。所不同的是乙烯基咪唑、％亞甲基雙丙烯酰胺、2，2-偶氮二異丁腈的用量分別為200 μ L、300 mg、10 mg ；
4、絡(luò)合鎳離子的反應(yīng)同實(shí)施例1-4中所述。
[0021]實(shí)施例5:殼層厚度為80nm左右，交聯(lián)度為80%的核殼式Fe304/PVM_Ni2+微球的制備
1、檸檬酸鈉穩(wěn)定的磁簇的制備同實(shí)施例1-1中所述；
2、對(duì)磁簇表面進(jìn)行活性乙烯基修飾同實(shí)施例1-2中所述；
3、核殼式Fe304/PVM的制備同實(shí)施例1-3中所述。所不同的是乙烯基咪唑、％亞甲基雙丙烯酰胺、2，2-偶氮二異丁腈的用量分別為100 uL,400 mg、10 mg;
4、絡(luò)合鎳離子的反應(yīng)同實(shí)施例1-4中所述。
[0022]實(shí)施例6:利用殼層厚度為80 nm交聯(lián)度為20%的磁性復(fù)合微球Fe304/PVM_Ni2+進(jìn)行富集6個(gè)組氨酸標(biāo)記重組蛋白的實(shí)驗(yàn)
1、首先稱取Img Fe304/PVM-Ni2+磁性粒子，用100 μ L去離子水洗滌兩次；
2、接著加入500μ L (40 M-g/mL)組氣酸標(biāo)記蛋白，在室溫下鮮育30分鐘；
3、然后磁分離收集上清液,加入100μ L去離子水洗滌兩次；
4、最后用10μ L冰醋酸進(jìn)行洗脫,取10 μ L原液，10 μ L上清液和10 μ L洗脫液，烘干后分別加入10 μ L溴酹藍(lán)loading buffer,跑電泳(見(jiàn)圖2)。
[0023]實(shí)施例7:磁性粒子在復(fù)雜的模型蛋白中分離純化組氨酸標(biāo)記的重組蛋白
1、首先稱取Img Fe304/PVM-Ni2+磁性粒子，用100 μ L去離子水洗滌兩次；
2、接著加入5μδ HRP, 5 μδ Cyt c和5 Pg組氨酸標(biāo)記的重組蛋白，加去離子水至100μ L，在室溫下孵育30分鐘；
3、然后磁分離收集上清液,加入100μ L去離子水洗滌兩次；
4、最后用50μ L冰醋酸進(jìn)行洗脫。將原液,上清液和洗脫液烘干后分別加入10 μ L溴酹藍(lán)loading buffer,跑電泳(見(jiàn)圖3)。[0024]實(shí)施例8:磁性粒子在復(fù)雜的大腸桿菌裂解液體系中分離組氨酸標(biāo)記的重組蛋白
1、首先稱取Img Fe304/PVM-Ni2+磁性粒子，用100 μ L去離子水洗滌兩次；
2、接著加入3μ L細(xì)菌裂解液和4 Pg組氨酸標(biāo)記的重組蛋白，加去離子水至100 μ L，在室溫下孵育30分鐘；
3、然后磁分離收集上清液,加入100μ L去離子水洗滌兩次；
4、最后用50μ L冰醋酸進(jìn)行洗脫。將原液，上清液和洗脫液烘干后分別加入10 μ L溴酹藍(lán)loading buffer,跑電泳(見(jiàn)圖4)。
[0025]實(shí)施例9:磁性粒子在復(fù)雜的模型蛋白中分離純化牛血清蛋白BSA
1、首先稱取1mg Fe304/PVM-Ni2+磁性粒子，用100 μ L去離子水洗滌兩次；
2、接著加入5μδ HRP, 5 μδ ΜΥΟ, 5 μδ BHb和5 μδ BSA，加去離子水至100 yL，在室溫下孵育30分鐘；
3、然后磁分離收集上清液,加入100μ L去離子水洗滌兩次；
4、最后用50μ L冰醋酸進(jìn)行洗脫。將原液,上清液和洗脫液烘干后分別加入10 μ L溴酹藍(lán)loading buffer,跑電泳(見(jiàn)圖5)。
[0026]實(shí)施例10:磁性粒子除去復(fù)雜的胎牛血清體系中的BSA
1、首先稱取Img Fe304/PVM-Ni2+磁性粒子，用100 μ L去離子水洗滌兩次；
2、接著加入Iμ L胎牛血清，加去離子水至100 μ L,在室溫下孵育30分鐘；
3、然后磁分離收集上清液,加入100μ L去離子水洗滌兩次；
4、最后用50μ L冰醋酸進(jìn)行洗脫。將原液,上清液和洗脫液凍干后分別加入10 μ L溴酹藍(lán)loading buffer,跑電泳(見(jiàn)圖6)。
[0027]實(shí)施例11:磁性粒子循環(huán)用于組氨酸標(biāo)記蛋白的分離富集實(shí)驗(yàn)
1、首先稱取Img Fe304/PVM-Ni2+磁性粒子，用100 μ L去離子水洗滌兩次；
2、接著加入5UL (I mg/mL)組氨酸標(biāo)記的重組蛋白，然后各加入95 μ L去離子水，在室溫下孵育30分鐘；
3、然后磁分離除去上清液，用50μ L冰醋酸進(jìn)行洗脫；
4、取洗脫后的磁性粒子，重復(fù)步驟2-3共7次，每次富集前重新花5min絡(luò)合Ni2+，然后分別將這7次的洗脫液烘干,各加入10 μ L溴酹藍(lán)loading buffer,跑電泳(見(jiàn)圖7)。
[0028]實(shí)施例12:磁性粒子循環(huán)用于牛血清蛋白BSA的分離富集實(shí)驗(yàn)
