本發(fā)明涉及用于甲狀腺腫瘤分類的方法。本發(fā)明尤其涉及與特定甲狀腺腫瘤相關(guān)的微RNA分子。發(fā)明背景甲狀腺結(jié)節(jié)的準(zhǔn)確診斷持續(xù)挑戰(zhàn)著治療甲狀腺疾病患者的醫(yī)生。通常對(duì)具有細(xì)胞學(xué)上未定類結(jié)節(jié)的患者進(jìn)行診斷性手術(shù)，盡管大部分這些結(jié)節(jié)術(shù)后證實(shí)為良性。FNA細(xì)胞學(xué)在術(shù)前診斷的這種限制導(dǎo)致臨床需要可靠的術(shù)前分子標(biāo)記以區(qū)分良性甲狀腺結(jié)節(jié)和惡性甲狀腺結(jié)節(jié)。微RNA(miR)是一類重要的調(diào)控RNA，其對(duì)于廣泛的生物過程具有深遠(yuǎn)影響。這些小的(通常為18至24個(gè)核苷酸長(zhǎng)度)非編碼RNA分子可以通過促進(jìn)RNA降解、抑制mRNA翻譯并且還通過影響基因轉(zhuǎn)錄而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)模式。miR在多種過程例如發(fā)育和分化、控制細(xì)胞增殖、應(yīng)激反應(yīng)和新陳代謝中起到關(guān)鍵作用。在多種人體癌癥中發(fā)現(xiàn)許多miR的表達(dá)被修改，在一些情況下表明這種修改可以為腫瘤發(fā)展的成因。甲狀腺由兩種主要類型的細(xì)胞形成：濾泡細(xì)胞和C細(xì)胞或?yàn)V泡旁細(xì)胞。濾泡細(xì)胞產(chǎn)生甲狀腺激素，其為人體新陳代謝的調(diào)節(jié)劑。甲狀腺激素的過量產(chǎn)生(甲狀腺功能亢進(jìn))引起快速的或不規(guī)則的心跳、睡眠問題、神經(jīng)質(zhì)、饑餓、體重減輕和太過溫暖的感覺。相反，甲狀腺功能減退會(huì)引起新陳代謝放緩、疲勞和體重增加。甲狀腺激素的釋放通過由腦下垂體產(chǎn)生的促甲狀腺激素(TSH)調(diào)節(jié)。C細(xì)胞產(chǎn)生降血鈣素，其為負(fù)責(zé)鈣的使用的激素。淋巴細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞也存在于甲狀腺中。甲狀腺癌在美國(guó)是第八大最常見的癌癥，是在美國(guó)最快速增加的癌癥，每年有超過60000的新診斷案例，在2014年引起約1800人死亡。甲狀腺癌表現(xiàn)為可觸及的甲狀腺結(jié)節(jié)。不同類型的甲狀腺腫瘤發(fā)展自不同類型的細(xì)胞，其為嚴(yán)重性和最佳施用療法的決定因素。甲狀腺中的多數(shù)贅生物和腫瘤是良性的(非癌性的)，然而其他是惡性的(癌性的)。大約95％的甲狀腺癌為由甲狀腺濾泡細(xì)胞產(chǎn)生的分化型甲狀腺癌(DTC)。DTC有兩個(gè)組織學(xué)亞型：乳頭狀甲狀腺癌(PTC)型(90％至95％)和濾泡性甲狀腺癌(FTC)型(5％至10％)。診斷甲狀腺癌最常用的方法為通過細(xì)針穿刺(FNA)的活組織檢查。將FNA樣本進(jìn)行細(xì)胞學(xué)的常規(guī)檢查以確定結(jié)節(jié)是良性的或是惡性的。取決于機(jī)構(gòu)和醫(yī)生，F(xiàn)NA樣本細(xì)胞學(xué)檢查的敏感性和特異性分別為68％至98％和72％至100％。不幸的是，在采集的FNA標(biāo)本的情況中至少25％或不足以進(jìn)行診斷或無法通過細(xì)胞學(xué)確定。在現(xiàn)有的醫(yī)療實(shí)踐中，未確定結(jié)果的多數(shù)患者經(jīng)歷手術(shù)，并承受手術(shù)過程的所有風(fēng)險(xiǎn)和后果。隨訪結(jié)果顯示僅有25％的手術(shù)患者診斷患有癌癥，這意味著75％的患者經(jīng)受了不必要的手術(shù)過程。當(dāng)檢測(cè)細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記或基因標(biāo)記時(shí)，沒有能夠獨(dú)自提供可靠結(jié)果的獨(dú)特標(biāo)記以替代甲狀腺病變的形態(tài)學(xué)診斷。US7319011描述了檢測(cè)在測(cè)試濾泡性甲狀腺標(biāo)本中的基因DDIT3、ARG2、ITM1、C1orf24、TARSH和ACO1中的任一個(gè)的表達(dá)以區(qū)分濾泡性腺瘤(FA)和濾泡性癌(FC)。US7670775描述了CCND2、PCSK2和PLAB的表達(dá)分析以鑒別惡性甲狀腺組織。US6723506描述了與診斷和治療甲狀腺濾泡性癌有關(guān)的PAX8-PPAR1分子的分子表征。US7378233描述了在乳頭狀甲狀腺癌的24例(69％)中出現(xiàn)BRAF基因的T1796A突變。在尋求會(huì)克服未定類細(xì)胞學(xué)的不確定性并最終消除對(duì)非癌患者的不必要手術(shù)的分子診斷測(cè)試方面已經(jīng)進(jìn)行了不斷努力[Chen,Y.T.等人.(2008)Mod.Pathol.21,1139–1146；He,H.