本發(fā)明涉及一種評(píng)價(jià)皮膚干燥的狀態(tài)的方法和一種搜尋用于改善干燥皮膚的物質(zhì)的方法。
背景技術(shù):
正常的皮膚具有保持水分的功能(保濕功能)。由于該保濕功能從而保持皮膚的柔軟,通過維持屏障功能還可以保持良好的狀態(tài)。同時(shí),在皮膚的保濕功能降低皮膚干燥時(shí),皮膚狀態(tài)惡化,發(fā)生皮膚粗糙。
報(bào)道了在干燥皮膚中觀察到角質(zhì)層的水含量降低(非專利文獻(xiàn)1)、角質(zhì)層上部中角質(zhì)細(xì)胞粘接結(jié)構(gòu)(角化粒)的殘留(非專利文獻(xiàn)2)、以及具有不成熟的邊緣帶(編碼角質(zhì)化包膜)的角質(zhì)細(xì)胞的增加(非專利文獻(xiàn)3)。近年來(lái),還報(bào)道了根據(jù)由膠帶剝離而采集的角質(zhì)層的整體蛋白質(zhì)組分析(二維電泳),干燥皮膚中角化粒、膜聯(lián)蛋白A2和磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白1增加(非專利文獻(xiàn)4)。然而,至今的有關(guān)干燥皮膚的報(bào)告聚焦于已死細(xì)胞(角質(zhì)層)的結(jié)構(gòu)和成分,還沒有對(duì)活的皮膚細(xì)胞(活的角質(zhì)下細(xì)胞)進(jìn)行分析。
AGR2(前梯度同源蛋白2(Anterior gradient homolog 2))和AGR3(前梯度同源蛋白3(Anterior gradient homolog 3))都是屬于蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)族的蛋白質(zhì)。AGR2和AGR3都具有一個(gè)硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)域(CXXS),認(rèn)為其與蛋白質(zhì)的S-S鍵部位結(jié)合并且參與蛋白質(zhì)折疊和成熟(非專利文獻(xiàn)5和6)。實(shí)際上,報(bào)道了AGR2與腸中的粘蛋白結(jié)合來(lái)參與粘蛋白的成熟,在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá),并且AGR3在卵巢癌細(xì)胞中表達(dá)(非專利文獻(xiàn)7~9)。然而,至今沒有報(bào)道皮膚中AGR2和AGR3的功能。
非專利文獻(xiàn)
非專利文獻(xiàn)1:Bioengineering of the skin:Water and the stratum corneum.Elsner P,Berardesca E and Maibach HI(eds.),CRC Press Inc,3-12,1994
非專利文獻(xiàn)2:J Invest Dermatol,116(1):23-30,2001
非專利文獻(xiàn)3:Int J Cosmet Sci,25(4):157-167,2003
非專利文獻(xiàn)4:Exp Dermatol,21(3):205-210,2012
非專利文獻(xiàn)5:Mol Phylogenet Evol,36(3):734-740,2005
非專利文獻(xiàn)6:J Immunol Methods,378(1-2):20-32,2012
非專利文獻(xiàn)7:Proc Natl Acad Sci,106(17):6950-6955,2009
非專利文獻(xiàn)8:Dev Biol,338(2):270-279,2010
非專利文獻(xiàn)9:J Immunol Methods,378(1-2):20-32,2012
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明提供一種評(píng)價(jià)皮膚干燥的狀態(tài)的方法,其中,所述方法包括測(cè)定從被試者采集的皮膚細(xì)胞中的AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平。
進(jìn)一步,本發(fā)明提供一種評(píng)價(jià)或選擇干燥皮膚改善劑的方法,其中,所述方法包括以下的(A)~(D):
(A)將試驗(yàn)物質(zhì)向被試者或被試動(dòng)物給藥;
(B)測(cè)定從被試者或被試動(dòng)物中采集的皮膚細(xì)胞中的AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平;
(C)將上述(B)中測(cè)定的表達(dá)水平與從沒有將所述試驗(yàn)物質(zhì)給藥的被試者或被試動(dòng)物采集的皮膚細(xì)胞中的AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平比較;和
(D)基于上述(C)的結(jié)果,評(píng)價(jià)所述試驗(yàn)物質(zhì)的提高AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平的效果。
進(jìn)一步,本發(fā)明提供一種評(píng)價(jià)或選擇干燥皮膚改善劑的方法,其中,所述方法包括以下的(A’)~(D’):
(A’)使試驗(yàn)物質(zhì)接觸能夠表達(dá)AGR2和/或AGR3的來(lái)自哺乳動(dòng)物的組織或細(xì)胞;
(B’)測(cè)定所述組織或細(xì)胞中的AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平;
(C’)將上述(B’)中測(cè)定的表達(dá)水平與對(duì)照組中的AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平比較;和
(D’)基于上述(C’)的結(jié)果,評(píng)價(jià)所述試驗(yàn)物質(zhì)的提高AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平的效果。
附圖說(shuō)明
圖1是皮膚組織中的AGR2和AGR3的表達(dá)模式。不干燥:健康的人;干燥:有干燥皮膚的人。
圖2是皮膚組織中的AGR2和AGR3mRNA的表達(dá)水平。不干燥:健康的人;干燥:有干燥皮膚的人。*:p<0.05、**:p<0.01(T-檢驗(yàn))。
圖3是保濕劑對(duì)AGR2表達(dá)的影響。對(duì)于每個(gè)數(shù)據(jù)n=2。
具體實(shí)施方式
在本說(shuō)明書中,“皮膚干燥的狀態(tài)”還可以指皮膚保濕的狀態(tài)。皮膚干燥度越強(qiáng),則皮膚保持越少的水分,并且被試者具有更高度的干燥皮膚。相反地,皮膚干燥度越弱,則皮膚保持越多的水分,并且被試者具有越輕度的干燥皮膚或者不具有干燥皮膚。
