本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及獲得一種露地菊‘火焰’的早花新品系。

背景技術(shù)：

露地菊(Chrysanthemum morifolium)，為菊科菊屬、多年生草本植物，是我國(guó)傳統(tǒng)露地栽培觀賞植物之一，具有花色豐富、花期長(zhǎng)、株型整齊等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于規(guī)模化園林綠化。在高緯度的寒冷地區(qū)，露地菊能夠正常生長(zhǎng)，但其受光周期依賴(lài)，開(kāi)花時(shí)間大多集中在9月至10月，盛花期恰遇霜凍期，露地菊在霜降后花色開(kāi)始褪變，致使其觀賞性下降、觀賞期大幅縮短。然而基因工程技術(shù)的興起，可以進(jìn)行定向育種而不改變其它性狀，即采用先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)，將目的基因或DNA片段通過(guò)載體或直接導(dǎo)入受體細(xì)胞，使遺傳物質(zhì)重新組合。由于轉(zhuǎn)基因技術(shù)的安全性問(wèn)題備受關(guān)注，本發(fā)明以利用對(duì)生物安全的非抗生素標(biāo)記基因——6-磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(PMI)，以甘露糖為篩選介質(zhì)，只有轉(zhuǎn)入了PMI基因的外植體細(xì)胞能代謝6-磷酸甘露糖，從而為細(xì)胞正常生長(zhǎng)分化提供能量，而未轉(zhuǎn)入PMI基因的細(xì)胞則不能在篩選培養(yǎng)基上繼續(xù)生長(zhǎng)。

菊花遺傳轉(zhuǎn)化方法主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和直接導(dǎo)入法，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法以其易操作、低費(fèi)用、高效率、插入DNA片段大、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，成為轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的首選方法。轉(zhuǎn)基因花卉可明顯克服當(dāng)前常規(guī)育種的盲目性，縮短育種周期，可創(chuàng)造出技術(shù)含量高、市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)明顯的花卉新品種。花卉具有極高的觀賞價(jià)值，同時(shí)也蘊(yùn)涵的巨大經(jīng)濟(jì)利益，花卉基因工程的發(fā)展十分迅速，自1987年Meyer等獲得轉(zhuǎn)基因矮牽牛以來(lái)，花卉基因工程已成為花卉育種的新趨勢(shì)。 它通過(guò)抑制內(nèi)源基因或?qū)胪庠椿驈亩ㄏ蚋脑旎ɑ?，縮短了新品種選育的時(shí)間，而且可以突破種間不親和的限制，引入其他物種的基因，改良花卉品質(zhì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是為了獲得提前開(kāi)花的露地菊‘火焰’新品系，通過(guò)基因工程技術(shù)，從擬南芥中克隆出LEAFY基因。利用Gateway技術(shù)構(gòu)建植物過(guò)表達(dá)載體，將構(gòu)建的載體pCAMBIA1301-PMI-AtLFY電轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中。通過(guò)農(nóng)桿菌侵染外植體露地菊‘火焰’葉片進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)、共培養(yǎng)、前期篩選培養(yǎng)、后期篩選培養(yǎng)、生根篩選培養(yǎng)等階段，利用載體上生物安全標(biāo)記phosphomannose isomerase(PMI)基因在含有甘露糖的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，最終獲得轉(zhuǎn)AtLFY基因的抗性植株218株。然后對(duì)這些抗性植株利用PCR、GUS染色、Western blot等方法進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)。PCR檢測(cè)時(shí)分別檢測(cè)了抗性植株的PMI基因和特異基因AtLFY，檢測(cè)獲得轉(zhuǎn)AtLFY基因的陽(yáng)性植株13株。將這13株轉(zhuǎn)基因植株和野生型同時(shí)轉(zhuǎn)入田間，觀察轉(zhuǎn)基因植株現(xiàn)蕾時(shí)間、始花時(shí)間、盛花時(shí)間并與野生型植株進(jìn)行比較，篩選獲得露地菊‘火焰’早花品系，使其盛花期早于霜降期，延長(zhǎng)觀賞時(shí)間，因此本發(fā)明開(kāi)展對(duì)露地菊‘火焰’的花期調(diào)控是十分必要的。

附圖說(shuō)明

圖1為pCAMIB1301載體圖；圖2為抗性植株P(guān)CR檢測(cè)電泳圖；圖3為轉(zhuǎn)基因植株的GUS染色檢測(cè)結(jié)果圖；圖4轉(zhuǎn)基因植株的表型鑒定(現(xiàn)蕾期)；圖5轉(zhuǎn)基因植株的表型鑒定(露紅期)；圖6轉(zhuǎn)基因植株的表型鑒定(初開(kāi)期)；圖7轉(zhuǎn)基因植株的表型鑒定(盛花期)。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明技術(shù)方案如下：

