本申請要求2014年2月10日提交的美國臨時申請序號61/938,103的優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容通過引用并入本申請。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明一般地涉及使用納米組合物來調(diào)節(jié)細胞行為。

發(fā)明背景

現(xiàn)代細胞療法通常涉及在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)細胞行為，如刺激細胞增殖、誘導細胞分化和引導細胞遷移。然而，目前調(diào)節(jié)細胞行為的策略和方法是有限的。納米技術(shù)在生物醫(yī)學研究中的應用代表了基于納米級水平的修飾來創(chuàng)建有意義的和創(chuàng)新的工具的一個極具吸引力的嶄新方向。因此，需要開發(fā)使用納米粒子調(diào)節(jié)細胞行為的納米技術(shù)。

發(fā)明簡述

本公開提供了納米組合物以及此類納米組合物的方法或用途。所述納米組合物可以用于調(diào)節(jié)細胞行為，如細胞增殖、細胞分化、細胞活化和以濃度可控的方式獲得純的細胞群。

本公開的一個方面提供了一種用于細胞富集和調(diào)控的納米組合物。所述納米組合物包含納米結(jié)構(gòu)和與所述納米結(jié)構(gòu)可操作地連接的至少一種細胞調(diào)節(jié)劑。所述細胞調(diào)節(jié)劑能夠與細胞表面上的分子相互作用。

在一些實施方式中，在所述納米組合物中的納米結(jié)構(gòu)包含磁性材料。在一些實施方式中，所述磁性材料是鐵磁性、亞鐵磁性、順磁性或超順磁性材料。在一些實施方式中，所述磁性材料是超順磁性氧化鐵(SPIO)。

在一些實施方式中，在所述納米組合物中的納米結(jié)構(gòu)在所述納米結(jié)構(gòu)的表面上具有硅烷化涂層。

在一些實施方式中，在所述納米組合物中的納米結(jié)構(gòu)具有1nm至500nm的直徑。

在一些實施方式中，與所述納米結(jié)構(gòu)可操作地連接的所述細胞調(diào)節(jié)劑包括特異性識別細胞表面上的分子的抗體。在一些實施方式中，所述細胞調(diào)節(jié)劑選自下組：抗CD3抗體、抗CD28抗體、抗CD81抗體及其任意組合。

在一些實施方式中，所述細胞調(diào)節(jié)劑是細胞表面上的受體的配體。在一些實施方式中，所述細胞調(diào)節(jié)劑包括選自由B7-1和B7-2組成的組的CD28天然配體的刺激性形式。

在一些實施方式中，所述細胞調(diào)節(jié)劑選自下組：CD137抗體、CD137配體蛋白、IL-15蛋白和IL-15受體抗體。

在一些實施方式中，所述細胞調(diào)節(jié)劑是疫苗。

在某些實施方式中，所述細胞調(diào)節(jié)劑與細胞相互作用，從而富集所述細胞的群或調(diào)節(jié)所述細胞的行為。在一些優(yōu)選的實施方式中，所述細胞的行為是轉(zhuǎn)化、增殖、重編程、分化或遷移。

在某些實施方式中，可以將所述細胞用于治療。在一些優(yōu)選的實施方式中，所述細胞能夠產(chǎn)生嵌合的抗原受體。

在一些實施方式中，行為被調(diào)節(jié)的所述細胞是T細胞。在一些實施方式中，所述細胞是NK細胞。

在一些實施方式中，行為被調(diào)節(jié)的所述細胞是干細胞。在一些實施方式中，所述細胞是胚胎干細胞。

在一些實施方式中，所述細胞的可用性是因為其純度。

在一些實施方式中，所述納米組合物還包含可檢測標記。在一些實施方式中，所述可檢測標記是熒光分子、化學發(fā)光分子、生物發(fā)光分子、放射性同位素、MRI造影劑、CT造影劑、酶底物標記或著色劑。

在另一個方面，本公開提供了一種通過如下方式調(diào)節(jié)細胞行為的方法：使所述細胞與可操作地與納米結(jié)構(gòu)連接的至少一種細胞調(diào)節(jié)劑接觸。所述細胞調(diào)節(jié)劑與所述細胞表面上的分子接觸，并且所述細胞調(diào)節(jié)劑與所述分子之間的相互作用調(diào)節(jié)所述細胞的行為。在一些優(yōu)選的實施方式中，所述方法還包括富集所述細胞群。

本發(fā)明的另一個方面涉及一種在對象中治療疾病的方法。所述方法包括使細胞與可操作地與納米結(jié)構(gòu)連接的至少一種細胞調(diào)節(jié)劑接觸。所述細胞調(diào)節(jié)劑與所述細胞表面上的分子相互作用。所述細胞調(diào)節(jié)劑與所述分子之間的相互作用調(diào)節(jié)所述細胞的行為。然后將經(jīng)調(diào)節(jié)的細胞施用至所述對象。

附圖簡述

圖1：使用偶聯(lián)抗CD3/抗CD28抗體的納米組合物刺激CD4+T細胞。

圖2：使用納米組合物分離和鑒定循環(huán)腫瘤細胞。

發(fā)明詳述

在對本公開進行更加詳細的描述之前，應理解本公開不限于所描述的特定實施方式，并且因此當然是可以改變的。還應理解本申請所使用的術(shù)語僅僅是用于描述特定實施方式的目的，并且并非旨在為限制性的，因為本公開的范圍將僅由所附權(quán)利要求限定。當提供值的范圍時，應理解在該范圍上限和下限之間的每個中間值(除非上下文另有明確說明，否則到單位下限的十分之一)以及在該所示范圍中的任意其他所示的值或中間的值均應包括在本公開中。這些較小范圍的上限和下限可以獨立地包括在該較小范圍內(nèi)，并且也包括在本公開中，同時滿足在所示范圍內(nèi)的任意特異性排除的限值。當所示的范圍包括一個或全部兩個限值時，排除一個或全部兩個這些所包括的限值的范圍也包括在本公開中。

除非另有定義，本申請中使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語均與本公開所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員的通常理解具有相同含義。盡管與本申請所描述的那些相似或等同的任意方法和材料也能夠用于實踐或檢測本公開，但是現(xiàn)對優(yōu)選的方法和材料進行描述。

在本說明書中引用的所有出版物和專利均通過引用并入本申請，如同每個單獨的出版物或?qū)＠惶貏e地和單獨地指明通過引用并入并且其通過引用并入本申請以公開和描述與所引用的出版物相關(guān)的方法和/或材料。任何出版物的引用是為其在申請日之前公開的內(nèi)容，并且不應被解釋為承認由于此前的公開而導致本公開沒有資格先于此類出版物。而且，所提供的出版日期可能不同于可能需要獨立確證的實際出版日期。

如對于閱讀本公開后的本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見，本申請所描述和解釋的每個獨立的實施方式具有分別的組分和特征，在不脫離本公開范圍和主旨的前提下，所述分別的組分和特征可以容易地與任意其他若干實施方式的特征分離或者可以容易地與任意其他若干實施方式的特征組合。任何所述方法可以以所述事件的順序或以在邏輯上可能的任意其他順序?qū)嵤?/p>

除非另有說明，本公開的實施方式將使用在本領(lǐng)域范圍內(nèi)的化學、固態(tài)化學、無機化學、有機化學、物理化學、分析化學、材料化學、生物化學、生物學、分子生物學、重組DNA技術(shù)、藥理學、成像等技術(shù)。在文獻中對這些技術(shù)進行了充分的解釋。

在對本公開的實施方式進行詳細描述前，應理解除非另有說明，本公開不限于特定的材料、試劑、反應材料、生產(chǎn)工藝等，因此是可以改變的。還應理解本申請所使用的術(shù)語僅用于描述特定實施方式的目的，并且其并非旨在為限制性的。在本公開中也可能的是，在邏輯上可行的情況下可以以不同順序執(zhí)行步驟。

必須指出的是，如在本說明書和所附權(quán)利要求中所使用的，除非上下文另有明示，單數(shù)形式的“一個”、“一種”和“該”包括復數(shù)指示對象。因此，例如，提及“一種化合物”包括多種化合物。在本說明書和在隨后的權(quán)利要求中，將提及若干術(shù)語，除非相反的指示是明顯的，所述術(shù)語應該被定義為具有下述含義。

納米組合物

本公開的一個方面提供了一種用于細胞富集和調(diào)節(jié)的納米組合物，所述納米組合物包含納米結(jié)構(gòu)和與所述納米結(jié)構(gòu)可操作地連接的至少一種細胞調(diào)節(jié)劑，其中所述細胞調(diào)節(jié)劑能夠與細胞表面上的分子相互作用。

納米結(jié)構(gòu)

如在本申請中所使用的，術(shù)語“納米結(jié)構(gòu)”指具有范圍從約1nm至約1500nm(例如從1nm至1200nm、從1nm至1000nm、從1nm至800nm、從1nm至500nm、從1nm至400nm等)的直徑的粒子。在某些實施方式中，所述納米結(jié)構(gòu)包含單一粒子或一簇粒子。在某些實施方式中，所述納米結(jié)構(gòu)包含核納米粒子和涂層。所述核納米粒子可以是單一粒子或一簇粒子。所述涂層可以是本領(lǐng)域公知的任意涂層，例如聚合物涂層，如聚乙二醇、硅烷和多糖(例如葡聚糖及其衍生物)。

在一些實施方式中，本申請?zhí)峁┑募{米結(jié)構(gòu)含有磁性材料。適宜的磁性材料包括例如亞鐵磁性或鐵磁性材料(例如鐵、鎳、鈷、稀土金屬的一些合金以及一些天然存在的礦物(如磁石))、順磁性材料(如鉑、鋁)和超順磁性材料(例如超順磁性氧化鐵或SPIO)。

磁性材料具有磁性，所述磁性使得所述納米結(jié)構(gòu)被磁體或在磁場中被拉引或吸引。磁性能夠便于使用磁性相互作用對納米結(jié)構(gòu)進行操縱(例如分離、純化或富集)。當受到所施加的磁場(例如來自高場和/或高梯度磁體的磁場)時，所述磁性納米結(jié)構(gòu)可被吸引至指定位點或被磁性引導至指定位點。例如，可以將磁體(例如磁柵)置于所述納米結(jié)構(gòu)附近，以便吸引所述磁性納米結(jié)構(gòu)。

可以使用本領(lǐng)域公知的具有磁性的任意納米結(jié)構(gòu)。在某些實施方式中，本申請所提供的納米結(jié)構(gòu)包含磁性納米粒子，所述磁性納米粒子含有磁性材料。例如，所述納米結(jié)構(gòu)的磁性納米粒子是超順磁性氧化鐵(SPIO)納米粒子。所述SPIO納米粒子是氧化鐵納米粒子(磁赤鐵礦(γ-Fe₂O₃)或磁鐵礦(Fe₃O₄))，或者由這兩相組成的納米粒子。SPIO可以使用適宜的方法合成，并且作為膠體溶液分散在有機溶劑或水中。合成SPIO納米粒子的方法是本領(lǐng)域公知的(參見例如Morteza Mahmoudi等，Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles:Synthesis,Surface Engineering,Cytotoxicity and Biomedical Applications,Nova Science Pub Inc出版，2011)。在一個實施方式中，可以通過濕化學合成方法制備SPIO納米粒子，所述方法涉及在存在堿性介質(zhì)的條件下將Fe和Fe鹽共沉淀。在合成過程中，可以引入氮氣以控制氧化，可以加入表面活性劑和適宜的聚合物以抑制附聚或控制粒徑，和/或可以使用乳液(如油包水微乳)來調(diào)節(jié)SPIO納米粒子的物理性質(zhì)(參見例如Jonathan W.Gunn,The preparation and characterization of superparamagnetic nanoparticles for biomedical imaging and therapeutic application,ProQuest出版,2008)。在另一個實施方式中，可以任選地在存在一種或多種表面活性劑(例如月桂酸和油酸)和/或氧化劑(例如三甲基胺-N-氧化物)的條件下，在適宜溶劑(例如二辛基醚或十六烷)中通過單獨的五羰基鐵的熱分解或通過與過渡金屬羰基化合物的組合的五羰基鐵的熱分解而產(chǎn)生SPIO納米粒子(參見例如美國專利申請PG Pub 20060093555)。在另一個實施方式中，還可以通過氣相沉積法制備SPIO納米粒子，所述氣相沉積法涉及在含有不同濃度氧氣的氦氣氛中鐵的激光汽化(參見Miller J.S.等，Magnetism:Nanosized magnetic materials,Wiley-VCH出版,2002)。在某些實施方式中，所述SPIO納米粒子是在美國專利申請PG Pub 20100008862中公開的那些。

