本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種鼻咽癌microRNA檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
：MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小長約20～25個核苷酸。成熟的miRNAs是由較長的初級轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過一系列核酸酶的剪切加工而產(chǎn)生的，隨后組裝進(jìn)RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)，通過堿基互補(bǔ)配對的方式識別靶miRNA，并根據(jù)互補(bǔ)程度的不同指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶miRNA或者阻遏靶miRNA的翻譯。最近的研究表明，miRNA參與各種各樣的調(diào)節(jié)途徑，包括發(fā)育、病毒防御、造血過程、器官形成、細(xì)胞增殖和凋亡、脂肪代謝等等。近年來發(fā)現(xiàn)，部分miRNA的異常表達(dá)與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，如：miRNA的異常表達(dá)與鼻咽癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。研究者采用基因芯片技術(shù)，將31份鼻咽癌活檢樣品與10份正常鼻咽上皮細(xì)胞樣品對比分析了207個miRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了8個表達(dá)差異明顯的miRNA，分別是：miR-29c、miR-34b、miR-34c、miR-212、miR-216、miR-217、miR-151和miR-192，其中，在鼻咽癌細(xì)胞中，miR-29c表達(dá)濃度僅有正常鼻咽上皮細(xì)胞的1/5。此外還有研究表明，miR-17-92和miR155在鼻咽癌中為明顯的高表達(dá)，miR-34家族、miR-143、miR-145則表達(dá)下調(diào)。針對鼻咽癌microRNA的檢測方法主要有：NorthernBlot、基因芯片、熒光定量探針法、基于微球的流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)。然而，上述方法存在著敏感度低、耗時長、準(zhǔn)確性低、RNA的用量較大、檢測費(fèi)用昂貴、重復(fù)性差等缺點(diǎn)。目前?？朔松鲜鋈秉c(diǎn)的原位雜交技術(shù)是一種定位和形態(tài)學(xué)檢測保存的組織切片或細(xì)胞制備物中特異性microRNA序列的方法。然而，目前現(xiàn)有的原位雜交技術(shù)中，針對鼻咽癌microRNA的多重平行檢測所使用的試劑盒仍然存在許多問題，如：穩(wěn)定性差、重復(fù)性弱、特異性低、容易出現(xiàn)假陽性以及靈敏度低的缺點(diǎn)。因此，研發(fā)出一種穩(wěn)定性好、重復(fù)性好、特異性高、不容易出現(xiàn)假陽性以及靈敏度高的一種鼻咽癌microRNA的檢測試劑盒，成為了本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的問題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明提供了一種鼻咽癌microRNA的檢測試劑盒，所述檢測試劑盒具有穩(wěn)定性好、重復(fù)性好、特異性高、不容易出現(xiàn)假陽性以及靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明提供了一種探針組合物，所述探針組合物包括：與靶標(biāo)microRNA結(jié)合的捕獲探針以及信號放大組合物，所述靶標(biāo)microRNA選自hsa-miR-17-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-34b-3p、hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-212-3p、hsa-miR-216a-5p、hsa-miR-217、hsa-miR-151a-3p以及hsa-miR-192-5p中的一種或多種。