本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種制備干擾素高分子結(jié)合體IFN-POEGMA的方法。
背景技術(shù)：
：蛋白質(zhì)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥顯影、靶向治療以及臨床診斷等多個(gè)領(lǐng)域。單獨(dú)使用蛋白質(zhì)存在半衰期短、穩(wěn)定性差等問題。將蛋白質(zhì)與高分子相連制備蛋白質(zhì)-高分子結(jié)合體，可以有效的提高蛋白質(zhì)的溶解性、穩(wěn)定性、藥代動(dòng)力學(xué)和治療功效并降低其免疫原性。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)-高分子結(jié)合體的合成方法是將預(yù)先制備好的高分子與蛋白質(zhì)相連，往往存在著偶聯(lián)位點(diǎn)不確定、效率低、產(chǎn)率差、產(chǎn)物難以分離、質(zhì)量控制差、活性難以保持等諸多難題。干擾素-α2(IFN-α2)是病毒復(fù)制和腫瘤細(xì)胞生長的強(qiáng)效抑制劑，已被成功用于治療病毒性肝炎和癌癥等疾病。但是，IFN經(jīng)系統(tǒng)注射給藥后循環(huán)半衰期非常短，需要頻繁給藥且在高濃度下才能達(dá)到預(yù)期的療效，從而導(dǎo)致一些毒副作用，同時(shí)給患者帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。用聚乙二醇(PEG)修飾IFN，是改善其藥代動(dòng)力學(xué)和提高其療效的有效措施，被稱為長效干擾素。然而，目前的PEG化干擾素存在如反應(yīng)產(chǎn)率低、結(jié)合位點(diǎn)和偶聯(lián)化學(xué)計(jì)量難以控制、生物活性嚴(yán)重降低等弊端。因此，研發(fā)反應(yīng)條件溫和、步驟簡單、高效的位點(diǎn)特異性修飾方法對干擾素及其他藥用蛋白質(zhì)尤為重要。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種制備蛋白-高分子聚合物結(jié)合體的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：將蛋白-引發(fā)劑結(jié)合體、聚合物單體、CuCl、CuCl2、1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺在緩沖液中進(jìn)行聚合反應(yīng)，得到蛋白-高分子聚合物結(jié)合體；所述蛋白-引發(fā)劑結(jié)合體為引發(fā)劑和蛋白共價(jià)連接得到的產(chǎn)物。上述蛋白-引發(fā)劑結(jié)合體為大分子引發(fā)劑。上述緩沖液為pH值為7.4、濃度為10mM的PBS水溶液，具體配方為：2.684gNa2HPO4·12H2O、0.34gNaH2PO4·2H2O、8.19gNaCl溶解于1L水中得到的溶液。上述方法中，所述反應(yīng)體系包括：所述蛋白-引發(fā)劑結(jié)合體、所述聚合物單體、所述CuCl、所述CuCl2和所述1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺的摩爾比為1：200-10000：10-500：10-2000：10-4000；所述蛋白-引發(fā)劑結(jié)合體、所述聚合物單體、所述CuCl、所述CuCl2和所述1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺的摩爾比具體為1：1000-4000：25：75：125；所述蛋白-引發(fā)劑結(jié)合體中所述蛋白和所述引發(fā)劑的偶聯(lián)比為1：1。在本發(fā)明的實(shí)施例中，上述蛋白-引發(fā)劑結(jié)合體為引發(fā)劑在蛋白的C端，二者通過形成酰胺鍵而形成結(jié)合體，具體按照包括如下步驟的方法制備：將IFN-LPETGGH6蛋白、SortaseA-H6蛋白、2-(2-(2-(2-氨基乙酰胺基)乙酰胺基)乙酰胺基)乙基2-溴-2-甲基丙酸酯、CaCl2在pH7.4濃度為50mMTris·HCl水溶液中混合，反應(yīng)，得到干擾素-引發(fā)劑結(jié)合體IFN-Br；上述IFN-LPETGGH6蛋白、SortaseA-H6蛋白、上述2制備的2-(2-(2-(2-氨基乙酰胺基)乙酰胺基)乙酰胺基)乙基2-溴-2-甲基丙酸酯、CaCl2的摩爾比為2：1：50：200。上述方法中，所述聚合反應(yīng)在低氧或者惰性氣體氛圍下進(jìn)行；所述聚合反應(yīng)的時(shí)間是5分鐘至24小時(shí)，所述聚合反應(yīng)的溫度是0-80℃。上述方法中，所述引發(fā)劑連接到所述蛋白的C-端。上述方法中，所述蛋白為干擾素，所述干擾素選自干擾素α或其融合蛋白、干擾素β或其融合蛋白、干擾素γ或其融合蛋白、干擾素λ或其融合蛋白。上述方法中，所述干擾素α融合蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2。上述方法中，所述引發(fā)劑為寡聚甘氨酸功能化的原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)引發(fā)劑；所述寡聚甘氨酸功能化的原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)引發(fā)劑具體為2-(2-(2-(3,4-二溴代馬來酰亞胺-N-乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基2-溴代-2-甲基丙酸酯。上述方法中，所述聚合物單體為水溶性或生物可降解的聚合物單體；所述高分子具體為POEGMA。由上述方法制備的蛋白-高分子聚合物結(jié)合體也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述的蛋白-高分子聚合物結(jié)合體在制備抗腫瘤產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明通過利用生物化學(xué)和高分子化學(xué)技術(shù),在遠(yuǎn)離干擾素的C-末端進(jìn)行修飾并通過優(yōu)化過的原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)技術(shù)原位高效生長出POEGMA(聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯)，產(chǎn)生位點(diǎn)特異和單修飾的干擾素-高分子結(jié)合體(即IFN-POEGMA)。