在某些實施方式中，所述納米結(jié)構(gòu)還可以包含非SPIO納米粒子。所述非SPIO納米粒子包括例如金屬納米粒子(例如金或銀納米粒子(參見例如Hiroki Hiramatsu,F.E.O.,Chemistry of Materials 16,2509-2511(2004)))、半導體納米粒子(例如具有單一或多個組分的量子點，如CdSe/ZnS(參見例如M.Bruchez等，Science 281,2013-2016(1998)))、摻雜的不含重金屬的量子點(參見例如Narayan Pradhan等，J.Am.Chem.Soc.129,3339-3347(2007))或其他半導體量子點)；聚合物納米粒子(例如由PLGA(聚(乳酸-共-乙醇酸)(參見例如Minsoung Rhee等，Adv.Mater.23,H79-H83(2011))、PCL(聚己內(nèi)酯)(參見例如Marianne Labet等，Chem.Soc.Rev.38,3484-3504(2009))、PEG(聚乙二醇)或其他聚合物中的一種或組合制備的粒子)；含硅的納米粒子；和非SPIO磁性納米粒子(例如MnFe204(參見例如Jae-Hyun Lee等，Nature Medicine 13,95-99(2006))、合成的反鐵磁性納米粒子(SAF)(參見例如A.Fu等，Angew.Chem.Int.Ed.48,1620-1624(2009))和其他類型的磁性納米粒子)。在某些實施方式中，所述非SPIO納米粒子是有色納米粒子，例如半導體納米粒子，如量子點。

可以使用本領(lǐng)域公知的適宜方法制備或合成所述非SPIO納米粒子，例如溶膠-凝膠合成法、油包水微乳法、氣相沉積法等。例如，可以通過利用還原劑(如檸檬酸鹽或丙酮二羧酸酯)還原氯金酸鹽溶液(例如HAuCl₄)，從而制備金納米粒子。舉另一個例子，可以在二氧化硅粒子表面上由Cd(ClO₄)₂和Na₂S制備CdS半導體納米粒子。舉另一個例子，可以基于在注射至熱配位溶劑中之后有機金屬試劑(如二甲基鎘和三辛基硒)的熱解來合成II-VI半導體納米粒子(參見例如Gunter Schmid,Nanoparticles:From Theory to Application,John Wiley&Sons出版,2011)?？梢圆捎贸珊藫诫s策略制備摻雜的無重金屬的量子點，例如摻雜Mn的ZnSe量子點，其中在高溫下形成小尺寸的MnSe納米簇作為核，并且ZnSe層包覆在核上。舉另一個例子，可以通過如下方式制備聚合物納米粒子：在兩相溶劑系統(tǒng)中乳化聚合物，通過超聲或均化誘導納米尺寸的聚合物液滴，并蒸發(fā)有機溶劑以獲得納米粒子。舉另一個例子，可以通過溶膠-凝膠合成來制備含硅納米粒子，其中在存在酸或堿催化劑的條件下在水和乙醇的混合物中水解烷氧基硅前體(例如TMOS或TEOS)，在劇烈攪拌下縮合經(jīng)水解的單體，并且可以收集所得二氧化硅納米粒子。舉另一個例子，可以通過在高真空下使用離子束沉積，在非磁性間隔層(例如釕金屬)兩側(cè)的每一側(cè)上沉積鐵磁性層以及可化學蝕刻的銅剝離層和保護性鉭表面層，從而制備SAF(一種非SPIO磁性納米粒子)，并且在除去保護層和進行選擇性銅蝕刻后釋放所述SAF納米粒子。

納米粒子的尺寸為1nm至100nm(優(yōu)選尺寸為1-50nm、2-40nm、5-20nm、1nm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、11nm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm、20nm)。可以通過選擇適宜的合成方法和/或系統(tǒng)來控制納米粒子的尺寸。例如，為控制納米粒子的尺寸，可以在極性溶劑中進行納米粒子的合成，所述極性溶劑提供了能夠吸附在納米粒子表面上的離子種類，從而提供了靜電作用和粒子-粒子斥力以幫助穩(wěn)定納米粒子并抑制納米粒子的生長。舉另一個例子，可以在微量非均質(zhì)系統(tǒng)中合成納米粒子，所述微量非均質(zhì)系統(tǒng)能夠?qū)⒓{米粒子劃入受限的空腔或域中。此類微量非均質(zhì)系統(tǒng)可以包括液晶、單層和多層、直接膠束、反膠束、微乳和囊泡。為獲得所需尺寸范圍內(nèi)的納米粒子，可以適當控制或改變合成條件以提供例如所需的溶液濃度或所需的空腔范圍(詳細的綜述可以參見例如Vincenzo Liveri,Controlled synthesis of nanoparticles in microheterogeneous systems,Springer出版,2006)。

納米粒子的形狀可以是球形、立方體、棒狀(參見例如A.Fu等，Nano Letters,7,179-182(2007))、四角椎體形狀(參見例如Manna等，Nature Materials,2,382-385(2003))、椎體、多臂、納米管、納米線、納米纖維、納米板或任意其他適宜的形狀。在制備過程中控制納米粒子形狀的方法是本領(lǐng)域公知的(參見例如Waseda Y.等，Morphology control of materials and nanoparticles:advanced materials processing and characterization,Springer出版,2004)。例如，當采用自下而上的過程(即從分子至納米粒子)制備納米粒子時，可以加入強烈吸附于特定晶面上的形狀控制劑以控制粒子的生長速率。

單個納米結(jié)構(gòu)可以包含單個納米粒子或者多個微型納米粒子或一簇微型納米粒子(A.Fu等，J.Am.chem.Soc.126,10832-10833(2004),J.Ge等，Angew.Chem.Int.Ed.46,4342-4345(2007),Zhenda Lu等，Nano Letters 11,3404-3412(2011))。所述微型納米粒子可以是均質(zhì)的(例如由相同組合物/材料制得或具有相同尺寸)或者異質(zhì)的(由不同組合物/材料制得或具有不同尺寸)。一簇均質(zhì)微型納米粒子指具有基本上相同的特征或特性或者由基本上相同的材料組成的一系列粒子。一簇異質(zhì)微型納米粒子指具有不同特征或特性或者由基本上不同的材料組成的一系列粒子。例如，異質(zhì)微型納米粒子可以包含在中心的量子點和與所述量子點連接的若干離散的金(Au)納米晶。當納米粒子與涂層(如下文所述)締合時，在一系列異質(zhì)納米粒子中不同的納米粒子不需要首先彼此之間締合，而是能夠單獨和分別地與涂層締合。

在某些實施方式中，所公開的納米結(jié)構(gòu)包含多個納米粒子。例如，納米結(jié)構(gòu)含有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、100s或1000s個納米粒子。

在某些實施方式中，本申請所提供的納米結(jié)構(gòu)還包含涂層。至少一個核納米粒子能夠嵌入涂層或使用涂層涂覆?？梢允褂帽绢I(lǐng)域公知的任意適宜涂層，例如聚合物涂層和非聚合物涂層。涂層通過如下與核納米粒子相互作用1)分子內(nèi)相互作用，如共價鍵(例如σ鍵、π鍵、δ鍵、雙鍵、三鍵、四重鍵、五重鍵、六重鍵、3c-2e、3c-4e、4c-2e、抓氫鍵、彎曲鍵、偶極鍵、π反向鍵、共軛、超共軛、芳香性、哈普托數(shù)和反鍵)、金屬鍵(例如與在核納米粒子中的金屬原子的螯合相互作用)，或離子鍵(陽離子π鍵和鹽鍵)，和2)分子間相互作用，如氫鍵(例如雙氫鍵、雙氫配合物、低壘氫鍵、對稱氫鍵)和非共價鍵(例如疏水性、親水性、電荷-電荷或π-堆疊相互作用、范德華力、倫敦色散力、機械鍵、鹵素鍵、親金作用、嵌入、堆疊、熵力和化學極性)。

在某些實施方式中，涂層包含如美國臨時申請61/589,777和美國專利申請12/460,007(本公開中引用的所有參考文獻整體并入本申請)所公開的的低密度多孔性3D結(jié)構(gòu)。

所述低密度多孔性3D結(jié)構(gòu)指與現(xiàn)有介孔納米粒子(例如孔尺寸為2nm至50nm的介孔納米粒子)相比密度低得多(例如十幾倍、二十幾倍、三十幾倍、五十幾倍、七十幾倍、100s倍)的結(jié)構(gòu)。(A.Vincent等，J.Phys.Chem.C,2007,111,8291-8298；J.E.Lee等，J.Am.Chem.Soc,2010,132,552-557；Y.-S.Lin等，J.Am.Chem.Soc,2011,133,20444-20457；Z.Lu,Angew.Chem.Int.Ed.,2010,49,1862-1866.)。

在某些實施方式中，所述低密度多孔性3D結(jié)構(gòu)指密度<1.0g/cc(例如<100mg/cc、<10mg/cc、<5mg/cc、<1mg/cc、<0.5mg/cc、<0.4mg/cc、<0.3mg/cc、<0.2mg/cc或<0.1mg/cc)的結(jié)構(gòu)(例如，從0.01mg/cc至10mg/cc、從0.01mg/cc至8mg/cc、從0.01mg/cc至5mg/cc、從0.01mg/cc至3mg/cc、從0.01mg/cc至1mg/cc、從0.01mg/cc至1mg/cc、從0.01mg/cc至0.8mg/cc、從0.01mg/cc至0.5mg/cc、從0.01mg/cc至0.3mg/cc、從0.01mg/cc至1000mg/cc、從0.01mg/cc至915mg/cc、從0.01mg/cc至900mg/cc、從0.01mg/cc至800mg/cc、從0.01mg/cc至700mg/cc、從0.01mg/cc至600mg/cc、從0.01mg/cc至500mg/cc、從0.1mg/cc至800mg/cc、從0.1mg/cc至700mg/cc、從0.1mg/cc至1000mg/cc、從1mg/cc至1000mg/cc、從5mg/cc至1000mg/cc、從10mg/cc至1000mg/cc、從20mg/cc至1000mg/cc、從30mg/cc至1000mg/cc、從30mg/cc至1000mg/cc、從30mg/cc至900mg/cc、從30mg/cc至800mg/cc或者從30mg/cc至700mg/cc)。