等人.(2005)Proc.NatlAcad.Sci.USA102,19075–19080；Nikiforova,M.N.等人.(2009)Endocr.Pathol.20,85–91；Pallante,P.等人.(2006)Endocr.Relat.Cancer13,497–508；Nikiforova,M.N.等人.(2008)J.Clin.Endocrinol.Metab.93,1600–1608；Visone,R.等人.(2007)Endocr.Relat.Cancer14(3):791-8；US2014/0030714A1；US8541170；US2012/0220474A1；US8465914；US7598052；US8202692；WO2013/066678；WO2012/129378；US2013/0237590；EP2772550A1；Pallante等人.(2010)Endocrine-RelatedCancer17F91-F104；Dettmer等人.(2014)JMolEndocrinol.Mar6；52(2):181-9]。盡管如此，仍存在大量挑戰(zhàn)。開發(fā)不僅具有高敏感性和特異性、還能夠處理無法進(jìn)行細(xì)胞學(xué)分析而被列入未定類樣品類別的樣本的分子試驗(yàn)有很大的必要性。本發(fā)明提供了對(duì)該挑戰(zhàn)的解決方案。發(fā)明概述本發(fā)明人研發(fā)了新的整合技術(shù)平臺(tái)用于分析和表征甲狀腺臨床樣本中的微RNA，其包括一般由手術(shù)獲得的切除的活組織檢查和一般由細(xì)針穿刺(FNA)獲得的細(xì)胞學(xué)標(biāo)本，用于將甲狀腺病變分類為良性或惡性及其亞型。公開了作為潛在生物標(biāo)記的新型微RNA。因此，在第一方面，本發(fā)明提供了甲狀腺病變樣本的分類方法，該方法包括以下步驟：a.從有需要的受試者中獲得甲狀腺病變樣本；b.測(cè)量樣本中至少四種核酸的表達(dá)水平，所述核酸包含SEQIDNO1至SEQIDNO308的序列、其變體或具有與其至少約80％一致性的序列；c.確定核酸表達(dá)譜；d.對(duì)核酸表達(dá)譜應(yīng)用分類器算法：e.基于應(yīng)用于所述樣本的核酸表達(dá)譜的算法結(jié)果，將所述甲狀腺病變分類為良性腫瘤、惡性腫瘤、或良性腫瘤或惡性腫瘤的亞型。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方式中，在步驟(b)或(c)之后還包括獲得至少一對(duì)核酸表達(dá)水平的比例德步驟；其中在步驟(d)中所述分類器算法可應(yīng)用于核酸表達(dá)譜、至少一對(duì)核酸的所述比例、或其組合中的任一個(gè)。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方式中，所述核酸序列包含SEQIDNO.1至SEQIDNO.37中任一的序列、其變體、或具有與其至少約80％一致性的序列。在本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述核酸序列包含SEQIDNO.1至SEQIDNO.25中任一的序列、其變體、或具有與其至少約80％一致性的序列。在本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述甲狀腺病變樣本通過細(xì)針穿刺(FNA)活組織檢查獲得。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述樣本為來自FNA活組織檢查的涂片。在本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述甲狀腺病變?yōu)樾∮?cm的結(jié)節(jié)。在本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方式中，算法為機(jī)器學(xué)習(xí)型算法。在本發(fā)明所述方法的一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述算法還使核酸表達(dá)譜結(jié)合來自所述樣本的臨床數(shù)據(jù)或基因數(shù)據(jù)。在本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方式中，在步驟(b)之后當(dāng)至少一種所述核酸的表達(dá)水平低于或高于甲狀腺細(xì)胞的閾值時(shí)，基于所述核酸的表達(dá)水平將所述樣本舍棄。在本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述樣本具有少于50個(gè)甲狀腺細(xì)胞。在本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方式中，通過雜交、擴(kuò)增或者下一代測(cè)序方法實(shí)施所述測(cè)量。