這種原位ATRP技術(shù)反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)率高、純化步驟簡單、成本低，能夠有效保持生物活性并提高體外穩(wěn)定性，為蛋白質(zhì)修飾提供一種通用的方法。附圖說明圖1為干擾素-高分子結(jié)合體合成路線的示意圖。圖2為通過鎳柱親和層析獲得IFN-LPETGGH6。圖3為原位ATRP引發(fā)劑AEBM的合成及純化過程。圖4為顯示了原位ATRP引發(fā)劑通過轉(zhuǎn)肽酶A催化連接到IFN的C-末端示意圖。圖5為IFN-Br合成及純化過程分析。圖6為MALDI-TOF分析IFN-LPETGGH6和IFN-Br的分子量。圖7為LC-MS/ESI分析了IFN-Br的特異性修飾情況。圖8為IFN-POEGMA合成及純化過程。圖9為SDS-PAGE和GPC分析IFN-POEGMA圖10為顯示了通過1HNMR分析IFN-POEGMA結(jié)合體。圖11為分析原位ATRP合成IFN-POEGMA的對照試驗(yàn)。圖12為通過“graftingto”技術(shù)獲得IFN-POEGMA圖13為SDS-PAGE分析蛋白酶K處理IFN-POEGMA。圖14為通過原位ATRP得到不同分子量的IFN-POEGMA。圖15為DLS分析IFN-POEGMA和IFN-Br的水合半徑。圖16為CD分析IFN-POEGMA和IFN-Br的二級結(jié)構(gòu)。圖17為MTT法測定IFN-POEGMA、派羅欣和IFN-Br的體外生物活性。圖18為IFN-POEGMA、派羅欣和IFN-Br的體外熱穩(wěn)定性。圖19為利用DAS軟件中房室消除二房模型分析IFN-POEGMA、派羅欣和IFN-Br的藥物代謝動(dòng)力學(xué)情況。圖20為IFN-POEGMA、派羅欣和IFN-Br在腫瘤和其他組織中的分布情況。圖21為IFN-POEGMA、派羅欣、IFN-Br和生理鹽水抑制腫瘤生長情況。圖22為裸鼠注射IFN-POEGMA、派羅欣、IFN-Br和生理鹽水后的生存曲線。圖23為裸鼠注射IFN-POEGMA、派羅欣、IFN-Br和生理鹽水后的體重變化情況。圖24為裸鼠治療結(jié)束后腫瘤、心臟、肝臟和腎臟HE染色情況。圖25為裸鼠注射IFN-POEGMA、派羅欣、IFN-Br和生理鹽水后乳酸脫氫酶、肌酸激酶同工酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、肌酐和尿素氮等生理指標(biāo)變化情況。圖26為裸鼠IFN-POEGMA、派羅欣、IFN-Br和生理鹽水后紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血紅蛋白和血小板等生理指標(biāo)變化情況。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中的質(zhì)粒pET-25b(+)為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品。下述實(shí)施例中的TB培養(yǎng)基按照如下方法配置：向900mL水中加入蛋白胨12g、酵母提取物24g和甘油4mL，充分溶解后121℃高壓滅菌15min，滅菌后的混合液冷卻至 60℃，然后加入100mL滅菌的含170mmol/LKH2PO4和0.72mol/LK2HPO4的水溶液。下述實(shí)施例中的人Burkitt’sB淋巴瘤細(xì)胞和人卵巢癌細(xì)胞(OVCAR-3)均購自中國科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫。下述實(shí)施例中的RMPI-1640培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品。下述實(shí)施例中的雌性無胸腺(Nude)裸鼠為北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。雌性無胸腺(Nude)裸鼠在下文中簡稱裸鼠。下述實(shí)施例中的流程如圖1所示。下述實(shí)施例中，利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF)、酶標(biāo)儀、動(dòng)態(tài)光散射(DLS)、圓二色譜(CD)等分析手段表征IFN-ELP和IFN的分子量、相變溫度、水合半徑和二級結(jié)構(gòu)等物理化學(xué)性能。選用人Burkitt’sB淋巴瘤細(xì)胞，測試IFN-POEGMA和IFN的體外生物活性，即其體外抗腫瘤細(xì)胞增殖的能力；使用裸鼠模型，測試IFN-POEGMA和IFN在體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)，利用DAS3.0藥物代謝動(dòng)力學(xué)分析軟件計(jì)算出藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)；建立裸鼠腫瘤模型，測試IFN-POEGMA和IFN的抗腫瘤效果和藥物分布。下述實(shí)施例中的定量實(shí)驗(yàn)，如無特殊說明均設(shè)置三次重復(fù)，結(jié)果取平均值。實(shí)施例1、制備干擾素高分子結(jié)合體IFN-POEGMA的方法一、制備干擾素-引發(fā)劑結(jié)合體1、制備IFN-LPETGGH6融合蛋白和轉(zhuǎn)肽酶SortaseA-H61)重組菌的制備IFN-LPETGGH6融合蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2，其編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列1；轉(zhuǎn)肽酶SortaseA-H6的氨基酸序列為序列表中序列4，其編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列3；表達(dá)IFN-LPETGGH6融合蛋白的重組載體為將序列1所示的IFN-LPETGGH6融合蛋白編碼基因插入pET-25b(+)載體的NdeI和EcoRI酶切位點(diǎn)中得到的載體，命名為pET-25b-IFN-LPETGGH6；表達(dá)SortaseA-H6的重組載體為將序列3所示的SortaseA-H6蛋白編碼基因插入pET-25b(+)載體的NdeI和EcoRI酶切位點(diǎn)中得到的載體，命名為pET-25b-SortaseA-H6。