本發(fā)明涉及微生物合成生物學(xué)、基因組工程和分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及CRISPR/Cas9介導(dǎo)的大片段DNA拼接方法。
背景技術(shù)：
：合成生物學(xué)是一個新興的研究領(lǐng)域。2010年，美國科學(xué)家Venter及其研究團隊報道了世界上首個人造生命〔Gibson，D.G等，Creationofabacterialcellcontrolledbyachemicallysynthesizedgenome，Science，2010，329(5987):p.52-6〕，這一舉世矚目的研究成果使得合成生物學(xué)成為現(xiàn)代生命科學(xué)的研究熱點。DNA合成、大片段拼接和基因組移植技術(shù)的發(fā)展是合成生物學(xué)研究中重要的技術(shù)基礎(chǔ)。Venter及其研究團隊發(fā)展的DNA體外拼接〔Gibson，D.G.等，Completechemicalsynthesis，assembly，andcloningofaMycoplasmagenitaliumgenome，Science，2008，319(5867):p.1215-20〕和體內(nèi)拼接〔Gibson，D.G等，2010，同前〕技術(shù)被廣泛應(yīng)用于合成生物學(xué)研究中。DNA體外拼接的原理是將末端具有同源序列的DNA經(jīng)3’-5’核酸外切酶處理，產(chǎn)生的單鏈突出端經(jīng)退火復(fù)性后可以將多個DNA片段拼接在一起，而單鏈的缺刻可以被DNA聚合酶和DNA連接酶修復(fù)，從而形成完整的拼接片段。DNA體內(nèi)拼接體系是利用酵母體內(nèi)高效的同源重組系統(tǒng)，將末端具有同源序列的DNA片段連同線性化的載體轉(zhuǎn)入酵母體內(nèi)進行拼接。通過這兩個技術(shù)，Venter等〔Gibson，D.G.等，2008，同前〕已經(jīng)成功拼接裝配了580kb的生殖道支原體(Mycoplasmagenitalium)基因組。不僅如此，他們還全合成了1.08Mbp的絲狀支原體(M.mycoides)基因組JCVI-syn1.0，并移植導(dǎo)入到山羊支原體(M.capricolum)細胞中，獲得了由合成的絲狀支原體基因組控制的細胞，首次成功實現(xiàn)了人造生命〔Gibson，D.G等，2010，同前〕。隨后，2014年Boeke等領(lǐng)導(dǎo)的研究團隊人工合成了具有功能的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)III號染色體〔Annaluru，N.等，Totalsynthesisofafunctionaldesignereukaryoticchromosome，Science，2014，344(6179):p.55-8〕，這是第一個人工合成的真核生物的染色體，標志著人類向人工合成生命又邁進了一步。盡管DNA的合成成本隨著技術(shù)的進步而不斷降低，然而超大片段的DNA甚至是完整基因組的組裝由于受限于大片段DNA的操作困難，效率仍然是比較低的。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明第一方面提供一種核酸構(gòu)建物，該核酸構(gòu)建物含有與cas9基因操作性連接的酵母Tef1啟動子，且該核酸構(gòu)建物能在酵母中組成型表達Cas9。在一個具體實施例中，該核酸構(gòu)建物是質(zhì)粒。在一個具體實施例中，該核酸構(gòu)建物還含有來自pBR322的復(fù)制起始位點及其篩選標記，如氨芐青霉素抗性基因。在一個具體實施例中，所述核酸構(gòu)建物還含有來源于CEN6ARS4的復(fù)制區(qū)及其篩選標記，如MET14。在一個具體實施例中，所述核酸構(gòu)建物在酵母中為單拷貝復(fù)制，在大腸桿菌中為高拷貝復(fù)制。在一個具體實施例中，所述核酸構(gòu)建物含有依次操作性相連的來自pBR322的復(fù)制起點、啟動子Tef1、cas9基因、終止序列CYC1、lacZα、f1起點、篩選標記Met14、來自CEN6ARS4的復(fù)制區(qū)以及篩選標記氨芐青霉素抗性基因。在一個具體實施例中，所述核酸構(gòu)建物含有SEQIDNO:1第65-319位堿基所示的來自CEN6ARS4的復(fù)制區(qū)和SEQIDNO:1第3610-7749位堿基所示的cas9基因。在一個具體實施例中，所述核酸構(gòu)建物如SEQIDNO:1所示。