優(yōu)選地，所述捕獲探針的堿基序列從5’端到3’端依次為：與所述靶標(biāo)microRNA結(jié)合的特異性序列P1、第一間隔臂序列、P2序列，所述P1序列為SEQIDNO.1～SEQIDNO.11中的任意一條，所述P2序列為SEQIDNO.12～SEQIDNO.23中的任意一條，所述第一間隔臂序列為5～10個T。優(yōu)選地，所述信號放大組合物選自：第一信號放大組合物、第二信號放大組合物和第三信號放大組合物的任意一種；所述第一信號放大組合物為一級信號放大探針，所述第一信號放大組合物的3’端還修飾有第一熒光基團(tuán)，所述第一熒光基團(tuán)選自FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、TexasRed、LCRED640、Cy5、LCRED705和AlexaFluor488中的任意一種；所述第二信號放大組合物為一級信號放大探針和二級信號放大探針，所述第二信號放大組合物的3’端還修飾有第二熒光基團(tuán)，所述第二熒光基團(tuán)選自FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、TexasRed、LCRED640、Cy5、LCRED705和AlexaFluor488中的任意一種；所述第三信號放大組合物為一級信號放大探針、二級信號放大探針和三級信號放大探針，所述第三信號放大組合物的3’端還修飾有第三熒光基團(tuán)，所述第三熒光基團(tuán)選自FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、TexasRed、LCRED640、Cy5、LCRED705和AlexaFluor488中的任意一種。優(yōu)選地，所述一級信號放大探針的堿基序列從5’端到3’端依次為：P4序列、第二間隔臂序列、與所述P2序列反向互補(bǔ)結(jié)合的P3序列；所述P4序列為SEQIDNO.24～SEQIDNO.35中的任意一條，所述第二間隔臂序列為5～10個T。優(yōu)選地，所述二級信號放大探針的堿基序列從5’端到3’端依次為：P5序列、第三間隔臂序列、P6序列，所述P5序列含有一個或以上與所述P4序列反向互補(bǔ)的堿基序列；所述P5序列為SEQIDNO.36～SEQIDNO.47中的任意一條，所述P6序列為SEQIDNO.48～SEQIDNO.59中的任意一條，所述第三間隔臂序列為5～10個T。優(yōu)選地，所述三級信號大探針的堿基序列從5’端到3’端依次為：P8序列、第四間隔臂序列、P7序列，所述P7序列含有一個或以上與所述P5序列反向互補(bǔ)的堿基序列；所述P7序列為SEQIDNO.60～SEQIDNO.71中的任意一條，所述P8序列為5個堿基的polyT序列，所述第四間隔臂序列為5～10個T。優(yōu)選地，所述P1序列、P2序列、P3序列、P4序列、P5序列、P6序列、P7序列、P8序列內(nèi)部不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地，所述第一間隔臂序列、所述第二間隔臂序列、所述第三間隔臂序列和所述第四間隔臂序列中T的數(shù)量相同或者不同。優(yōu)選地，所述第一熒光基團(tuán)、所述第二熒光基團(tuán)和所述第三熒光基團(tuán)相同或者不同。本發(fā)明還提供了一種鼻咽癌microRNA檢測試劑盒，所述鼻咽癌microRNA檢測試劑盒包括以上任意一項(xiàng)所述的探針組合物。綜上所述，本發(fā)明通過選用在鼻咽癌中表達(dá)異常的microRNA作為靶標(biāo)，制的一種含有與靶標(biāo)結(jié)合的捕獲探針和信號放大組合物的試劑盒，克服了現(xiàn)有鼻咽癌microRNA的多重平行檢測所使用的試劑盒存在穩(wěn)定性差、重復(fù)性弱、特異性低、容易出現(xiàn)假陽性的缺點(diǎn)，本發(fā)明制得的一種鼻咽癌microRNA試劑盒具有穩(wěn)定性好、重復(fù)性好、特異性高、不容易出現(xiàn)假陽性以及靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。