表達(dá)IFN-LPETGGH6融合蛋白的重組菌為將表達(dá)IFN-LPETGGH6融合蛋白的重組載體導(dǎo)入E.coliBL21(DE3)pLysS(Novagen)中得到重組菌，命名為BL21/pET-25b-IFN-LPETGGH6；表達(dá)SortaseA-H6的重組菌為將表達(dá)SortaseA-H6的重組載體導(dǎo)入E.coliBL21 (DE3)pLysS(Novagen)中得到重組菌，命名為BL21/pET-25b-SortaseA-H6。2)IFN-LPETGGH6蛋白的表達(dá)和純化將重組菌BL21/pET-25b-IFN-LPETGGH6在50mLTB培養(yǎng)基中(含100μg/mL氨芐青霉素)，37℃、250rpm條件下震蕩培養(yǎng)過夜。第二天再轉(zhuǎn)接入1L新鮮TB培養(yǎng)基當(dāng)中(盛在2L的搖瓶中，氨芐青霉素濃度為100μg/mL)進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)并誘導(dǎo)表達(dá)。具體步驟如下：首先在37℃，200rpm條件下震蕩培養(yǎng)5h，隨后將培養(yǎng)溫度設(shè)為18℃，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，終濃度為0.4mM，培養(yǎng)16h，收集培養(yǎng)液。以3000×g離心力離心收集菌體，去除上層培養(yǎng)液，得到重組菌BL21/pET-25b-IFN-LPETGGH6菌體。用30mL冰冷PBS重懸BL21/pET-25b-IFN-LPETGGH6菌體，再用超聲儀在4℃條件下破碎細(xì)胞，然后將大腸桿菌破碎產(chǎn)物在4℃、14000×g離心力下離心15分鐘。在收集的上清液中加入2mL聚乙烯亞胺(PEI，10％)，再次離心15分鐘。得到的上清液經(jīng)過0.45μm濾膜過濾后，在AKTA蛋白純化系統(tǒng)(AKTAPurifier10，GE)上經(jīng)過鎳親和層析柱(HisTrapHP5mL)提純，平衡緩沖液為10mMPBS、500mMNaCl，5％甘油、10mM咪唑，洗脫緩沖液為平衡緩沖液加500mM咪唑得到的混合液。收集洗脫峰對應(yīng)的洗脫液，且用SDS-PAGE檢測，留約21.1kDa的目標(biāo)產(chǎn)物對應(yīng)的洗脫液，為IFN-LPETGGH6蛋白。洗脫所得到的IFN-LPETGGH6蛋白經(jīng)脫鹽柱(HiPrep26/10Desalting)除去咪唑，同時(shí)置換到50mMTris·HCl緩沖液中。純化樣品用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測試純度，并用分光光度計(jì)法(NanoDrop2000)測定了蛋白的濃度。SDS-PAGE分析樣品由含有5％β-巰基乙醇的Laemmli樣品緩沖液配制，濃度為1mg/mL，95℃下加熱5min后，10μL樣品裝載到預(yù)制的10％SDS-PAGE凝膠中，垂直電泳80～100V電壓下運(yùn)行90min(電泳液為：25mMTris、250mMGlycine、0.1％SDS)。凝膠用考馬斯藍(lán)G-250染色處理后觀察條帶位置。結(jié)果如圖2所示，A為通鎳親和層析純化，UV監(jiān)測線性洗脫得到目標(biāo)產(chǎn)物IFN-LPETGGH6；B為SDS-PAGE分析IFN-LPETGGH6純化情況；顯示了IFN-LPETGGH6蛋白表達(dá)與鎳親和層析柱純化情況。從左至右依次為上樣前細(xì)胞裂解液、鎳柱流穿液、50mM咪唑洗柱、500mM咪唑洗脫目的蛋白和蛋白標(biāo)樣，可以看出，通過大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)、鎳親和層析柱純化獲得純度＞95％的IFN-LPETGGH6蛋白，產(chǎn)率達(dá)到200mg/L培養(yǎng)菌液，可以看出，得到約21.1kDa的目標(biāo)產(chǎn)物。3)SortaseA-H6蛋白的表達(dá)和純化采用同樣的方法處理重組菌BL21/pET-25b-SortaseA-H6，收集洗脫峰對應(yīng)的洗脫液，且用SDS-PAGE檢測，留約22.9kD的目標(biāo)產(chǎn)物對應(yīng)的洗脫液，為SortaseA-H6 蛋白。2、合成ATRP引發(fā)劑2-羥基乙基氨基甲酸叔丁醇酯(1.6g,10mmol)，N，N-二異丙基乙基胺(1.8ml,11mmol,1.1當(dāng)量)在冰水浴中溶于二氯甲烷(20ml)。在低于0攝氏度條件下滴加2-溴-2-甲基丙酰溴(1.25ml,10mmol)，15分鐘滴加完畢。30分鐘后，移除冰水浴，并保持?jǐn)嚢?6小時(shí)。旋蒸移除溶劑，產(chǎn)物用硅膠柱純化(二氯甲烷：乙酸乙酯＝1:1)。產(chǎn)物為黃色油狀液體，2-溴-2-甲基丙酸2-(2-(叔丁氧羰基)胺基)乙酯(C11H20BrNO4,2.13g,68.6％).1HNMR(400MHz,CDCl3):δ4.827(s,1H),4.243(m,2H),3.424(m,2H),1.945(s,6H),1.447(s,9H).ESI-massm/z:332.1([M+Na]+),334.1([M+Na]+).2-溴-2-甲基丙酸2-(2-(叔丁氧羰基)胺基)乙酯(2.13g)溶于6M-的氯化氫乙酸乙酯溶液50ml，攪拌2小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，過濾，產(chǎn)物為白色粉末，2-溴-2-甲基丙酸2-氨基乙酯鹽酸鹽(C6H13BrClNO2,1.69g,100％).ESI-massm/z:210.3([M–Cl+Na]+),212.3([M–Cl+Na]+).2-(2-(2-叔丁氧羰基)乙酰胺基)乙酰胺基)乙酸(289mg,1mmol)，2-溴-2-甲基丙酸2-氨基乙酯鹽酸鹽(246mg,1mmol)，EDC(288mg,1.5mmol),和N，N-二異丙基乙基胺(175μl,1mmol)溶于氯甲烷(10ml二)，室溫?cái)嚢?6小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，移除溶劑，殘留白色固體一次用4毫升水洗滌2次，1毫升乙醇洗滌3次，然后用4毫升乙酸乙酯洗滌，得到白色粉末狀產(chǎn)物，2-溴-2-甲基丙酸2-(2-(2-(2-叔丁氧羰基)乙酰胺基)乙酰胺基)乙酰胺基)乙酯(C15H26BrN3O6,269mg,56％).1HNMR(400MHz,CDCl3):δ4.261(t,2H),3.909(s,2H),3.871(s,2H),3.779(s,2H),3.544(t,2H),1.938(s,6H),1.449(s,9H).ESI-massm/z:481.2([M+H]+),483.1([M+H]+),503.2([M+Na]+),505.1([M+Na]+).2-溴-2-甲基丙酸2-(2-(2-(2-叔丁氧羰基)乙酰胺基)乙酰胺基)乙酰胺基)乙酯(108.2mg,0.225mmol)溶于6M的氯化氫乙酸乙酯溶液5ml，攪拌2小時(shí)。