本發(fā)明第二方面提供一種核酸構(gòu)建物，所述核酸構(gòu)建物在酵母中組成型表達sgRNA，所述sgRNA含有操作性連接的酵母啟動子SNR52、20bp識別位點和HandleCas9序列。在一個具體實施例中，所述核酸構(gòu)建物是質(zhì)粒。在一個具體實施例中，所述核酸構(gòu)建物還含有來源于2μ的載體復(fù)制區(qū)及其篩選標記，如TRP1。在一個具體實施例中，所述核酸構(gòu)建物還含有來自pBR322的復(fù)制起始位點及其篩選標記，如氨卞青霉素抗性基因。在一個具體實施例中，所述核酸構(gòu)建物含有依次操作性相連的來自pBR322的復(fù)制起點、SNR52啟動子、20bp識別位點1、HandleCas9序列、SNR52啟動子、20bp識別位點2、HandleCas9序列、CYC1引物、CYC1終止序列、lacZα、f1起點、TRP1、來源于2μ的載體復(fù)制區(qū)和氨芐抗性基因。在一個具體實施例中，所述核酸構(gòu)建物含有SEQIDNO:2第4624-4998和第5012-5386位所示的序列。在一個具體實施例中，所述核酸構(gòu)建物如SEQIDNO:2所示。本發(fā)明第三方面提供一種核酸構(gòu)建物，該核酸構(gòu)建物含有來源于CEN6ARS4的載體復(fù)制區(qū)及其篩選標記如ADE2，和來源于pBeloBAC11的載體復(fù)制起點及分配區(qū)及其篩 選標記如氯霉素抗性基因。在一個具體實施例中，所述核酸構(gòu)建物是質(zhì)粒。在一個具體實施例中，所述核酸構(gòu)建物含有操作性相連的來源于CEN6ARS4的載體復(fù)制區(qū)、篩選標記ADE2、氯霉素抗性基因、分配調(diào)控基因rctB、弧菌二號染色體復(fù)制區(qū)oriCII、以及分配調(diào)控基因inc、rctA、parA和parB。在一個具體實施例中，所述核酸構(gòu)建物如SEQIDNO:3所示。本發(fā)明第四方面提供一種細胞，所述細胞含有本發(fā)明任意一種、兩種或全部三種核酸構(gòu)建物。在一個具體實施例中，所述細胞為大腸桿菌或酵母細胞。在一個具體實施例中，所述核酸構(gòu)建物以游離的質(zhì)粒形式存在于所述細胞中。在一個具體實施例中，所述核酸構(gòu)建物在所述細胞中組成型表達。本發(fā)明第五方面提供一種拼接DNA的方法，所述方法包括：(1)將含有待拼接的DNA序列的供體質(zhì)粒、能在酵母中組成型表達Cas9的核酸構(gòu)建物、用于拼接的線性化的受體載體和能夠引導(dǎo)Cas9切割供體質(zhì)粒的含sgRNA的核酸構(gòu)建物轉(zhuǎn)入步驟同一酵母細胞中；和(2)孵育步驟(1)所述的酵母細胞；從而實現(xiàn)DNA拼接。在一個具體實施例中，通過酵母原生質(zhì)體融合技術(shù)將含有待拼接的DNA序列的供體質(zhì)粒和能在酵母中組成型表達Cas9的核酸構(gòu)建物轉(zhuǎn)移到同一酵母細胞中。在一個具體實施例中，采用醋酸鋰法將用于拼接的線性化的受體載體和能夠引導(dǎo)Cas9切割供體質(zhì)粒的含sgRNA的核酸構(gòu)建物轉(zhuǎn)入酵母細胞中。在一個具體實施例中，先采用原生質(zhì)體融合技術(shù)將含有待拼接的DNA序列的供體質(zhì)粒和能在酵母中組成型表達Cas9的核酸構(gòu)建物轉(zhuǎn)入酵母細胞中，然后采用LiAc法將用于拼接的線性化的受體載體和能夠引導(dǎo)Cas9切割供體質(zhì)粒的含sgRNA的核酸構(gòu)建物轉(zhuǎn)入上述酵母細胞中。在一個具體實施例中，供體質(zhì)粒包含酵母中的單拷貝復(fù)制區(qū)、篩選標記、能被sgRNA識別的序列以及能被Cas9識別切割的序列。在一個具體實施例中，待拼接的DNA兩端含有與其拼接的DNA末端同源的序列。在一個具體實施例中，所述同源序列長度為300～800bp，例如約500bp。在一個具體實施例中，除在DNA兩端外，在DNA的其它區(qū)域不存在與所述同源序列同源的序列。在一個具體實施例中，受體載體兩端含有與待拼接的DNA的兩端同源的的序列。在一個具體實施例中，所述同源序列的長度為60～500bp，例如約60～100bp。在一個具體實施例中，所述能在酵母中組成型表達Cas9的質(zhì)粒為本發(fā)明第一方面所述的核酸構(gòu)建物。在一個具體實施例中，所述受體載體為本發(fā)明第三方面所述的核酸構(gòu)建物。在一個具體實施例中，所述含sgRNA的質(zhì)粒為本發(fā)明第二方面所述的核酸構(gòu)建物。在一個具體實施例中，步驟(2)之后，通過受體載體、能表達Cas9的質(zhì)粒和以及含sgRNA的質(zhì)粒上的標記篩選出需要的轉(zhuǎn)化子。