本發(fā)明涉及一種新的誘導(dǎo)劑及其應(yīng)用，屬于基因工程藥物制備領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：目前，在大腸桿菌表達(dá)外源蛋白的研究，多以IPTG(異丙基-β-D巰基半乳糖苷)作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá)，但因?yàn)镮PTG使異源蛋白的合成速度太快，以致于沒有足夠的時間進(jìn)行折疊，當(dāng)存在二硫鍵時，二硫鍵不能正確配對，過多蛋白間的非特異性結(jié)合，蛋白質(zhì)無法達(dá)到足夠的溶解度，多以包涵體的形式存在，導(dǎo)致可溶性蛋白含量很低(陳圓圓等，包涵體的形成原因及其處理方法.上海畜牧獸醫(yī)通訊，2009,1:62)。而實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示有些包涵體通過復(fù)性后失去了免疫活性，因此如何增加此類蛋白的可溶性表達(dá)量成了關(guān)鍵問題。另外，IPTG具有潛在的毒性(金奇.醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué).北京:科學(xué)出版社,2001)，對菌體生長具有一定的抑制作用，各國藥典均不提倡使用，并且價格昂貴，因而不適宜在發(fā)酵罐中進(jìn)行基因工程產(chǎn)品的規(guī)?；a(chǎn)。傳染性法氏囊病是由傳染性法氏囊病病毒(InfectiousBursalDiseaseVirus,IBDV)導(dǎo)致的，以法氏囊腫大、肝臟損傷為主要特征的高度接觸性傳染病。隨著我國養(yǎng)雞業(yè)的集約化發(fā)展，傳染性法氏囊病已成為危害養(yǎng)雞業(yè)的一種主要傳染病，目前，亟需免疫原性好、安全性高的新型亞單位疫苗問世?，F(xiàn)有技術(shù)中，主要以IBDVVP2蛋白作為免疫原性蛋白研制亞單位疫苗，以大腸桿菌表達(dá)為主，但I(xiàn)BDVVP2是在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的異源蛋白，因?yàn)檎婧颂堑鞍谉o法糖基化使中間體溶解度下降，導(dǎo)致不溶解的包涵體形成(WilliamSelleck,SongTan.RecombinantProtienComplexExpressioninE.coli.CurrentProtocolsinProtein,Science,2008, 21(5):324-321),可溶性蛋白產(chǎn)量較低，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示IBDVVP2所形成的包涵體通過復(fù)性后沒有免疫活性。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足之處，本發(fā)明的第一方面在于提供一種誘導(dǎo)在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行外源蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)劑，其中，所述誘導(dǎo)劑包括蛋白乳清粉。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明的所述誘導(dǎo)劑包括蛋白乳清粉和蔗糖。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明的誘導(dǎo)劑中，所述蛋白乳清粉包括高蛋白乳清粉、中蛋白乳清粉、低蛋白乳清粉。其中，所述高蛋白乳清粉中，水分≤5％,蛋白質(zhì)≥11％,灰分≤8％,乳糖≥68％,脂肪≤1.5％；所述中蛋白乳清粉中蛋白≥6％，乳糖≥75％，脂肪≤1.5％；所述低蛋白乳清粉中，蛋白≥2％，乳糖為82％-85％，脂肪≤1％。術(shù)語“蛋白乳清粉”又稱為“乳清蛋白”(wheyprotein)，是經(jīng)巴氏殺菌法、脫鹽、蒸發(fā)濃縮和噴霧干燥制成的，主要用于食品工業(yè)，特別是焙烤、糕餅制造和乳制品工業(yè)中，外觀均為淡顏色，沒有結(jié)塊(如有輕微結(jié)塊也可輕微碾開)，沒有非乳清的味道和氣味；還可添加至動物飼料中，因乳清粉能提供大量的乳糖，在仔豬的消化道內(nèi)發(fā)酵可產(chǎn)生大量的乳酸，幫助乳的消化，抑制致病細(xì)菌的生長，因而主要用于乳豬飼料的添加。奶牛及肉牛、狗和貓，家禽以及其他動物也從乳清蛋白產(chǎn)品的使用中不同程度的獲得營養(yǎng)益處。