1、首先稱取Img Fe304/PVM-Ni2+磁性粒子，用100 μ L去離子水洗滌兩次；
2、接著加入5μ L (I mg/mL)牛血清蛋白BSA,然后各加入95 yL去離子水,在室溫下孵育30分鐘；
3、然后磁分離除去上清液，用50μ L冰醋酸進(jìn)行洗脫；
4、取洗脫后的磁性粒子，重復(fù)步驟2-3共7次，每次富集前重新花5min絡(luò)合Ni2+，然后分別將這7次的洗脫液烘干,各加入10 μ L溴酹藍(lán)loading buffer,跑電泳(見(jiàn)圖8)。
【權(quán)利要求】
1.一種富含鎳離子的核殼式磁性復(fù)合微球的制備方法，其特征在于所述核殼式磁性復(fù)合微球的核為磁簇，殼為交聯(lián)的富含咪唑基團(tuán)的聚合物網(wǎng)絡(luò)，咪唑基團(tuán)用于固定鎳離子，通過(guò)表面固定的鎳離子可在中性條件下快速分離組氨酸蛋白；具體步驟如下: (1)將1~30g六水合三氯化鐵、1~60g醋酸鹽和0.1~20g檸檬酸鹽溶解在20~500mL乙二醇中，在100~200.C下機(jī)械攪拌0.5~5h，然后置于含有聚四氟乙烯內(nèi)襯的不銹鋼高壓反應(yīng)釜中，將該釜放置于100~300.C的烘箱中反應(yīng)l0~50h，取出，用自來(lái)水使其冷卻至室溫；用磁鐵分離出產(chǎn)物磁簇，并用無(wú)水乙醇洗滌除去未反應(yīng)的反應(yīng)物，最后將產(chǎn)物磁簇分散在無(wú)水乙醇中，備用； (2)將步驟⑴得到的100mg~5g磁簇、20~400mL無(wú)水乙醇、5~100mL去離子水、0.5~20mL氨水以及0.2~20g帶雙鍵的硅烷偶聯(lián)劑加入三口燒瓶中，在反應(yīng)溫度為50~l50°C下機(jī)械攪拌l0~50h，使磁簇表面修飾上活性的乙烯基官能團(tuán)；反應(yīng)結(jié)束后，用磁分離得到表面修飾有乙烯基的磁簇，并用無(wú)水乙醇除去過(guò)量的硅烷偶聯(lián)劑；然后放入真空烘箱進(jìn)行干燥； (3)將步驟(2)得到的25~100mg表面修飾有乙烯基的磁簇、0.1~10mL側(cè)鏈帶咪唑基團(tuán)的烯類單體、2mg~5g % 亞甲基雙丙烯酰胺、1~100mg 2，2-偶氮二異丁腈以及溶劑20~400ml乙腈加入50~1000ml單口燒瓶中，超聲使其混合均勻；將燒瓶連接到裝有精餾柱的回流裝置上；從室溫升溫到沸騰狀態(tài)，然后控制反應(yīng)在90~160.C保持0.1~5h ;反應(yīng)結(jié)束后用磁分離，并用無(wú)水乙醇進(jìn)行洗滌，得到表面帶咪唑基團(tuán)的磁性復(fù)合微球；所述的側(cè)鏈帶咪唑基團(tuán)的烯類單體為乙烯基咪唑； (4)將步驟(3)得到的核殼結(jié)構(gòu)磁性復(fù)合微球加到濃度為10-1000mg/mL的10-200mL鎳鹽溶液中，超聲分散，在室溫下攪拌反應(yīng)1-24 h;反應(yīng)結(jié)束后，用去離子水反復(fù)清洗微球，將微球保存在去離子水中備用；所述的鎳鹽為氯化鎳、硫酸鎳、乙酸鎳或硝酸鎳中的一種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中所述的醋酸鹽可為醋酸鈉、醋酸鋰、醋酸鉀、醋酸銨或醋酸鎂中的一種，所述的檸檬酸鹽可為檸檬酸或檸檬酸鈉中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中所述帶雙鍵的硅烷偶聯(lián)劑為KH570。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(3)中所述側(cè)鏈帶咪唑基團(tuán)的烯類單體及A N，-亞甲基雙丙烯酰胺的濃度之和為0.001 wt%到10 wt%0
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(3)中所述的A亞甲基雙丙烯酰胺的用量與A N，-亞甲基雙丙烯酰胺用量和側(cè)鏈帶咪唑基團(tuán)的烯類單體用量總和的百分比值為大于等于10 wt %。
6.—種如權(quán)利要求1所述制備方法獲得的表面富含鎳離子的磁性聚合物復(fù)合微球在分離組氨酸蛋白方面具有廣泛的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C08F226/06GK103897123SQ201410089968
【公開(kāi)日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年3月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月13日
【發(fā)明者】汪長(zhǎng)春, 章雨婷 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)