在本說(shuō)明書中,“由皮膚干燥而導(dǎo)致的粗糙皮膚”(在本說(shuō)明書中,可以僅稱為“粗糙皮膚”)是指由于皮膚的保濕功能降低而導(dǎo)致失去皮膚的柔軟性和屏障功能,由此狀態(tài)發(fā)生了惡化的皮膚。由干燥而導(dǎo)致的粗糙皮膚的例子,例如可以列舉干性皮膚、敏感皮膚、皮膚干燥癥、老年性皮膚干燥癥、魚鱗癬以及干性濕疹。
在本說(shuō)明書中,“從被試者(或者被試動(dòng)物)采集的皮膚細(xì)胞”包括能夠表達(dá)AGR2和/或AGR3的皮膚組織中的活細(xì)胞,優(yōu)選為活表皮細(xì)胞?;畋砥ぜ?xì)胞是在表皮組織中比角質(zhì)層更深層中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞組。來(lái)自被試者(或者被試動(dòng)物)的活表皮細(xì)胞可以通過利用通常的方法,例如鉆取活組織檢查,采集皮膚組織之后,利用例如中性蛋白酶處理分離表皮和真皮來(lái)進(jìn)行采集。
在本說(shuō)明書中,“AGR2和/或AGR3的表達(dá)”是指AGR2基因和AGR3基因的至少一者的表達(dá)或兩者的表達(dá),或者AGR2蛋白質(zhì)和AGR3蛋白質(zhì)的至少一者的表達(dá)或兩者的表達(dá)。在以mRNA水平檢測(cè)時(shí),AGR2基因或AGR3基因的表達(dá)水平可以通過例如從細(xì)胞中提取總RNA之后利用實(shí)時(shí)RT-PCR法(Real-Time RT-PCR method)或RNA酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)(RNase Protection Assay)來(lái)進(jìn)行測(cè)定,或者利用例如Northern印跡分析對(duì)轉(zhuǎn)錄有AGR2基因或AGR3基因的mRNA進(jìn)行檢測(cè)并定量。AGR2蛋白質(zhì)或AGR3蛋白質(zhì)的表達(dá)水平可以通過通常的免疫分析法,例如RIA法、EIA法、ELISA、生物檢定法(bioassay)、蛋白質(zhì)組(proteome)和免疫印跡(Western blot),進(jìn)行測(cè)定。其中,免疫印跡廉價(jià)并且簡(jiǎn)單。
本發(fā)明涉及提供一種快速且精確地評(píng)價(jià)皮膚干燥狀態(tài)或由皮膚干燥而導(dǎo)致的粗糙皮膚的狀態(tài)的方法,并且提供一種有效地搜尋用于改善由皮膚干燥而導(dǎo)致的粗糙皮膚的物質(zhì)的方法。
本發(fā)明者們著眼于與皮膚的水含量相關(guān)的至今沒有進(jìn)行研究的活皮膚細(xì)胞(活的角質(zhì)下細(xì)胞),并且專門進(jìn)行了研究以搜尋使這些細(xì)胞的活動(dòng)與皮膚的水含量有聯(lián)系的指標(biāo)。其結(jié)果,本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn):以前沒有報(bào)道在皮膚中的功能的AGR2和AGR3的表達(dá)是表明皮膚干燥的狀態(tài)的良好的指標(biāo)。
根據(jù)本發(fā)明,可以快速并且精確地評(píng)價(jià)被試者的皮膚干燥的狀態(tài)或者由皮膚干燥而導(dǎo)致的粗糙皮膚的狀態(tài)。根據(jù)本發(fā)明,還可以有效地搜尋改善干燥皮膚的狀態(tài)或由皮膚干燥而導(dǎo)致的粗糙皮膚的狀態(tài)的物質(zhì)。
如后述的實(shí)施例所示,干燥皮膚的被試者與沒有干燥皮膚的被試者相比,皮膚細(xì)胞中的AGR2和AGR3的表達(dá)水平都降低。另外,AGR2和AGR3的表達(dá)水平與作為皮膚干燥的狀態(tài)的指標(biāo)而為人所知的皮膚干燥得分和角質(zhì)層電導(dǎo)系數(shù)相關(guān)。因此,AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平可以是反映被試者皮膚干燥的狀態(tài)的指標(biāo)。
因此,本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式是一種評(píng)價(jià)皮膚干燥的狀態(tài)的方法,所述方法包括測(cè)定從被試者中采集的皮膚細(xì)胞中的AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平。在該方法的一個(gè)實(shí)施方式中,皮膚干燥的狀態(tài)的評(píng)價(jià)是由皮膚干燥而導(dǎo)致的粗糙皮膚的狀態(tài)的評(píng)價(jià)。適用該方法的被試者包括為了非治療目的例如美容目的而期望預(yù)防或改善干燥皮膚或敏感皮膚或者期望知道成為干燥皮膚或敏感皮膚的風(fēng)險(xiǎn)的被試者、以及期望預(yù)防或改善由干燥,例如皮膚干燥癥、老年性皮膚干燥癥、魚鱗癬以及干性濕疹,而導(dǎo)致的皮膚癥狀或狀態(tài)的被試者。該方法中測(cè)定AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平的步驟如上所述。
在上述方法中,基于測(cè)得的AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平來(lái)評(píng)價(jià)被試者的皮膚干燥狀態(tài)或粗糙皮膚的狀態(tài)。優(yōu)選將AGR2和AGR3兩者的表達(dá)水平用作指標(biāo)。
在上述評(píng)價(jià)的一個(gè)實(shí)施方式中,在被試者的皮膚細(xì)胞中AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平低時(shí),被試者的皮膚被評(píng)價(jià)為處于干燥狀態(tài)或是粗糙皮膚。另一方面,在AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平高時(shí),被試者的皮膚被評(píng)價(jià)為不是處于干燥狀態(tài)或不是粗糙皮膚。表達(dá)水平的程度可以通過與預(yù)先設(shè)定的參照值比較來(lái)確定。作為參照值,可以使用從干燥皮膚或粗糙皮膚的組取得的AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平的指標(biāo)(以下,參照值1)或者從不干燥皮膚或不粗糙皮膚的組取得的AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平的指標(biāo)(以下,參照值2)。參照值1的具體例子包括從干燥皮膚或粗糙皮膚的組采集的皮膚細(xì)胞(例如,活表皮細(xì)胞)中的AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平的平均值。參照值2的具體例子包括從不干燥皮膚或不粗糙皮膚的組采集的皮膚細(xì)胞(例如,活表皮細(xì)胞)中的AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平的平均值。不干燥皮膚或不粗糙皮膚的組的例子包括皮膚干燥得分為1.5以下的人的組,優(yōu)選為皮膚干燥得分為1以下的人的組。干燥皮膚或粗糙皮膚的組的例子包括皮膚干燥得分大于2.5的人的組,優(yōu)選為皮膚干燥得分大于3的人的組。在本說(shuō)明書中,皮膚的“干燥得分”是通過利用5個(gè)等級(jí)(0:不干燥、1:觀察到稍微脫皮、2:觀察到中等脫皮和/或死皮、3:觀察到明顯的死皮和/或稍微開裂、4:觀察到嚴(yán)重的死皮和/或開裂)目視評(píng)價(jià)目標(biāo)位置的干燥狀態(tài)而獲得的值。然而,在本實(shí)施方式中,參照值不限定于上述的值,可以適當(dāng)設(shè)定能夠反映皮膚干燥的實(shí)際狀態(tài)的適當(dāng)?shù)闹怠?/p>