術(shù)語“蛋白乳清粉”按蛋白含量高低可分為三種：高蛋白乳清粉水分≤5％,蛋白質(zhì)≥11％,灰分≤8％,乳糖≥68％,脂肪≤1.5％；中蛋白乳清粉蛋白≥6％，乳糖≥75％，脂肪≤1.5％；低蛋白乳清粉蛋白≥2％，乳糖為82％-85％，脂肪≤1％。因其成本很低，且可以達(dá)到很好的誘導(dǎo)效果，所以可以大大節(jié)約生產(chǎn)成本。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明的所述誘導(dǎo)劑包括150-300g/L低蛋白乳清粉，5-20g/L七水硫酸鎂，10-25g/L胰蛋白胨，15-40g/L酵母提取物。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的所述誘導(dǎo)劑包括150g/L低蛋白乳清粉，15g/L七水硫酸鎂，15g/L胰蛋白胨，30g/L酵母提取物。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的所述誘導(dǎo)劑包括150-300g/L低蛋白乳清粉，50-200g/L蔗糖，5-20g/L七水硫酸鎂，10-25g/L胰蛋白胨，15-40g/L酵母提取物。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的所述誘導(dǎo)劑包括150g/L低蛋白乳清粉，150g/L蔗糖，15g/L七水硫酸鎂，15g/L胰蛋白胨，30g/L酵母提取物。本發(fā)明的第二方面在于提供了一種使用所述誘導(dǎo)劑在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)IBDV重組抗原蛋白的方法，所述方法包括：(1)將含IBDVVP2的重組質(zhì)粒的宿主菌依次制備成一級種子和二級種子；(2)發(fā)酵和誘導(dǎo)：將所述步驟(1)中所述二級種子接種于含發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，37℃培養(yǎng)，當(dāng)DO值降至15％時緩慢增加通氣量至400-800L/h；當(dāng)pH上升、DO值上升時開始按DO值反饋慢速流加補(bǔ)料培養(yǎng)基，至DO值大于35％時自動流加補(bǔ)料培養(yǎng)基；當(dāng)菌體濃度OD600為10-25時降溫至誘導(dǎo)溫度后開始添加含抗生素的所述誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)，至DO值大于35％時慢速流加含抗生素的所述誘導(dǎo)劑，于誘導(dǎo)時間結(jié)束后收取發(fā)酵液，離心后收取含IBDV重組抗原蛋白的菌體。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明的誘導(dǎo)表達(dá)IBDV重組抗原蛋白的方法中，所述步驟(2)發(fā)酵和誘導(dǎo)步驟為：所述的二級種子接種于含發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，37℃培養(yǎng)，初始攪拌為100-300rpm，初始通氣量為100-300L/h，當(dāng)DO值降至15％時緩慢增加通氣量至400-800L/h；當(dāng)pH上升、DO值上升時開始慢速流加補(bǔ)料培養(yǎng)基，至DO值大于35％時自動流加補(bǔ)料培養(yǎng)基；當(dāng)菌體濃度OD600為10-25時降溫至誘導(dǎo)溫度后開始添加含抗生素的所述誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)，至DO值大于35％時慢速流加含抗生素的所述誘導(dǎo)劑，于誘導(dǎo)時間結(jié)束后收取發(fā)酵液，離心后收取含IBDV重組抗原蛋白的菌體。作為本發(fā)明的一個實(shí)施方式，本發(fā)明的誘導(dǎo)表達(dá)IBDV重組抗原蛋白的方法中，所述步驟(1)中所述含IBDVVP2的重組質(zhì)粒的宿主菌制 備方法包括：I提取雞傳染性法氏囊病病毒的總RNA；II將IBDVVP2基因利用基因工程手段構(gòu)建大腸桿菌重組質(zhì)粒載體，并制備大腸桿菌重組質(zhì)粒的宿主菌。作為本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方式，所述含IBDVVP2的重組質(zhì)粒的宿主菌為DH5α(DH5α-VP2)、BL21(DE3-VP2)。優(yōu)選地，所述宿主菌的制備方法之所述步驟II中所述大腸桿菌重組質(zhì)?？