具體實(shí)施方式下面將對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所 描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。為了更詳細(xì)說明本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明提供的一種鼻咽癌microRNA檢測試劑盒，進(jìn)行具體地描述。實(shí)施例1本實(shí)施例提供了捕獲探針的制備方法，本實(shí)施例所設(shè)計(jì)的捕獲探針的堿基序列從5’端到3’端依次為與待檢測的靶標(biāo)microRNA結(jié)合的特異性序列P1、間隔臂序列、P2序列。間隔臂序列可將將捕獲探針P2序列與待檢測的靶標(biāo)microRNA間隔開來，通過在探針內(nèi)部設(shè)置適當(dāng)長度的間隔臂序列，可減少空間位阻，提高雜交反應(yīng)的效率以及雜交反應(yīng)的特異性。本發(fā)明捕獲探針的間隔臂序列優(yōu)選為5個T。本實(shí)施例針對hsa-miR-17-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-34b-3p、hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-212-3p、hsa-miR-216a-5p、hsa-miR-217、hsa-miR-151a-3p以及hsa-miR-192-5p設(shè)計(jì)捕獲探針，具體見表1、表2：表1捕獲探針的P1序列表2捕獲探針的P2序列SEQIDNO.P2序列(5’→3’)SEQIDNO.P2序列(5’→3’)12GTCTATAGTG18GATGACAGTA13GATTCAGTGA19AGTACTTGTG14TTGAGTAATG20AGTCTTGAAG15TGTAATGAGT21TGATGAATTG16GATTAGTGAT22ATGACGATAG17GTAGATTAGT23TTGACGTGAA實(shí)施例2本實(shí)施例提供了信號放大組分的制備方法，本實(shí)施例所述制備方法得到的信號放大組分選自：第一信號放大組分、第二信號放大組分和第三信號放大組分的任意一種；所述第一信號放大組分包括一級信號放大探針，所述第一信號放大組分的3’端還修飾有熒光基團(tuán)；所述第二信號放大組分為一級信號放大探針和二級信號放大探針，所述第二信號放大組分的3’端還修飾有熒光基團(tuán)；所述第三信號放大組分為一級信號放大探針、二級信號放大探針和三級信號放大探針，所述第三信號放大組分的3’端還修飾有熒光基團(tuán)。(1)、第一信號放大組分，第一信號放大組分包括一級信號放大探針和修飾在第一信號放大組分3’端的熒光基團(tuán)，修飾在第一信號放大組分3’端的熒光基團(tuán)選自Cy3、Cy5以及AlexaFlour488中的任意一種。一級信號放大探針的堿基序列從5’端到3’端依次為：P4序列、間隔臂序列、與P2序列反向互補(bǔ)配對結(jié)合的P3序列，一級信號放大探針的間隔臂序列優(yōu)選為10個T。本實(shí)施例設(shè)計(jì)的一級信號放大探針的P4序列，具體見表3。表3一級信號放大探針的P4序列SEQIDNO.P4序列(5’→3’)24GATCTCTTTTTGATCTCTTTTTGATCTC25ATATCATTTTTATATCATTTTTATATCA26TATCTCTTTTTTATCTCTTTTTTATCTC27CACATCTTTTTCACATCTTTTTCACATC28TCACATTTTTTTCACATTTTTTTCACAT29ACATCATTTTTACATCATTTTTACATCA30CATCGATTTTTCATCGATTTTTCATCGA31TCAGTCTTTTTTCAGTCTTTTTTCAGTC32ACTCTCTTTTTACTCTCTTTTTACTCTC33ATCATCTTTTTATCATCTTTTTATCATC34ACATCCTTTTTACATCCTTTTTACATCC35TCATCATTTTTTCATCATTTTTTCATCA(2)、第二信號放大組分，第二信號放大組分包括一級信號放大探針和二級信號放大探針，以及修飾在第二信號放大組分3’端的熒光基團(tuán)，修飾在第二信號放大組分3’端的熒光基團(tuán)選自選自Cy3、Cy5以及AlexaFlour488中的任意一種。