例如,在來(lái)自被試者的AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平的測(cè)定值等于或低于參照值1時(shí),該被試者的皮膚被評(píng)價(jià)為處于干燥狀態(tài)或是粗糙皮膚。例如,在來(lái)自被試者的AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平的測(cè)定值等于或高于參照值2時(shí),該被試者的皮膚被評(píng)價(jià)為不處于干燥狀態(tài)或不是粗糙皮膚。例如,在來(lái)自被試者的AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平的測(cè)定值高于參照值1且低于參照值2時(shí),該被試者的皮膚被評(píng)價(jià)為處于稍微干燥的狀態(tài)或者處于成為干燥皮膚和粗糙皮膚的風(fēng)險(xiǎn)高的狀態(tài)。
例如,在來(lái)自被試者的AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平的測(cè)定值為參照值2的50%以下、優(yōu)選為30%以下、更優(yōu)選為25%以下時(shí),該被試者的皮膚被評(píng)價(jià)為處于干燥狀態(tài)或是粗糙皮膚。
或者,在皮膚細(xì)胞中的AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平等于或低于參照值1時(shí),皮膚細(xì)胞被評(píng)價(jià)為是來(lái)源于皮膚處于干燥狀態(tài)或是粗糙皮膚的被試者的皮膚細(xì)胞。另一方面,在皮膚細(xì)胞中的AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平等于或高于參照值2時(shí),皮膚細(xì)胞被評(píng)價(jià)為是來(lái)源于皮膚不處于干燥狀態(tài)或不是粗糙皮膚的被試者的皮膚細(xì)胞。或者,在皮膚細(xì)胞中的AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平的測(cè)定值高于參照值1且低于參照值2時(shí),皮膚細(xì)胞被評(píng)價(jià)為是來(lái)源于皮膚處于稍微干燥的狀態(tài)或具有成為干燥皮膚和粗糙皮膚的風(fēng)險(xiǎn)高的被試者的皮膚細(xì)胞。
或者,在皮膚細(xì)胞中的AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平的測(cè)定值為參照值2的50%以下、優(yōu)選為30%以下、更優(yōu)選為25%以下時(shí),皮膚細(xì)胞被評(píng)價(jià)為是來(lái)源于皮膚處于干燥狀態(tài)或是粗糙皮膚的被試者的皮膚細(xì)胞。
在上述評(píng)價(jià)的其它實(shí)施方式中,經(jīng)時(shí)測(cè)定被試者的皮膚細(xì)胞中的AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平。經(jīng)時(shí)測(cè)定的頻率包括但不限定于例如每周、每二周和每月。測(cè)定的次數(shù)只能必須為二次以上,優(yōu)選為三次以上。例如,在相比于上述測(cè)定時(shí)AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平降低時(shí),被試者的皮膚被評(píng)價(jià)為干燥變得更嚴(yán)重或粗糙皮膚變得更嚴(yán)重。另一方面,在相比于上述測(cè)定時(shí)AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平提高時(shí),被試者的皮膚被評(píng)價(jià)為干燥得到改善或粗糙皮膚得到改善。例如,在三次以上經(jīng)時(shí)測(cè)定并且從第一次測(cè)定開始AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平連續(xù)降低時(shí),被試者的皮膚被評(píng)價(jià)為干燥變得更嚴(yán)重或粗糙皮膚變得更嚴(yán)重。另一方面,在從第一次測(cè)定開始AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平連續(xù)提高時(shí),被試者的皮膚被評(píng)價(jià)為干燥得到改善或粗糙皮膚得到改善。
或者,在皮膚細(xì)胞中的AGR2和/或AGR3表達(dá)水平相比最近測(cè)定降低時(shí),皮膚細(xì)胞被評(píng)價(jià)為是來(lái)源于其皮膚干燥變得更嚴(yán)重或粗糙皮膚變得更嚴(yán)重的被試者的皮膚細(xì)胞。另一方面,在皮膚細(xì)胞中的AGR2和/或AGR3表達(dá)水平相比最近測(cè)定提高時(shí),皮膚細(xì)胞被評(píng)價(jià)為是來(lái)源于其皮膚干燥得到改善或粗糙皮膚得到改善的被試者的皮膚細(xì)胞?;蛘?,在皮膚細(xì)胞中的AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平相比最初測(cè)定連續(xù)降低時(shí),皮膚細(xì)胞被評(píng)價(jià)為是來(lái)源于其皮膚干燥變得更嚴(yán)重或粗糙皮膚變得更嚴(yán)重的被試者的皮膚細(xì)胞。另一方面,在皮膚細(xì)胞中的AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平相比最初測(cè)定連續(xù)提高時(shí),皮膚細(xì)胞被評(píng)價(jià)為是來(lái)源于其皮膚干燥得到改善或粗糙皮膚得到改善的被試者的皮膚細(xì)胞。