赏ㄟ^本領(lǐng)域的常規(guī)方法構(gòu)建而成，即將IBDVVP2基因插入到大腸桿菌表達(dá)載體合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)之間，使IBDVVP2基因可操作的與大腸桿菌表達(dá)調(diào)控序列相連接；更優(yōu)選地，將IBDVVP2基因核苷酸序列插入到大腸桿菌表達(dá)載體pColdIII的多克隆位點(diǎn)之間，使所述核苷酸序列冷休克基因(CspA)啟動子和lacZ啟動子的下游并受其調(diào)控，得到重組大腸桿菌表達(dá)載體。優(yōu)選地，所述宿主菌的制備方法之所述步驟II中所述大腸桿菌重組質(zhì)?？赏ㄟ^常規(guī)的方法轉(zhuǎn)化宿主菌，所述宿主菌又稱宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞的類型可為DH5α、BL21；更優(yōu)選地，將大腸桿菌重組質(zhì)粒采用CaCl2轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化BL21(DE3)大腸桿菌株(EColi.BL21(DE3))。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明的誘導(dǎo)表達(dá)IBDV重組抗原蛋白的方法中，所述步驟(2)中所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括：10-15g/L胰蛋白胨，5-10g/L酵母提取物，5-10g/L甘油，1-2g/L磷酸氫二銨，5-8g/L磷酸二氫鉀，0.6-1g/L檸檬酸，0.5-1g/L七水硫酸鎂，5ml/L微量元素溶液，pH值為6.8-7.0，在使用前加入終濃度為50μg/mL的硫酸卡那霉素或100μg/mL的氨芐青霉素；其中，所述微量元素溶液包括：10g/L七水硫酸亞鐵、2.25g/L七水硫酸鋅、1g/L五水硫酸銅、0.5g/L五水硫酸錳、0.23g/L十水四硼酸鈉、2g/L二水氯化鈣、0.1g/L七鉬酸銨，用5mol/L鹽酸溶解上述物質(zhì)，優(yōu)選地，所述微量元素溶液需經(jīng)116-121℃滅菌20-30min。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明的誘導(dǎo)表達(dá)IBDV重組抗原蛋白的方法中，所述步驟(2)中所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，8g/L甘油，2g/L磷酸氫二銨，6.7g/L磷酸二氫鉀，0.8g/L 檸檬酸，0.65g/L七水硫酸鎂，5ml/L微量元素溶液，pH值為6.8-7.0，在使用前加入終濃度為50μg/mL的硫酸卡那霉素或100μg/mL的氨芐青霉素；其中，所述微量元素溶液包括：10g/L七水硫酸亞鐵、2.25g/L七水硫酸鋅、1g/L五水硫酸銅、0.5g/L五水硫酸錳、0.23g/L十水四硼酸鈉、2g/L二水氯化鈣、0.1g/L七鉬酸銨，用5mol/L鹽酸溶解上述物質(zhì)，優(yōu)選地，所述微量元素溶液需經(jīng)116-121℃滅菌20-30min。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明的誘導(dǎo)表達(dá)IBDV重組抗原蛋白的方法中，所述步驟(2)中所述補(bǔ)料培養(yǎng)基為蔗糖補(bǔ)料培養(yǎng)基，所述蔗糖補(bǔ)料培養(yǎng)基包括300g/L蔗糖、15g/L七水硫酸鎂、15g/L胰蛋白胨、30g/L酵母提取物，在使用前加入終濃度為50μg/mL的硫酸卡那霉素或100μg/mL的氨芐青霉素。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明的誘導(dǎo)表達(dá)IBDV重組抗原蛋白的方法中，所述步驟(2)中所述含抗生素的誘導(dǎo)劑的所述抗生素為濃度為50μg/mL的硫酸卡那霉素或100μg/mL的氨芐青霉素。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明的誘導(dǎo)表達(dá)IBDV重組抗原蛋白的方法中，所述步驟(2)中所述誘導(dǎo)溫度為25-35℃，所述誘導(dǎo)時間為6-16h。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的誘導(dǎo)表達(dá)IBDV重組抗原蛋白的方法中，所述誘導(dǎo)溫度為28℃，所述誘導(dǎo)時間為8h。