一級信號放大探針的堿基序列從5’端到3’端依次為：P4序列、間隔臂序列、與P2序列反向互補(bǔ)配對結(jié)合的P3序列，一級信號放大探針的間隔臂序列優(yōu)選為10個T。二級信號放大探針的堿基序列從5’端到3’端依次為：P5序列、間隔臂序列、P6序列，P5序列含有一個或以上與P4序列反向互補(bǔ)的堿基序列，二級信號放大探針的間隔臂序列優(yōu)選為6個T。本實(shí)施例設(shè)計(jì)的二級信號放大探針的P5序列，具體見表4。表4二級信號放大探針的P5序列SEQIDNO.P5序列(5’→3’)SEQIDNO.P5序列(5’→3’)36GAGATC42TCGATG37TGATAT43GACTGA38GAGATA44GAGAGT39GATGTG45GATGAT40ATGTGA46GGATGT41TGATGT47TGATGA本實(shí)施例設(shè)計(jì)的二級信號放大探針的P6序列，具體見表5。表5二級信號放大探針的P6序列SEQIDNO.P6序列(5’→3’)48TACGATTTTACGATTTTACGA49CATAGTTTCATAGTTTCATAG50TAGCATTTTAGCATTTTAGCA51ACGTATTTACGTATTTACGTA52TGAACTTTTGAACTTTTGAAC53CATTGTTTCATTGTTTCATTG54TGTCCTTTTGTCCTTTTGTCC55CTACGTTTCTACGTTTCTACG56AGCAGTTTAGCAGTTTAGCAG57ACGCTTTTACGCTTTTACGCT58TCTAGTTTTCTAGTTTTCTAG59CTCTATTTCTCTATTTCTCTA(3)、第三信號放大組分，第三信號放大組分包括一級信號放大探針、二級信號放大探針和三級信號放大探針，以及修飾在第三信號放大組分3’端的熒光基團(tuán)，修飾在第三信號放大組分3’端的熒光基團(tuán)選自Cy3、Cy5、TET以及AlexaFlour488中的任意一種。一級信號放大探針的堿基序列從5’端到3’端依次為：P4序列、間隔臂序列、與P2序列反向互補(bǔ)配對結(jié)合的P3序列，一級信號放大探針的間隔臂序列優(yōu)選為10個T。二級信號放大探針的堿基序列從5’端到3’端依次為：P5序列、間隔臂序列、P6序列，P5序列含有一個或以上與P4序列反向互補(bǔ)的堿基序列，二級信號放大探針的間隔臂序列優(yōu)選為6個T。三級信號大探針的堿基序列從5’端到3’端依次為：P8序列、間隔臂序列、P7序列，P7序列含有一個或以上與P5序列反向互補(bǔ)的堿基序列，三級信號放大探針的間隔臂序列優(yōu)選為5個T。本實(shí)施例設(shè)計(jì)的三級信號放大探針的P7序列，具體見表6。表6三級信號放大探針的P7序列SEQIDNO.P7序列(5’→3’)SEQIDNO.P7序列(5’→3’)60TCGTA66GGACA61CTATG67CGTAG62TGCTA68CTGCT63TACGT69AGCGT64GTTCA70CTAGA65CAATG71TAGAG本實(shí)施例中，P8序列為5個堿基的polyT序列。實(shí)施例3本實(shí)施例提供了一種鼻咽癌microRNA檢測試劑盒的制備方法，所述鼻咽癌microRNA檢測試劑盒包括：實(shí)施例1制得的探針組分和實(shí)施例2制得的信號放大組分。本實(shí)施例設(shè)計(jì)的一種鼻咽癌microRNA檢測試劑盒的組成，具體見表7。表7一種鼻咽癌microRNA檢測試劑盒(表格數(shù)字為SEQIDNO.)實(shí)施例4本實(shí)施例提供了應(yīng)用實(shí)施例3制得的一種鼻咽癌microRNA檢測試劑盒對鼻咽癌細(xì)胞進(jìn)行檢測。