可以使用本領(lǐng)域公知的多種方法確定3D結(jié)構(gòu)的密度(參見例如Lowell,S.等，Characterization of porous solids and powders:surface area,pore size and density,Springer出版,2004)。示例性的方法包括Brunauer Emmett Teller(BET)法和氦比重計法(參見例如Varadan V.K.等，Nanoscience and Nanotechnology in Engineering,World Scientific出版,2010)。簡言之，在BET法中，將待測3D結(jié)構(gòu)的干燥粉末置于向其中供給氦氣和氮氣的檢測箱中，記錄溫度變化，并對結(jié)果進行分析和外推以計算待測樣品的密度。在氦比重計法中，使用氦氣填充待測3D結(jié)構(gòu)的干燥粉末，并研究由體積變化產(chǎn)生的氦氣壓力以提供密度。由于3D結(jié)構(gòu)的超低密度，因此基于干燥粉末樣品的測定密度不反映3D結(jié)構(gòu)的實際密度，框架容易在干燥過程中坍塌，因此其在孔隙度測定中提供的數(shù)量比當3D結(jié)構(gòu)完全伸展時(例如像當3D結(jié)構(gòu)在緩沖溶液中完全伸展時)小得多。在某些實施方式中，可以使用3D結(jié)構(gòu)的干重除以該3D結(jié)構(gòu)在水溶液中的總體積來確定3D結(jié)構(gòu)的密度。例如，可以分別確定具有和不具有3D結(jié)構(gòu)的核粒子的干重，并且這兩者之間的差值將是3D結(jié)構(gòu)的總質(zhì)量。類似地，可以分別確定在水溶液中具有和不具有3D結(jié)構(gòu)的核粒子的體積，并且這兩者之間的差值將是在水溶液中核粒子上3D結(jié)構(gòu)的體積。

在某些實施方式中，多孔性納米結(jié)構(gòu)可以作為多個涂覆有3D結(jié)構(gòu)的大納米粒子在水溶液中分散，在這種情況下，3D結(jié)構(gòu)的總體積可以計算為單個大納米粒子的3D結(jié)構(gòu)的平均體積乘以大納米粒子的數(shù)量。對于每個單獨的大納米粒子而言，可以使用動態(tài)光散射(DLS)技術(shù)確定具有3D結(jié)構(gòu)的粒子的尺寸(例如半徑)，并且可以在透射電子顯微鏡(TEM)下確定不具有3D結(jié)構(gòu)的粒子核的尺寸(例如半徑)，因為3D結(jié)構(gòu)在TEM下基本上是不可見的。相應地，可以通過從具有3D結(jié)構(gòu)的粒子的體積中減去不具有3D結(jié)構(gòu)的粒子的體積而獲得在單獨的大納米粒子上的3D結(jié)構(gòu)的體積。

可以使用任意適宜的方法計算對于給定核質(zhì)量的大納米粒子的數(shù)量。例如，單獨的大納米粒子可以由在TEM下可見的多個小納米粒子組成。在這種情況下，可以基于在TEM下的測定結(jié)果確定小納米粒子的平均尺寸和體積，可以通過將已知的核材料的密度乘以小粒子的體積確定小納米粒子的平均質(zhì)量?？梢酝ㄟ^用核質(zhì)量除以小納米粒子的平均質(zhì)量來估計小納米粒子的總數(shù)。對于單獨的大納米粒子而言，可以在TEM下確定其中小納米粒子的平均數(shù)量。相應地，可以通過小納米粒子的總數(shù)除以在單獨的大納米粒子中的小納米粒子的平均數(shù)量來估算對于給定核質(zhì)量而言的大納米粒子的數(shù)量。或者，所述低密度多孔性3D結(jié)構(gòu)指在結(jié)構(gòu)中具有40％-99.9％(優(yōu)選50％至99.9％)的空的空間或孔的結(jié)構(gòu)，其中80％的孔具有尺寸為1nm至500nm的孔半徑。

可以通過氣體/蒸汽吸附法表征3D結(jié)構(gòu)的孔隙度。在這種技術(shù)中，通常，在其沸點下的氮氣吸附于固體樣品上。可以使用在特定分壓下吸附的氣體量，通過Brunauer、Emmit和Teller(BET)氮氣吸附/解吸公式來計算材料的比表面積。通過Kelvin公式或經(jīng)修訂的Kelvin公式(BJH公式(參見例如D.Niu等，J.Am.chem.Soc.132,15144-15147(2010)))來計算孔尺寸。還可以通過壓汞法表征3D結(jié)構(gòu)的孔隙度(參見例如Varadan V.K.等，如上所示)。簡言之，從3D結(jié)構(gòu)中除去氣體，然后將該結(jié)構(gòu)浸入汞中。因為汞在室溫下是不潤濕的，施加外部壓力逐漸迫使汞進入樣品。通過監(jiān)測每個施加壓力下引入的汞的加入體積，基于Washburn公式計算孔尺寸。

或者，所述低密度多孔性3D結(jié)構(gòu)指具有如下材料性質(zhì)的結(jié)構(gòu)，即所述多孔性結(jié)構(gòu)(一個或多個核納米粒子除外)在透射電子顯微鏡下不能明顯地觀察到或者基本上是透明的，例如即使當所述3D結(jié)構(gòu)的特征尺寸在10s或100s納米范圍內(nèi)時。在本申請中使用的術(shù)語“明顯地觀察到”或“基本上是透明的”指基于在TEM下3D結(jié)構(gòu)的圖像能夠容易地估計或確定所述3D結(jié)構(gòu)的厚度。可以通過本領(lǐng)域公知的方法觀察或測定納米結(jié)構(gòu)(例如涂覆有低密度多孔性3D結(jié)構(gòu)或嵌入低密度多孔性3D結(jié)構(gòu)中/在其上具有低密度多孔性3D結(jié)構(gòu)的納米粒子)。例如，可以使用DLS法測定具有3D結(jié)構(gòu)的納米結(jié)構(gòu)的尺寸(例如半徑)，可以在TEM下測定不具有3D結(jié)構(gòu)的核粒子的尺寸(例如半徑)。在某些實施方式中，3D結(jié)構(gòu)的厚度通過DLS測得為10s、100s納米范圍，但是其在TEM下不能容易地確定。例如，當在透射電子顯微鏡(TEM)下觀察本申請所提供的納米結(jié)構(gòu)時，可以鑒定納米粒子，但是低密度多孔性3D結(jié)構(gòu)不能被明顯地觀察到，或者其幾乎是透明的。這將所述低密度多孔性3D結(jié)構(gòu)與現(xiàn)有技術(shù)中報道的那些相區(qū)分，現(xiàn)有技術(shù)中報道的那些包含涂覆有交聯(lián)的和尺寸可調(diào)的3D結(jié)構(gòu)的納米粒子，包括介孔二氧化硅納米粒子或涂層(參見例如J.Kim等，J.Am.Chem..Soc,2006,128,688-689；J.Kim等，Angew.Chem.Int.Ed.,2008,47,8438-8441)。該特征也表明與本領(lǐng)域公知的其他涂覆的納米粒子相比，所述低密度多孔性3D結(jié)構(gòu)具有低得多的密度和/或高得多的多孔性。所述3D結(jié)構(gòu)的多孔性還可以通過負載不同分子的能力進行評估(參見例如Wang L.等，Nano Research 1,99-115(2008))。因為本申請所提供的3D結(jié)構(gòu)具有低密度，可以預計與其他涂覆的納米粒子相比，更多的有效負載能夠與所述3D結(jié)構(gòu)締合。例如，當3D結(jié)構(gòu)負載有機熒光團(如羅丹明)時，一個納米粒子的3D結(jié)構(gòu)能負載超過105個羅丹明分子。

在某些實施方式中，所述低密度多孔性3D結(jié)構(gòu)由含有硅烷的分子或硅烷樣分子(例如硅烷、有機硅烷、烷氧基硅烷、硅酸鹽及其衍生物)制得。

在某些實施方式中，含有硅烷的分子包括有機硅烷，有機硅烷也稱為硅烷偶聯(lián)劑。有機硅烷具有通式R_xSiY(_4-x)，其中R基團是烷基、芳基或有機官能團。Y基團是甲氧基、乙氧基或乙酰氧基，x是1、2或3。R基團能夠賦予特定功能，如使有機硅烷分子與核納米粒子的表面或其他有效負載通過共價或非共價相互作用締合。Y基團是可水解的，并且能夠形成硅氧烷鍵以與另一種有機硅烷分子交聯(lián)。示例性的R基團包括但不限于二硫烷基、氨基烷基、巰基烷基、乙烯基烷基、環(huán)氧基烷基和甲基丙烯?；榛?、羧基烷基。在R基團中的烷基可以是亞甲基、亞乙基、亞丙基等。示例性的Y基團包括但不限于烷氧基，如OCH₃、OC₂H₅和OC₂H₄OCH₃。例如，有機硅烷可以是氨基-丙基-三甲氧基硅烷、巰基-丙基-三甲氧基硅烷、羧基-丙基-三甲氧基硅烷、氨基-丙基-三乙氧基硅烷、巰基-丙基-三乙氧基硅烷、羧基-丙基-三乙氧基硅烷、雙-[3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基]-四硫化物、雙-[3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基]-二硫化物、氨基丙基三乙氧基硅烷、N-2-(氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷、乙烯基-三(2-甲氧基乙氧基)硅烷、3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷、2-(3,4-環(huán)氧基環(huán)己基)-乙基三甲氧基硅烷、3-環(huán)氧丙氧基-丙基三乙氧基硅烷、3-異氰酸酯基丙基三乙氧基硅烷和3-氰酸酯基丙基三乙氧基硅烷。

細胞調(diào)節(jié)劑

所述納米結(jié)構(gòu)與至少一種細胞調(diào)節(jié)劑可操作地連接。

在本申請中所使用的術(shù)語“可操作地連接”包括將細胞調(diào)節(jié)劑嵌入、摻入、整合、締合、連接、組合、交聯(lián)、混合和/或包覆于納米結(jié)構(gòu)。所述細胞調(diào)節(jié)劑可以與納米結(jié)構(gòu)通過非共價締合(例如氫鍵、離子鍵、范德華力和疏水性相互作用)或共價結(jié)合可操作地連接。例如，所述細胞調(diào)節(jié)劑與納米結(jié)構(gòu)的表面混合和/或摻入其上，或者還能夠載入納米結(jié)構(gòu)的孔中。

在本申請中所使用的“調(diào)節(jié)”(“Modulating”、“modulation”或“modulate”)指細胞的改變和/或調(diào)控。細胞的改變和/或調(diào)控可以通過將與細胞調(diào)節(jié)劑結(jié)合的細胞的性質(zhì)與對照(即不與細胞調(diào)節(jié)劑結(jié)合的細胞)的性質(zhì)進行比較而確定?？梢曰诩毎母鞣N性質(zhì)來測定細胞的改變和/或調(diào)控，包括但不限于在細胞群中細胞的數(shù)量、細胞的形態(tài)、細胞的品系/類型(例如從一種細胞類型轉(zhuǎn)化為另一種)、細胞的狀態(tài)(例如DNA或染色體的重排或重組、RNA或蛋白的表達改變、蛋白的分泌或運輸)、細胞的移動或遷移?？梢允褂帽绢I(lǐng)域公知的適宜方法確定細胞的改變和/或調(diào)控，包括例如使用顯微鏡觀察、細胞計數(shù)、細胞分選、免疫組化、免疫細胞化學、PCR、northern印跡、southern印跡、western印跡(參見例如Julio E.Celis等，Cell Biology,A Laboratory Handbook(3rd Ed.))。

本申請中使用的“相互作用”或“結(jié)合”指兩個分子之間非隨機的締合。所述非隨機的締合可以由結(jié)合親和性(Kd)表征，所述結(jié)合親和性計算為當兩個分子之間的結(jié)合達到平衡時的解離速率與締合速率的比值(k_off/k_on)。當k_on的測定結(jié)果例如由于一種分子的聚集而難以獲得時，還可以使用在結(jié)合平衡時測得的解離速率(k_off)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域公知的適宜方法適當?shù)卮_定細胞調(diào)節(jié)劑與細胞表面上的分子之間的結(jié)合親和性(例如Kd或k_off)，包括例如Biacore(參見例如Murphy,M.等，Current protocols in protein science,第19章，第19.14節(jié),2006)和Kinexa技術(shù)(參見例如Darling,R.J.等，Assay Drug Dev.TechnoL,2(6):647-657(2004))。