在一個具體實施例中，本發(fā)明方法包括：(i)將本發(fā)明上述第一、二和三方面所述的核酸構(gòu)建物和含有待拼接的DNA序列的供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入同一酵母細胞中；和(ii)孵育步驟(i)所述的酵母細胞；從而實現(xiàn)DNA拼接。本發(fā)明還提供一種試劑盒，所述試劑盒含有本發(fā)明前述第一、二和三方面所述的任意一種、任意兩種或全部三種核酸構(gòu)建物；和任選的本發(fā)明所述的供體質(zhì)粒。試劑盒中還可任選得含有用于通過酵母原生質(zhì)體融合技術(shù)或LiAc法將所述核酸構(gòu)建物或供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母細胞所需的各種試劑。附圖說明圖1顯示CRISPR/Cas9介導(dǎo)的大片段DNA拼接方法原理圖。三個含有不同供體質(zhì)粒的酵母菌(其中一個酵母菌含有Cas9表達質(zhì)粒)通過原生質(zhì)體融合，使三個質(zhì)粒融合到同一個酵母細胞中；LiAc轉(zhuǎn)化線性化受體載體和psgRNA。sgRNA在酵母體內(nèi)表達后與Cas9結(jié)合，將后者定位到特定識別位點使其可以切割供體質(zhì)粒上大片段DNA兩端附近的位點(箭頭所指位置)，切割下的片段與線性受體載體在酵母體內(nèi)通過同源重組拼接成環(huán)形質(zhì)粒。圖2顯示CRISPR/Cas9介導(dǎo)的大片段DNA拼接方法流程圖。通過原生質(zhì)體融合方法可以將Cas9表達質(zhì)粒和所有供體質(zhì)粒融合到同一個酵母細胞中，該步驟需要7天時間。在此期間可以準備線性化的受體載體以及進行psgRNA的構(gòu)建。通過LiAc法將線性化受體載體和psgRNA轉(zhuǎn)化進入已包含了Cas9表達質(zhì)粒和所有供體質(zhì)粒的酵母細胞中。CRISPR/Cas9在酵母體內(nèi)的表達可以切割供體質(zhì)粒釋放大片段DNA，利用酵母的同源重組系統(tǒng)，這些含同源臂的大片段DNA與線性受體載體可以正確拼接成環(huán)形質(zhì)粒，該步驟需要5天時間。圖3顯示Cas9表達質(zhì)粒pMetcas9示意圖。質(zhì)粒pMetcas9含有啟動子Tef1使Cas9可在酵母中組成型表達。該質(zhì)粒含酵母復(fù)制區(qū)(CEN6ARS4)和篩選標記(MET14)，在酵母中為單拷貝復(fù)制；同時含大腸桿菌復(fù)制區(qū)(來源于pBR322)和篩選標記氨芐青霉 素(Ampicillin)，在大腸桿菌中為高拷貝復(fù)制。序列見SEGIDNO:1。圖4顯示sgRNA表達質(zhì)粒psgRNA示意圖。質(zhì)粒psgRNA含有的啟動子SNR52使sgRNATarget1和Target2可在酵母中組成型表達。該質(zhì)粒含酵母復(fù)制區(qū)(來源于2μ)和篩選標記(TRP1)，在酵母中為多拷貝復(fù)制；同時含大腸桿菌復(fù)制區(qū)(來源于pBR322)和篩選標記氨芐青霉素(Ampicillin)，在大腸桿菌中為高拷貝復(fù)制。序列見SEGIDNO:2。圖5顯示線性化載體模板pcriv0質(zhì)粒示意圖。質(zhì)粒pcriv0含酵母復(fù)制區(qū)(CEN6ARS4)和篩選標記(ADE2)，在酵母中為單拷貝復(fù)制；同時含弧菌二號染色體復(fù)制區(qū)oriCII及分配調(diào)控相關(guān)基因rctA、rctB、inc、parA、parB和氯霉素篩選標記，在大腸桿菌中為單拷貝復(fù)制。序列見SEGIDNO:3。圖6顯示pCriv6酶切驗證圖及示意圖。A顯示pCriv6酶切驗證圖，其中M為LambdaLadderPFGMarker；1為pCriv6NotI酶切pCriv6；2為SpeI酶切pCriv6。pCriv6經(jīng)NotI酶切得到311kb大小的一條帶，而經(jīng)SpeI酶切可以得到98kb和213kb大小的兩條帶。PFGE條件：1％瓊脂糖凝膠，6V/cm，14℃，16小時，轉(zhuǎn)換時間1－25秒；B顯示pCriv6示意圖。圖7顯示pCriv7酶切結(jié)果及示意圖。A為pCriv7酶切驗證圖，其中M為LambdaLadderPFGMarker；1為SpeI酶切pCriv7。pCriv7經(jīng)SpeI酶切得到片段200kb、182kb、157kb、98kb、32kb大小的五條帶。其中32kb條帶與酵母染色體碎片大小相近，因此在膠上無法分開。PFGE條件：1％瓊脂糖凝膠，6V/cm，14℃，16小時，轉(zhuǎn)換時間1－25秒；B為pCriv7示意圖。具體實施方式本發(fā)明旨在發(fā)展一種高效拼接大片段DNA的方法。