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明的誘導(dǎo)表達(dá)IBDV重組抗原蛋白的方法中，所述步驟(2)中所述含IBDV重組抗原蛋白的菌體經(jīng)離心破碎后收集上清進(jìn)行檢測，所述檢測的方式為瓊擴(kuò)實(shí)驗(yàn)。術(shù)語“IBDV重組抗原蛋白”是指含有IBDV免疫原性蛋白VP2的重組蛋白，術(shù)語“IBDV免疫原性蛋白VP2”是指含441AA的IBDV最主要的結(jié)構(gòu)蛋白，也是主要宿主保護(hù)性抗原，其誘導(dǎo)的中和抗體能被動地保護(hù)宿主不受IBDV感染(祁小樂，王笑梅，高玉龍等.雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白研究進(jìn)展.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2008,30(8):656-660)。術(shù)語“宿主菌”是指表達(dá)載體或DNA構(gòu)建物的合適宿主，所述表達(dá)載體或DNA構(gòu)建物的表達(dá)系統(tǒng)包含但不限于本發(fā)明的乳糖操縱子、tac 操縱子、trc操縱子等，其載體包括但不限于pET系列載體、pGEX系列載體。具體而言，宿主菌株優(yōu)選為大腸桿菌，表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)選乳糖操縱子，tac操縱子、trc操縱子。術(shù)語“DO值”為當(dāng)前狀態(tài)下溶解氧占飽和狀態(tài)的百分比，其中“DO”為DissolvedOxygen，又稱溶解氧或溶氧，是指溶解于水中分子狀態(tài)的氧。術(shù)語“抗生素”包括但不限于硫酸卡那霉素、氨芐青霉素、氯霉素、四環(huán)素、慶大霉素。本發(fā)明的第三方面在于提供所述誘導(dǎo)劑在制備IBDV重組VP2抗原蛋白方面的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：(1)用本發(fā)明的蛋白乳清粉、蛋白乳清粉-蔗糖作為誘導(dǎo)劑來誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)，表達(dá)水平相當(dāng)甚至高于ITPG、IPTG-甘油誘導(dǎo)時的效果，目的蛋白占菌體總蛋白的水平可高達(dá)10％-15％；得到的大腸桿菌BL21(DE3)菌體得率高，菌體濃度OD600可達(dá)到50-80，菌體濕重達(dá)到45-75g/L。(2)所述表達(dá)方法簡單，發(fā)酵時間短，誘導(dǎo)劑蛋白乳清粉價廉易得，生產(chǎn)成本低，且無IPTG存在，后處理較為簡單、安全。附圖說明圖1是搖瓶條件下不同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)8h時的目的蛋白瓊擴(kuò)效價AGP結(jié)果，其中上圖為標(biāo)準(zhǔn)樣品的瓊擴(kuò)圖，下圖為不同誘導(dǎo)劑(IPTG-甘油、低蛋白乳清粉、低蛋白乳清粉-蔗糖)情況下的瓊擴(kuò)結(jié)果；其中下圖中PBS為陰性對照，22、23、24、25、26、27均表示瓊擴(kuò)效價AGP的數(shù)值。圖2是10L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)不同的誘導(dǎo)劑條件下菌體的生長情況，其中縱坐標(biāo)為菌體生長OD600值，橫坐標(biāo)為生長時間，(◇)低蛋白乳清粉-蔗糖誘導(dǎo)劑；(△)IPTG-甘油誘導(dǎo)劑；(○)低蛋白乳清粉誘導(dǎo)劑；(□)IPTG誘導(dǎo)劑。圖3是發(fā)酵過程中添加不同誘導(dǎo)劑條件下表達(dá)的目的蛋白的 WesternBlot結(jié)果，其中泳道M為Marker，泳道1為未誘導(dǎo)的空白對照，泳道2是添加IPTG誘導(dǎo)劑的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，泳道3是添加IPTG-甘油誘導(dǎo)劑的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，泳道4是添加低蛋白乳清粉誘導(dǎo)劑的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，泳道5是添加低蛋白乳清粉-蔗糖誘導(dǎo)劑的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例1含IBDVVP2的重組質(zhì)粒的宿主菌的制備1.1菌株含IBDVVP2的重組質(zhì)粒的宿主菌BL21(DE3)-IBDV-VP2表達(dá)體系的構(gòu)建。