酶法降解滸苔多糖的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種酶法降解滸苔多糖的方法：將滸苔粗多糖或滸苔多糖配置成濃度為1～20mg/mL的多糖溶液；然后以糖化酶作為水解酶，于pH為3.5～5.5、溫度為40～60℃反應(yīng)1～5小時，得首次酶解降解多糖溶液；將首次酶解降解多糖溶液煮沸4～6分鐘后，離心以除去糖化酶，得含有首次酶解降解后滸苔多糖的上清液。將上述上清液經(jīng)透析后冷凍干燥，得粉末狀的酶解降解滸苔多糖(分子量范圍為7.2～122kDa)。本發(fā)明的方法具有水解效率高，所得多糖體外抗氧化活性好的特點。
【專利說明】酶法降解滸苔多糖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食品生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種酶法降解滸苔多糖的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]滸苔是我國東南沿海的一種大型經(jīng)濟性綠藻，資源豐富，本身可以食用，并含有多種活性物質(zhì)，如滸苔多糖，脂類色素，酚類等。據(jù)文獻報道，滸苔多糖具有提高哺乳動物免疫力、降血脂、消炎抗菌以及抗氧化等生理功能。因此將滸苔開發(fā)成功能食品有很好的前景。滸苔水提多糖主要為水溶性的硫酸多糖，其組成主要是葡萄糖醛酸-木糖-鼠李糖聚合物。滸苔多糖分子量大，如果將其降解成分子量相對較小的產(chǎn)物，則由于游離出更多的活性基團，能會使其生物活性得到提高。
[0003]據(jù)報道，滸苔多糖糖鍵類型主要是β -1, 4、α -1，2、a -1, 4、α -1, 2，4和β -1, 6，還含有較少量的β -1, 3和α -1, 3糖苷鍵。
[0004]酸降解是多糖降解的傳統(tǒng)方法，可通過調(diào)節(jié)酸度、溫度和作用時間得到不同降解程度的水解產(chǎn)物。但硫酸多糖在降解過程中其硫酸基易被水解脫落，硫酸基含量的降低會導(dǎo)致多糖的生理活性降低；該方法的降解率為40.05% ;分子量范圍一般為5.32~95.6kDa0
[0005]氧化降解雖可減少多糖在降解過程中的硫酸基脫落，但氧化產(chǎn)物相對較復(fù)雜，增加了分離純化的難度。該方法的降解率為61.32% ;分子量范圍一般為2.28~55.9kDa。
[0006]酶法降解作用條件溫和，也可避免硫酸基的脫落，但不易得到水解效率高的酶。但目前對滸苔多糖的酶法降解很少有見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種水解效率高、體外抗氧化活性好的酶法降解滸苔多糖的方法。
[0008]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種酶法降解滸苔多糖的方法，將滸苔粗多糖或?qū)⑻Χ嗵桥渲贸蓾舛葹镮~20mg/mL(較佳為4~6mg/mL)的多糖溶液；然后以糖化酶(葡萄糖淀粉酶)作為水解酶，在多糖溶液中加入糖化酶直至糖化酶的終濃度為2~100U/mL(較佳為10~20U/mL);于pH為3.5~5.5、溫度為40~60°C反應(yīng)I~5小時(較佳為于pH為4.5，49°C反應(yīng)2小時)，得首次酶解降解多糖溶液；將首次酶解降解多糖溶液煮沸4~6分鐘后，離心以除去糖化酶，得含有首次酶解降解后滸苔多糖的上清液。
[0009]備注說明:將滸苔粗多糖或滸苔多糖配置成濃度為I~20mg/mL的多糖溶液，即為:當(dāng)選用滸苔粗多糖時，滸苔粗多糖的濃度為I~20mg/mL ;當(dāng)選用滸苔多糖時，滸苔多糖的濃度為I~20mg/mL。
[0010]離心是指:7000~9000r/s離心4~6min。
[0011]作為本發(fā)明的酶法降解滸苔多糖的方法的改進:將含有首次酶解降解后滸苔多糖的上清液用截留分子量為500的透析袋透析，以除去無機鹽；得透析液；將透析液冷凍干燥，得粉末狀的酶解降解滸苔多糖(分子量較低，分子量范圍為7.2~122kDa之間)。