利用該發(fā)明減少了困難且低效率的大片段DNA的體外操作，使大片段DNA的拼接變得簡單易行。本發(fā)明提供了一種利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，在酵母中高效拼接DNA的方法(原理見圖1)。通過酵母原生質(zhì)體融合技術(shù)，將含有待拼接的兩端帶有同源序列的大片段DNA的供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到同一個酵母細胞中，同時該酵母細胞中含有一個組成型表達Cas9的質(zhì)粒；LiAc法共同轉(zhuǎn)化一個用于拼接的線性化受體載體和一個能夠切割供體載體的sgRNA質(zhì)粒；供體載體被切割后，大片段DNA通過酵母體內(nèi)同源重組拼接到受體載體上，通過受體載體、Cas9載體和sgRNA載體上的標記篩選出需要的轉(zhuǎn)化子(見圖2)。與前人已建立的拼接方法相比，本方法的優(yōu)點在于實驗操作過程中避免了繁瑣低效的體外抽取、酶切、回收及轉(zhuǎn)化大片段DNA的步驟，使實驗過程變得簡單、易操作。本發(fā)明對待拼接DNA的大小沒有嚴格限制，有應(yīng)用于超大片段DNA的拼接的潛力，比如用于拼接幾兆 堿基對的基因組的組裝和拼接。例如，適用于本發(fā)明方法拼接的DNA片段至少為100kbp，例如至少500kbp，可達幾兆堿基對。本文中，高拷貝復(fù)制指拷貝數(shù)大于1，一般指5以上，例如10以上。本發(fā)明具有下列詳細特征：Cas9表達載體的構(gòu)建：構(gòu)建在大腸桿菌中為高拷貝復(fù)制(復(fù)制起始位點來源于pBR322，篩選標記為氨芐青霉素(Ampicillin)抗性基因)，在酵母中單拷貝復(fù)制(載體復(fù)制區(qū)來源于CEN6ARS4，篩選標記MET14)且能組成型表達Cas9的質(zhì)粒pMetcas9。CEN6ARS4可獲自pSH47(Guldener,U.等，Anewefficientgenedisruptioncassetteforrepeateduseinbuddingyeast，NucleicAcidsResearch24(13):2519-2524)。該復(fù)制區(qū)序列可如SEQIDNO:1第65-319位堿基所示。Cas9的序列可如SEQIDNO:1第3610-7749位堿基所示。HpaI、SpeI雙酶切質(zhì)粒p415-GalL-hCAS9〔DiCarlo，J.E.等，GenomeengineeringinSaccharomycescerevisiaeusingCRISPR-Cassystems，NucleicAcidsResearch，2013，41(7):p.4336-4343〕，回收兩個5.4kbp的片段。PCR擴增MET14標記(以釀酒酵母S.cerevisiaes288c基因組為模板)和Tef1啟動子(以質(zhì)粒pAG36〔Goldstein，A.L.等，ThreenewdominantdrugresistancecassettesforgenedisruptioninSaccharomycescerevisiae.Yeast.1999Oct；15(14):1541-53〕為模板)，通過引物3’端帶上40bp與待拼接的相鄰片段的同源序列，PCR產(chǎn)物純化后轉(zhuǎn)入酵母體內(nèi)進行拼接，拼接的質(zhì)粒經(jīng)PCR及測序驗證正確后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B，抽取質(zhì)粒備用。圖3顯示了本發(fā)明pMetcas9的質(zhì)粒圖譜，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。sgRNA表達載體構(gòu)建：構(gòu)建在大腸桿菌中為高拷貝復(fù)制(復(fù)制起始位點來源于pBR322，篩選標記為氨芐青霉素抗性基因)，在酵母中多拷貝復(fù)制(載體復(fù)制區(qū)來源于2μ，篩選標記TRP1)且能組成型表達sgRNA的質(zhì)粒psgRNA。sgRNA包括SNR52啟動子、20bp識別位點和HandleCas9序列。所述20bp識別位點負責識別供體質(zhì)粒上的對應(yīng)的識別位點，而HandleCas9負責招募Cas9至切割位點，從而實現(xiàn)對供體質(zhì)粒的切割。所述20bp的識別位點可以根據(jù)供體質(zhì)粒載體的骨架序列隨意設(shè)計。在一個具體實施例中，SEQIDNO:2的第4624-4998位堿基顯示了sgRNA的序列，第5012-5386位堿基顯示另一sgRNA的序列，其包括了SNR5啟動子、20bp識別位點和HandleCas9序列。