本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種用于鑒定鴿子性別的引物對、試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
鴿肉含有多種氨基酸、維生素及微量元素；鴿蛋也是養(yǎng)生、滋補的佳品。隨著國內(nèi)外鴿子市場消費水平的增長，越來越多的商家投入到鴿子生產(chǎn)中，鴿子的繁育和發(fā)展受到了更多的關(guān)注。鴿子屬于單態(tài)性鳥類，即雌雄性別在外觀上表現(xiàn)一致。鴿子還是典型的“一夫一妻”制的繁殖方式，如果性別比例不當(dāng)，不僅會使鴿群不安定，還會影響繁殖，降低產(chǎn)蛋率，所以雌雄鑒別在鴿子養(yǎng)殖業(yè)中具有重要作用。
鴿子作為晚成鳥，雛鴿體型小且雌雄外貌形態(tài)差別甚微，不像一般家禽可以從外形上區(qū)分雌雄。因此，人們對鴿子的雌雄鑒定主要依賴分子生物學(xué)方法，而其中CHD-W基因鑒定法最為常用。CHD1(chromo-helicase-DNA binding protein-1)在非平胸鳥類的Z、W染色體都有分布，兩者的外顯子序列和大小相似，內(nèi)含子大小卻有很大差別。國內(nèi)外學(xué)者根據(jù)這個特性，利用內(nèi)含子兩側(cè)保守序列設(shè)計特異性引物，使用PCR方法對CHD-W進行擴增，用于多種非平胸目鳥的性別鑒定，并取得了顯著進展。
然而，一方面現(xiàn)有的引物主要針對普遍的非平胸目鳥類，與特定鳥類的基因吻合度低，PCR效果較差；另一方面現(xiàn)有的引物擴增雌性兩條帶大小差別不大，不易區(qū)分，容易造成判斷失誤；而且，在鴿子基因組DNA的提取過程費時費力，還容易造成樣品污染，影響檢測結(jié)果。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種技術(shù)實用性強、重復(fù)性好、效率高的直接對血液擴增鑒定鴿子性別的方法。該方法既可節(jié)約鴿子基因組DNA提取的成本，降低樣本污染的風(fēng)險和假陽性的概率，又可以用于鑒別外觀上難以區(qū)分性別的鴿子的性別鑒定。
本發(fā)明的目的之一是提供一種鑒定鴿子性別的引物對。該引物對為：
上游引物CHd-WL1(SEQ ID NO：1，5’CTCTGGGTTTTGACCAACTA3’)；
下游引物CHd-WR1(SEQ ID NO：2，5’ATATCTTACCGCCTGATCTC3’)。
本發(fā)明的目的之二是提供一種鑒定鴿子性別的PCR試劑盒。該試劑盒包括：所述引物對SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2、LA PCR buffer、dNTPs、PEC-1和Omni Klentaq。
最后，本發(fā)明的目的提供一種鑒定鴿子性別的方法。具體步驟如下：對NCBI數(shù)據(jù)庫中公布的多種鳥類CHD1序列進行比對，確定較為保守的區(qū)域，設(shè)計一對原創(chuàng)性引物對，引物對名稱為CHd-WL1(核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)和CHd-WR1(核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示)，該引物與其他已報道的禽類性別鑒定的引物完全不同，可用于鴿子性別的分子鑒定。采集鴿子翅靜脈的新鮮血液或者抗凝管(EDTA)收集的凍存血，利用該引物對進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。電泳后擴增產(chǎn)物為單一條帶，可以判定該個體為雌性；電泳后擴增產(chǎn)物無條帶，可以判定該個體為雄性。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明直接使用鴿子血液進行PCR檢測，不僅節(jié)省了成本和勞動時間，還降低了樣本污染的風(fēng)險和假陽性的概率；在保守區(qū)域設(shè)計引物用于鴿子性別的鑒定，PCR擴增效果好，電泳檢測條帶清晰，結(jié)果易讀，可以準(zhǔn)確地判定鴿子性別；本發(fā)明設(shè)計引物通用性強，適用于鴿子品種包括但不限于白卡鴿、白王鴿、深王鴿、泰森鴿、銀王鴿等。本發(fā)明使用血液直擴鑒定鴿子性別，是一種技術(shù)實用性強、重復(fù)性好、效率高的的方法。
附圖說明
圖1實施例中鴿子血液直接PCR產(chǎn)物電泳后的圖譜；其中電泳圖譜第一行：白卡1-8為白卡鴿，深王1-8為深王鴿，白王1-8為白王鴿；電泳圖譜第二行：銀王1-8號為銀王鴿，泰森1-8為泰森鴿，B為空白對照。圖中M為marker，♀為雌性，♂為雄性。
具體實施方式