在一些實施方式中，與納米結(jié)構(gòu)可操作地連接的細胞調(diào)節(jié)劑包括特異性識別細胞表面上的分子的抗體。舉一個例子，所述細胞調(diào)節(jié)劑包括抗CD3抗體。舉另一個例子，所述細胞調(diào)節(jié)劑包括抗CD28抗體。舉另一個例子，所述細胞調(diào)節(jié)劑包括CD137抗體。舉又一個例子，所述細胞調(diào)節(jié)劑包括IL-15受體抗體。

如在本申請中所使用的術(shù)語“抗體”旨在包括多克隆和單克隆抗體、嵌合抗體、半抗原和抗體片段，以及與抗原上的表位特異性結(jié)合而作為抗體等效物的分子。術(shù)語“抗體”包括任意同種型(IgA、IgG、IgE、IgD、IgM)的多克隆和單克隆抗體，或其抗原結(jié)合部分，包括但不限于F(ab)和Fv片段(如sc Fv)、單鏈抗體、嵌合抗體、人源化抗體和Fab表達庫。

在一些實施方式中，細胞調(diào)節(jié)劑是細胞表面上的受體的配體。舉一個例子，所述細胞調(diào)節(jié)劑包括CD28天然配體的刺激性形式，所述CD28天然配體選自由B7-1和B7-2組成的組。舉另一個例子，所述細胞調(diào)節(jié)劑是CD137配體蛋白。舉另一個例子，所述細胞調(diào)節(jié)劑是CD81配體蛋白。舉另一個例子，所述細胞調(diào)節(jié)劑是IL-15蛋白。舉另一個例子，所述細胞調(diào)節(jié)劑是細胞因子，包括趨化因子(例如CCL14、CCL19、CCL20、CCL21、CCL25、CCL27、CXCL12和CXCL13、IL-1、TNF-α、LPS、CXCL-8、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL11、CXCL10)、干擾素(例如INF-α、INF-β、INF-γ)、白介素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17)、淋巴因子(例如IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、粒細胞-巨噬細胞CSF、INF-γ)、腫瘤壞死因子(例如TNF-α、淋巴毒素-α、gp39(CD40L)、CD27L、CD30L、FASL、4-1BBL、OX40L、TNF相關(guān)凋亡誘導配體(TRAIL))。舉另一個例子，所述細胞調(diào)節(jié)劑是激素，包括催乳素、加壓素、催產(chǎn)素、心房利鈉肽(ANP)、心房利鈉因子(ANF)、胰高血糖素、胰島素、促生長素抑制素、膽囊收縮素、胃泌素、瘦素、黃體生成素，卵泡刺激素或甲狀腺刺激激素。舉又一個例子，所述細胞調(diào)節(jié)劑是生長因子，包括腎上腺髓質(zhì)素(AM)、血管生成素(ANG)、自分泌移動因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、表皮生長因子(EGF)、促紅細胞生成素(EPO)、成纖維細胞生長因子(FGF)、神經(jīng)膠質(zhì)細胞系來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、生長分化因子-9(GDF9)、肝細胞生長因子(HGF)、肝癌來源的生長因子(HDGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、遷移刺激因子、肌肉生長抑制素(GDF-8)、神經(jīng)生長因子(NGF)和其他神經(jīng)營養(yǎng)因子、血小板來源的生長因子(PDGF)、血小板生成素(TPO)、轉(zhuǎn)化生長因子α(TGF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、Wnt信號通路、胎盤生長因子(PGF)、胎牛生長激素(FBS)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7。

在某些實施方式中，所述細胞調(diào)節(jié)劑選自下組：抗CD3抗體、抗CD28抗體、抗CD81抗體、CD28配體的刺激形式、抗CD5抗體、抗CD4抗體、抗CD8抗體、抗CTLA-4抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗CD278抗體、抗CD27L抗體、抗CD137抗體、CD137配體蛋白、抗CD30L抗體、IL-2、IL-2受體抗體、IL-15蛋白、IL-15受體抗體、IL-12、IL-12受體抗體、IL-1、IL-1受體抗體、IFN-γ、IFN-γ受體抗體、TNF-α、TNF-α受體抗體、IL-4、IL-4受體抗體、IL-10、IL-10受體抗體及其任意組合。

在一些實施方式中，所述細胞調(diào)節(jié)劑是疫苗。疫苗是改善對特定疾病免疫性的分子。在一些實施方式中，所述細胞調(diào)節(jié)劑類似于引起疾病的微生物，并且由微生物的減弱或死亡形式、其毒素，或其表面蛋白中的一種制成。例如，所述細胞調(diào)節(jié)劑是針對腺病毒、炭疽熱、活BCG、白喉、破傷風類毒素、無細胞百日咳、流感嗜血桿菌B、甲肝、乙肝、人乳頭瘤病毒、甲型流感病毒(H1N1)、流感病毒、甲型流感病毒(HSN1)、日本腦炎病毒、麻疹、腮腺炎病毒、風疹病毒、腦膜炎球菌、鼠疫、肺炎球菌、脊髓灰質(zhì)炎病毒、狂犬病毒、輪狀病毒、天花、傷寒、水痘病毒、黃熱病、帶狀皰疹。在一些實施方式中，所述細胞調(diào)節(jié)劑是癌癥疫苗。例如，所述細胞調(diào)節(jié)劑是腫瘤抗原，即從癌細胞分離的蛋白。另一個例子，所述細胞調(diào)節(jié)劑可以是BiovaxID(治療濾泡性淋巴瘤)、Provenge(治療前列腺癌)、Tarmagens、黑色素瘤相關(guān)抗原3(MAGE-A3)、PROSTVAC、CDX110、CDX1307、CDX1401、CimaVax-EGF(治療肺癌)、CV9104、Neuvenge、Neu Vax、Ax-37、ADXS11-001、ADXS31-001、ADXS31-164、GI-4000、GRNVAC1、GI6207、GI6301、IMA901、Stimuvax、Cvac、SCIB1。

細胞表面上的分子

所述細胞調(diào)節(jié)劑能夠與細胞表面上的分子相互作用。分子組成型地或瞬時地存在于細胞表面上。在一些實施方式中，在細胞被本申請所述的納米組合物調(diào)節(jié)后，所述分子在細胞表面上出現(xiàn)。

在一些實施方式中，在細胞表面上的分子是細胞表面受體。在一些實施方式中，細胞表面受體是特定的完整的膜蛋白，其參與細胞與環(huán)境之間的交流。在一些實施方式中，細胞表面上的分子是細胞因子受體，例如白介素受體、紅細胞生成素受體、GM-CSF受體、G-CSF受體、生長激素受體、催乳素受體、制瘤素M受體、白血病抑制因子受體、干擾素α/β受體、干擾素γ受體、IL-1受體、CSF1、C-kit受體、IL-18受體、CD27、CD30、CD40、CD120、淋巴毒素β受體、IL-8受體、IL-17受體、CCR1、CXCR4、MCAF受體、NAP-2受體、TGFβ受體。在一些實施方式中，細胞表面上的分子是生長因子受體，例如降鈣素受體、降鈣素受體樣受體、VEGF受體、EGF受體、FGF受體、BMP受體、BDNF受體、促紅細胞生成素受體、GDNF受體、G-CSF受體、GM-CSF受體、GDF受體、HGF受體、HDGF受體、IGF受體、NGF受體、PDGF受體、TPO受體、TGF-α受體、TGF-β受體。在一些實施方式中，細胞表面上的分子是激素受體，例如胰島素受體、甲狀腺素刺激激素受體、卵泡刺激激素受體、促黃體激素受體。

在某些優(yōu)選的實施方式中，與所述納米結(jié)構(gòu)可操作地連接的細胞調(diào)節(jié)劑包括與上文所述的細胞表面受體特異性結(jié)合的抗體。

在一些實施方式中，細胞表面上的分子是細胞粘附分子。在一些實施方式中，細胞粘附分子是位于細胞表面上的蛋白，其參與與其他細胞或與細胞外基質(zhì)的結(jié)合，輔助細胞彼此之間粘附或與其周圍粘附。在一些實施方式中，細胞表面上的分子是免疫球蛋白超家族細胞粘附分子，例如突觸細胞粘附分子、神經(jīng)細胞粘附分子、細胞間細胞粘附分子、血管細胞粘附分子、血小板內(nèi)皮細胞粘附分子、L1蛋白、CHL1、神經(jīng)束蛋白、NrCAM、髓鞘相關(guān)糖蛋白、CD22、CD83、CTX、連接粘附分子、BT-IgSF、柯薩奇病毒和腺病毒受體、VSIG、ESAM、連接素、連接蛋白樣分子、CD2、CD48。在一些實施方式中，細胞表面上的分子是淋巴細胞歸巢受體，例如CD34和GLYCAM-1。在一些實施方式中，細胞表面上的分子是整合素。在一些實施方式中，細胞表面上的分子是鈣粘蛋白。在一些實施方式中，細胞表面上的分子是選擇素，例如F-選擇素、L-選擇素和P-選擇素。

被調(diào)節(jié)的細胞及其行為

細胞調(diào)節(jié)劑與細胞表面上的分子之間的相互作用調(diào)節(jié)細胞的行為、觸發(fā)細胞的功能或性質(zhì)的改變。所述細胞包括原核細胞和真核細胞。在一些實施方式中，所述細胞是動物細胞。在一些優(yōu)選的實施方式中，所述細胞是哺乳動物細胞，例如小鼠細胞、大鼠細胞、家兔細胞、猴細胞、人細胞。所述細胞可以在體外分離和培養(yǎng)，或者存在于體內(nèi)。

所述細胞可以是目標生物體內(nèi)存在的任意類型，例如來源于內(nèi)胚層的細胞(例如外分泌分泌細胞和激素分泌細胞)、來源于外胚層的細胞(例如上皮細胞、神經(jīng)細胞)和來源于中胚層的細胞(例如代謝和貯存細胞、屏障功能細胞(肺細胞、腸細胞、外分泌腺細胞)、腎細胞、細胞外基質(zhì)細胞、收縮性細胞(肌肉細胞)、血液和免疫系統(tǒng)細胞、生殖細胞、滋養(yǎng)細胞)。在一些實施方式中，所述細胞是免疫系統(tǒng)細胞，例如T細胞、B細胞、自然殺傷(NK)細胞、巨噬細胞。在一些優(yōu)選的實施方式中，所述細胞是T細胞。在一些優(yōu)選的實施方式中，所述細胞是NK細胞。

在一些實施方式中，所述細胞是干細胞，例如胚胎干細胞、誘導的多能干細胞、造血干細胞、乳房干細胞、腸干細胞、間充質(zhì)干細胞、內(nèi)皮干細胞、神經(jīng)干細胞、神經(jīng)嵴干細胞。

被調(diào)節(jié)的細胞的行為可以是細胞的任意功能或性質(zhì)，包括但不限于細胞增殖、細胞生長、細胞分化、細胞活化、細胞轉(zhuǎn)化、細胞遷移、細胞運動、細胞移動、細胞凋亡和細胞粘附、細胞純度以及細胞用于治療用途的能力。