在本發(fā)明的例子中由于各供體質(zhì)粒所用的骨架都相同，所以只需要兩個識別位點就可以完成對所有供體質(zhì)粒的切割。20bp識別位點的序列可根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)的技術(shù)進行設(shè)計。表一顯示了本發(fā)明具體實施例中所用的兩個20bp的識別位點的序列。在一個具體實施例中，人工合成兩個DNA片段Target1(SEQIDNO:4)和Target2(SEQIDNO:5)，其中Target1用BglII和SpeI酶切，Target2用SpeI和NcoI酶切，分 別回收400bp大小的酶切片段，與BglII和NcoI酶切的載體pTRPgRNA(由質(zhì)粒p426-SNR52p-gRNA.Y-SUP4t〔DiCarlo，J.E.等，同上〕質(zhì)粒改造，將URA3篩選標記改為TRP1篩選標記)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B，得到含有兩個靶向識別位點的sgRNA的質(zhì)粒。拼接的質(zhì)粒經(jīng)PCR及測序驗證正確。表一：sgRNA識別序列圖4顯示了本發(fā)明psgRNA的質(zhì)粒圖譜，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。受體載體pcriv0的構(gòu)建和線性化：PCR擴增pcriv0載體的復(fù)制區(qū)(弧菌二號染色體復(fù)制區(qū)〔Egan，E.S.和M.K.Waldor，DistinctReplicationRequirementsfortheTwoVibriocholeraeChromosomes，Cell，2003，114(4):p.521-530〕)和氯霉素篩選標記(以商業(yè)化質(zhì)粒pBeloBAC11(NEB公司)為模板)，以及酵母復(fù)制區(qū)(來源于CEN6ARS4)和ADE2篩選標記(來源于釀酒酵母基因組)，通過引物3’端帶上40bp與待拼接的相鄰片段的同源序列。PCR產(chǎn)物純化后轉(zhuǎn)入酵母體內(nèi)進行拼接。陽性克隆經(jīng)PCR驗證及測序正確后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B。抽質(zhì)粒酶切驗證正確后，經(jīng)測序確認供體載體pcriv0的序列正確性。線性化的載體可以經(jīng)PCR擴增得到，通過引物帶上與待拼接大片段DNA同源的60～500bp、優(yōu)選60～200bp(例如約60bp)的序列。圖5顯示了本發(fā)明受體載體pcriv0的質(zhì)粒圖譜，其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。含大片段DNA的供體質(zhì)粒的準備：含有待拼接大片段DNA的供體質(zhì)粒需要包含酵母中單拷貝復(fù)制區(qū)(來源于CEN6ARS4)及不同的選擇標記。此外，大片段DNA兩端需要加入與待拼接的相鄰大片段DNA同源的300～800bp(例如500bp左右)的序列。所有同源序列在這些大片段DNA的其他區(qū)域無顯著同源序列。此外，應(yīng)理解，供體質(zhì)粒應(yīng)含有能被sgRNA識別的序列。通常，此序列位于供體載體骨架上大片段DNA插入位置的外側(cè)，并與sgRNA中的20bp識別位點相同。供體質(zhì)粒中還應(yīng)含有能被Cas9切割的位點，例如PAM位點?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域已知的技術(shù)設(shè)計這樣的序列。作為一個例子，可在供體質(zhì)粒上設(shè)計如下識別/切割位點：ATAGTGTCACCTAAATAGCTTGG和CGTAGCAACCAGGCGTTTAAGGG(即表一中的20bp序列加PAM位點)。應(yīng)理解，本發(fā)明方法可拼接2個以上大片段DNA。因此，本發(fā)明可使用兩個以上供體質(zhì)粒，例如3個、4個甚至更多個，只要這些供體質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)滿足上述要求即可。轉(zhuǎn)化/原生質(zhì)體融合：對于小于30kb的多個質(zhì)粒，可以用LiAc方法〔Gietz,R.D.和R.H.Schiestl，High-efficiencyyeasttransformationusingtheLiAc/SScarrierDNA/PEGmethod，NatureProtocols，2007，2(1):p.31-34〕轉(zhuǎn)化進入酵母中。