[0012]備注說明:上述透析時間為20~28小時；冷凍干燥是指在-45~_55°C干燥20~28小時。
[0013]作為本發(fā)明的酶法降解滸苔多糖的方法的另一種改進:將含有首次酶解降解后滸苔多糖的上清液進行再次水解，所述再次水解包括如下步驟:
[0014]在含有首次酶解降解后滸苔多糖的上清液中加入果膠酶，所述果膠酶的用量為滸苔粗多糖或滸苔多糖重量的I~10% (較佳為6~9%) ^pH為3.5~5.5、溫度為45~60°C反應(yīng)I~5小時(較佳為pH為4.5，溫度為56°C反應(yīng)3小時)，得再次酶解降解多糖溶液；將再次酶解降解多糖溶液煮沸4~6分鐘后，離心以除去果膠酶，得含有再次酶解降解后滸苔多糖的上清液。
[0015]備注說明:果膠酶的酶活為30U/mg。離心是指:7000~9000r/s離心4~6min。
[0016]作為本發(fā)明的酶法降解滸苔多糖的方法的進一步改進:
[0017]將含有再次酶解降解后滸苔多糖的上清液用截留分子量為500的透析袋透析，以除去無機鹽；得透析液；將透析液冷凍干燥，得粉末狀的酶解降解滸苔多糖(分子量較低，分子量范圍為7.2~122kDa 之間)。
[0018]備注說明:上述透析時間為20~28小時；冷凍干燥是指在-45~_55°C干燥20~28小時。
[0019]在本發(fā)明中，可用pH3.5~5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液進行pH值的調(diào)節(jié)控制。
[0020]本發(fā)明所使用的滸苔粗多糖的純度(質(zhì)量含量)為75~80%。
[0021]在本發(fā)明中，滸苔粗多糖或滸苔多糖均可通過公知技術(shù)獲得，例如，滸苔粗多糖也可通過如下方法制備而得:
[0022]I)、將干燥(含水率≤8.21%，質(zhì)量％)后的滸苔用搗碎機進行粉碎，過120目篩，得將苔粉末。
[0023]2)、乙醇除雜:
[0024]將無水乙醇與滸苔粉末按照20ml/lg的料液比，于90°C水浴條件下攪拌從而除去海藻中的脂溶性成分，所述除雜過程重復(fù)2~4次(每次攪拌約30分鐘)，過濾，取濾餅。
[0025]3)、水提滸苔多糖:
[0026]將步驟2)所得的濾餅按照《滸苔水溶性多糖提取的工藝研究》中的“滸苔水溶性多糖提取工藝”，制備得到滸苔粗多糖水溶液。
[0027]4)、蛋白的去除:
[0028]將步驟3)所得的滸苔粗多糖水溶液按照《滸苔多糖脫蛋白方法的研究》中的“滸苔多糖酶法脫蛋白工藝”進行酶法脫蛋白:木瓜蛋白酶的用量為3% (1:￥)，？!1值為6.5，溫度50°C，酶解時間為2.5h。
[0029]再將所得的酶解液利用Sevag法除蛋白多次，離心直至上層幾乎無蛋白，減壓旋蒸除去氯仿與正丁醇，加入無水乙醇使得其純度不低于80%，在4°C冰箱醇沉12h后，再離心，沉淀用無水乙醇、乙醚、丙酮的順序多次洗滌，最后進行冷凍干燥，得滸苔粗多糖。其中，多糖的質(zhì)量含量為75.45%，即純度為75.45%。
[0030]采用本發(fā)明方法制備而得的酶解降解滸苔多糖粉末，分子量范圍為7.2~122kDa之間。[0031]采用本發(fā)明方法制備而得的酶解降解滸苔多糖粉末，測定其抗氧化活性，用高效凝膠滲透層析法測定分子量。
[0032]本發(fā)明具有如下技術(shù)效果:
[0033]1.與酸降解等傳統(tǒng)方法相比，采用本發(fā)明的方法降解滸苔多糖作用條件溫和，反應(yīng)時間短。
[0034]2.得到的降解多糖分子量較低；分子量范圍為7.2~122kDa之間。
[0035]3.與未降解的滸苔多糖相比，具有更好的體外抗氧化活性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0036]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細(xì)說明。