在一些優(yōu)選的實施方式中，被調(diào)節(jié)的細胞的行為是細胞增殖。例如，T細胞增殖可以通過施用與聚合物骨架或微珠偶聯(lián)的抗CD3抗體而活化(參加美國專利號6,129,916)。類似地，T細胞增殖可以通過在體外將T細胞與抗CD3抗體和抗CD28抗體接觸而活化，所述抗CD3抗體和抗CD28抗體均固定于固相表面上(參見美國專利號6,352,694)。T細胞增殖還可以通過與抗CD3抗體和CD28天然配體的刺激形式(如B7-1和B7-2)接觸而活化，其中抗CD3抗體和CD28的天然配體均固定于固相表面上(參見美國專利號6,352,694)。NK細胞增殖可以通過將NK細胞與CD137配體蛋白、CD137抗體、IL-15蛋白或IL-15受體抗體接觸而活化，其中CD137配體蛋白、CD137抗體、IL-15蛋白或IL-15受體抗體固定于固相支持物上(參見美國專利號8399645)。

在一些優(yōu)選的實施方式中，被調(diào)節(jié)的細胞的行為是細胞分化。在一些實施方式中，可以通過將干細胞與能夠誘導干細胞分化的分子接觸而實現(xiàn)分化的調(diào)節(jié)，其中所述分子與納米結(jié)構(gòu)可操作地連接。例如，能夠通過施用與微珠連接的IL-12而誘導CD34陽性細胞分化成NK細胞。

在一些優(yōu)選的實施方式中，行為被調(diào)節(jié)的細胞可以用于治療。在一些實施方式中，可以對細胞進行進一步調(diào)節(jié)以表達某種用于治療的蛋白。在一些優(yōu)選的實施方式中，所述細胞能夠產(chǎn)生嵌合的抗原受體(CAR)。嵌合的抗原受體的示例參見美國專利號8,399,645(抗CD19單鏈可變片段結(jié)構(gòu)域、4-1BB信號結(jié)構(gòu)域和CD3zeta信號結(jié)構(gòu)域嵌合受體)；美國專利號5,686,281(T細胞受體CD28信號結(jié)構(gòu)域嵌合受體)；Geiger,T.L.等，Blood 98:2364-2371(2001)；Hombach,A.等，J Immunol 167:6123-6131(2001)(CD28/CD3zeta信號受體)；Maher,J.等，Nat Biotechnol 20:70-75(2002)(TCRzeta/CD28受體)；Haynes,N.M.等，J Immunol 169:5780-5786(2002)(抗癌胚抗原單鏈可變片段/CD28zeta嵌合受體)；Haynes,N.M.等，Blood 100:3155-3163(2002)(抗erbB2單鏈可變片段/CD28/TCR zeta嵌合受體)；Till B.G.等，Blood 119(17):3940-50(2012)(具有CD28和4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域的CD20特異性CAR)；Haso W.等，Blood 121(7):1165-74(2013)(CD22特異性CAR)。這些參考文獻在此并入本說明書。

顯色的納米結(jié)構(gòu)

本申請所提供的納米結(jié)構(gòu)可以是顯色的或非顯色的。如在本申請中所使用的“顯色的”指納米結(jié)構(gòu)在適宜條件下能夠產(chǎn)生顏色信號。例如，在使用某種波長的光激發(fā)后，顯色的納米結(jié)構(gòu)可以發(fā)射熒光顏色信號?；蛘撸黾{米結(jié)構(gòu)可以是非顯色的。當處于對于顯色的納米結(jié)構(gòu)會誘導顏色信號的條件下時，非顯色的納米結(jié)構(gòu)不發(fā)射顏色信號。

在某些實施方式中，顯色的納米結(jié)構(gòu)是條形碼編碼的或與可檢測試劑締合以顯示顏色。術(shù)語“條形碼編碼”或“條形碼編碼的”或“IDed”指所述納米結(jié)構(gòu)與能夠鑒別所述納米結(jié)構(gòu)的已知編碼或已知標簽締合。如在本申請中所使用的“編碼”指能夠產(chǎn)生將條形碼編碼或IDed的納米結(jié)構(gòu)彼此之間區(qū)分的可檢測信號的分子。例如，所述顯色的納米結(jié)構(gòu)可以包含顯色的納米粒子(例如量子點)，所述顯色的納米粒子在已知波長下發(fā)射可檢測的顏色信號。

在某些實施方式中，條形碼編碼的納米結(jié)構(gòu)的表征或鑒別是基于Han等，Nature Biotechnology,Vol.19,pp:631-635(2001)或US專利申請10/185,226公開的多路復用光編碼系統(tǒng)。簡言之，將多色半導體量子點(QD)嵌入納米結(jié)構(gòu)中。各QD具有給定強度(在例如0-10的水平內(nèi))和給定顏色(波長)。對于各單色編碼而言，所述納米結(jié)構(gòu)取決于其中所嵌入的QD的數(shù)量而具有不同的QD強度。如果使用多種顏色(n種顏色)和多種強度(m種強度水平)的QD，則所述納米結(jié)構(gòu)可以具有等于m的n-1次方(m^n-l)的獨特標識或編碼的總數(shù)。此外，由于多孔性結(jié)構(gòu)能夠與附加有效負載(例如熒光有機分子)締合，如果可用的附加熒光顏色的數(shù)目為Y，則編碼的總數(shù)可以是Yx(m^n-l)。

在某些實施方式中，所述納米粒子(具有或不具有條形碼編碼)通過與可檢測試劑可操作地連接而顯色?？蓹z測試劑可以是熒光分子、化學發(fā)光分子、生物發(fā)光分子、放射性同位素、MRI造影劑、CT造影劑、酶底物標記和/或著色劑等。

熒光分子的示例包括但不限于熒光化合物(熒光團)，其可以包括但不限于：1,5IAEDANS；1,8-ANS；4-甲基傘形酮；5-羧基-2,7-二氯熒光素；5-羧基熒光素(5-FAM)；5-羧基萘熒光素；5-羧基四甲基羅丹明(5-TAMRA)；5-FAM(5-羧基熒光素)；5-HAT(羥基色胺)；5-羥色胺(HAT)；5-ROX(羧基-X-羅丹明)；5-TAMRA(5-羧基四甲基羅丹明)；6-羧基羅丹明6G；6-CR 6G；6-JOE；7-氨基-4-甲基香豆素；7-氨基放線菌素D(7-AAD)；7-羥基-4-甲基香豆素；9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶；ABQ；酸性品紅；ACMA(9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶)；吖啶橙；吖啶紅；吖啶黃(acridine yellow)；吖啶黃(Acriflavin)；富爾根氏吖啶黃(Acriflavin Feulgen)SITSA；水母素(發(fā)光蛋白)；AFP-自體熒光蛋白-(量子生物技術(shù))；Fluor 350；Fluor 405；Fluor500；Alexa Fluor 430^TM；Alexa Fluor 488^TM；Alexa Fluor 532^TM；Alexa Fluor 546^TM；Alexa Fluor 568^TM；Alexa Fluor 594^TM；Alexa Fluor 633^TM；Alexa Fluor 647^TM；Alexa Fluor660^TM；Alexa Fluor 680^TM；茜素絡(luò)合劑；茜素紅；別藻藍素(APC)；AMC、AMCA-S；AMCA(氨基甲基香豆素)；AMCA-X；氨基放線菌素D；氨基香豆素；氨基甲基香豆素(AMCA)；苯胺藍；Anthrocyl stearate；APC(別藻藍素)；APC-Cy7；APTRA-BTC；APTS；阿斯屈拉松(Astrazon)亮紅4G；阿斯屈拉松(Astrazon)橙R；阿斯屈拉松(Astrazon)紅6B；阿斯屈拉松(Astrazon)黃7GLL；阿的平；ATTO-TAG^TMCBQCA；ATTO-TAG^TMFQ；金胺；Aurophosphine G；Aurophosphine；BAO 9(雙氨基苯基惡二唑)；BCECF(高pH)；BCECF(低pH)；硫酸黃連素；β內(nèi)酰胺酶；Bimane；雙苯甲酰胺；雙苯甲酰胺(赫司特公司(Hoechst))；雙-BTC；Blancophor FFG；Blancophor SV；BOBO^TM-1；BOBO^TM-3；氟硼熒492/515；氟硼熒493/503；氟硼熒500/510；氟硼熒505/515；氟硼熒530/550；氟硼熒542/563；氟硼熒558/568；氟硼熒564/570；氟硼熒576/589；氟硼熒581/591；氟硼熒630/650-X；氟硼熒650/665-X；氟硼熒665/676；氟硼熒Fl；氟硼熒FL ATP；氟硼熒Fl-神經(jīng)酰胺；氟硼熒R6G SE；氟硼熒TMR；氟硼熒TMR-X偶聯(lián)物；氟硼熒TMR-X，SE；氟硼熒TR；氟硼熒TR ATP；氟硼熒TR-X SE；BO-PRO^TM-1；BO-PRO^TM-3；磺基亮黃素(Brilliant Sulphoflavin)FF；BTC；BTC-5N；鈣黃綠素；鈣黃綠素藍；深紅鈣^TM；綠鈣；綠鈣-1Ca ²⁺染料；綠鈣-2Ca ²⁺；綠鈣-5N Ca ²⁺；綠鈣-C18Ca²⁺；橙鈣；卡爾科弗盧爾熒光增白劑(Calcofluor White)；羧基-X-羅丹明(5-ROX)；瀑布藍(Cascade Blue^TM)；瀑布黃(Cascade Yellow)；兒茶酚胺；CCF2(GeneBlazer商標)；CFDA；葉綠素；色霉素A；色霉素A；CL-NERF；羧基熒光素雙醋酸鹽(CMFDA)；香豆素鬼筆環(huán)肽；C-藻青素；CPM甲基香豆素；CTC；CTC甲臜；Cy2^TM；Cy3.1 8；Cy3.5^TM；Cy3^TM；Cy5.1 8；Cy5.5^TM；Cy5^TM；Cy7^TM；環(huán)AMP氟傳感器(FiCRhR)；Dabcyl；單磺酰；單磺酰胺；單磺酰尸胺；單磺酰氯；單磺酰DHPE；單磺酰氟；DAPI；Dapoxyl；Dapoxyl 2；Dapoxyl 3′DCFDA；DCFH(二氯二氫熒光素二乙酸酯)；DDAO；DHR(二氫羅丹明123)；二-4-ANEPPS；二-8-ANEPPS(未按照比例)；DiA(4-二-16-ASP)；二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH)；DiD-親脂性示蹤劑；DiD(DiIC18(5))；DIDS；二氫羅丹明123(DHR)；DiI(DiIC18(3))；二硝基酚；DiO(DiOC18(3))；DiR；DiR(DiIC18(7))；DM-NERF(高pH)；DNP；多巴胺；DTAF；DY-630-NHS；DY-635-NHS；ELF 97；曙紅；赤蘚紅；赤蘚紅ITC；溴化乙錠；乙啶均二聚體-1(EthD-1)；Euchrysin；EukoLight；氯化銪(III)；EYFP；快藍；FDA；富爾根(副品紅)：FIF(甲醛誘導的熒光)；FITC；Flazo Orange；Fluo-3；Fluo-4；熒光素(FITC)；熒光素二乙酸酯；Fluoro-Emerald；熒光金(羥芪巴脒)；Fluor-Ruby；Fluor X；FM1-43^TM；FM 4-46；Fura Red^TM(高pH)；Fura Red^TM/Fluo-3；Fura-2；Fura-2/BCECF；Genacryl Brilliant Red B；Genacryl Brilliant Yellow 10GF；Genacryl Pink 3G；Genacryl Yellow 5GF；GeneBlazer(CCF2)；Gloxalic Acid；粒狀藍；血卟啉；Hoechst 33258；Hoechst 33342；Hoechst 34580；HPTS；羥基香豆素；羥芪巴脒(熒光金)；羥色胺；Indo-1，高鈣；Indo-1，低鈣；吲哚二碳菁(DiD)；吲哚三碳菁(DiR)；Intrawhite Cf；JC-1；JO-JO-1；JO-PRO-1；LaserPro；Laurodan；LDS 751(DNA)；LDS 751(RNA)；Leucophor PAF；Leucophor SF；Leucophor WS；麗絲胺羅丹明；麗絲胺羅丹明B；鈣黃綠素/乙錠均二聚體；LOLO-1；LO-PRO-1；熒光黃；Lyso示蹤藍；Lyso示蹤藍-白；Lyso示蹤綠；Lyso示蹤紅；Lyso示蹤黃；Lyso傳感器藍；Lyso傳感器綠；Lyso傳感器黃/綠；Mag綠；萘紅(根皮紅B)；Mag-Fura紅；Mag-Fura-2；Mag-Fura-5；Mag-Indo-1；鎂綠；鎂橙；孔雀石綠；海藍；Maxilon Brilliant Flavin 10GFF；Maxilon Brilliant Flavin 8GFF；血藍蛋白；甲氧基香豆素；線粒體示蹤綠FM；線粒體示蹤橙；線粒體示蹤紅；光輝霉素；Monobromobimane；Monobromobimane(mBBr-GSH)；Monochlorobimane；MPS(甲基氯派若寧二苯乙烯)；NBD；NBD胺；尼羅紅；Nitrobenzoxadidole；去甲腎上腺素；核快紅；核黃；Nylosan Brilliant lavin E8G；俄勒岡綠；俄勒岡綠488-X；俄勒岡綠^TM；俄勒岡綠^TM488；俄勒岡綠^TM500；俄勒岡綠^TM514；太平洋藍；副薔薇胺(福爾根)；PBFI；PE-Cy5；PE-Cy7；PerCP；PerCP-Cy5.5；PE-德克薩斯紅[Red 613]；根皮紅B(麥哥達拉紅)；Phorwite AR；Phorwite BKL；Phorwite Rev；Phorwite RPA；磷化氫3R；光刻膠；藻紅蛋白B[PE]；藻紅蛋白R[PE]；PKH26(Sigma)；PKH67；PMIA；Pontochrome Blue Black；POPO-1；POPO-3；PO—PRO-1；PO-PRO-3；櫻草黃；普施安黃；碘化丙啶(PI)；PYMPO；芘；派若寧；派若寧B；Pyrozal Brilliant Flavin 7GF；QSY 7；喹吖因氮芥；紅613[PE-德克薩斯紅]；試鹵靈；RH 414；Rhod-2；羅丹明；羅丹明110；羅丹明123；羅丹明5GLD；羅丹明6G；羅丹明B；羅丹明B 200；羅丹明B額外的；羅丹明BB；羅丹明BG；羅丹明綠；羅丹明Phallicidine；羅丹明鬼筆環(huán)肽；羅丹明紅；羅丹明WT；玫瑰紅；R-藻青蛋白；R-藻紅蛋白(PE)；S65A；S65C；S65L；S65T；SBFI；血清素；Sevron亮紅2B；Sevron亮紅4G；Sevron亮紅B；Sevron橙；Sevron黃L；SITS；SITS(櫻草黃)；SITS(二苯乙烯異硫代磺酸)；SNAFL鈣黃綠素；SNAFL-1；SNAFL-2；SNARF鈣黃綠素；SNARF1；鈉綠；光譜淺綠；光譜綠；光譜橙；光譜紅；SPQ(6-甲氧基-N-(3-硫代丙基)喹啉)；二苯乙烯；硫代羅丹明B和C；硫代羅丹明額外；SYTO 11；SYTO 12；SYTO 13；SYTO 14；SYTO 15；SYTO 16；SYTO 17；SYTO 18；SYTO 20；SYTO 21；SYTO 22；SYTO 23；SYTO 24；SYTO 25；SYTO 40；SYTO 41；SYTO 42；SYTO 43；SYTO 44；SYTO 45；SYTO 59；SYTO 60；SYTO 61；SYTO 62；SYTO 63；SYTO 64；SYTO 80；SYTO 81；SYTO 82；SYTO 83；SYTO 84；SYTO 85；SYTOX藍；SYTOX綠；SYTOX橙；四環(huán)素；四甲基羅丹明(TRITC)；德克薩斯紅^TM；德克薩斯紅-X^TM偶聯(lián)物；硫代二羰基菁(DiSC3)；噻嗪紅R；噻唑橙；硫代黃素5；硫代黃素S；硫代黃素TCN；Thiolyte；硫代噻唑橙；Tinopol CBS(Calcofluor White)；TMR；TO-PRO-1；TO-PRO-3；TO-PRO-5；TOTO-1；TOTO-3；TriColor(PE-Cy5)；TRITC四甲基羅丹明異硫氰酸酯；真藍；真紅；Ultralite；熒光素鈉B；Uvitex SFC；WW 781；X-羅丹明；XRITC；二甲苯橙；Y66F；Y66H；Y66W；YO-PRO-1；YO-PRO-3；YOYO-1；YOYO-3；Sybr綠、噻唑橙(內(nèi)部螯合染料(interchelating dye))、熒光半導體納米粒子、鑭系元素或其組合。