本實(shí)施例所使用的鼻咽癌細(xì)胞的來源為：鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2Z(購自ATCC)。表8提供了本實(shí)施例所使用的各種溶液的配方。表8溶液配方步驟一：樣本預(yù)處理，將CNE-2Z細(xì)胞轉(zhuǎn)移至濾膜1、將CNE-2Z凍存細(xì)胞管從液氮中取出進(jìn)行復(fù)蘇，待管中細(xì)胞融化后，細(xì)胞數(shù)量1×107，600×g水平離心5min，棄上清，在樣本保存管中使用保存液保存血液樣本。2、加入4mLPBS和1mL固定劑，渦旋混勻，室溫靜置8min。3、樣本過濾：將樣本保存管中的液體轉(zhuǎn)移至過濾器中，打開真空抽濾泵抽盡液體；在本保存管中加入4mLPBS，洗滌管壁后抽濾液體。4、將濾膜轉(zhuǎn)移至24孔板中，加入400μL4％甲醛溶液，室溫固定1h。5、去除液體，每孔加入1mLPBS洗滌三次，每次浸泡2min。步驟二：透化處理1、在一塊新的24孔板中每孔加入50μL透化劑，將濾膜從PBS中取出，濾膜片邊緣接觸吸水紙，去除多余的液體，將濾膜倒扣在透化劑上，即濾膜鐵圈刻有編碼的一面向下貼近液體。室溫孵育5min。2、去除液體，每孔加入1mlPBS洗滌兩次，每次浸泡2min。將濾膜保持在PBS中至下一步實(shí)驗(yàn)操作。步驟三：消化細(xì)胞，暴露miRNA，使其與捕獲探針雜交1、配制消化酶工作液，取消化酶1.25μL與PBS48.75μL，制得消化酶工作液50μL。2、消化酶工作液渦旋混勻，分裝至24孔板中，每孔50μl。3、將濾膜取出，倒扣至24孔板中消化酶工作液上，保證濾膜向下一面與液體充分接觸，不能有氣泡存在。室溫靜置1h。4、去除液體，每孔加入1mlPBS洗滌三次，每次浸泡2min。將濾膜保持在PBS緩沖液中至下一步實(shí)驗(yàn)操作。步驟四：探針雜交，探針特異性序列與目標(biāo)miRNA序列結(jié)合1、捕獲探針混合液、探針緩沖液使用前需40℃水浴預(yù)熱20min。2、配制捕獲探針工作液，取捕獲探針混合液8μL和探針緩沖液42μL，制得捕獲探針工作液50.0μL。捕獲探針工作液渦旋混勻，分裝至24孔板中，每孔50μl。3、將濾膜取出，倒扣至24孔板中捕獲探針工作液上，保證濾膜向下一面與液體充分接觸，不能有氣泡存在。4、蓋上24孔板蓋，40±1℃孵育3小時。5、去除液體，每孔加入1ml洗滌液洗滌三次，每次浸泡2min。將濾膜保持在洗滌液中至下一步實(shí)驗(yàn)操作，樣本在洗滌液中浸泡時間不能超過30min。步驟五、目標(biāo)mRNA序列信號放大1、探針緩沖液使用前需40℃水浴預(yù)熱20min。2、配制探針工作液，取信號放大探針混合液8μL和探針緩沖液42μL制得探針工作液50μl。渦旋混勻，分裝至24孔板中，每孔50μl。3、將濾膜取出，倒扣至24孔板中探針工作液上，保證濾膜向下一面與液體充分接觸，不能有氣泡存在。4、蓋上24孔板蓋，40±1℃孵育3小時。5、去除液體，每孔加入1ml洗滌液洗滌三次，每次浸泡2min。將濾膜保持在洗滌液中至下一步實(shí)驗(yàn)操作，樣本在洗滌液中浸泡時間不能超過30min。步驟六、顯色，熒光標(biāo)記目標(biāo)信號1、顯色緩沖液(40℃預(yù)熱)避光渦旋混合，分裝至24孔板中，每孔50μl。2、將濾膜取出，倒扣至24孔板中顯色緩沖液上，保證濾膜向下一面與液體充分接觸，不能有氣泡存在。3、蓋上24孔板蓋，40±1℃孵育30min。4、去除液體，每孔加入1ml洗滌液洗滌三次，每次浸泡2min。將濾膜保持在洗滌液中至下一步實(shí)驗(yàn)操作，樣本在洗滌液中浸泡時間不能超過30min。步驟七、熒光顯微鏡觀察CNE-2Z細(xì)胞本發(fā)明的對照品使用DAPI作為細(xì)胞核熒光基團(tuán)，其發(fā)射藍(lán)色熒光信號。1、將濾膜細(xì)胞面朝上置于載玻片上，沿鐵圈內(nèi)環(huán)將濾膜割下，加10μL抗熒光淬滅封片液(AntifadeMountingMedium)(購自碧云天，貨號P0126)，蓋上18mm×18mm的蓋玻片，直接鏡檢或置于-20℃保存。2、通過20倍物鏡計(jì)數(shù)CNE-2Z細(xì)胞中異性核數(shù)量。