在上述評(píng)價(jià)的另一個(gè)實(shí)施方式中,可以將與上述參照值的比較和經(jīng)時(shí)比較組合。在本實(shí)施方式中,經(jīng)時(shí)測(cè)定被試者的皮膚細(xì)胞中的AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平。經(jīng)時(shí)測(cè)定的頻率和次數(shù)與上述相同。將每次的各個(gè)測(cè)定值與通過上述步驟獲得的參照值比較,進(jìn)一步還將二次測(cè)定或隨后測(cè)定的測(cè)定值與利用上述步驟得到的初期的測(cè)定值比較。在本實(shí)施方式中,通過綜合地研究與參照值的比較結(jié)果和與初期測(cè)定值的比較結(jié)果,可以更詳細(xì)地評(píng)價(jià)被試者的皮膚干燥的狀態(tài)和粗糙皮膚的狀態(tài)。
如上所述,AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平的降低與皮膚干燥相關(guān)。因此,提高AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平的物質(zhì)可以提高皮膚保濕功能,改善干燥皮膚或粗糙皮膚。
因此,本發(fā)明的其它實(shí)施方式是一種評(píng)價(jià)或選擇干燥皮膚改善劑或粗糙皮膚改善劑的方法,所述方法包括以下的(A)~(D):
(A)將試驗(yàn)物質(zhì)向被試者或被試動(dòng)物給藥;
(B)測(cè)定從被試者或被試動(dòng)物中采集的皮膚細(xì)胞中的AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平;
(C)將上述(B)中測(cè)定的表達(dá)水平與從沒有將所述試驗(yàn)物質(zhì)給藥的被試者或被試動(dòng)物中采集的皮膚細(xì)胞中的AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平比較;和
(D)基于上述(C)的結(jié)果,評(píng)價(jià)所述試驗(yàn)物質(zhì)的提高AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平的效果。
被試動(dòng)物可以包括非人動(dòng)物,例如小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、豚鼠、兔子、貓、狗、豬、和例如猴子的靈長(zhǎng)類,從容易獲取和操作的方面出發(fā),優(yōu)選為嚙齒類,例如大鼠和小鼠。
向被試者或被試動(dòng)物給藥的試驗(yàn)物質(zhì)只要是期望用作干燥皮膚改善劑或粗糙皮膚改善劑的物質(zhì),就沒有特別地限定。試驗(yàn)物質(zhì)可以是天然存在的物質(zhì)或利用例如化學(xué)或生物方法人工合成的物質(zhì),并且可以是化合物或組合物或混合物。將試驗(yàn)物質(zhì)給藥的方法沒有特別地限定,例如,從簡(jiǎn)便性和低侵襲的方面出發(fā),優(yōu)選為經(jīng)皮給藥、經(jīng)口給藥、照射和吸入。給藥期限可以在一天至數(shù)月的范圍進(jìn)行設(shè)定,給藥的頻率可以在一天一次至一天多次的范圍進(jìn)行設(shè)定。
接著,測(cè)定從被試者或被試動(dòng)物采集的皮膚細(xì)胞(試驗(yàn)組)中的AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平。表達(dá)水平的測(cè)定步驟如上所述。
進(jìn)一步,測(cè)定從沒有將上述試驗(yàn)物質(zhì)給藥的被試者或被試動(dòng)物采集的皮膚細(xì)胞(對(duì)照組)中的AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平。對(duì)照組包括例如在將試驗(yàn)物質(zhì)給藥前從相同的被試者或被試動(dòng)物采集的皮膚細(xì)胞、相同的被試者或被試動(dòng)物中從沒有將試驗(yàn)物質(zhì)給藥的皮膚區(qū)域或?qū)?duì)照物質(zhì)給藥的皮膚區(qū)域采集的皮膚細(xì)胞、從沒有將試驗(yàn)物質(zhì)給藥的被試者或被試動(dòng)物采集的皮膚細(xì)胞。表達(dá)水平的測(cè)定步驟如上所述。
接著,在試驗(yàn)組與對(duì)照組之間比較AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平。優(yōu)選比較AGR2和AGR3兩者的表達(dá)水平。在試驗(yàn)組中AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平相比對(duì)照組增加時(shí),上述試驗(yàn)物質(zhì)被評(píng)價(jià)為具有提高AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平的效果。將被評(píng)價(jià)為具有提高AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平的試驗(yàn)物質(zhì)選擇為干燥皮膚或粗糙皮膚改善劑。
例如,在試驗(yàn)組中AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平相比對(duì)照組中的表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著地增加時(shí),試驗(yàn)物質(zhì)被評(píng)價(jià)為具有提高AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平的效果。例如,在將對(duì)照組中的AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平視作100%并且試驗(yàn)組中的表達(dá)水平為105%以上、優(yōu)選為110%以上、更優(yōu)選為120%以上時(shí),試驗(yàn)物質(zhì)被評(píng)價(jià)為具有提高AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平的效果。將該具有提高AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平的效果的試驗(yàn)物質(zhì)選擇為干燥皮膚或粗糙皮膚改善劑。
除了上述在體內(nèi)(in vivo)進(jìn)行的方法以外,本發(fā)明的評(píng)價(jià)或選擇干燥皮膚改善劑或粗糙皮膚改善劑的方法也可以在體外(in vitro)或離體(ex vivo)進(jìn)行。即,本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是一種評(píng)價(jià)或選擇干燥皮膚改善劑或粗糙皮膚改善劑的方法,所述方法包括以下的(A’)~(D’):
(A’)使試驗(yàn)物質(zhì)接觸能夠表達(dá)AGR2和/或AGR3的來(lái)自哺乳動(dòng)物的組織或細(xì)胞;