放射性同位素的示例包括¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S、³H、¹¹¹In、¹¹²In、¹⁴C、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁸⁶Y、⁸⁸Y、⁹⁰Y、¹⁷⁷Lu、²¹¹At、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁵³Sm、²¹²Bi、³²P、¹⁸F、²⁰¹Tl、⁶⁷Ga、¹³⁷Cs和其他放射性同位素。

酶底物標記的例子包括熒光素酶(例如螢火蟲熒光素酶和細菌熒光素酶)、熒光素、2,3-二氫酞嗪二酮、蘋果酸脫氫酶、脲酶、過氧化物酶如辣根過氧化物酶(HRPO)、堿性磷酸酶、-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、雜環(huán)氧化酶(如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)、乳過氧化物酶、微過氧化物酶等。

納米組合物的使用方法

本公開的另一個方面提供了一種通過將所述細胞與同納米結(jié)構(gòu)可操作地連接的至少一種細胞調(diào)節(jié)劑接觸而調(diào)節(jié)細胞行為的方法。所述細胞調(diào)節(jié)劑與細胞表面上的分子相互作用，并且所述細胞調(diào)節(jié)劑與所述分子之間的相互作用調(diào)節(jié)所述細胞的行為。

在一些實施方式中，所述細胞調(diào)節(jié)劑是與細胞表面上的受體特異性結(jié)合，以使得所述結(jié)合將導致所述細胞的功能或性質(zhì)的改變的分子(例如抗體或配體)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域公知的適宜方法確定細胞的功能或性質(zhì)的改變，包括例如使用顯微鏡觀察、細胞計數(shù)、細胞分選、免疫組化、免疫細胞化學、PCR、northern印跡、southern印跡、western印跡(參見例如Julio E.Celis等，Cell Biology,A Laboratory Handbook(3rd Ed.))?？梢允褂帽绢I(lǐng)域公知的方法對行為已被調(diào)節(jié)的細胞進行分離、富集或純化以供進一步的研究或治療應用。在一些優(yōu)選的實施方式中，可以通過應用磁場以下拉細胞對行為已被調(diào)節(jié)的細胞進行富集。在此類實施方式中，與細胞調(diào)節(jié)劑可操作地連接的納米結(jié)構(gòu)包含磁性材料。在將納米組合物施用至細胞并調(diào)節(jié)其行為后，可以通過應用磁場而下拉與納米組合物特異性結(jié)合的細胞。在某些實施方式中，可以通過反復地再分散細胞并應用磁場下拉細胞而進一步純化所富集的細胞?；蛘?，包含細胞調(diào)節(jié)劑的納米組合物不包含磁性材料。在細胞行為被調(diào)節(jié)后，施用包含特異性識別被調(diào)節(jié)細胞的試劑的另一個納米組合物，并應用磁場以下拉被調(diào)節(jié)的細胞?？梢灶A期的是，所述非磁性納米粒子包括但不限于在美國臨時申請61/589,777和美國臨時申請12/460,007中公開的納米粒子，只要所述非磁性納米粒子能夠攜帶細胞調(diào)節(jié)劑。

在某些實施方式中，在將細胞用于進一步的研究或治療應用前，不需要對經(jīng)富集、分離或純化的被調(diào)節(jié)的細胞進行處理以除去納米組合物。

在某些實施方式中，調(diào)節(jié)細胞行為的方法包括將細胞與兩種或更多種細胞調(diào)節(jié)劑接觸的步驟，所述兩種或更多種細胞調(diào)節(jié)劑協(xié)同作用以調(diào)節(jié)細胞的行為。所述兩種或更多種細胞調(diào)節(jié)劑可以與一個納米結(jié)構(gòu)可操作地連接。或者，所述兩種或更多種細胞調(diào)節(jié)劑可以分別與不同納米結(jié)構(gòu)可操作地連接。

在某些實施方式中，公開了使用多種磁性納米組合物調(diào)節(jié)細胞的方法。所述方法包括將細胞與同第一納米結(jié)構(gòu)可操作地連接的第一細胞調(diào)節(jié)劑接觸的步驟。所述第一納米結(jié)構(gòu)包含順磁性材料。在細胞被第一細胞調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)后，通過應用強磁場而富集細胞。然后將與第二納米結(jié)構(gòu)可操作地連接的第二細胞調(diào)節(jié)劑進一步施用至所富集的細胞。所述第二納米結(jié)構(gòu)包含超順磁性材料。在細胞被第二細胞調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)后，然后通過應用磁場富集細胞，其中僅有與第二細胞調(diào)節(jié)劑結(jié)合的細胞而非與第一細胞調(diào)節(jié)劑結(jié)合的細胞被下拉。此類方法提供了在將被調(diào)節(jié)的細胞用于進一步的研究或治療應用之前不需要將納米組合物除去。

在某些實施方式中，用于調(diào)節(jié)細胞行為的方法包括向?qū)ο笫┯眉{米組合物，從而在體內(nèi)將細胞與細胞調(diào)節(jié)劑接觸的步驟。例如，可以向?qū)ο笫┯冒呙绲募{米組合物以提高對象針對特定疾病的免疫力。

在某些實施方式中，用于調(diào)節(jié)細胞行為的方法包括向?qū)ο笫┯帽徽{(diào)節(jié)的細胞，并且追蹤在對象體內(nèi)被調(diào)節(jié)細胞的結(jié)果的步驟。在此類實施方式中，所述納米組合物還包含與所述納米結(jié)構(gòu)可操作地連接的可檢測標記。例如，所述可檢測標記可以是熒光分子、化學發(fā)光分子、生物發(fā)光分子、放射性同位素、MRI造影劑、CT造影劑、酶底物標記或著色劑。

在某些實施方式中，當樣品中細胞表面上的分子為亞納克水平時，可以進行用于調(diào)節(jié)細胞行為的方法。

在某些實施方式中，術(shù)語“亞納克水平”指不超過100ng、10ng、1ng或0.1ng的分子。例如亞納克包括0.01ng、0.02ng、0.03ng、0.04ng、0.05ng、0.06ng、0.07ng、0.08ng、0.09ng、0.1ng、0.2ng、0.3ng、0.4ng、0.5ng、0.6ng、0.7ng、0.8ng、0.9ng、1.0ng或者任意上述水平之間的任意范圍(例如0.01ng至100ng之間、0.01ng至10ng之間、0.01ng至1ng之間、0.01ng至0.1ng之間)。