1、實(shí)驗(yàn)材料質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生物；T4DNALigase購自BioLab；EcoR1、Sal1限制性內(nèi)切酶、pColdIII_DH5α菌株購自TaKaRa；瓊脂糖凝膠膠回收試劑盒購自天澤生物,其他試劑均為分析純。2、實(shí)驗(yàn)步驟2.1VP2cDNA制備2.1.1總RNA的提取總RNA簡要過程如下：將感染雞傳染性法氏囊病病毒超強(qiáng)毒LQ9株(該毒株公開于中國專利CN103849631A中)的SPF雞法氏囊用研磨器研磨。取200μL病料補(bǔ)加TE(10mMTris,1mMEDTA,pH8.0)至500μL，加入5μL蛋白酶K和10％(W/V)十二烷基磺酸鈉(SDS)50μL，56℃水浴3小時。加入等體積苯酚/氯仿(1:1，V/V)抽提3次，等體積氯仿抽提一次。移出上清至另一1.5mL離心管，加入1/10體積的 NaAc(3M,pH5.2)、等體積異丙醇，-20℃沉淀2小時。4℃、10000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，用75％乙醇洗一次。真空干燥，將RNA用無RNA酶去離子水0.5ml重新溶解。2.1.2VP2cDNA制備根據(jù)VP2基因5’和3’末端的保守區(qū)序列合成寡聚核苷酸引物，每個引物的5’端包含一個方便將基因克隆到載體上的限制酶切位點(diǎn)。這對引物被用來進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增生成cDNA。合成寡聚核苷酸引物序列如下：VP2-EcoR1-f：CCGGAATTCATGACAAACCTGCAAGATCAAACVP2-Sall-r：ACGCGTCGACTTACCTTAGGGCCCGGATTATGT2.2含酶切位點(diǎn)的VP2片段擴(kuò)增對上述制備的VP2cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并利用瓊脂糖凝膠膠回收試劑盒回收，-20℃保存。2.3pColdⅢ質(zhì)粒EcoR1、Sal1雙酶切利用EcoR1、Sal1對pColdⅢ質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，形成具有粘性末端的連接片段，反應(yīng)體系如下：37℃水浴2h后，瓊脂糖電泳回收1.7kb大小的目的片段。2.4目的基因片段的瓊脂糖凝膠回收目的基因片段的瓊脂糖凝膠回收按以下步驟進(jìn)行：(1)從瓊脂糖凝膠中切下含有目的條帶的凝膠塊，放入1.5ml離心管中，稱重。(2)每100mg瓊脂糖凝膠加入300μl溶膠溶液。(3)55℃溫浴10min，至凝膠完全融化。(4)取700μl融化的凝膠溶液轉(zhuǎn)移至純化柱中，10000g室溫離心1min。(5)將純化柱放回收集管中，加入500μl洗滌緩沖液，10000g室 溫離心1min。(6)棄去濾過液，純化柱放回收集管，再次離心1min，以除去殘留的WashingBuffer。(7)將純化柱轉(zhuǎn)移至1.5ml新的微量離心管中，在柱子中央加入30～50μl洗脫緩沖液，10000g室溫離心1min。離心管中洗脫液即為回收的DNA。2.5酶連反應(yīng)取約10μl經(jīng)過酶切和純化的pColdⅢ載體，加入30μl的待插入片段。加入1μlT4DNA連接酶，漩渦混勻，室溫離心數(shù)秒。反應(yīng)體系如下：20-25℃孵育連接2小時后可以取20μl直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，并涂布在含有100μg/mL氨芐青霉素LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，長出的菌落即為陽性克隆，命名為pColdⅢ_VP2/E.ColiBL21(DE3)菌株。挑取單克隆在含有100μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒后，送Invitrogen公司測序分析，測序結(jié)果通過BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)分析顯示前期擴(kuò)增的VP2基因序列(見SEQIDNo.1)與Genebank公布的IBDV超強(qiáng)毒株VP2基因序列同源性較高，能達(dá)到98％。