(一)目標(biāo)基因AtLEAFY的克隆及過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建

首先利用RT-PCR的方法，從擬南芥中克隆得到基因LEAFY(Sequence ID:ref|NM_125579.1，Length:1263)，利用Gateway技術(shù)構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體，構(gòu)建表達(dá)載體的引物為：

attB-LFY–F 5′-AAAAAGCAGGCTATGGATCCTGAAGGTTTCACG-3′

attB-LFY–R 5′-AGAAAGCTGGGTCTAGAAACGCAAGTCGTCGC-3′

attB-adapter-F 5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3′

attB-adapter-R 5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3′

然后利用農(nóng)桿菌反復(fù)凍融法，將構(gòu)建好的過(guò)表達(dá)在體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，將農(nóng)桿菌菌液全部涂于一個(gè)LB固體培養(yǎng)基平板上，20℃靜置培養(yǎng)24hrs。挑取單個(gè)菌落在LB液體培養(yǎng)基中(Kana和rif抗性)，在28℃搖菌培養(yǎng)后使用attB-adapter-F/R引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，將PCR產(chǎn)物送測(cè)序并保存菌種備用。

(二)露地菊‘火焰’的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株鑒定

首先利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法進(jìn)行露地菊‘火焰’遺傳轉(zhuǎn)化，具體方法如下：

(1)預(yù)培養(yǎng)：以露地菊‘火焰’無(wú)菌苗幼嫩葉片為試材，將葉片切成1cm×1cm小塊，接種到預(yù)培養(yǎng)基上進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)1天。

(2)搖菌：3mL LB液體+3μL Kana+3μL rif中加入5μL農(nóng)桿菌菌液，28℃160rpm 12hrs。

(3)侵染與共培養(yǎng)：將過(guò)夜搖的菌液取1ml加入50ml LB液體中并加入50μL Kana，28℃160rpm兩個(gè)小時(shí)左右，測(cè)其OD₆₀₀值，使其達(dá)到0.5-0.6。將預(yù)培養(yǎng)的葉片放入菌液中并加入乙酰丁香酮濃度為500mg/L，侵染10min，侵染時(shí)要輕輕搖動(dòng)菌液，使每一塊外植體都能與菌液充分接觸。用滅菌濾紙吸去葉片表面 附著的多余菌液，待葉片表面無(wú)明顯水分后，然后將其接入共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)2天。

(4)篩選培養(yǎng)：采用選擇壓遞增的方式進(jìn)行篩選，將共培養(yǎng)的葉片在超凈工作臺(tái)內(nèi)轉(zhuǎn)入到前期篩選的培養(yǎng)基中，當(dāng)外植體葉片上可以看到微小的愈傷組織后將其轉(zhuǎn)入后期篩選培養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)一步的篩選，每15天換一次培養(yǎng)基。

(5)生根培養(yǎng)：當(dāng)分化的芽長(zhǎng)度為1cm到2cm的時(shí)候，將抗性苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，促進(jìn)生根，每15天到20天換一次培養(yǎng)基，獲得抗性植株。

然后以獲得的露地菊‘火焰’抗性植株總DNA為模板，以LR反應(yīng)的質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，以野生型菊花為陰性對(duì)照，分別以PMI基因和AtLFY基因特異引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。

(6)培養(yǎng)基配方

預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基：MS+BA 0.5mg/L+NAA 1.5mg/L+sucrose 30g/L

共培養(yǎng)培養(yǎng)基：1/2MS+BA 0.5mg/L+NAA 1.5mg/L+sucrose 30g/L

延遲培養(yǎng)培養(yǎng)基：MS+BA 0.5mg/L+NAA 1.5mg/L+sucrose 30g/L

前期篩選培養(yǎng)基：MS+BA 0.5mg/L+NAA 1.5mg/L+sucrose 22g/L+mannose 8g/L+cef 300mg/L

后期篩選培養(yǎng)基：MS+BA 0.5mg/L+NAA 1.5mg/L+sucrose 20g/L+mannose 10g/L+cef 300mg/L

生根培養(yǎng)培養(yǎng)基：1/2MS+sucrose 20g/L+mannose 10g/L+cef 100mg/L

然后對(duì)初步PCR鑒定的轉(zhuǎn)基因露地菊‘火焰’，取幼嫩葉片，浸泡到GUS染液中，用真空抽濾器對(duì)其進(jìn)行真空滲透，反復(fù)幾次后，將其放入37℃溫箱中保溫20-22hrs。將葉片轉(zhuǎn)入75％的乙醇中進(jìn)行脫色3到5天，期間不斷換新的75％的 乙醇，至陰性對(duì)照材料呈現(xiàn)出黃白色。在肉眼或顯微鏡下進(jìn)行觀察，白色背景上的藍(lán)色小斑點(diǎn)即GUS表達(dá)位點(diǎn)。

最后對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的進(jìn)行表型鑒定，將檢測(cè)獲得的陽(yáng)性植株13株轉(zhuǎn)基因植株和野生型同時(shí)轉(zhuǎn)入田間，觀察轉(zhuǎn)基因植株現(xiàn)蕾時(shí)間、始花時(shí)間、盛花時(shí)間與野生型植株進(jìn)行比較，篩選獲得花期提前7-11天的露地菊‘火焰’早花品系9個(gè)。