(B’)測(cè)定所述組織或細(xì)胞中的AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平;
(C’)將上述(B’)中測(cè)定的表達(dá)水平與對(duì)照組中的AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平比較;和
(D’)基于上述(C’)的結(jié)果,評(píng)價(jià)所述試驗(yàn)物質(zhì)的提高AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平的效果。
在上述方法中,可以使用的試驗(yàn)物質(zhì)的類型與上述體內(nèi)方法的相同。
在上述(A’)中使用的能夠表達(dá)AGR2和/或AGR3的來(lái)自哺乳動(dòng)物的組織或細(xì)胞的例子包括能夠表達(dá)AGR2基因或AGR3基因或者AGR2蛋白質(zhì)或AGR3蛋白質(zhì)的從哺乳動(dòng)物中分離的組織或細(xì)胞、或其培養(yǎng)物。該分離的組織或細(xì)胞、或其培養(yǎng)物包括分離的皮膚組織或分離的皮膚細(xì)胞,優(yōu)選為活表皮細(xì)胞及其培養(yǎng)物,例如腸細(xì)胞系、乳腺癌細(xì)胞系和卵巢癌細(xì)胞系。
或者,在上述(A’)中使用的能夠表達(dá)AGR2和/或AGR3的來(lái)自哺乳動(dòng)物的組織或細(xì)胞的例子包括以表達(dá)AGR2基因或AGR3基因或者AGR2蛋白質(zhì)或AGR3蛋白質(zhì)的方式進(jìn)行了基因改變的哺乳動(dòng)物的組織或細(xì)胞、或其培養(yǎng)物。該進(jìn)行了基因改變的哺乳動(dòng)物的組織或細(xì)胞、或其培養(yǎng)物可以通過例如將編碼AGR2蛋白質(zhì)和/或AGR3蛋白質(zhì)的基因?qū)氩溉閯?dòng)物的任意的組織或細(xì)胞中,以表達(dá)AGR2和/或AGR3或者AGR2和/或AGR3的表達(dá)得到強(qiáng)化的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)化來(lái)制作。將基因?qū)爰?xì)胞中的方法包括利用例如電穿孔和脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法的載體導(dǎo)入,但不限定于此。
本發(fā)明的方法中使用的能夠表達(dá)AGR2和/或AGR3的組織或細(xì)胞的來(lái)源的哺乳動(dòng)物的例子包括人、小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、豚鼠、兔子、貓、狗、豬、猴子,但不限定于此。
能夠表達(dá)AGR2和/或AGR3的組織或細(xì)胞與試驗(yàn)物質(zhì)的接觸可以通過例如,預(yù)先將試驗(yàn)物質(zhì)添加至培養(yǎng)液中以獲得規(guī)定的濃度之后將該組織或細(xì)胞置于培養(yǎng)液中,或者向置有該組織或細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入試驗(yàn)物質(zhì)以獲得規(guī)定的濃度來(lái)進(jìn)行。優(yōu)選將接觸后的組織或細(xì)胞在例如室溫(25℃)至37℃下通常培養(yǎng)3至48小時(shí)。通常所用的培養(yǎng)基可以用作培養(yǎng)上述組織或細(xì)胞的培養(yǎng)基。
測(cè)定上述(B’)中接觸過試驗(yàn)物質(zhì)的組織或細(xì)胞(試驗(yàn)組)中的AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平。測(cè)定AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平的步驟如上所述。
上述(C’)中的對(duì)照組包括與試驗(yàn)組中相同的能夠表達(dá)AGR2和/或AGR3的來(lái)自哺乳動(dòng)物的組織或細(xì)胞,其中,該組織或細(xì)胞沒有接觸過試驗(yàn)物質(zhì)?;蛘?,對(duì)照組包括例如天然地不具有或幾乎不具有AGR2和/或AGR3表達(dá)能力的來(lái)自哺乳動(dòng)物的組織或細(xì)胞;以及改變與試驗(yàn)組相同的組織或細(xì)胞以使AGR2和/或AGR3不表達(dá)的組織或細(xì)胞或進(jìn)一步將上述組織或細(xì)胞與試驗(yàn)物質(zhì)接觸過的組織或細(xì)胞。以AGR2和/或AGR3不表達(dá)的方式進(jìn)行了改變的組織或細(xì)胞包括例如利用siRNA的敲除細(xì)胞、和來(lái)自AGR2和/或AGR3敲除小鼠的組織或細(xì)胞。對(duì)照組中測(cè)定AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平的步驟如上所述。
接著,在試驗(yàn)組和對(duì)照組之間比較AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平。優(yōu)選比較AGR2和AGR3兩者的表達(dá)水平。在試驗(yàn)組中AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平相比對(duì)照組增加時(shí),上述實(shí)驗(yàn)物質(zhì)被評(píng)價(jià)為具有提高AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平的效果,并且選擇作為干燥皮膚或粗糙皮膚改善劑。試驗(yàn)組與對(duì)照組間的比較以及試驗(yàn)物質(zhì)的評(píng)價(jià)和選擇步驟與上述體內(nèi)法中的相同。
在上述體內(nèi)法和體外法或離體法的任一種中根據(jù)需要進(jìn)一步篩選選擇的物質(zhì)。例如,將通過上述方法被評(píng)價(jià)或選擇為干燥皮膚或粗糙皮膚改善劑的試驗(yàn)物質(zhì)向被試者、被試動(dòng)物和來(lái)自他們的培養(yǎng)皮膚給藥以直接調(diào)查對(duì)皮膚的保濕能力的影響。由此,可以進(jìn)一步選擇具有更強(qiáng)的改善干燥皮膚或粗糙皮膚的作用的物質(zhì)??梢曰诶缃?jīng)皮水分丟失量(TEWL)、皮膚干燥得分、角質(zhì)層電導(dǎo)系數(shù)、和角質(zhì)層中保濕成分的量(NMF、神經(jīng)酰胺等)來(lái)測(cè)定皮膚的保濕能力。
在本說(shuō)明書中進(jìn)一步公開以下的組合物、制造方法、用途或方法作為本發(fā)明的示例性實(shí)施方式。但是,注意本發(fā)明不限定于這些實(shí)施方式。
<1>一種評(píng)價(jià)皮膚干燥狀態(tài)的方法,其中,所述方法包括測(cè)定從被試者采集的皮膚細(xì)胞中的AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平。