實(shí)施例2培養(yǎng)基的制備2.1發(fā)酵培養(yǎng)基的制備發(fā)酵培養(yǎng)基包括：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，甘油8g/L，磷酸氫二銨2g/L，磷酸二氫鉀6.7g/L，檸檬酸0.8g/L，七水硫酸鎂0.65g/L，微量元素溶液5ml/L，用去離子水溶解，并用5mol/LNaOH調(diào)pH值至 6.8-7.0，116-121℃滅菌20-30分鐘。在使用前加入終濃度為100μg/mL氨芐青霉素。其中，微量元素溶液包括：七水硫酸亞鐵10g，七水硫酸鋅2.25g，五水硫酸銅1g，五水硫酸錳0.5g，十水四硼酸鈉0.23g，二水氯化鈣2g，七鉬酸銨0.1g，使用1000ml的5mol/L鹽酸溶解上述物質(zhì)。2.2補(bǔ)料培養(yǎng)基的制備甘油補(bǔ)料培養(yǎng)基：甘油500g，七水硫酸鎂15g，胰蛋白胨15g，酵母提取物30g，去離子水加至1000mL，在使用前加入終濃度為100μg/mL氨芐青霉素。蔗糖補(bǔ)料培養(yǎng)基：蔗糖300g，七水硫酸鎂15g，胰蛋白胨15g，酵母提取物30g，去離子水加至1000mL，在使用前加入終濃度為100μg/mL氨芐青霉素。2.3誘導(dǎo)劑的制備IPTG誘導(dǎo)劑：0.2mMIPTG，七水硫酸鎂15g，胰蛋白胨15g，酵母提取物30g，去離子水加至1000mL。IPTG-甘油誘導(dǎo)劑：0.2mMIPTG，甘油500g/L，七水硫酸鎂15g，胰蛋白胨15g，酵母提取物30g，去離子水加至1000mL。低蛋白乳清粉誘導(dǎo)劑：低蛋白乳清粉150g，七水硫酸鎂15g，胰蛋白胨15g，酵母提取物30g，去離子水加至1000mL。低蛋白乳清粉-蔗糖誘導(dǎo)劑：低蛋白乳清粉150g，蔗糖150g，七水硫酸鎂15g，胰蛋白胨15g，酵母提取物30g，去離子水加至1000mL。實(shí)施例3誘導(dǎo)表達(dá)方式的建立IBDV重組VP2蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)方法，包括：(1)將實(shí)施例1所制得的重組質(zhì)粒的宿主菌pColdIII_VP2/E.ColiBL21(DE3)菌株依次制備一級種子和二級種子；(2)發(fā)酵和誘導(dǎo)：將步驟(1)所述二級種子接種于含發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，37℃培養(yǎng)，初始攪拌為300rpm，初始通氣量為300L/h，當(dāng)DO值降低至15％時緩慢增加通氣量至500L/h；當(dāng)pH上升、DO值上 升時開始按DO值反饋慢速流加補(bǔ)料培養(yǎng)基，至DO值大于35％時自動流加補(bǔ)料培養(yǎng)基；當(dāng)菌體濃度OD600至20左右時降溫至28℃后開始添加含100μg/mL氨芐青霉素的所述誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)，至DO值大于35％時慢速流加含100μg/mL氨芐青霉素的所述誘導(dǎo)劑，于誘導(dǎo)8h后收取發(fā)酵液，離心后收取含IBDV重組抗原蛋白的菌體。當(dāng)誘導(dǎo)劑是IPTG誘導(dǎo)劑時，所添加的補(bǔ)料培養(yǎng)基為甘油補(bǔ)料培養(yǎng)基(緩慢流加)，當(dāng)誘導(dǎo)時加入IPTG誘導(dǎo)劑(一次性加入)；當(dāng)誘導(dǎo)劑是IPTG-甘油誘導(dǎo)劑，所添加的補(bǔ)料培養(yǎng)基為甘油補(bǔ)料培養(yǎng)基(緩慢流加)，當(dāng)誘導(dǎo)時加入IPTG-甘油誘導(dǎo)劑(其中所含的IPTG成分一次性加入，其余成分緩慢流加)；當(dāng)誘導(dǎo)劑為低蛋白乳清粉誘導(dǎo)劑時，所添加的補(bǔ)料培養(yǎng)基為蔗糖補(bǔ)料培養(yǎng)基(緩慢流加)，當(dāng)誘導(dǎo)時加入低蛋白乳清粉誘導(dǎo)劑(緩慢流加)；當(dāng)誘導(dǎo)劑為低蛋白乳清粉-蔗糖誘導(dǎo)劑時，所添加的補(bǔ)料培養(yǎng)基為蔗糖補(bǔ)料培養(yǎng)基(緩慢流加)，當(dāng)誘導(dǎo)時加入低蛋白乳清粉誘導(dǎo)劑(緩慢流加)。