在本發(fā)明方法的一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述雜交包括使樣本接觸探針，其中探針包括(i)微RNA的DNA等同物，(ii)其互補(bǔ)物，(iii)與(i)或(ii)至少80％一致性的序列，或(iv)與SEQIDNO.1至SEQIDNO.25中的任一種的至少八個(gè)連續(xù)核苷酸雜交的核酸序列。在本發(fā)明方法的另一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述探針連接于固體載體。在本發(fā)明方法的另一個(gè)具體實(shí)施方式中，擴(kuò)增為實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，所述RT-PCR擴(kuò)增方法包括正向引物和反向引物，任選地包括用探針進(jìn)行雜交。在本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法還包括根據(jù)所述甲狀腺病變?yōu)榱夹曰驉盒韵蛩鍪茉囌呤┯貌町惢委煛Ｔ诒景l(fā)明方法的另一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述病變?yōu)閻盒缘模鲋委煘槭中g(shù)、化療、放療、激素療法或任意其他推薦治療中的任一種。在另一方面，本發(fā)明提供用于將甲狀腺病變樣本分類的方案，該方案包括以下步驟：a.從有需要的受試者中獲得甲狀腺病變樣本；b.測(cè)量樣本中至少四種核酸的水平，所述核酸包含序列SEQIDNO.1至SEQIDNO.308、其變體或具有至少80％與其一致性的序列；c.確定在所述樣本中與特定細(xì)胞類型有關(guān)的核酸表達(dá)；d.其中(i)至少一種非甲狀腺細(xì)胞標(biāo)記的核酸的表達(dá)水平在閾值以上確定該樣本被舍棄；或(ii)非甲狀腺細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)水平在閾值以下確定該樣本繼續(xù)進(jìn)行步驟(e)用于進(jìn)一步分析；e.當(dāng)樣本未在步驟(d)中被舍棄時(shí)，確定核酸表達(dá)譜；f.對(duì)微RNA表達(dá)譜應(yīng)用分類器算法；g.基于應(yīng)用于所述樣本的核酸表達(dá)譜的算法結(jié)果，將所述甲狀腺病變分類為良性腫瘤、惡性腫瘤、或良性腫瘤或惡性腫瘤的亞型。在本發(fā)明方案的一個(gè)實(shí)施方式中，在步驟(b)之后還包括獲得至少一對(duì)核酸表達(dá)水平比例的步驟；其中在步驟(f)中所述分類器算法可以應(yīng)用于核酸表達(dá)譜、至少一對(duì)核酸的所述比例或其組合中的任一個(gè)。在本發(fā)明方案的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述核酸序列包含SEQIDNO.1至SEQIDNO.37中任一的序列、其變體或具有與其至少約80％一致性的序列。在本發(fā)明方案的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述核酸序列包含SEQIDNO.1至SEQIDNO.25中任一的序列、其變體或具有與其至少80％一致性的序列。在本發(fā)明方案的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述甲狀腺病變樣本通過細(xì)針穿刺(FNA)活組織檢查獲得。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述樣本為來自FNA活組織檢查的涂片。在本發(fā)明方案的另一實(shí)施方式中，所述甲狀腺病變?yōu)樾∮?cm的結(jié)節(jié)。在本發(fā)明方案的另一實(shí)施方式中，所述樣本具有少于50個(gè)甲狀腺細(xì)胞。在本發(fā)明方案的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述算法為機(jī)器學(xué)習(xí)型算法。在本發(fā)明方案的另一個(gè)實(shí)施方案中，通過雜交、擴(kuò)增或者下一代測(cè)序方法實(shí)施測(cè)量。在另一方面，本發(fā)明提供了用于甲狀腺腫瘤分類的工具盒，所述試劑盒包含：a.用于進(jìn)行甲狀腺腫瘤分類的探針，其中所述探針包含以下任一個(gè)：(i)包含序列SEQIDNO1至SEQIDNO308中至少一種的微RNA的DNA等同物，(ii)其互補(bǔ)物；(iii)與(i)或(ii)至少80％一致性的序列，(iv)與SEQIDNO1至SEQIDNO182中任一種的至少八個(gè)連續(xù)核苷酸雜交的核酸序列，或者(v)與RT-PCR產(chǎn)物雜交的核酸序列；任選地b.用于使用所述探針的說明書。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述試劑盒還包含正向PCR引物和反向PCR引物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的試劑盒可包含正向引物和反向引物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的試劑盒還可以包含用于進(jìn)行原位雜交分析的試劑。