產(chǎn)物為白色粉末，2-溴-2-甲基丙酸2-(2-(2-(2-氨基乙酰胺基)乙酰胺基)乙酰胺基)乙酯鹽酸鹽，即ATRP引發(fā)劑AEBM(C12H22BrClN4O5,化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式1所示，84.1mg,98％).1HNMR(400MHz,D2O):δ4.196(t,2H),3.938(s,2H),3.815(s,2H),3.794(s,2H),3.456(t,2H),1.813(s,6H).ESI-massm/z:381.1([M–Cl+H]+),383.0([M–Cl+H]+)。式1如下:圖3顯示了原位ATRP引發(fā)劑AEBM的合成及純化過程。最終成功獲得純度＞95％的引發(fā)劑AEBM，產(chǎn)率為37.3％。3、通過轉(zhuǎn)肽酶A酶催化獲得干擾素-引發(fā)劑結(jié)合體通過轉(zhuǎn)肽酶A酶催化在IFN-LPETGGH6的C-末端引入ATRP引發(fā)劑AEBM，具體如下：將上述1制備的上述IFN-LPETGGH6蛋白、SortaseA-H6蛋白、上述2制備的2-(2-(2-(2-氨基乙酰胺基)乙酰胺基)乙酰胺基)乙基2-溴-2-甲基丙酸酯、CaCl2在pH7.4濃度為50mMTris·HCl水溶液中混合，反應(yīng)，得到干擾素-引發(fā)劑結(jié)合體IFN-Br；上述IFN-LPETGGH6蛋白、SortaseA-H6蛋白、上述2制備的2-(2-(2-(2-氨基乙酰胺基)乙酰胺基)乙酰胺基)乙基2-溴-2-甲基丙酸酯、CaCl2的摩爾比為2：1：50：200。具體方法如下：在10mL含有IFN-LPETGGH6(200μM)的50mMTris·HCl溶液(溶質(zhì)為IFN-LPETGGH6，溶劑為pH值為7.4、濃度為50mMTris·HCl水溶液)中加入5mM2-(2-(2-(2-氨基乙酰胺基)乙酰胺基)乙酰胺基)乙基2-溴-2-甲基丙酸酯，與10mL含有100μM轉(zhuǎn)肽酶A和20mMCaCl2的Tris·HCl溶液(溶質(zhì)為轉(zhuǎn)肽酶和CaCl2)混合，室溫反應(yīng)過夜，得到反應(yīng)混合物。將反應(yīng)混合物用陰離子交換層析(HiTrapCaptoQ5mL)純化，得到IFN-Br；純化采用的平衡緩沖液為20mMTris·HCl，pH7.5；洗脫緩沖液為含有1MNaCl的20mMTris·HCl水溶液，pH7.5；柱子大小為5mL，流速為2mL/min；收集洗脫峰對應(yīng)的洗脫液，且用SDS-PAGE檢測，留約20.5kD的目標(biāo)產(chǎn)物對應(yīng)的洗脫液，為干擾素-引發(fā)劑結(jié)合體IFN-Br。并用PBS經(jīng)脫鹽柱進(jìn)一步去除小分子雜質(zhì)。該反應(yīng)效率＞95％。圖4顯示了ATRP引發(fā)劑通過轉(zhuǎn)肽酶A催化連接到IFN的C-末端，轉(zhuǎn)肽酶A的半胱氨酸(Cys)作為親核基團(tuán)進(jìn)行攻擊，作用在IFN-LPETGGH6上識別序列LPETG的蘇氨酸和甘氨酸間的肽鍵，使其斷開(酰化作用)，進(jìn)而產(chǎn)生一個(gè)酰基酶中間物，隨后三甘氨酸的氨基親核攻擊酰基酶，把AEBM共價(jià)聯(lián)結(jié)到IFN-α2上。將干擾素-引發(fā)劑結(jié)合體IFN-Br用SDS-PAGE進(jìn)行了驗(yàn)證分析，結(jié)果如圖5所示，顯示了IFN-Br合成及純化過程分析，其中，A：AEX分離轉(zhuǎn)肽酶A催化IFN-LPETGGH6與AEBM反應(yīng)的混合物，UV監(jiān)測線性洗脫得到目標(biāo)產(chǎn)物IFN-Br；B： SDS-PAGE分析IFN-LPETGGH6與AEBM反應(yīng)前后得到IFN-Br的結(jié)果。從左到右依次為SrtA-H6、IFN-LPETGGH6、反應(yīng)混合物、洗脫蛋白IFN-Br、流穿樣品SrtA-H6和蛋白標(biāo)樣。純化產(chǎn)物IFN-Br的分子量用基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF)測定，所用儀器為4800PlusMALDI-TOF/TOFTM分析儀(ABSCIEX)。用液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/ESI)分析驗(yàn)證IFN-LPETGGH6和IFN-Br的氨基酸序列及C-末端的特異性修飾，所用儀器為Q-Exactive液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀(ThermoScientific)。圖6為MALDI-TOF分析IFN-LPTEGGH6和IFN-Br分子量，分別為21105.7和20533.1,與理論值21105.9和20532.0符合。圖7為IFN-Br的C-末端肽段EGSGGGGSLPETGGG(-Br)同位素分布情況，A圖為LC-MS/ESI實(shí)驗(yàn)值；B圖為理論預(yù)測值,理論值與實(shí)驗(yàn)值吻合。表1顯示了LC-MS/ESI分析的IFN-Br胰蛋白酶分解后肽段氨基酸序列組成。圖6、圖7和表1表明利用轉(zhuǎn)肽酶A能夠定點(diǎn)定量獲得干擾素-引發(fā)劑結(jié)合體IFN-Br，干擾素-引發(fā)劑結(jié)合體IFN-Br中蛋白和引發(fā)劑的偶聯(lián)比為1:1。