實(shí)施例4與現(xiàn)有表達(dá)方式的對比4.1搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)一級種子的制備：將從-70℃冰箱中取出含有雞傳染性法氏囊IBDVVP2重組菌的甘油保藏管于冰水浴中解凍，混勻后以1％接種量接到含有5mL培養(yǎng)基的試管中，并加入終濃度為100μg/mL的氨芐青霉素溶液，于37℃的恒溫?fù)u床中震蕩培養(yǎng)12h，轉(zhuǎn)速為220rpm/min。在搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)中，一級種子的接菌量為1％體積比，37℃，220rpm培養(yǎng)。當(dāng)菌體OD600值生長至0.6左右時迅速降溫至28℃，并加入誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)，在誘導(dǎo)不同時間點(diǎn)取樣離心破碎并用標(biāo)準(zhǔn)血清檢測瓊擴(kuò)效價(即AGP，表明可溶性蛋白的瓊擴(kuò)效價)，結(jié)果見表1，其中誘導(dǎo)8h時的瓊擴(kuò)實(shí)驗(yàn)見圖1。表1搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)不同誘導(dǎo)劑在不同誘導(dǎo)時間后VP2蛋白瓊擴(kuò)效價AGP由表1結(jié)果可知：在搖瓶發(fā)酵中，低蛋白乳清粉作為誘導(dǎo)劑時，誘導(dǎo)8h時效果(1:64)與IPTG-甘油的效果(1:64)相當(dāng)，并且優(yōu)于IPTG單獨(dú)的誘導(dǎo)結(jié)果(1:32)，表明可溶性蛋白的表達(dá)量相當(dāng)于IPTG-甘油的，高于IPTG單獨(dú)誘導(dǎo)時的結(jié)果；低蛋白乳清粉-蔗糖作為誘導(dǎo)劑時，誘導(dǎo)8h時效果(1:128)優(yōu)于低蛋白乳清粉單獨(dú)作為誘導(dǎo)劑、IPTG-甘油作為誘導(dǎo)劑使用時的效果(1:64)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于IPTG單獨(dú)作為誘導(dǎo)劑時的效果(1:32)，表明可溶性蛋白的表達(dá)量高于IPTG-甘油的、IPTG單獨(dú)的結(jié)果，為擴(kuò)大發(fā)酵提供了理論依據(jù)。4.2發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)一級種子的制備：將從-70℃冰箱中取出含有雞傳染性法氏囊IBDVVP2重組菌的甘油保藏管于冰水浴中解凍，混勻后以1％接種量接到含有5mL培養(yǎng)基的試管中，并加入終濃度100μg/mL氨芐青霉素溶液，于37℃的恒溫?fù)u床中震蕩培養(yǎng)12h，轉(zhuǎn)速為220rpm/min。二級種子的制備：把一級種子按5％(V/V)的接種量接入到含500mL三角瓶中，裝液量為體積百分比20％，并加入終濃度100μg/mL氨芐青霉素溶液，于37℃的恒溫?fù)u床中震蕩培養(yǎng)12h，轉(zhuǎn)速為220rpm/min。發(fā)酵和誘導(dǎo)：將二級種子按10％(V/V)的接種量接種于含發(fā)酵培養(yǎng)基的10L發(fā)酵罐中，37℃培養(yǎng)，初始攪拌為300rpm，初始通氣量為300L/h，當(dāng)DO值降低至15％時緩慢增加通氣量至500L/h；當(dāng)pH上升、DO值上升時開始按DO值反饋慢速流加補(bǔ)料培養(yǎng)基，至DO值大于35％時自動流加補(bǔ)料培養(yǎng)基；當(dāng)菌體濃度OD600至20左右時降溫至28℃后開始添加含100μg/mL氨芐青霉素的所述誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)，至DO值大 于35％時慢速流加含100μg/mL氨芐青霉素的所述誘導(dǎo)劑，于誘導(dǎo)8h后收取發(fā)酵液，離心后收取含IBDV重組抗原蛋白的菌體。誘導(dǎo)表達(dá)后的結(jié)果見表2和圖2。表210L發(fā)酵罐中不同誘導(dǎo)劑條件以及不同誘導(dǎo)時間下目的蛋白的瓊擴(kuò)效價AGP對比結(jié)果表3不同誘導(dǎo)劑的市場價格及發(fā)酵過程中每升用量與成本誘導(dǎo)劑市場價(每千克)每升用量(g)每升成本價(元)IPTG10000-250000.050.5-1.2IPTG-甘油10000-250000.050.5-1.2低蛋白乳清粉6-10100.06-0.1低蛋白乳清粉-蔗糖6-10100.06-0.1注：從誘導(dǎo)開始到結(jié)束所消耗的IPTG誘導(dǎo)補(bǔ)料培養(yǎng)基、IPTG-甘油誘導(dǎo)補(bǔ)料培養(yǎng)基低蛋白乳清粉誘導(dǎo)補(bǔ)料培養(yǎng)基、低蛋白乳清粉-蔗糖誘導(dǎo)補(bǔ)料培養(yǎng)基的使用量均約為50ml/L。