3、根據(jù)10倍物鏡定位異性核位置，滴油，用油鏡觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并拍照記錄結(jié)果。4、然后再根據(jù)10倍物鏡定位下一個異性核位置，滴油，用油鏡觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果并視野拍照記錄結(jié)果。5、重復(fù)操作至拍完所有的異性核，數(shù)量與20倍物鏡計(jì)數(shù)結(jié)果一致。顯微鏡使用通道如表9：表9熒光基團(tuán)的激發(fā)波長和發(fā)射波長步驟八：檢測結(jié)果及判斷分析1、陽性CNE-2Z鑒定標(biāo)準(zhǔn)。在濾膜上，富集有鼻咽癌細(xì)胞，鼻咽癌細(xì)胞陽性的判定標(biāo)準(zhǔn)為：1)具有相應(yīng)靶標(biāo)miRNA特異性標(biāo)識物，在本試劑盒中表現(xiàn)為在相應(yīng)的熒光通道下顯示熒光信號點(diǎn)。2)細(xì)胞核DAPI染色陽性。3)鼻咽癌細(xì)胞核形狀不規(guī)則，直徑大于10μm，明顯大于濾膜孔徑，濾膜孔徑為7μm。白細(xì)胞大小與濾膜孔大小相近。2、使用上述檢測方法，對每個樣本進(jìn)行檢測和觀察，其中，針對細(xì)胞核的DAPI染色，使用“-”或“+”表示是否檢測到熒光；針對目標(biāo)檢測miRNA的熒光信號強(qiáng)度，分別讀取每個樣本中10個鼻咽癌細(xì)胞的相應(yīng)顏色的miRNA熒光點(diǎn)數(shù)量，并計(jì)算平均點(diǎn)數(shù)，具體檢測結(jié)果見表10：表10樣本檢測結(jié)果從本實(shí)施例得出，實(shí)施例3制得的一種鼻咽癌microRNA試劑盒可以對靶標(biāo)miRNA進(jìn)行準(zhǔn)確檢測。實(shí)施例5本實(shí)施例提供了對于試劑盒的穩(wěn)定性的檢測。本發(fā)明提供的一種鼻咽癌miRNA檢測試劑盒，所述鼻咽癌miRNA檢測試劑盒針對不同的靶標(biāo)miRNA，選取不同數(shù)量的捕獲探針，組成相應(yīng)的探針混合液，從而實(shí)現(xiàn)不同數(shù)量miRNA的并行檢測。本實(shí)施例將使用實(shí)施例3的探針組Group1組成的鼻咽癌miRNA檢測試劑盒，對三組不同細(xì)胞株來源(購自ATCC)的15種樣本(每種細(xì)胞株5個樣本)中的hsa-miR-17-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-223-3p表達(dá)情況進(jìn)行檢測，從而評估本發(fā)明試劑盒的穩(wěn)定性。具體分組參閱表11。表11細(xì)胞株和檢測樣本樣本號鼻咽癌細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)組樣本16～樣本20CNE-2ZGroup4樣本21～樣本25NPCGroup5樣本26～樣本305-8FGroup6本實(shí)施例所述探針選自實(shí)施例1～3，實(shí)驗(yàn)步驟參考實(shí)施例4。檢測結(jié)果：使用上述試劑盒，對每個樣本進(jìn)行檢測和觀察，其中，針對細(xì)胞核的DAPI染色，使用“-”或“+”表示是否檢測到熒光；針對目標(biāo)檢測miRNA標(biāo)志物的熒光信號強(qiáng)度，分別讀取每個樣本中10個鼻咽癌細(xì)胞的相應(yīng)顏色的miRNA熒光點(diǎn)數(shù)量，并計(jì)算平均點(diǎn)數(shù)，具體樣本檢測結(jié)果參閱表12：表12樣本檢測結(jié)果從表12檢測結(jié)果可見，一方面，不同細(xì)胞株來源的樣本，其檢測結(jié)果不同，因此，本發(fā)明是能夠?qū)崿F(xiàn)不同miRNA表達(dá)水平檢測的，證明了本發(fā)明一種microRNA檢測試劑盒穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)；另一方面，相同細(xì)胞株來源的5個樣本，其hsa-miR-17-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-223-3p的4個miRNA的熒光點(diǎn)數(shù)檢測結(jié)果相近(±3)，具體見Group4(樣本16～20)、Group5(樣本21～25)或Group6(樣本26～30)，因此，本試劑盒具有重復(fù)性好和良好的特異性的優(yōu)點(diǎn)；由此可見，本發(fā)明試劑盒具有重復(fù)性好、特異性高的優(yōu)點(diǎn)。