表1序列修飾電荷MH+[Da]CDLPQTHSLGSR31313.62854RTLMLLAQMR21232.69731RTLmLLAQMRM4(氧化)31248.68982TLmLLAQMRM3(氧化)21092.59123TLMLLAQMR21076.60283RISLFSCLK21066.60832ISLFSCLK2910.50798ISLFSCLKDR21181.63384DRHDFGFPQEEFGNQFQK22226.00054HDFGFPQEEFGNQFQK21954.86662AETIPVLHEMIQQIFNLFSTK22459.30058AETIPVLHEmIQQIFNLFSTKM10(氧化)32475.29734DSSAAWDETLLDK21450.66924FYTELYQQLNDLEAcVIQGVGVTETPLMKC15(脲甲基化)；43359.64882FYTELYQQLNDLEAcVIQGVGVTETPLmKC15(脲甲基化)；33375.64304M28(氧化)EDSILAVR2902.49407EDSILAVRK21030.58916KYFQR2741.40355ITLYLKEK21007.61278ITLYLK2750.47972KYSPCAWEVVR21337.66753YSPCAWEVVR21209.57158AEIMR1619.32322SFSLSTNLQESLR21481.76055SKEGSGGGGSLPETGGgG17(-Br)21624.64482EGSGGGGSLPETGGgG15(-Br)21409.51714二、干擾素高分子結(jié)合體IFN-POEGMA的獲得1、干擾素高分子結(jié)合體IFN-POEGMA的制備在上述干擾素-引發(fā)劑結(jié)合體IFN-Br的引發(fā)劑ATRP表面合成POEGMA，方法包括如下步驟：將干擾素-引發(fā)劑結(jié)合體IFN-Br、OEGMA、CuCl、CuCl2、1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺(HMTETA)和pH值為7.4、濃度為10mM的PBS水溶液(PBS配方為：2.684gNa2HPO4·12H2O、0.34gNaH2PO4·2H2O、8.19gNaCl溶解于1L水中)，在密閉條件下反應(yīng)，得到干擾素高分子結(jié)合體IFN-POEGMA；干擾素-引發(fā)劑結(jié)合體IFN-Br、OEGMA、CuCl、CuCl2、1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺(HMTETA)的摩爾比為1：1000-4000：25：75：150；具體如下：在2.5mL含有40μMIFN-Br的PBS溶液(溶質(zhì)為IFN-Br，溶劑為pH值為7.4、濃度為10mM的PBS溶液)中加入100μmol的OEGMA，通氮?dú)?5min后，加入預(yù)先溶解于1mL雙蒸水中并已除空氣的CuCl(2.5μmol),CuCl2(7.5μmol)和1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺(HMTETA)(12.5μmol)，密閉條件下反應(yīng)1h，然后暴露在空氣中終止反應(yīng)，得到反應(yīng)混合物。反應(yīng)混合物經(jīng)陰離子交換柱(HiTrapCaptoQcolumn，GEHealthcare)分離純化出IFN-POEGMA，該純化步驟與上述相同：純化采用的平衡緩沖液為20mMTris·HCl，pH7.5；洗脫緩沖液為20mMTris·HCl，1MNaCl，pH7.5，柱子大小為5mL，流速為2mL/min；收集洗脫峰對應(yīng)的洗脫液，且用SDS-PAGE檢測，留約20 kDa的目標(biāo)產(chǎn)物對應(yīng)的洗脫液，為IFN-POEGMA1。與上述方法相同，不同是加入200μmol的OEGMA，收集洗脫峰對應(yīng)的洗脫液，且用SDS-PAGE檢測，留約60kDa的目標(biāo)產(chǎn)物對應(yīng)的洗脫液，為IFN-POEGMA2。與上述方法相同，不同是加入400μmol的OEGMA，收集洗脫峰對應(yīng)的洗脫液，且用SDS-PAGE檢測，留約120kDa的目標(biāo)產(chǎn)物對應(yīng)的洗脫液，為IFN-POEGMA3。將IFN-POEGMA1、IFN-POEGMA2、IFN-POEGMA3分別用SDS-PAGE檢測，分子量分別為分子量20kDa、60kDa和120kDa，與預(yù)測大小相同?？梢钥闯?，通過改變單體OEGMA投料(100,200和400μmol)可以控制IFN-POEGMA結(jié)合體的分子量。計(jì)算產(chǎn)率，公式為(IFN-POEGMA結(jié)合體的質(zhì)量/IFN-LPETGGH6的質(zhì)量)*100％，結(jié)果如表2，IFN-POEGMA1、IFN-POEGMA2、IFN-POEGMA3的產(chǎn)率分別為38.4％，66.1％和78.0％。表22、干擾素高分子結(jié)合體IFN-POEGMA的結(jié)構(gòu)分析圖8顯示了IFN-POEGMA的合成及純化過程，其中，A為SDS-PAGE分析IFN-Br原位ATRP生長高分子POEGMA，從左往右依次為：反應(yīng)混合物、純化后的IFN-POEGMA、未反應(yīng)的IFN-Br。B：AEX分離原位ATRP反應(yīng)的混合物，UV監(jiān)測線性洗脫得到目標(biāo)產(chǎn)物IFN-POEGMA。結(jié)果表明陰離子交換方法能夠非常有效地從ATRP反應(yīng)混合物中分離IFN-POEGMA。圖9為SDS-PAGE和GPC分析IFN-POEGMA，A圖為SDS-PAGE分析IFN-POEGMA，從左往右依次為：純化后的IFN-POEGMA、IFN-Br、IFN-LPETGGH6，B圖為GPC分析IFN-POEGMA。圖10通過1HNMR分析IFN-POEGMA結(jié)合體。為了驗(yàn)證POEGMA是在IFN-Br的C-末端合成的，用不含引發(fā)劑的三甘氨酸連接到IFN-α2上，然后用上述相同的條件進(jìn)行了對照試驗(yàn)。圖11顯示了分析ATRP合成IFN-POEGMA的對照試驗(yàn)，其中，A：GPC分析IFN-Br合成IFN-POEGMA和IFN-GGG 對照試驗(yàn)。B：SDS-PAGE分析，從左至右依次為蛋白標(biāo)樣、IFN-Br進(jìn)行ATRP反應(yīng)、IFN-GGG對照試驗(yàn)和IFN-Br。對照試驗(yàn)采用與IFN-Br相同的反應(yīng)條件對IFN-GGG用來進(jìn)行ATRP反應(yīng)，顯示IFN-GGG并沒有生長出POEGMA，說明該聚合反應(yīng)僅在連接了ATRP引發(fā)劑的IFN-Br的C-末端進(jìn)行，而不存在蛋白其他反應(yīng)基團(tuán)上的副反應(yīng)。為了顯示原位ATRP技術(shù)的優(yōu)越性，利用“graftingto”技術(shù)合成IFN-POEGMA。