大于30kb的質(zhì)粒由于用LiAc方法難以轉(zhuǎn)化進入酵母中，則需要采用酵母原生質(zhì)體融合方法〔Curran，B.P.和V.C.Bugeja，ProtoplastfusioninSaccharomycescerevisiae，Methodsinmolecularbiology(Clifton，NJ)，1996，53:p.45-9〕。兩個或三個含不同供體質(zhì)粒的酵母細胞可以一次融合，用全部質(zhì)粒的標記去篩選，會得到所有質(zhì)粒在同一個細胞中的酵母菌。大片段DNA在酵母體內(nèi)的拼接：將psgRNA和線性化受體載體轉(zhuǎn)化已包含所有待拼接大片段DNA質(zhì)粒的酵母細胞。在sgRNA和Cas9的共同作用下，切割所有供體質(zhì)粒，釋放出全部待拼接的大片段DNA。通過酵母體內(nèi)高效的同源重組系統(tǒng)，這些末端含有同源序列大片段DNA以及線性化的受體載體可以拼接在一起。通過共同篩選pMetcas9、psgRNA和受體載體所帶的營養(yǎng)缺陷標記，得到需要的轉(zhuǎn)化重組子。陽性克隆需要經(jīng)PCR、測序以及脈沖場凝膠電泳驗證。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook&Russell所著的MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆實驗指南第三版)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例1：兩個大片段DNA的拼接本例中選用本實驗室在釀酒酵母VL6-48中已分別構(gòu)建好的pSP5和pTP3-U質(zhì)粒(表二)。pSP5含有116643bp的供體DNA，命名為SP5；pTP3-U含有184475bp的供體DNA，命名為TP3。SP5和TP3序列均來源于大腸桿菌，它們是通過PCR擴增大腸桿菌某些必需基因，通過酵母菌內(nèi)兩級或三級拼接得到的較大質(zhì)粒，SP5右末端及TP3左末端有491bp的同源序列。表二：質(zhì)粒pSP5、pTP3-U信息供體質(zhì)粒篩選標記供體DNA名稱插入片段大小(bp)pSP5HIS3SP5116643pTP3-UURA3TP3184475將Cas9表達質(zhì)粒pMetcas9(圖3，SEQIDNO:1)轉(zhuǎn)入已含pSP5質(zhì)粒的酵母細胞VL6-48中。將VL6-48/pSP5/pMetcas9和VL6-48/pTP3-U進行原生質(zhì)體融合，酵母原生質(zhì)體融合方法和試劑配制參考文獻〔Curran，B.P.和V.C.Bugeja，ProtoplastfusioninSaccharomycescerevisiae，Methodsinmolecularbiology(Clifton，NJ)，1996.53:p.45-9〕和〔Kouprina，N.和V.Larionov，Selectiveisolationofgenomiclocifromcomplexgenomesbytransformation-associatedrecombinationcloningintheyeastSaccharomycescerevisiae，NatureProtocols，2008，3(3):p.371-377〕，在此基礎(chǔ)做了一定改進，其步驟為：1.VL6-48/pSP5/pMetcas9和VL6-48/pTP3-U分別在SC-Met，Ura和SC-His平板上劃線，30℃培養(yǎng)3天。2.挑酵母菌單菌落接至5ml相對應(yīng)的SC液體培養(yǎng)基中，30℃，200rpm過夜培養(yǎng)；3.過夜酵母菌液稀釋10倍測OD600，此時OD應(yīng)為0.3-0.5(表示生長良好)。1:20到1:25轉(zhuǎn)接到50ml相對應(yīng)的SC液體培養(yǎng)基，使起始OD600小于或等于0.2。30℃，200rpm培養(yǎng)至OD600為1.0-1.5，約5-6個小時。4.20℃，5000rpm離心5分鐘收菌，用30ml無菌水重懸，離心收菌；用20ml1M的無菌山梨醇溶液重懸細胞，5000rpm離心5分鐘收菌。5.用20mlSPE溶液(1M山梨糖醇，0.01M磷酸鈉，0.01MNa2EDTA，pH7.5)重懸細胞，加入20μl酵母裂解酶(zymolyase)溶液(20mg/mlZymolyase-20T，50％甘油，2.5％葡萄糖，50mMTris-HCl，pH8.0)和40μlβ-巰基乙醇，混勻，30℃處理30min。6.5℃，570g離心5分鐘收菌，用50ml1M山梨醇洗一次，300-600g離心5min收菌。