下面參考具體實施例，對本發(fā)明進行說明，需要說明的是，這些實施例僅僅是說明性的，而不能理解為對本發(fā)明的限制。
若未特別指明，實施例中所采用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，可以參照《分子克隆實驗指南》(J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，第三版，科學(xué)出版社)或者相關(guān)產(chǎn)品進行，所采用的試劑和產(chǎn)品也均為可商業(yè)獲得的。未詳細描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法，所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時標(biāo)明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。
實施例
1、鴿子血液采集
本發(fā)明的樣品來源于鴿子5個品種：白卡鴿、白王鴿、深王鴿、泰森鴿、銀王鴿，每個 品種雌雄各4只。先將鴿子側(cè)臥保定，露出腋窩處，拔去該部羽毛，可見翼下靜脈，壓迫翼下靜脈的近心端，使血管怒張，消毒后，手持采血針由翼根向翅膀方向沿靜脈平行刺入，采完后要壓迫止血。采集的血液可直接檢測或者抗凝管(EDTA)收集-20℃冷凍保存。
2、引物設(shè)計
對NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中公布的多種鳥類CHD1序列進行比對，確定保守的區(qū)域，利用primer5.0設(shè)計一對原創(chuàng)性引物對：CHd-WL1(核苷酸序列SEQ ID NO：1 CTCTGGGTTTTGACCAACTA)和CHd-WR1(核苷酸序列SEQ ID NO：2ATATCTTACCGCCTGATCTC)，該引物與其他已報道的禽類性別鑒定的引物完全不同，可用于鴿子性別的分子鑒定。
3、PCR擴增
20μl反應(yīng)體系中加入鴿子血液0.8μl、LA PCR buffer 2μl、上下游引物各0.6μl、dNTPs 1μl、PEC-15μl、Omni Klentaq 0.3μl、ddH2O 9.7μl。其中：LA PCR buffer來自寶生物工程(大連)有限公司的10×LA Taq Buffer II(Mg2+plus)(Code No.9153A)，dNTPs購于寶生物工程(大連)有限公司(Code No.4030Q)，PEC-1增強劑購于VitaNavi Trchnology(VN260P)，Omni Klentaq直擴酶來自美國Enzymatics公司的Omni(P7500-HC-F)，ddH2O為高壓滅菌的去離子水，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成，工作濃度為10μM。表1是PCR的反應(yīng)體系。
PCR反應(yīng)條件為：98℃5min，35個循環(huán)：95℃30s，54℃30s，72℃45s，后72℃延伸5min，反應(yīng)產(chǎn)物于4℃保存。
表1
4、性別鑒定
將PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。鴿子性別鑒定檢測結(jié)果如圖1所示：其中電泳圖譜第一行：白卡1-8為白卡鴿，深王1-8為深王鴿，白王1-8為白王鴿；電泳圖 譜第二行：銀王1-8號為銀王鴿，泰森1-8為泰森鴿，B為空白對照。圖中M為marker，是天根生化科技(北京)有限公司的100bp DNA ladder，♀為雌性，♂為雄性。從擴增產(chǎn)物電泳圖譜可知：擴增產(chǎn)物電泳為單一條帶的是雌鴿，長度約370bp；擴增產(chǎn)物電泳無條帶的是雄鴿。
5、序列分析
由于雄性鴿子不能擴增出目的條帶，因此我們將經(jīng)過鑒定的雌鴿樣本的PCR擴增產(chǎn)物送華大基因測序，以驗證性別鑒定的準(zhǔn)確性。雌鴿樣本的PCR擴增產(chǎn)物測序峰圖使用Chromas軟件查看，測序堿基序列結(jié)果使用DNAMAN軟件查看，并使用DNAMAN軟件將鴿子的測序堿基序列和NCBI數(shù)據(jù)庫公布的多種鳥類的CHD1序列進行對比分析，結(jié)果顯示擴增序列與參考序列有很高的一致性，說明我們擴增的序列為CHD1基因，進而說明我們設(shè)計的引物性別鑒定的結(jié)果是真實可靠的。
本發(fā)明方法技術(shù)實用性強，重復(fù)性好，效率高。直接使用鴿子血液進行PCR檢測，不僅節(jié)省了成本和勞動時間，還降低了樣本污染的風(fēng)險和假陽性的概率。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出：對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。