Graftingto技術(shù)包含兩步驟：1)合成POEGMA；2)POEGMA接枝到IFN-α2的C-末端。在上述相同條件下利用引發(fā)劑AEBM合成對應(yīng)分子量的POEGMA(～60kDa)，利用超濾方法除去小分子等雜志。25μMIFN-LPETGH6,12.5μM轉(zhuǎn)肽酶A和500μMPOEGMA在50mMTris·HCl,150mMNaCl,10mMCaCl2,pH7.4常溫過夜孵育。反應(yīng)混合物經(jīng)一次陽離子交換柱(平衡緩沖液為20mMTris·HCl，pH7.0；洗脫緩沖液為20mMTris·HCl，1MNaCl，pH7.0)除去轉(zhuǎn)肽酶A，一次陰離子交換柱(平衡緩沖液為20mMTris·HCl，pH8.0；洗脫緩沖液為20mMTris·HCl，1MNaCl，pH8.0)除去未反應(yīng)的IFN-LPETGH6和POEGMA。最后獲得純度＞95％的IFN-POEGMA，產(chǎn)率為1.15％。圖12為SDS-PAGE和GPC分析了“graftingto”技術(shù)合成IFN-POEGMA，A圖為SDS-PAGE分析離子交換純化IFN-POEGMA，從左至右分別為：蛋白標(biāo)樣、反應(yīng)前混合物、反應(yīng)24h后混合物、第一次陽離子交換柱純化后混合物、第二次陰離子交換柱純化后IFN-POEGMA、利用原位ATRP技術(shù)合成并純化的IFN-POEGMA。B圖為GPC技術(shù)分析“graftingto”技術(shù)。結(jié)果表明，利用“graftingto”技術(shù)合成IFN-POEGMA反應(yīng)產(chǎn)率低，純化困難，說明原位ATRP技術(shù)具有產(chǎn)率高、純化簡單、易于放大及應(yīng)用等顯著優(yōu)勢。3、干擾素高分子結(jié)合體IFN-POEGMA的物理化學(xué)表征IFN-POEGMA的分子量和多分散系數(shù)(PDI)用GPC測定，所用儀器為WatersHPLC/GPC系統(tǒng)連接UV檢測器(Waters2489)和示差折光檢測器(Waters2414)。色譜柱為AsahipakGS-520HQ和GS-320HQ或GS-520HQ串聯(lián)，流動(dòng)相為50mMTris·HCl緩沖液(pH7.4)，檢測條件為25℃，流速0.5mL/min。不同分子量的窄分布PEG標(biāo)準(zhǔn)樣生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線用來計(jì)算分子量和PDI。為了準(zhǔn)確計(jì)算高分子POEGMA的分子量，先通過蛋白酶降解與原位高分子偶聯(lián)的蛋白質(zhì)再進(jìn)行表征。具體步驟為：IFN-POEGMA結(jié)合體(1mg/mL)與蛋白酶K(0.5mg/mL)在50mMTris·HCl,2mMCaCl2,pH7.4，45℃孵育12h。圖13顯示了IFN-POEGMA可以被蛋白酶K降解IFN，再通過GPC準(zhǔn)確表征POEGMA分子量，從左往右依次為：蛋白標(biāo)樣、IFN-POEGMA1、IFN-POEGMA與蛋白酶K反應(yīng)前、IFN-POEGMA與蛋白酶K反應(yīng)過夜后、蛋白酶K。通過已知分子量的PEG標(biāo)準(zhǔn)品被用來生成標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IFN-POEGMA結(jié)合體的 分子量和PDI。圖14顯示了SDS-PAGE和GPC通過原位ATRP得到不同分子量的IFN-POEGMA。A圖為SDS-PAGE分析不同分子量的IFN-POEGMA，從左往右依次是：蛋白標(biāo)樣、IFN-POEGMA1、IFN-POEGMA2、IFN-POEGMA3、IFN-Br。B圖為GPC分析IFN-POEGMA的分子量，對應(yīng)IFN-POEGMA1、IFN-POEGMA2和IFN-POEGMA3的分子量分別為23.6kDa、66.2kDa和103.7kDa，PDI分別為1.29、1.35和1.34。同時(shí)也證明可以通過調(diào)控單體/引發(fā)劑比例有效控制蛋白質(zhì)-高分子結(jié)合體的分子量。在MalvernZetasizerNano-zs90上用動(dòng)態(tài)光散射(DLS)方法測定IFN-POEGMA的水合半徑。樣品稀釋在PBS緩沖液中，測試前經(jīng)0.22μm孔徑濾膜過濾處理。經(jīng)DLS測試，IFN-Br的水合半徑為2.2nm，而合成的IFN-POEGMA1、IFN-POEGMA2和IFN-POEGMA3的水合半徑分別為5.9nm、10.6nm和15.2nm。圖15顯示了DLS分析IFN-POEGMA。用核磁共振儀(1HNMR)表征蛋白質(zhì)-高分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)。IFN-POEGMA樣品經(jīng)冷凍干燥后，溶解于D2O，在JEOLECX-400400MHz核磁共振光譜儀上進(jìn)行分析。通過1HNMR譜圖證實(shí)了蛋白分子上成功合成了POEGMA。圖10顯示了通過1HNMR分析IFN-POEGMA2結(jié)合體。IFN-POEGMA2的二級結(jié)構(gòu)用圓二色性譜分析測得。樣品用水溶液稀釋至0.18mg/mL(1.2μM)，用Pistarπ-180(AppliedPhotophysics有限公司)在190-250nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描分析。圖16顯示了圓二色性色譜分析IFN-Br、IFN-POEGMA的二級結(jié)構(gòu)。對IFN-Br和IFN-POEGMA結(jié)合體做了圓二色性譜分析，均在190-260nm波長范圍內(nèi)的圓二色譜都呈現(xiàn)出同樣的209/219nm雙峰曲線，且與IFN-Br曲線重疊良好，表明在蛋白質(zhì)上生長原位高分子對蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)沒有明顯影響。用二喹啉甲酸法(BCA)測定IFN-POEGMA的蛋白濃度，已知濃度的牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)樣，具體步驟按照說明書。