在某些實施方式中，亞納克水平指不超過1000pM、100pM、10pM、1pM、0.1pM、0.01pM、0.001pM(＝1fM)或0.0001pM的分析物。例如，亞納克包括0.001pM(＝1fM)、0.002pM、0.003pM、0.004pM、0.005pM、0.006pM、0.007pM、0.008pM、0.009pM、0.01pM、0.02pM、0.03pM、0.04pM、0.05pM、0.06pM、0.07pM、0.08pM、0.09pM、0.1pM、0.1pM、0.2pM、0.3pM、0.4pM、0.5pM、0.6pM、0.7pM、0.8pM、0.9pM、1pM、2pM、3pM、4pM、5pM、6pM、7pM、8pM、9pM、10pM或者任意上述水平之間的任意范圍(例如0.0001pM至1000pM之間、0.0001pM至100pM之間、0.0001pM至10pM之間、0.0001pM至1pM之間、0.0001pM至0.1pM之間、0.0001pM至0.01pM之間、0.0001pM至0.001pM之間)。

在某些實施方式中，亞納克水平指樣品中的單個細胞、多個細胞(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200個細胞)。

在某些實施方式中，用于調(diào)節(jié)細胞的方法還包括富集所述細胞的群。

本發(fā)明的另一個方面涉及一種在對象中治療疾病的方法。所述方法包括將細胞與同納米結(jié)構(gòu)可操作地連接的至少一種細胞調(diào)節(jié)劑接觸。所述細胞調(diào)節(jié)劑與細胞表面上的分子相互作用。所述細胞調(diào)節(jié)劑與所述分子之間的相互作用調(diào)節(jié)所述細胞的行為。然后向所述對象施用被調(diào)節(jié)的細胞。在某些優(yōu)選的實施方式中，所治療的疾病是癌癥。

如在本說明書中所使用的，術(shù)語“對象”指動物，優(yōu)選地為哺乳動物，更優(yōu)選地為人。所述“對象”不旨在在任何方面為限制性的，并且其可以是任何年齡、性別和身體狀況。

制備納米組合物的方法

本申請的另一個方面涉及形成納米組合物的方法，所述納米組合物包含納米結(jié)構(gòu)和與所述納米結(jié)構(gòu)可操作地連接的至少一種細胞調(diào)節(jié)劑，其中所述細胞調(diào)節(jié)劑可以與細胞表面上的分子相互作用，其中所述細胞調(diào)節(jié)劑與所述分子之間的相互作用調(diào)節(jié)所述細胞的行為。在某些實施方式中，所述細胞調(diào)節(jié)劑和/或可檢測標記可以例如在溶液、分散體、懸浮體、乳液等中與易于形成的納米結(jié)構(gòu)混合，以使得所述細胞調(diào)節(jié)劑摻入所述納米結(jié)構(gòu)的多孔性隔室中，或者使得所述細胞調(diào)節(jié)劑與所述納米結(jié)構(gòu)上的官能團偶聯(lián)。

在某些實施方式中，可以在所述納米結(jié)構(gòu)形成過程中或形成后引入細胞調(diào)節(jié)劑。例如，當通過硅烷化過程形成所述納米結(jié)構(gòu)時，可以將細胞調(diào)節(jié)劑引入硅烷化系統(tǒng)，以便在硅烷化過程中將所述細胞調(diào)節(jié)劑摻入所述納米結(jié)構(gòu)。舉另一個例子，對于具有表面反應性基團(如鏈霉親和素)的納米結(jié)構(gòu)而言，可以在有利于結(jié)合的條件下將包含所述反應性基團的結(jié)合伴侶(如生物素)的細胞調(diào)節(jié)劑與所述納米結(jié)構(gòu)混合。

制備納米結(jié)構(gòu)的方法

本申請的另一個方面涉及形成納米結(jié)構(gòu)的方法，所述納米結(jié)構(gòu)包含具有涂層的至少一個核納米粒子。例如，所述納米結(jié)構(gòu)通過如下方式形成：使用涂層材料涂覆或包裹一個或多個核納米粒子，使得所述一個或多個粒子嵌入所述涂層材料中。舉另一個例子，在存在核納米粒子的條件下通過交聯(lián)前體而形成涂層材料，以使得所述納米粒子嵌入交聯(lián)的涂層材料中。

在某些實施方式中，所述方法還包括將一個或多個官能團引入納米結(jié)構(gòu)中或納米結(jié)構(gòu)表面上?？梢栽谛纬赏繉硬牧系倪^程中引入所述官能團。例如，在交聯(lián)過程中，特別是在交聯(lián)過程的結(jié)束階段過程中，可以加入含有此類官能團的前體。還可以在形成納米結(jié)構(gòu)后引入官能團，例如通過利用化學修飾將官能團引入納米結(jié)構(gòu)的表面。在某些實施方式中，官能團在納米結(jié)構(gòu)或在涂層材料中是固有的。官能團用作納米結(jié)構(gòu)與細胞調(diào)節(jié)劑之間的連接。所述官能團的示例包括但不限于氨基、巰基、羧基、膦酸酯、生物素、鏈霉親和素、親和素、羥基、烷基或其他疏水性分子、聚乙二醇或其他親水性分子，以及光裂解性、熱裂解性或pH響應性接頭。

在某些實施方式中，所述方法還包括純化所獲得的納米結(jié)構(gòu)產(chǎn)物。所述純化可以包括使用透析、切向流過濾、滲濾或其組合。

制備具有低密度多孔性3D結(jié)構(gòu)的納米結(jié)構(gòu)的方法

本公開的另一個方面涉及形成具有低密度多孔性3D結(jié)構(gòu)的包含至少一個核納米粒子的納米結(jié)構(gòu)的方法。例如，通過如下方式形成所述納米結(jié)構(gòu)：用低密度多孔性3D結(jié)構(gòu)涂覆或包裹一個或多個核納米粒子，以使得所述一個或多個粒子嵌入所述3D結(jié)構(gòu)中。

所述低密度多孔性3D結(jié)構(gòu)通過如下方式形成：通過組裝或交聯(lián)含硅烷的分子或硅烷樣分子而使其沉積或覆蓋核納米粒子的表面。可以通過在核納米粒子表面上的硅烷化過程來制備所述低密度多孔性3D結(jié)構(gòu)。

硅烷化過程包括例如在酸性或堿性條件下交聯(lián)含硅烷的分子或硅烷樣分子(例如烷氧基硅烷，如氨基-丙基-三甲氧基硅烷、巰基-丙基-三甲氧基硅烷，或硅酸鈉)的步驟。

在某些實施方式中，在交聯(lián)中使用酸性或堿性催化劑。示例性的酸性催化劑包括但不限于質(zhì)子酸催化劑(例如硝酸、乙酸和磺酸)和Lewis酸催化劑(例如三氟化硼、三氟化硼單乙胺復合物、三氟化硼甲醇復合物、FeCl₃、AlCl₃、ZnCl₂和ZnBr₂)。示例性的堿性催化劑包括胺或季胺化合物，如四甲基氫氧化銨和氫氧化銨。硅烷化過程可以包括一個或多個階段，例如：引發(fā)階段，在此階段中所述3D結(jié)構(gòu)開始形成；生長階段，在此階段中硅質(zhì)結(jié)構(gòu)層易于在核納米粒子上形成并且形成更多；和/或結(jié)束階段，在此階段中所述3D結(jié)構(gòu)即將完成(例如所述3D結(jié)構(gòu)的外表面即將形成)。在硅烷化過程中，可以在該過程的不同階段加入一種或多種含硅烷的分子。例如，在引發(fā)階段，可以加入有機硅烷(如氨基丙基三甲氧基硅烷或巰基丙基三甲氧基硅烷)以便引發(fā)核納米粒子表面上的硅烷化。舉另一個例子，可以在硅烷化的生長階段將具有更少烷氧基(例如僅2個烷氧基)的硅烷分子加入反應中。舉另一個例子，在硅烷化的結(jié)束階段，可以加入具有一種或多種不同官能團的有機硅烷分子。這些官能團可以是氨基、羧基、巰基或膦酸酯基團，其可以進一步與其他分子(例如親水性試劑、生物活性劑、可檢測標記、光響應基團、電子響應基團、磁響應基團、酶促響應基團或pH響應基團，或者結(jié)合伴侶)偶聯(lián)，以在穩(wěn)定性、溶解度、生物相容性、進一步偶聯(lián)或衍生的能力或與有效載荷親和性方面進一步修飾3D結(jié)構(gòu)?；蛘?，所述官能團還可以是易于與其他分子(例如與生物活性試劑、熱響應分子、光響應分子、電子響應分子、磁響應分子、pH響應分子、酶促響應分子、可檢測標記或結(jié)合伴侶(如生物素或親和素))偶聯(lián)的基團。

為控制低密度硅質(zhì)結(jié)構(gòu)的形成，所述制備進一步包括降低密度的操作，如在反應或形成過程中引入空氣氣泡、增加反應溫度、微波、超聲、渦旋、搖動旋轉(zhuǎn)和/或調(diào)節(jié)反應的化學組成以調(diào)節(jié)硅烷分子的交聯(lián)度。不被理論所束縛，據(jù)信這些操作能夠有助于使得反應介質(zhì)均勻、分散良好并且促進具有增加的空腔或孔隙度的低密度多孔性3D結(jié)構(gòu)的形成。在某些實施方式中，降低密度的操作包括將反應或形成混合物超聲?？梢赃m當?shù)剡x擇硅烷化過程中超聲的條件(例如持續(xù)時間)，以便在所得低密度多孔性3D結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生所需的孔隙度。例如，可以在硅烷化過程的某一階段中應用超聲。在硅烷化階段中超聲的持續(xù)時間可以持續(xù)例如至少1小時、1.5小時、2小時、2.5小時、3小時、3.5小時、4小時。在某些實施方式中，在硅烷化過程中的各階段均應用超聲。

在某些實施方式中，降低密度的操作包括向反應中引入至少一種醇。在某些實施方式中，所述醇具有至少3個(例如至少4個、至少5個或至少6個)碳原子。例如，所述醇可以具有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個或更多個碳原子。在某些實施方式中，所述醇可以是一元醇或多元醇。一元醇的說明性的例子包括丙醇、丁醇、戊醇、己醇等。

多元醇的說明性的例子包括丙二醇、丙三醇、蘇糖醇、木糖醇等。在某些實施方式中，所述醇可以具有飽和的碳鏈或不飽和的碳鏈。具有飽和碳鏈的醇可以以化學式C_nH_(2n+2)O表示。在某些實施方式中，n不低于3，或者不低于4，或者不低于5(例如n＝3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多)。具有不飽和碳鏈的醇在兩個碳原子之間具有雙鍵或三鍵。在某些實施方式中，所述醇可以是環(huán)醇，例如環(huán)己醇、肌醇或薄荷醇。

在某些實施方式中，所述醇具有直鏈碳鏈(例如正丙醇、正丁醇、正戊醇、正己醇等)或支鏈碳鏈(例如異丙醇、異丁醇、叔丁醇等)。在某些實施方式中，所述醇以約30％至約70％(例如30％至約70％、約30％至約60％、約30％至約55％、約40％至約70％、約45％至約70％、約40％至約60％)的體積分數(shù)存在。在某些實施方式中，所述醇以50％左右(例如45％左右、46％左右、47％左右、48％左右、49％左右、50％左右、51％左右、52％左右、53％左右、54％左右、55％左右、56％左右、57％左右、58％左右、59％左右或60％左右)的體積分數(shù)存在。在某些實施方式中，降低密度的操作包括向反應中引入空氣氣泡。在某些實施方式中，所述空氣氣泡可以在反應過程中持續(xù)存在。可以通過任何適宜的方法將空氣氣泡引入反應中，例如通過向反應中通入氣泡，或者通過向反應混合物中引入氣體產(chǎn)生劑。

還可以優(yōu)化其他實驗條件，以提供所需低密度多孔性3D結(jié)構(gòu)的形成。這種實驗條件包括例如核納米粒子的濃度、催化劑的濃度、催化劑與核納米粒子的濃度比、低密度硅質(zhì)結(jié)構(gòu)形成的溫度或有機硅烷的分子結(jié)構(gòu)。