<2>根據(jù)<1>所述的方法,其中,皮膚干燥的狀態(tài)優(yōu)選為由皮膚干燥而導(dǎo)致的粗糙皮膚的狀態(tài)。
<3>根據(jù)<2>所述的方法,其中,由皮膚干燥而導(dǎo)致的粗糙皮膚優(yōu)選選自干性皮膚、敏感皮膚、皮膚干燥癥、老年性皮膚干燥癥、魚鱗癬以及干性濕疹。
<4>根據(jù)<1>~<3>中任一項(xiàng)所述的方法,其中,被試者優(yōu)選是為了非治療目的而期望預(yù)防或改善干燥皮膚或敏感皮膚的被試者、為了非治療目的而期望知道成為干燥皮膚或敏感皮膚的風(fēng)險(xiǎn)的被試者、或者期望預(yù)防或改善選自皮膚干燥癥、老年性皮膚干燥癥、魚鱗癬以及干性濕疹的癥狀或狀態(tài)的被試者。
<5>根據(jù)<1>~<4>中任一項(xiàng)所述的方法,其中,進(jìn)一步優(yōu)選包括作為參照值1獲取從干燥皮膚或粗糙皮膚的組采集的皮膚細(xì)胞中的AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平的平均值。
<6>根據(jù)<1>~<4>中任一項(xiàng)所述的方法,其中,進(jìn)一步優(yōu)選包括作為參照值2獲取從不干燥皮膚或不粗糙皮膚的組采集的皮膚細(xì)胞中的AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平的平均值。
<7>根據(jù)<5>所述的方法,其中,干燥皮膚或粗糙皮膚的組優(yōu)選為皮膚干燥得分大于2.5的人的組,更優(yōu)選為皮膚干燥得分大于3的人的組。
<8>根據(jù)<6>所述的方法,其中,不干燥皮膚或不粗糙皮膚的組優(yōu)選為皮膚干燥得分為1.5以下的人的組,更優(yōu)選為皮膚干燥得分為1以下的人的組。
<9>根據(jù)<5>~<8>中任一項(xiàng)所述的方法,其中,優(yōu)選進(jìn)一步包括將被試者的皮膚細(xì)胞中的AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平與參照值1或參照值2比較。
<10>根據(jù)<9>所述的方法,其中,優(yōu)選進(jìn)一步包括在被試者的皮膚細(xì)胞中的AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平等于或低于參照值1時(shí),將被試者的皮膚評(píng)價(jià)為處于干燥狀態(tài)或是粗糙皮膚。
<11>根據(jù)<9>所述的方法,其中,優(yōu)選進(jìn)一步包括在被試者的皮膚細(xì)胞中的AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平等于或高于參照值2時(shí),將被試者的皮膚評(píng)價(jià)為不處于干燥狀態(tài)或不是粗糙皮膚。
<12>根據(jù)<9>所述的方法,其中,優(yōu)選進(jìn)一步包括在被試者的皮膚細(xì)胞中的AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平為參照值2的50%以下、優(yōu)選為30%以下、更優(yōu)選為25%以下時(shí),將被試者的皮膚評(píng)價(jià)為處于干燥狀態(tài)或是粗糙皮膚。
<13>根據(jù)<1>~<12>中任一項(xiàng)所述的方法,其中,皮膚細(xì)胞優(yōu)選為活表皮細(xì)胞。
<14>根據(jù)<1>~<13>中任一項(xiàng)所述的方法,其中,上述AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平的測(cè)定優(yōu)選為:利用實(shí)時(shí)RT-PCR法、RNA酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)或Northern印跡分析的AGR2和/或AGR3的mRNA定量測(cè)定;或者利用RIA法、EIA法、ELISA、生物檢定法、蛋白質(zhì)組或免疫印跡的AGR2蛋白質(zhì)和/或AGR3蛋白質(zhì)的表達(dá)水平的測(cè)定。
<15>一種評(píng)價(jià)或選擇干燥皮膚改善劑的方法,其中,所述方法包括以下的(A)~(D):
(A)將試驗(yàn)物質(zhì)向被試者或被試動(dòng)物給藥;
(B)測(cè)定從被試者或被試動(dòng)物采集的皮膚細(xì)胞中的AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平;
(C)將上述(B)中測(cè)定的表達(dá)水平與從沒有將所述試驗(yàn)物質(zhì)給藥的被試者或被試動(dòng)物采集的皮膚細(xì)胞中的AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平比較;和
(D)基于上述(C)的結(jié)果,評(píng)價(jià)所述試驗(yàn)物質(zhì)的提高AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平的效果。
<16>根據(jù)<15>所述的方法,其中,所述皮膚細(xì)胞優(yōu)選為活表皮細(xì)胞。
<17>根據(jù)<15>或<16>所述的方法,其中,優(yōu)選進(jìn)一步包括以下的(E)基于所述(D)中的評(píng)價(jià),將所述(D)中提高AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平的試驗(yàn)物質(zhì)選擇作為干燥皮膚改善劑。
<18>根據(jù)<15>~<17>中任一項(xiàng)所述的方法,其中,從沒有將所述試驗(yàn)物質(zhì)給藥的被試者或被試動(dòng)物采集的皮膚細(xì)胞優(yōu)選選自以下:
(1)在將試驗(yàn)物質(zhì)給藥前從相同的被試者或被試動(dòng)物采集的皮膚細(xì)胞;
(2)相同的被試者或被試動(dòng)物中從沒有將試驗(yàn)物質(zhì)給藥的皮膚區(qū)域或?qū)?duì)照物質(zhì)給藥的皮膚區(qū)域采集的皮膚細(xì)胞;和
(3)從沒有將試驗(yàn)物質(zhì)給藥的其它的被試者或被試動(dòng)物采集的皮膚細(xì)胞。
<19>根據(jù)<15>~<18>中任一項(xiàng)所述的方法,其中,優(yōu)選在所述(B)中測(cè)得的表達(dá)水平相比從沒有將試驗(yàn)物質(zhì)給藥的被試者或被試動(dòng)物采集的皮膚細(xì)胞中的表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著地增加時(shí),將所述試驗(yàn)物質(zhì)評(píng)價(jià)為具有提高AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平的效果。