實(shí)施例6本實(shí)施例提供了針對不同數(shù)量靶標(biāo)miRNA的更具有特異性的檢測試劑盒。1、試劑盒制備的設(shè)計(jì)(捕獲探針數(shù)量的選擇)本實(shí)施例提供一種鼻咽癌microRNA檢測的試劑盒，所述的試劑盒針對不同的靶點(diǎn)miRNA，可以選取不同數(shù)量的捕獲探針，組成相應(yīng)的探針混合液，從而實(shí)現(xiàn)不同數(shù)量miRNA的并行檢測。本實(shí)施例分別針對1種、3種、5種、7種miRNA，選用捕獲探針，信號放大組分選擇第三信號放大組分，組成檢測試劑盒，對同一細(xì)胞株CNE-2Z來源的樣本進(jìn)行檢測，對比其檢測效果。試劑盒的具體組成參閱表13，所述探針選自實(shí)施例1～3，實(shí)驗(yàn)步驟參考實(shí)施例4。表13試劑盒各序列內(nèi)容(表格數(shù)字為SEQIDNO.)2、使用上述試劑盒，對同一細(xì)胞株CNE-2Z來源的樣本進(jìn)行檢測和觀察，其中，針對細(xì)胞核的DAPI染色，使用“-”或“+”表示是否檢測到熒光；針對目標(biāo)檢測miRNA標(biāo)志物的熒光信號強(qiáng)度，分別讀取每個樣本中10個鼻咽癌細(xì)胞的相應(yīng)顏色的miRNA熒光點(diǎn)數(shù)量，并計(jì)算平均點(diǎn)數(shù)，具體結(jié)果為：表13樣本檢測結(jié)果(熒光信號點(diǎn)數(shù))通過上述4組實(shí)驗(yàn)對比可知，本試劑盒可以針對不同數(shù)量的靶標(biāo)miRNA進(jìn)行檢測，使用1條、3條和5條、7條的針對不同miRNA捕獲探針均可完成檢測，具有很好的穩(wěn)定性。實(shí)施例7本發(fā)明提供的一種鼻咽癌miRNA檢測試劑盒，為了評估本發(fā)明提供的試劑盒的特異性和不容易出現(xiàn)假陽性，本實(shí)施例將使用本發(fā)明提供的檢測試劑盒，對3種不同腫瘤細(xì)胞株(人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2Z、人肺癌細(xì)胞株SPC-A1以及人胃癌細(xì)胞株Hs746T，購自ATCC))以及正常鼻咽細(xì)胞株NP69進(jìn)行檢測。本實(shí)施例以檢測各細(xì)胞株(每種細(xì)胞株檢測5個樣本)hsa-miR-17-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-216a-5p以及hsa-miR-151a-3p表達(dá)情況進(jìn)行檢測為例。具體試驗(yàn)安排如表14、15：表14試劑盒設(shè)計(jì)(表格數(shù)字為SEQIDNO.)表15細(xì)胞株和檢測樣本本實(shí)施例所述探針選自實(shí)施例1～3，實(shí)驗(yàn)步驟參考實(shí)施例4。檢測結(jié)果：使用上述試劑盒，對每個樣本進(jìn)行檢測和觀察，其中，針對細(xì)胞核的DAPI染色，使用“-”或“+”表示是否檢測到熒光；針對目標(biāo)檢測miRNA標(biāo)志物的熒光信號強(qiáng)度，分別讀取每個樣本中10個鼻咽癌細(xì)胞的相應(yīng)顏色的miRNA熒光點(diǎn)數(shù)量，并計(jì)算平均點(diǎn)數(shù)，具體樣本檢測結(jié)果見表16：表16樣本檢測結(jié)果從表16檢測結(jié)果可見，一方面，hsa-miR-17-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-216a-5p以及hsa-miR-151a-3p在鼻咽癌細(xì)胞株和鼻咽上皮細(xì)胞株中的表達(dá)情況均不同，且差異顯著(詳見本實(shí)施例實(shí)驗(yàn)組11與實(shí)驗(yàn)組12的檢測結(jié)果)；另一方面，hsa-miR-17-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-216a-5p以及hsa-miR-151a-3p在不同癌癥細(xì)胞株的 表達(dá)情況也不盡相同，且部分miRNA的表達(dá)情況差異顯著(詳見本實(shí)施例實(shí)驗(yàn)組11、13、14)。