甘油和蔗糖的價格低廉，可忽略。由表2-3及圖2可知：大批量生產(chǎn)時，當(dāng)?shù)偷鞍兹榍宸圩鳛檎T導(dǎo)劑時，得到的大腸桿菌BL21(DE3)菌體濃度(OD600為39)與IPTG-甘油的相當(dāng)(OD600為40)且高于IPTG的(OD600為20)，誘導(dǎo)8h時效果(1:64)與IPTG-甘油的效果(1:64)相當(dāng)并優(yōu)于IPTG單獨(dú)的誘導(dǎo)結(jié)果(1:32)，表明菌體得率高，可溶性蛋白的表達(dá)量相當(dāng)于IPTG-甘油的，高于IPTG單獨(dú)誘導(dǎo)時的結(jié)果；當(dāng)?shù)偷鞍兹榍宸?蔗糖作為誘導(dǎo)劑時，得到的大腸桿菌BL21(DE3)菌體濃度(OD600為60)高于其他誘導(dǎo)劑的效果，誘導(dǎo)8h時效果(1:128) 優(yōu)于低蛋白乳清粉單獨(dú)、IPTG-甘油作為誘導(dǎo)劑使用時的效果(1:64)，是IPTG單獨(dú)誘導(dǎo)時的4倍，表明菌體得率更高，可溶性蛋白的表達(dá)量高于IPTG-甘油的、IPTG單獨(dú)誘導(dǎo)時的結(jié)果。同時，因?yàn)榈偷鞍兹榍宸凼莵碜怨I(yè)生產(chǎn)奶酪制品的副產(chǎn)物，價格較為便宜(成本僅為IPTG的1/10左右)，無毒無害，且誘導(dǎo)補(bǔ)料培養(yǎng)基中的蔗糖用量要少，進(jìn)一步降低誘導(dǎo)補(bǔ)料培養(yǎng)基的生產(chǎn)成本。實(shí)施例5不同誘導(dǎo)劑所得的菌體濕重和目的蛋白瓊擴(kuò)效價對比將IPTG-甘油、低蛋白乳清粉、低蛋白乳清粉-蔗糖三種不同誘導(dǎo)劑分別按照實(shí)施例4.2實(shí)驗(yàn)進(jìn)行制備并收取含IBDV重組抗原蛋白的菌體，通過離心測沉淀的方法測定菌體濕重，測定結(jié)果見表4。將收取含IBDV重組抗原蛋白的菌體經(jīng)離心破碎后收集上清并進(jìn)行檢測，以中國獸醫(yī)監(jiān)察所的雞傳染性法氏囊標(biāo)準(zhǔn)陽性血清作為對照，用瓊擴(kuò)實(shí)驗(yàn)測定IBDVVP2蛋白的AGP效價(賀榮蓮，雞傳染性法氏囊病快速診斷方法的研究。中國獸醫(yī)雜志，1995，2(6)：3-6)，具體步驟詳見傅先強(qiáng)主編的《養(yǎng)禽場禽病檢驗(yàn)手冊》(北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1994.51-52)。表4相同條件下不同誘導(dǎo)劑的菌體濕重、瓊擴(kuò)效價AGP對比結(jié)果誘導(dǎo)補(bǔ)料培養(yǎng)基誘導(dǎo)條件菌體濕重IBDVVP2蛋白AGP效價IPTG-甘油28℃/8h40.3g/L1:64低蛋白乳清粉28℃/8h38.4g/L1:64低蛋白乳清粉-蔗糖28℃/8h60.7g/L1:128由表4可知：低蛋白乳清粉與IPTG-甘油誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體濕重差距較小，IBDVVP2可溶性蛋白的AGP效果則一樣。低蛋白乳清粉-蔗糖的誘導(dǎo)效果明顯優(yōu)于低蛋白乳清粉、IPTG-甘油的誘導(dǎo)效果，且IBDVVP2可溶性蛋白的AGP最高可達(dá)到1:128，同時菌體濕重明顯增高，可達(dá)到60.7g/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于IPTG-甘油和低蛋白乳清粉的誘導(dǎo)表達(dá)效果。綜上所述，本發(fā)明所用的蛋白乳清粉、蛋白乳清粉-蔗糖作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)，得到的大腸桿菌BL21(DE3)菌體得率高，菌體濃 度OD600可達(dá)到40-80，菌體濕重達(dá)到40-75g/L，獲得的目的蛋白占菌體總蛋白的水平可高達(dá)10％-15％，優(yōu)于ITPG的誘導(dǎo)水平；而且誘導(dǎo)后可溶性蛋白的表達(dá)量相當(dāng)甚至高于IPTG或IPTG-甘油誘導(dǎo)后的表達(dá)效果；且蛋白乳清粉無毒無害，價廉易得，生產(chǎn)成本低，便于大規(guī)模生產(chǎn)。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3