<20>根據(jù)<15>~<18>中任一項(xiàng)所述的方法,其中,優(yōu)選在將從沒有將試驗(yàn)物質(zhì)給藥的被試者或被試動(dòng)物采集的皮膚細(xì)胞中的表達(dá)水平視作100%并且上述(B)中測(cè)得的表達(dá)水平為105%以上、優(yōu)選為110%以上、更優(yōu)選為120%以上時(shí),將所述試驗(yàn)物質(zhì)評(píng)價(jià)為具有提高AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平的效果。
<21>一種評(píng)價(jià)或選擇干燥皮膚改善劑的方法,其中,所述方法包括以下的(A’)~(D’):
(A’)使試驗(yàn)物質(zhì)接觸能夠表達(dá)AGR2和/或AGR3的來(lái)自哺乳動(dòng)物的組織或細(xì)胞;
(B’)測(cè)定所述組織或細(xì)胞中的AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平;
(C’)將上述(B’)中測(cè)定的表達(dá)水平與對(duì)照組中的AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平比較;和
(D’)基于上述(C’)的結(jié)果,評(píng)價(jià)所述試驗(yàn)物質(zhì)的提高AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平的效果。
<22>根據(jù)<21>所述的方法,其中,優(yōu)選進(jìn)一步包括以下的(E’)基于所述(D’)中的評(píng)價(jià),將所述(D’)中提高AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平的試驗(yàn)物質(zhì)選擇作為干燥皮膚改善劑。
<23>根據(jù)<21>或<22>所述的方法,其中,上述能夠表達(dá)AGR2和/或AGR3的來(lái)自哺乳動(dòng)物的組織或細(xì)胞優(yōu)選選自以下:
(1)分離的皮膚組織或分離的皮膚細(xì)胞、或其培養(yǎng)物;
(2)分離的活表皮細(xì)胞、或其培養(yǎng)物;
(3)腸細(xì)胞系、乳腺癌細(xì)胞系或卵巢癌細(xì)胞系;和
(4)以AGR2基因或AGR3基因或者AGR2蛋白質(zhì)或AGR3蛋白質(zhì)表達(dá)的方式進(jìn)行了基因改變的哺乳動(dòng)物的組織或細(xì)胞、或其培養(yǎng)物。
<24>根據(jù)<21>~<23>中任一項(xiàng)所述的方法,其中,對(duì)照組優(yōu)選選自以下:
(1)能夠表達(dá)AGR2和/或AGR3的來(lái)自哺乳動(dòng)物的組織或細(xì)胞,其中,該組織或細(xì)胞沒有接觸過試驗(yàn)物質(zhì);
(2)天然地不具有或幾乎不具有AGR2和/或AGR3表達(dá)能力的來(lái)自哺乳動(dòng)物的組織或細(xì)胞;
(3)以AGR2和/或AGR3不表達(dá)的方式進(jìn)行過改變的能夠表達(dá)AGR2和/或AGR3的來(lái)自哺乳動(dòng)物的組織或細(xì)胞;和
(4)接觸過試驗(yàn)物質(zhì)的(2)或(3)的組織或細(xì)胞。
<25>根據(jù)<21>~<24>中任一項(xiàng)所述的方法,其中,優(yōu)選在上述(B’)中測(cè)得的表達(dá)水平相比上述對(duì)照組的表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著地增加時(shí),將所述試驗(yàn)物質(zhì)評(píng)價(jià)為具有提高AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平的效果。
<26>根據(jù)<21>~<24>中任一項(xiàng)所述的方法,其中,優(yōu)選在將上述對(duì)照組中表達(dá)水平視作100%并且上述(B’)中測(cè)得的表達(dá)水平為105%以上、優(yōu)選為110%以上、更優(yōu)選為120%以上時(shí),將所述試驗(yàn)物質(zhì)評(píng)價(jià)為具有提高AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平的效果。
<27>根據(jù)<15>~<26>中任一項(xiàng)所述的方法,其中,上述AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平的測(cè)定優(yōu)選為:利用實(shí)時(shí)RT-PCR法、RNA酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)或Northern印跡分析的AGR2和/或AGR3的mRNA定量測(cè)定;或者利用RIA法、EIA法、ELISA、生物檢定法、蛋白質(zhì)組或免疫印跡的AGR2蛋白質(zhì)和/或AGR3蛋白質(zhì)的表達(dá)水平的測(cè)定。
<28>根據(jù)<15>~<27>中任一項(xiàng)所述的方法,其中,所述干燥皮膚改善劑是由皮膚干燥而導(dǎo)致的粗糙皮膚的改善劑。
<29>根據(jù)<28>所述的方法,其中,由皮膚干燥而導(dǎo)致的粗糙皮膚選自干性皮膚、敏感皮膚、皮膚干燥癥、老年性皮膚干燥癥、魚鱗癬以及干性濕疹。
<30>作為被試者的皮膚干燥狀態(tài)的指標(biāo)的AGR2和/或AGR3的用途。
<31>根據(jù)<30>所述的用途,其中,AGR2和AGR3優(yōu)選組合使用。
<32>根據(jù)<30>或<31>所述的用途,其中,優(yōu)選將AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平用作指標(biāo),更優(yōu)選將ARG2和/或AGR3的mRNA水平或者AGR2蛋白質(zhì)和/或AGR3蛋白質(zhì)的表達(dá)水平用作指標(biāo)。
實(shí)施例
以下,通過其實(shí)施例來(lái)更具體地說(shuō)明本發(fā)明。
(樣品)
通過鉆取活組織檢查從居住于美國(guó)的白種健康女性(20~40歲)中的7名有干性皮膚癥狀的人和6名健康人的小腿部位采集皮膚組織,并用作樣品。
(實(shí)施例1)
皮膚組織中的AGR2和AGR3的表達(dá)模式的比較
將作為樣品采集的皮膚組織埋入OCT化合物(Sakura Tissue Tek)并冷凍。其后,用低溫切片機(jī)制作厚度為7μm的切片,將組織切片用冷卻的丙酮固定。其后,用Protein Block Serum-Free Ready to Use(Dako)抑制非特異性結(jié)合。初級(jí)抗原:將抗AGR2(Anti-AGR2)(abcam)或抗AGR3(Anti-AGR3)(abcam)稀釋于Can get signal溶液(TOYOBO)中,培養(yǎng)1小時(shí)。其后,二次抗原:將Alexa555抗兔(Life Technologies)和Alexa555抗小鼠(Life Technologies)稀釋于Can get signal溶液中,培育30分鐘以可視化。