直接與納米結(jié)構(gòu)的尺寸相關(guān)的低密度多孔性3D結(jié)構(gòu)的厚度能夠通過例如改變含硅烷的分子(例如三烷氧基硅烷或硅酸鈉)的量、反應時間以及反應步驟之間的時間間隔和這類反應參數(shù)而被控制(例如從1nm至1000nm)。

所述3D結(jié)構(gòu)的厚度可以是約1至5nm厚。在某些實施方式中，所述厚度可以是約1至10nm厚。在某些實施方式中，所述厚度可以是約1至20nm厚。在某些實施方式中，所述厚度可以是約1至30nm厚。在某些實施方式中，所述厚度可以是約1至40nm厚。在某些實施方式中，所述厚度可以是約1至50nm厚。在某些實施方式中，所述厚度可以是約1至60nm厚。在某些實施方式中，所述厚度可以是約1至100nm厚。在某些實施方式中，所述厚度可以是約1至500nm厚。在某些實施方式中，所述厚度可以是約1至1000nm厚。

所述低密度多孔性3D結(jié)構(gòu)在核納米粒子表面上形成后，所述核納米粒子被嵌入所述3D結(jié)構(gòu)中。所得到的納米結(jié)構(gòu)能夠具有約1至1000nm、1至100nm或者1至10nm的厚度(例如納米結(jié)構(gòu)的最長尺寸，或者如果所述結(jié)構(gòu)是球形則為直徑)。在另一個實施方式中，所述納米結(jié)構(gòu)能夠具有約1至30nm的直徑。在另一個實施方式中，所述納米結(jié)構(gòu)能夠具有約500nm的直徑。在另一個實施方式中，所述納米結(jié)構(gòu)能夠具有約100nm的直徑。在另一個實施方式中，所述納米結(jié)構(gòu)能夠具有約50nm的直徑。在另一個實施方式中，所述納米結(jié)構(gòu)能夠具有約30nm的直徑。在另一個實施方式中，所述納米結(jié)構(gòu)能夠具有約10nm的直徑。

可以使用本申請所述的方法和/或本領(lǐng)域公知的常規(guī)方法將本申請制備的具有低密度3D結(jié)構(gòu)的納米結(jié)構(gòu)與一種或多種細胞調(diào)節(jié)劑可操作地連接。任選地，還可以表征所述細胞調(diào)節(jié)劑，如所述細胞調(diào)節(jié)劑的量。

實施例1

納米組合物的制備

使用硅烷化包封的超順磁性氧化鐵納米粒子制備納米組合物。將納米組合物的終濃度調(diào)整為1mg/ml。通過交聯(lián)劑硫代-SMCC將0.3mg/ml鏈霉親和素分子與納米組合物共價偶聯(lián)，孵育過夜后，通過磁性分離將納米組合物-鏈霉親和素偶聯(lián)物從剩余的溶液中純化。

首先使用市售生物素化試劑盒(Thermo Scientific)按照推薦的方案將抗CD3(克隆OKT3)、抗CD28(克隆28.2)或其他共刺激抗體生物素化。以確定的抗體/納米組合物的量將經(jīng)純化的生物素化抗體與鏈霉親和素-納米組合物混合并且反應過夜，然后磁性純化以形成所需的與抗體偶聯(lián)的納米組合物。

實施例2

使用與抗CD3/抗CD28偶聯(lián)的納米組合物的T細胞擴增

據(jù)報道，被固定的抗CD3和抗CD28抗體能夠同時傳遞信號和共刺激信號，以刺激T細胞增殖(Baroja等(1989),Cellular Immunology,120:205-217)。在WO09429436A1中使用固相表面(如培養(yǎng)皿和珠粒)固定抗CD3和抗CD28抗體。通常情況下，在具有尺寸為4.5um直徑的M-450上進行在小珠上的固定。

US2008/0317724A1公開了信號分子的空間表達能夠顯著影響T細胞對于那些信號分子的應答。例如，當抗CD3和抗CD28抗體位于底物上分別的預定區(qū)域上時，在該底物上孵育的T細胞分泌不同量的白介素-2和/或顯示出鈣尖峰，這不僅取決于這些信號分子的類型，還取決于這些分子的間距。例如，使用抗CD3和抗CD28抗體產(chǎn)生一種圖案，其中抗CD3抗體占據(jù)中心特征，所述中心特征被抗CD28抗體的衛(wèi)星特征圍繞，所述抗CD28抗體的衛(wèi)星特征與抗CD3中心特征的間距約1至2微米。與抗CD3和抗CD28抗體以“共定位”特征一起呈現(xiàn)給T細胞相比，當抗CD28抗體特征間隔開約1至2微米時，T細胞的白介素-2(IL-2)分泌增強。

Erin R Steenblock和Tarek M Fahmy(Molecular Therapy vol.16no.4,765-772April2008)報道了使用固體表面納米粒子(130nm)，并顯示與微粒(8um)相比這些納米粒子對T細胞的刺激更弱。作者指出，此前報道(Mescher,MF(1992).J Immunol 149:2402-2405.)的發(fā)現(xiàn)支持了這些發(fā)現(xiàn)，表明尺寸上接近于T細胞的微米尺寸的粒子提供了最佳的T細胞刺激。Mesher的研究表明大且連續(xù)的表面接觸面積對有效的CTL活化的關(guān)鍵重要性。發(fā)現(xiàn)使用固定于粒徑為4至5微米的乳膠微球上的I類同種異體抗原提供了最佳刺激。小于4微米時，應答隨粒徑的減小迅速降低，并且大量小粒子無法補償不理想的尺寸。US8,012,750B2公開了一種用于活化T細胞的可生物降解的裝置。根據(jù)US8,012,750B2，納米球未提供足夠的交聯(lián)以活化初始T細胞，因此僅能夠用于此前已活化的T細胞。使用共固定有抗CD3和抗CD28抗體的尺寸為4至24微米(平均7微米)的球再次產(chǎn)生實驗數(shù)據(jù)。

在本實施例中，使用與抗CD4抗體偶聯(lián)的納米結(jié)構(gòu)通過磁性分離從新鮮或冷凍的人PBMC中純化CD4+T細胞。類似地，使用與抗CD8抗體偶聯(lián)的納米結(jié)構(gòu)通過磁性純化從新鮮或冷凍的人PBMC中制備CD8+T細胞。以2-4×10⁶個細胞/ml接種CD4+或CD8+T細胞。將此記為第0天。在第1天，將與抗CD3/抗CD28偶聯(lián)的納米組合物加入細胞中。在第3天，將IL-2和更多培養(yǎng)基加入細胞中。在第5天，進行細胞計數(shù)，更換培養(yǎng)基并加入IL-2。在第7天和第10天，加入IL-2。在第12天，計數(shù)細胞數(shù)量。

如表1-4所示，使用具有不同濃度的偶聯(lián)抗CD3/抗CD28抗體的納米組合物刺激CD4+或CD8+T細胞擴增。

表1：CD4+T細胞的擴增

#對照：未與抗體偶聯(lián)的納米結(jié)構(gòu)

表2：CD8+T細胞的擴增

表3：CD4+T細胞的再刺激

表4：CD8+T細胞的再刺激

實施例3

納米組合物與的比較

將濃度為1mg/ml的與鏈霉親和素偶聯(lián)的磁性低密度納米結(jié)構(gòu)與1ug/ml生物素化的抗CD3抗體和10ug/ml生物素化的抗CD28抗體混合，以制備與抗CD3/抗CD28偶聯(lián)的納米組合物。先將抗CD3抗體加入納米結(jié)構(gòu)中并孵育30min，隨后加入抗CD28抗體并將溶液置于旋轉(zhuǎn)器上在4℃下過夜。次日，使用磁性分離從剩余溶液中純化納米結(jié)構(gòu)-抗CD3/CD28抗體偶聯(lián)物，并且將其再分散于PBS緩沖液中備用。將未經(jīng)純化的新鮮人PBMC調(diào)整為10⁶個細胞/ml。將50ul 1mg/ml的抗-CD3/抗-CD28偶聯(lián)的納米組合物加入細胞中。按照其實驗方案以1:1的珠粒/T細胞比例使用(Life Technologies)。每ml 10⁶個T細胞使用25ul經(jīng)洗滌的珠粒。

如圖2和表5所示，與抗CD3/抗CD28偶聯(lián)的相比，抗CD3/抗CD28偶聯(lián)的納米組合物顯示出更強的T細胞刺激(CD69的表達)。不同T細胞亞群可具有不同的活化要求。特別地，在不存在輔助細胞的條件下難以活化初始T細胞。我們的結(jié)果顯示所有T細胞亞群均能夠被納米組合物很好地活化。如圖2和表5所示，與存在抗CD3/抗CD28偶聯(lián)的相比，在存在抗CD3/抗CD28偶聯(lián)的納米組合物的條件下，更多CD4+T細胞、CD4+初始T細胞、CD4+中央記憶T細胞、CD+效應記憶T細胞被活化。

表5：使用與抗CD3/抗CD28抗體偶聯(lián)的納米組合物刺激CD4+T細胞

#對照：未與抗體偶聯(lián)的納米結(jié)構(gòu)

實施例4

使用納米組合物分離和鑒定循環(huán)腫瘤細胞

通過在硅烷化過程中包封SPIO和量子點而制備同時具有磁性和熒光性質(zhì)的納米結(jié)構(gòu)。1mg/ml多功能熒光磁性納米結(jié)構(gòu)通過交聯(lián)劑硫代-SMCC而與0.3mg/ml鏈霉親和素偶聯(lián)。磁性分離后，將經(jīng)純化的納米結(jié)構(gòu)-鏈霉親和素偶聯(lián)物分散于PBS緩沖液中。使用市售生物素化試劑盒根據(jù)標準方案將抗EpCAM抗體或抗CD19抗體生物素化。將1mg/ml納米結(jié)構(gòu)-鏈霉親和素分別與20ug/ml生物素-抗EpCAM或20ug/ml生物素-抗CD19偶聯(lián)，在4℃下孵育過夜后，將納米結(jié)構(gòu)-抗EpCAM或納米結(jié)構(gòu)-抗CD19磁性分離和純化。最終的與抗體偶聯(lián)的納米組合物以1mg/ml的濃度儲存于PBS緩沖液中。對于細胞分離，將20至500ul與抗體偶聯(lián)的納米組合物與在體積為0.5至7.5ml的全血樣品中的10至1000個經(jīng)CFSE或CMTMR預染色的示蹤癌細胞混合。孵育1小時后，使用磁體將納米組合物捕獲的細胞從其余的全血樣品中分離。

如圖1所示，被捕獲的細胞具有高純度和高收率(均>90％)。熒光顏色標識細胞類型，并表示細胞表面分子位置和功能。使用具有多功能熒光和磁性性質(zhì)的納米組合物與兩種不同類型循環(huán)腫瘤細胞的相互作用并將其從全血樣品中分離。特異性相互作用來自于納米結(jié)構(gòu)表面偶聯(lián)的抗體和細胞表面分子。紅色熒光納米結(jié)構(gòu)(615nm發(fā)射)在表面上具有抗EpCAM抗體，其與H1650細胞(CFSE染色為綠色)相互作用。綠色熒光納米結(jié)構(gòu)(535nm發(fā)射)在表面上具有抗CD19抗體，其與Oc1-Ly8(CMTMR染色為櫻紅色)相互作用。這些多功能納米組合物不僅與細胞相互作用，還通過熒光信號鑒定細胞類型或細胞表面標記物。

盡管本發(fā)明參照特定的實施方式(其中一些是優(yōu)選的實施方式)進行了特別的顯示和描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員應理解在不脫離如本申請所述的本發(fā)明的主旨和范圍的前提下可以對其形式和細節(jié)做出多種改變。