[0037]圖1是由本發(fā)明實施例1-1得到的酶解滸苔多糖以及未降解多糖的DPPH自由基清除能力的測試結(jié)果。
[0038]圖2是由本發(fā)明實施例1-1得到的酶解滸苔多糖以及未降解多糖的超氧陰離子自由基清除能力的測試結(jié)果。
[0039]圖3是由本發(fā)明實施例1-1得到的酶解滸苔多糖以及未降解多糖的羥基自由基清除能力的測試結(jié)果。
[0040]圖4是本發(fā)明實施例1-1得到的酶解滸苔多糖的高效凝膠滲透色譜圖。
【具體實施方式】
[0041]實施例1-1、酶法降解滸苔多糖的方法:
[0042]取純度為75.45 %的滸苔粗多糖用pH4.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液(乙酸和乙酸鈉的總濃度為0.lmol/L)溶解成滸苔粗多糖濃度為5mg/mL的粗多糖溶液。
[0043]先將10 X 104U/mL的糖化酶(葡萄糖淀粉酶)用ρΗ4.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液(乙酸和乙酸鈉的總濃度為0.lmol/L)稀釋至100U/mL，得糖化酶酶溶液。取710 μ L糖化酶酶溶液用蒸餾水補足至lmL，得稀釋后糖化酶酶溶液。
[0044]然后在4mL粗多糖溶液中加入1ml稀釋后糖化酶酶溶液，從而使糖化酶的濃度為14.2U/mL，滸苔粗多糖的濃度為4mg/mL ;此時pH為4.5，于溫度為49°C反應(yīng)時間2小時。
[0045]將酶解后的多糖溶液煮沸5min，離心除去酶(8000r/s，5min)，然后將所得上清液用截留分子量為500的透析袋透析24h，以除去無機鹽；得透析液；最后將透析液進行冷凍干燥(即在真空冷凍干燥器中干燥24h，溫度為-50°C )。得到降解率為7.6%的酶解滸苔
多糖(即，得酶解降解滸苔多糖)。
[0046]
【權(quán)利要求】
1.酶法降解滸苔多糖的方法，其特征是:將滸苔粗多糖或滸苔多糖配置成濃度為1~20mg/mL的多糖溶液；然后以糖化酶作為水解酶，在多糖溶液中加入糖化酶直至糖化酶的終濃度為2~100U/mL ;于pH為3.5~5.5、溫度為40~60°C反應(yīng)1~5小時，得首次酶解降解多糖溶液；將首次酶解降解多糖溶液煮沸4~6分鐘后，離心以除去糖化酶，得含有首次酶解降解后滸苔多糖的上清液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法降解滸苔多糖的方法，其特征是:將含有首次酶解降解后滸苔多糖的上清液用截留分子量為500的透析袋透析，以除去無機鹽；得透析液；將透析液冷凍干燥，得粉末狀的酶解降解滸苔多糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法降解滸苔多糖的方法，其特征是:將含有首次酶解降解后滸苔多糖的上清液進行再次水解，所述再次水解包括如下步驟: 在含有首次酶解降解后滸苔多糖的上清液中加入果膠酶，所述果膠酶的用量為滸苔粗多糖或滸苔多糖重量的1~10% ;于pH為3.5~5.5、溫度為45~60°C反應(yīng)1~5小時，得再次酶解降解多糖溶液；將再次酶解降解多糖溶液煮沸4~6分鐘后，離心以除去果膠酶，得含有再次酶解降解后滸苔多糖的上清液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的酶法降解滸苔多糖的方法，其特征是:將含有再次酶解降解后滸苔多糖的上清液用截留分子量為500的透析袋透析，以除去無機鹽；得透析液；將透析液冷凍干燥，得粉末狀的酶解降解滸苔多糖。
【文檔編號】C08B37/00GK103951761SQ201410200699
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年5月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月13日
【發(fā)明者】周濤, 許莉莉 申請人:浙江工商大學(xué)