將結(jié)果示于圖1中。AGR2和AGR3在皮膚的活表皮細(xì)胞區(qū)域的上部局部存在并表達(dá)。雖然AGR2和AGR3的局部存在區(qū)域在健康人與有干性皮膚的人之間沒有差異,但是有干性皮膚的人中表達(dá)強(qiáng)度顯著較弱。
(實(shí)施例2)
皮膚組織中的AGR2和AGR3的表達(dá)水平的比較
將作為樣品采集的皮膚組織(7名有干性皮膚的人和6名健康人)浸漬于中性蛋白酶液中,分離成表皮和真皮。將得到的表皮組織浸漬于RNA later(QIAGEN)中,并保存于-80℃直至使用。其后,使用RNeasy(注冊(cè)商標(biāo))Mini Kit(QIAGEN)提取總RNA。測(cè)定總RNA的濃度,使用一定量的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。將高容量RNA-to-cDNA試劑盒(High capacity RNA-to-cDNA kit)(Applied Biosystems)用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。由得到的cDNA通過實(shí)時(shí)PCR定量測(cè)定AGR2和AGR3的mRNA表達(dá)。將Taqman(注冊(cè)商標(biāo))探針(AGR2:Hs00180702_m1,AGR3:Hs00411286_m1,Applied Biosystems)用于定量測(cè)定,將PRISM 7500(Applied Biosystems)用于檢測(cè)和定量。在20μL的反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR,擴(kuò)增條件是95℃下15秒的變性反應(yīng),在60℃下1分鐘的退火和延伸反應(yīng)。每個(gè)基因的表達(dá)水平利用RPLP0(Hs99999902_m1,Applied Biosystems)的表達(dá)水平校正,作為將健康人中AGR2和AGR3的各個(gè)平均表達(dá)水平視作1的情況下的相對(duì)值來(lái)表示。
將結(jié)果示于圖2中。有干性皮膚的人的皮膚中的AGR2和AGR3的表達(dá)水平相比健康人顯著地降低。
(實(shí)施例3)
AGR2和AGR3的表達(dá)水平與皮膚干燥的程度的相關(guān)性
調(diào)查被試者(13人)的皮膚干燥得分和角質(zhì)層電導(dǎo)系數(shù)。作為皮膚干燥得分,利用5個(gè)等級(jí)(0:不干燥、1:觀察到稍微脫皮、2:觀察到中等脫皮和/或死皮、3:觀察到明顯的死皮和/或稍微開裂、4:觀察到嚴(yán)重的死皮和/或開裂)由2名評(píng)價(jià)者目視評(píng)價(jià)目標(biāo)位置的干燥狀態(tài),獲得平均值。通過Skicon200EX(IBS Inc.)測(cè)定角質(zhì)層電導(dǎo)系數(shù)。利用鉆取活組織檢查從各個(gè)被試者采集小腿部位的皮膚組織。通過與實(shí)施例2相同的步驟,從采集的皮膚組織中分離表皮組織,提取總RNA,通過RT-PCR定量測(cè)定mRNA表達(dá)水平,用RPLP0表達(dá)水平校正測(cè)得的值,然后測(cè)定AGR2和AGR3的各表達(dá)水平。通過斯皮爾曼等級(jí)相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)(Spearman’s rank correlation coefficient test),關(guān)于來(lái)自各被試者測(cè)定的AGR2和AGR3的各表達(dá)水平,分別獲得皮膚干燥得分與角質(zhì)層電導(dǎo)系數(shù)間的相關(guān)系數(shù)。將結(jié)果示于表1中。AGR2和AGR3兩者的表達(dá)水平都明顯與作為皮膚干燥狀態(tài)的指標(biāo)的皮膚干燥得分和角質(zhì)層電導(dǎo)系數(shù)相關(guān)。因此,這表示AGR2和/或AGR3的表達(dá)水平是表明皮膚干燥狀態(tài)的指標(biāo)。
[表1]
(實(shí)施例4)
保濕劑的AGR2基因表達(dá)水平促進(jìn)作用的分析
在37℃、5%CO2的條件下使用EpiLife(注冊(cè)商標(biāo))(由Kurabo購(gòu)得)培養(yǎng)正常人表皮細(xì)胞(NHEK)。將細(xì)胞以1×105細(xì)胞播種于12孔板中并培養(yǎng)48小時(shí),然后,用無(wú)血清培養(yǎng)基交換培養(yǎng)基。進(jìn)一步,將作為已知的干燥皮膚改善劑的維生素D3(99.5%乙醇溶液,最終濃度為1nM或10nM)(Nutrients,4(9):1213-8,2012)、桉樹提取物(50%乙醇溶液,最終濃度為0.001%)(J Cosmet Dermatol,12(1):3-11,2013)、作為桉樹提取物的主要生理活性物質(zhì)的大果桉醛(macrocarpal)(50%乙醇溶液,最終濃度為10nM)(Int J Cosmet Sci,34(1):17-22,2012)或者99.5%乙醇或50%乙醇作為對(duì)照添加至培養(yǎng)基中。培養(yǎng)72小時(shí)之后,使用RNeasy(注冊(cè)商標(biāo))Mini Kit(QIAGEN)從細(xì)胞中提取總RNA。測(cè)定總RNA的濃度,并且使用一定量的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。將高容量RNA-to-cDNA試劑盒(Applied Biosystems)用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。由得到的cDNA通過實(shí)時(shí)PCR定量測(cè)定AGR2的mRNA表達(dá)。將Taqman(注冊(cè)商標(biāo))探針(AGR2:Hs00180702_m1,Applied Biosystems)用于定量測(cè)定,將PRISM 7500(Applied Biosystems)用于檢測(cè)和定量測(cè)定。在20μL的反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR,擴(kuò)增條件是95℃下15秒的變性反應(yīng),在60℃下1分鐘的退火和延伸反應(yīng)。利用RPLP0(Hs99999902_m1,Applied Biosystems)的表達(dá)水平校正mRNA表達(dá)水平,作為將對(duì)照(僅99.5%EtOH溶劑)的AGR2的平均表達(dá)水平視作1的情況下的相對(duì)值來(lái)表示。
將結(jié)果示于圖3和表2中。在維生素D3、桉樹提取物和大果桉醛中,相比對(duì)照AGR2表達(dá)提高。
[表2]