三、對照方法制備在2.5mL含有40μMIFN-Br的PBS溶液(溶質(zhì)為IFN-Br，溶劑為pH值為7.4、濃度為10mM的PBS溶液)加入一定量的OEGMA(OEGMA與IFN-Br的摩爾比分別為500:1)和11OμL維生素C水溶液(4Omg/mL),通氮?dú)?5min后,加入10μL的氯化亞銅和N,N,N`,N'`,N'`一五甲基二乙烯基三胺(PMDTA)(濃度分別為100mM和300mM)混合物儲液,密閉條件下反應(yīng)lh,然后暴露在空氣中終止反應(yīng)，得到反應(yīng)混合物。反應(yīng)混合物經(jīng)陰離子交換柱(HiTrapCaptoQcolumn，GEHealthcare)分離純化(純化方法同前)出IFN-POEGMA，收集8mL柱體積的為干擾素高分子結(jié)合體IFN-POEGMA(對照組)；將IFN-POEGMA(對照組)用SDS-PAGE檢測和GPC測定，分子量為60.0kDa。計(jì)算產(chǎn)率，公式為(IFN-POEGMA結(jié)合體的質(zhì)量/IFN-LPETGGH6的質(zhì)量)*100％，結(jié)果如表3，IFN-POEGMA(對照組)的產(chǎn)率為18.9％。表3可以看出，本發(fā)明的二的方法與三的對照方法制備的同樣分子量的IFN-POEGMA結(jié)合體比較，本發(fā)明的二的方法制備的IFN-POEGMA結(jié)合體的產(chǎn)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于三的對照方法，說明本發(fā)明的方法效果好。實(shí)施例2、干擾素高分子結(jié)合體IFN-POEGMA的功能驗(yàn)證1、IFN-POEGMA的體外生物活性和熱穩(wěn)定性測試本發(fā)明中IFN-POEGMA(選擇實(shí)施例2的二的方法制備的IFN-POEGMA2，即分子量為66.2kDa進(jìn)行表征，下均同)的抗細(xì)胞增殖活性采用MTT方法測定。選用了人Burkitt’sB淋巴瘤細(xì)胞(DaudiB)，因?yàn)樵摷?xì)胞對IFN-α2具有較高的敏感。DaudiB細(xì)胞在含有15％FBS、50U/mL盤尼西林和50μg/mL鏈霉素的RMPI-1640中培養(yǎng)一段時(shí)間后，在96孔板中接種一定濃度的細(xì)胞懸浮液(50μL/孔，7500個(gè)細(xì)胞)，將IFN-Br、派羅欣和純化后的IFN-POEGMA結(jié)合體樣品系列稀釋，各50μL加入96孔培養(yǎng)板中，設(shè)陰性對照(不含IFN-α2)和空白對照(只含培養(yǎng)液)，37℃，5％CO2培養(yǎng)72h，加MTT溶解液20μL/孔，3h后用酶標(biāo)儀測定各孔490nm波長的吸收值，比較不同樣品處理后細(xì)胞增殖的程度。圖17顯示了MTT測定IFN-POEGMA的體外生物活性，表4顯示了IFN-Br、派羅欣和IFN-POEGMA的體外生物活性，IFN-Br、派羅欣和IFN-POEGMA的IC50分別為11.6pg/mL、195.90pg/mL和27.37pg/mL，活性保持率分別為100％、5.92％和42.38％。綜上可知，IFN-POEGMA體外抗腫瘤活性遠(yuǎn)高于派羅欣，表明原位ATRP沒有嚴(yán)重降低IFN的活性，為體內(nèi)抗腫瘤活性測試提供了依據(jù)。表4本發(fā)明表征了IFN-POEGMA的熱穩(wěn)定性。樣品(200μg/mL)置于37℃1,2,4,6,8h,1,2,3,5,7,8和10天后，利用MTT法測定其抗腫瘤細(xì)胞增殖活性。如圖18，IFN-POEGMA放置37℃5天活性保持在95％以上，到第10天仍然保持80％以上活性，相反，IFN-Br活性迅速下降，8h后僅保持26％的活性，24h后活性消失。該數(shù)據(jù)表明，經(jīng)過POEGMA修飾后的IFN具有很好的體外熱穩(wěn)定性。2、IFN-POEGMA的藥物代謝動(dòng)力學(xué)測試以下所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均在清華大學(xué)關(guān)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的各項(xiàng)規(guī)定指導(dǎo)下完成。本發(fā)明中利用Bal/cnude裸鼠模型經(jīng)尾靜脈注射IFN-Br、派羅欣和IFN-POEGMA，測定了血液中干擾素濃度隨時(shí)間變化的情況，并利用DAS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。在藥物處理期前，9只雌性裸鼠觀察一段時(shí)間后隨機(jī)分成3組。以1mg/kg體重劑量尾靜脈注射IFN-POEGMA、派羅欣及未修飾IFN-Br對照物，然后在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)(1,5,15,30min,1,3,6,24,48,72和96h)尾靜脈取血20μL(采血管預(yù)先用肝素鈉(江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品)浸潤并烘干)，室溫靜置1h，在4℃、3000×g下離心收集上層血漿，保存于﹣80℃低溫冰箱。用人IFN-α2ELISA試劑盒(PBLinterferonsource)根據(jù)說明書測定血清中的IFN-α2含量。利用DAS3.0藥物代謝動(dòng)力學(xué)分析軟件計(jì)算IFN-POEGMA、派羅欣和IFN-Br的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)。表5和圖19分別顯示了IFN-POEGMA、派羅欣和IFN-Br在裸鼠中藥物代謝動(dòng)力學(xué)情況。IFN分布半衰期(t1/2α)消除半衰期(t1/2β)分別為0.42h和1.58h，在給藥5分鐘后，血液中干擾素的濃度即迅速下降到初始劑量的50％以下，24h后殘留濃度不足初始濃度的0.1％。而IFN-POEGMA在體內(nèi)的濃度是逐漸減少的，其初始半衰期和消除半衰期分別為2.09h和56.34h，是IFN的35倍左右。到給藥72h后，仍有20％以上的殘留。IFN-POEGMA的藥時(shí)曲線下面積(AUC0-∞)是IFN的167倍。以上結(jié)果表明，與未修飾的IFN相比，IFN-POEGMA結(jié)合體的消除半衰期和體內(nèi)平均存留時(shí)間明顯延長，藥時(shí)曲線面積顯著增加，清除率顯著降低，與派羅欣具有相近的體內(nèi)循環(huán)半衰期。表53、IFN-POEGMA體內(nèi)組織分布情況本發(fā)明中利用移植了卵巢癌細(xì)胞的裸鼠測定了給藥2h，24h和4d后腫瘤中殘留的干擾素的濃度。