7.用20mlMP緩沖液(1M山梨糖醇，0.1MNaCl，0.01MHAc，用10M的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為5.5)重懸細胞，600g離心5min收菌。8.沉淀用3mlMP緩沖液重懸，稀釋1/80倍，用血小板計數(shù)器計數(shù)。三個菌株分別取1*107個細胞，混勻，300-600g離心5min，沉淀用2ml60％的PEG4000和0.2ml1MCaCl2溶液重懸。9.室溫放置3min，加入6mlMP緩沖液，混勻，室溫放置6min。10.按上述離心條件收菌，用10mlMP緩沖液洗一次，離心收菌后，重懸于1mlMP緩沖液中。11.分別取100μl和900μl加入到事先融化的上層培養(yǎng)基(SC-Met，Ura，His)中，涂布平板，30℃培養(yǎng)5-7天。原生質(zhì)體融合后，在SC三缺培養(yǎng)基上長出30個融合子，這些融合子應(yīng)是含有pMetcas9、pSP5和pTP3-U三個質(zhì)粒的酵母菌，命名為ZJ1。設(shè)計兩條分別與SP55’端和TP3-U3’端有60bp左右同源序列的引物pCriv6-VR和pCriv6-VF(見表三)，以pcriv0為模板，用KOD-plus-neo(購自Toyobo公司)PCR擴增出線性供體載體，PCR擴增條件為：95℃預(yù)變性5min；98℃變性10s，52℃退火20s，68℃延伸10min，30個循環(huán)。表三：實施例一和實施例二中所用引物醋酸鋰(LiAc)轉(zhuǎn)化1ug線性受體載體(圖5，SEQIDNO:3)和1ugpsgRNA(圖4，SEQIDNO:2)到菌株ZJ1中。LiAc轉(zhuǎn)化方法及試劑、培養(yǎng)基的配制見參考文獻〔Gietz，R.D.和R.H.schiestl，2007，同前〕，在該文獻的基礎(chǔ)上做了一些改進，其基本步驟為：1.酵母菌ZJ1在SC-Met，Ura，His板上劃線，30℃培養(yǎng)2天；2.挑酵母菌單菌落接至5mlYPAD液體培養(yǎng)基中，30℃，200rpm過夜培養(yǎng)；3.過夜酵母菌液稀釋10倍測OD600，此時OD應(yīng)為0.4-0.5(表示生長良好)。1:20到1:25轉(zhuǎn)接到2*YPAD液體培養(yǎng)基，使起始OD600小于或等于0.2。30℃，200rpm培養(yǎng)至OD600為0.8-1.0，約4-5個小時；4.20℃，5000rpm離心5分鐘收菌，用1/2體積無菌水重懸(如50ml菌液用25ml無菌水重懸)離心收菌；5.1/2體積無菌水再洗一次，離心收菌，用1ml無菌水重懸后轉(zhuǎn)至1.5mlEP管中，13000g，30秒離心收菌；6.用1/50體積無菌水重懸(如50ml菌液最后用1ml無菌水重懸)，100μL每管分裝備用；7.取出-20℃凍存的ssDNA(鮭精DNA)100℃變性5分鐘后，立刻插入冰里；8.將備用的酵母菌13000g離心30秒，棄上清。依次加入(可先準備除DNA片段外的混合物，再分別加DNA片段)：注：正對照：環(huán)形的酵母-大腸桿菌穿梭質(zhì)粒pXX11。負對照：只加ddH2O34μL。9.用上述混合液重懸酵母菌(可渦旋)；10.42℃熱擊25分鐘(每5分鐘混勻一次)；11.13000g離心1分鐘去上清，用200uLddH2O重懸酵母菌，涂SC-Met，Trp，Ade三缺板。用SC-Met，Trp，Ade三缺板篩選，30℃培養(yǎng)3-4天，得到28個轉(zhuǎn)化子，菌落PCR驗證的陽性率為5/7，含有正確的拼接質(zhì)粒pCriv6。菌落PCR驗證的步驟為：在片段之間的接頭處設(shè)計三對驗證引物(見表三)，擴增片段大小為0.5-1.5kbp之間，挑取7個酵母轉(zhuǎn)化子懸于20ul無菌水中，混勻后取0.2uL為模板，用KOD-FX酶進行PCR驗證，PCR擴增條件為：95℃預(yù)變性5min；98℃變性10s，52℃退火20s，68℃延伸1.5min，35個循環(huán)。挑選一個酵母菌準備制作膠塊，進行脈沖場凝膠電泳檢測。酵母菌制作膠塊方法為：1.接單克隆到50mlSC-Met，Trp，Ade培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)過夜。2.OD600＝1.0-2.0時，4000rpm離心5min收菌。3.用50mlddH2O，重懸菌體，4000rpm離心5min收菌，4.用10ml50mMEDTApH8.0重復(fù)步驟3，洗一次細胞。5.用750μl細胞重懸緩沖液(10mMTris-HCl，pH7.2)重懸，4000rpm離心5min，細胞沉淀用150μl細胞重懸緩沖液重懸，放50℃平衡。