此處可以清楚的得出，本發(fā)明提供的試劑盒具有特異性高和不容易出現(xiàn)假陽性的優(yōu)點(diǎn)。實(shí)施例8本發(fā)明提供一種鼻咽癌miRNA檢測試劑盒靈敏度的檢測。本實(shí)施例以檢測人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2Z為例，所述的人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2Z母液細(xì)胞濃度為1×107/mL，將人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2Z母液稀釋成3個梯度，分別是1×103/mL、100/mL以及10/mL。本實(shí)施例以及檢測hsa-miR-17-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-29c-3p和hsa-miR-151a-3p為例，每個細(xì)胞濃度梯度檢測5個樣品，每個樣品取1mL進(jìn)行檢測。具體的試驗(yàn)安排如表17、18：表17試劑盒設(shè)計(jì)(表格數(shù)字為SEQIDNO.)表18細(xì)胞濃度及檢測樣本本實(shí)施例所述探針選自實(shí)施例1～3，實(shí)驗(yàn)步驟參考實(shí)施例4。檢測結(jié)果：使用上述試劑盒，對每個樣本進(jìn)行檢測和觀察，其中，針對細(xì)胞核的DAPI染色，使用“-”或“+”表示是否檢測到熒光。通過比較檢測到靶miRNA細(xì)胞數(shù)與檢測到的細(xì)胞數(shù)，評價(jià)本發(fā)明所提供試劑盒的靈敏度。具體樣本檢測結(jié)果見表19(表中數(shù)據(jù)表示細(xì)胞個數(shù))：表19不同細(xì)胞濃度的檢測效果根據(jù)上述檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明所提供的試劑盒對hsa-miR-17-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-29c-3p和hsa-miR-151a-3p的檢測靈敏度高，且檢測結(jié)果與實(shí)際情況相符。同時，使用本發(fā)明所提供的試劑盒檢測低密度人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2Z(約10個細(xì)胞/mL)，檢測到靶miRNA細(xì)胞數(shù)與檢測到的細(xì)胞數(shù)至少90％，甚至達(dá)到100％。與現(xiàn)有技術(shù)普遍至少需要100個細(xì)胞/mL才能達(dá)到檢測效果相比，可明顯得出本發(fā)明制得的試劑盒靈敏度明顯高于現(xiàn)有技術(shù)。針對本發(fā)明所提供的其他不同的miRNA及其不同組合的檢測，也能實(shí)現(xiàn)本實(shí)施例的檢測效果，具體檢測結(jié)果省略?？梢?，本發(fā)明所提供的針對鼻咽癌相關(guān)miRNA的檢測試劑盒檢測靈敏度高。由以上實(shí)驗(yàn)內(nèi)容可以清楚的推知，本發(fā)明提供的其他miRNA的組合也同樣能實(shí)現(xiàn)本實(shí)施例的效果，具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)省略。綜上所述，本發(fā)明提供的一種鼻咽癌microRNA的檢測試劑盒具有穩(wěn)定性好、重復(fù)性好、特異性高、不容易出現(xiàn)假陽性以及靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3