人卵巢癌細(xì)胞(OVCAR-3)在含有10％FBS，50U/mL盤尼西林和50μg/mL鏈霉素的RMPI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間后，用胰蛋白酶消化剝離，經(jīng)PBS洗滌，重懸于不含上述添加物的RMPI-1640培養(yǎng)基并與BDMatrigelMatrix等體積混合物中，0.2mL單細(xì)胞懸液(5×106個(gè)細(xì)胞)接種于裸鼠左后肢股骨處背部皮下，培養(yǎng)30天后形成100-200mm3大小的實(shí)體瘤腫塊。將裸鼠隨機(jī)分成3組，IFN-POEGMA、派羅欣、IFN-Br以尾靜脈注射打入裸鼠體內(nèi)，給藥劑量為10μg/20g體重。給藥2h，24h和4d后處死裸鼠，收集心臟、腎臟、肝臟、脾臟、肺臟、胰腺、胃、肌肉、小腸和腫瘤等組織器官。用提取緩沖液 (PBS含1mMEDTA，0.5％TritonX-100，0.5％脫氧膽酸鈉，1mMPMSF，按1:100比例稀釋的蛋白酶抑制劑混合物和磷酸酶抑制劑混合物(Sigma-Aldrich))破碎后，離心取上清提取液。組織中IFN的濃度用ELISA方法定量測定。圖20為IFN-POEGMA在各組織中的累積情況，說明IFN-POEGMA在心臟、腎臟、肝臟、脾臟、肺臟、胰腺、胃、肌肉、小腸和腫瘤中均能夠有效累積。其中，A圖為IFN-POEGMA、派羅欣、IFN-Br在腫瘤中累積情況，可以看出，IFN-POEGMA組腫瘤中干擾素的濃度和IFN組腫瘤中干擾素的濃度相比，注射2h為10.5倍，注射24h為133.2倍，注射4d后IFN-POEGMA仍有15％的殘留。B圖為IFN-POEGMA、派羅欣、IFN-Br在其他組織中累積的情況。表明，IFN-POEGMA能夠有效利用增強(qiáng)通透和滯留效應(yīng)，使干擾素在腫瘤組織中聚集、在血液循環(huán)中半衰期延長，從而提高干擾素在體內(nèi)的生物利用度和抗腫瘤功效。4、裸鼠模型測試IFN-POEGMA體內(nèi)抗腫瘤活性IFN-POEGMA的體內(nèi)生物活性用動(dòng)物移植性腫瘤實(shí)驗(yàn)法測定。按上述方法，OVCAR-3細(xì)胞接種于裸鼠左后肢股骨處背部皮下，培養(yǎng)3周天后形成實(shí)體瘤腫塊(～20mm3)，從而建立裸鼠腫瘤模型。將26只裸鼠分成4組，IFN-POEGMA、派羅欣及對照品(IFN-Br為陽性對照，生理鹽水為陰性對照)以尾靜脈注射打入裸鼠體內(nèi)，給藥劑量為20μg/20g體重，每周注射一次，直至生理鹽水組、IFN-Br組和派羅欣組的裸鼠全部死亡。在本實(shí)驗(yàn)中裸鼠死亡包括自然死亡和安樂處死，安樂處死是指裸鼠腫瘤生長超過500mm3或體重下降超過15％，被注射巴比妥鈉類藥物處死。每周觀察裸鼠生存狀態(tài)以及腫瘤生長情況，動(dòng)態(tài)測量裸鼠體重和腫瘤體積隨時(shí)間的變化。為檢測IFN-POEGMA的毒性，給藥三次后，處死小鼠，并收集腫瘤、心臟、肝臟和腎臟，固定在4％甲醛溶液中，切片后通過標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行HE染色，觀察器官的組織學(xué)形態(tài)。結(jié)束治療后，通過眼球取血，測量乳酸脫氫酶、肌酸激酶同工酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、肌酐、尿素氮、紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板、血紅蛋白等基本生理指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖21和圖22)，實(shí)驗(yàn)期間，生理鹽水組的裸鼠的腫瘤體積快速增大，注射第38天，裸鼠腫瘤體積均超過500mm3，生存中值僅為35天；實(shí)驗(yàn)期間，IFN-Br組的裸鼠的腫瘤體積逐漸增大，注射第45天IFN組的裸鼠腫瘤體積也超過500mm3，生存中值為38天，沒有體現(xiàn)明顯的抗腫瘤活性；實(shí)驗(yàn)期間，派羅欣組的裸鼠的腫瘤體積逐漸增大，注射第56天IFN組的裸鼠腫瘤體積也超過500mm3，生存中值為50.5天，有一定的抗腫瘤活性；實(shí)驗(yàn)期間，IFN-POEGMA組的裸鼠的腫瘤體積基本沒有變化，同時(shí)，有75％的小鼠腫瘤消失，只有2只小鼠腫瘤緩慢增大，直到77天和88天腫瘤體積才超過500mm3。以上數(shù)據(jù)表明，IFN-POEGMA能夠有效地抑制腫瘤的生長，具有非常 好的體內(nèi)抗腫瘤活性，甚至優(yōu)于目前市售藥品派羅欣。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，實(shí)驗(yàn)期間，IFN-POEGMA組的裸鼠體重略有增加(圖23)，表明IFN-POEGMA對裸鼠沒有明顯的副作用。圖24為給藥3次后小鼠的腫瘤、心臟、肝臟、腎臟的組織學(xué)切片，可以看出，注射IFN-POEGMA后，小鼠腫瘤細(xì)胞間隙出現(xiàn)空穴，胞漿和細(xì)胞核形態(tài)不明顯，細(xì)胞壞死，大塊細(xì)胞膜脫落，與對照組差異明顯。同時(shí)，心臟、肝臟和腎臟的細(xì)胞形態(tài)完整，無明顯細(xì)胞壞死，與對照組組織學(xué)形態(tài)無明顯差異。圖25和圖26分別為結(jié)束治療后小鼠的生化和血液指標(biāo)，與生理鹽水組、IFN-Br組和派羅欣組的裸鼠相比，IFN-POEGMA組的裸鼠的乳酸脫氫酶、肌酸激酶同工酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、肌酐、尿素氮、紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板、血紅蛋白等基本生理指標(biāo)沒有顯著差別。以上數(shù)據(jù)表明IFN-POEGMA不會對裸鼠體內(nèi)器官造成明顯毒性。本發(fā)明的方法原位ATRP合成技術(shù)產(chǎn)率高，純化簡單，易于工業(yè)化，制備的干擾素-POEGMA結(jié)合體具有較高的生物活性保存率，顯著延長的半衰期和有效的腫瘤抑制作用，與市售藥物派羅欣體內(nèi)外活性相比表現(xiàn)出更加優(yōu)異的功效。ATRP合成技術(shù)可望取代PEG化成為修飾蛋白藥物以提高藥物穩(wěn)定性、改善藥物代謝動(dòng)力學(xué)和增強(qiáng)治療功效的新方法。當(dāng)前第1頁1 2 3