6.加入85μlZymolyase-20T溶液(20mg/mlZymolyase-20T，50％甘油，2.5％葡萄糖，50mMTris-HCl，pH8.0)和225μl2％的TE25S溶解的低熔點瓊脂糖(事先配好，50℃平衡)。混勻后，倒入模具中，放冰上或4℃冰箱冷卻。7.約30min后，把膠塊取出，加入5ml酵母裂解酶(lyticase)緩沖液(10mMTris-HClpH7.5，50mMEDTApH8.0)和500μlZymolyase-20T，37℃孵育2h.8.膠塊用25ml水洗一次，然后用洗滌緩沖液洗滌緩沖液(20mMTris-HClpH8.0，50mMEDTA)洗滌一次。9.每1ml膠塊加入5ml蛋白酶k反應(yīng)液(100mMEDTApH8.0，0.2％脫氧膽酸鈉，1％月桂酰肌氨酸鈉，1mg/ml蛋白酶K)，50℃消化過夜(細胞特性不同，有些樣品需要延長消化時間到4d，但這并不會損傷DNA)。10.用50ml洗滌緩沖液洗滌膠塊4次，于室溫輕柔震蕩，每次30-60min。11.脈沖場凝膠電泳將酵母線性基因組跑出膠塊，環(huán)形質(zhì)粒仍然留在膠塊中，電泳條件為，0.5XTBE緩沖液，電壓6v/cm，轉(zhuǎn)換時間為60-120秒，12h。12.第二天取出膠塊，如步驟10，用50ml洗滌緩沖液洗滌膠塊4次，于室溫輕柔震蕩，每次30-60min。第2、3次洗滌時加入1mM的PMSF，使蛋白酶K失活。13.在限制性內(nèi)切酶消化前，先用10倍稀釋的洗滌緩沖液或TE洗滌膠塊30min，再用1Xcutsmart緩沖液(購自NEB公司)浸泡1h。14.NotI、SpeI(購自NEB公司)分別酶切1/3膠塊。脈沖場電泳檢測，電泳條件為：0.5XTBE緩沖液，電壓6v/cm，轉(zhuǎn)換時間為1-25秒，24h。脈沖場凝膠電泳結(jié)果顯示，pCriv6經(jīng)NotI酶切得到一條311kb大小的條帶，而經(jīng)SpeI酶切可以得到98kb和213kb大小的兩條帶，與預(yù)測條帶大小相同(見圖6)。實施例2：三個大片段DNA的拼接本例中選用本實驗室在釀酒酵母VL6-48中已分別構(gòu)建好的pTP1、pTP2和pTP3-L質(zhì)粒(表四)。表四：質(zhì)粒pTP1、pTP2、pTP3-L信息篩選標記插入片段名稱插入片段大小(bp)pTP1HIS3TP1177147pTP2URA3TP2297952pTP3-LLYS2TP3184475pTP1含有177147bp的供體DNA，命名為TP1；pTP2含有297952bp的供體DNA，命名為TP2；pTP3-L含有184475bp的供體DNA，命名為TP3。TP1、TP2和TP3序列均來源于大腸桿菌，它們的構(gòu)建方法和實例一中pSP5和pTP3-U的構(gòu)建方法類似。TP1右末端與TP2左末端有385bp的同源序列，而TP2右末端及TP3左末端有491bp的同源序列。將Cas9表達質(zhì)粒pMetcas9(見圖3和SEQIDNO:1)轉(zhuǎn)入已含pTP2質(zhì)粒的酵母細胞中。將酵母菌VL6-48/pTP1、VL6-48/pTP2/pMetcas9、VL6-48/pTP3-L用實施例一中所述原生質(zhì)體融合的方法將三個質(zhì)粒融合在同一酵母菌細胞中得到菌株ZJ2。設(shè)計兩條分別與片段TP15’端和TP33’端60bp左右同源的引物pCriv7-VR和pCriv7-VF(見表二)，以pCriv0為模板，用KOD-plus-neoPCR擴增出線性供體載體，PCR擴增條件為：95℃預(yù)變性5min；98℃變性10s，52℃退火20s，68℃延伸10min，30個循環(huán)。1μg供體線性載體(圖5，SEQIDNO:3)和1μgpsgRNA(圖4，SEQIDNO:2)用LiAc法共同轉(zhuǎn)化ZJ2，用SC-Met，Trp，Ade三缺板篩選，30℃培養(yǎng)3-4天，得到7個轉(zhuǎn)化子，菌落PCR驗證的陽性率為2/3，正確的拼接質(zhì)粒命名為pCriv7。PCR驗證的引物見表三。挑選一個酵母菌準備制作膠塊，進行脈沖場凝膠電泳檢測拼接質(zhì)粒pCriv7。pCriv7經(jīng)SpeI酶切得到片段200kb、182kb、157kb、98kb、32kb(被酵母染色體基因組覆蓋)大小的5條帶，PFGE結(jié)果請見附圖7。上文所列的各相關(guān)文獻均以全篇引入本申請作為參考。本發(fā)明所涉及的多個方面已做如上闡述。然而，應(yīng)理解的是，在不偏離本發(fā)明之精神與范圍的前提下，對上述描述的任何修飾都是允許的。同樣，類似的情況也包括在權(quán)利要求中。當前第1頁1 2 3