在本發(fā)明的另一方面，用于甲狀腺腫瘤分類的試劑盒包含：(a)至少一種正向RT-PCR引物，例如包含序列SEQIDNO.270至SEQIDNO.293的引物中的至少一種；(b)反向引物；(c)與由RT-PCR擴(kuò)增的分子進(jìn)行雜交的至少一種探針，例如在實(shí)施例中提供的探針；任選地(d)用于實(shí)施所述RT-PCR的說明書、或用于甲狀腺腫瘤分類的說明書中的任一種。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述探針為普通探針。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述探針為微RNA序列特異性探針。在另一方面，本發(fā)明提供了分離核酸，所述核酸包含與SEQIDNO.27至SEQIDNO.29、SEQIDNO.33、SEQIDNO.34、SEQIDNO.139、SEQIDNO.140、SEQIDNO.307和SEQIDNO.308中的任一序列至少80％一致性的至少12個(gè)連續(xù)核苷酸。在另一方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含本文描述的分離核酸作為活性劑，和任選的輔料、載體、稀釋劑和賦形劑。因此，所述核酸分子可作為活性劑包含于藥物組合物、制劑或藥劑中。在另一方面，本發(fā)明提供了包含本文描述的分離核酸的載體。在另一方面，本發(fā)明提供了包含本文描述的分離核酸的探針。在另一方面，本發(fā)明提供了包含本文描述的分離核酸的生物芯片。在另一方面，本發(fā)明提供了本文描述的分離核酸在藥劑制備中的用途。附圖說明圖1：在Giemsa染色的乳頭狀癌(Pap-carc.)涂片和非乳頭狀癌(N-Pap-carc.)涂片中的微RNA表達(dá)。散點(diǎn)圖顯示來自Giemsa染色的乳頭狀癌涂片(y軸，n＝1)相對(duì)于Giemsa染色的非乳頭狀癌涂片(x軸，n＝1)的微RNA(miR)差異化表達(dá)。如通過微陣列所測(cè)量的，數(shù)據(jù)以歸一化熒光單位顯示。平行線描述在任一方向的樣品之間的1.5倍變化。在兩個(gè)樣品中，灰十字表示未測(cè)試(NT)的對(duì)照探針或中值信號(hào)<300。在乳頭狀癌涂片中上調(diào)五種微RNA(hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-21-5p和hsa-miR-31-5p)。圖2A至2B：通過下一代測(cè)序檢測(cè)的新型微RNA。圖2A顯示在甲狀腺組織中檢測(cè)的兩種新型微RNA、MD2-495(上)和MD2-437(下)預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。圖2B顯示在11個(gè)切除的甲狀腺樣本中的每一個(gè)中兩種新型微RNA的表達(dá)。圖3A至3B：惡性樣本中的微RNA表達(dá)相對(duì)于良性樣本中的微RNA表達(dá)。散點(diǎn)圖顯示在惡性結(jié)節(jié)中微RNA(y軸)的中值表達(dá)水平相對(duì)于良性結(jié)節(jié)中微RNA(x軸)的中值表達(dá)水平，微RNA包括miR-125b-5p、miR-222-3p和miR-146b-5p(高亮)。每個(gè)十字表示微RNA，并包括對(duì)照的序列、低表達(dá)的微RNA和不可靠的探針(NT)。虛線表示1.5倍。圖3A顯示了在組I中的分析。圖3B顯示了在組II中的分析。圖4：MiR-375在髓樣病變中的表達(dá)。該圖顯示miR-375在髓樣病變(菱形，Med)中的表達(dá)對(duì)比于在惡性非髓樣病變(方形，Mal-n-med)中的表達(dá)以及在良性病變中的表達(dá)(圓形，B)。線表示每組的中值表達(dá)。p值＝1.2e-42。倍數(shù)變化＝201.4。圖5A至5B：可以用不同染料染色樣本，可以檢測(cè)微RNA。該圖顯示在用不同染料染色的惡性樣本(M)或良性樣本(B)中miR-146b-5p的中值表達(dá)水平。圖5A顯示用May-GrünwaldGiemsa染色的樣本中miR表達(dá)對(duì)比于用DiffQuik染色的樣本中miR表達(dá)。p值＝0.18(Wilcoxon)。倍數(shù)變化中值(med.f-ch)＝1.0。圖5B顯示用DiffQuik染色的樣本中miR表達(dá)對(duì)比于在Papanicolaou染色的樣本中miR表達(dá)。p值＝0.56(Wilcoxon)。倍數(shù)變化中值(med.f-ch)＝1.1。圖6A至6B：Hurthle細(xì)胞標(biāo)記。該圖顯示了相對(duì)于沒有Hurthle細(xì)胞指示的濾泡性腺瘤，在顯示Hurthle細(xì)胞的濾泡性腺瘤中的MID-16582表達(dá)更高。Sign.＝顯著的；Diff.＝差異的；f-ch＝倍數(shù)變化；Bl.＝血液；NT，未測(cè)試。圖6A：y軸和x軸顯示在未記錄為具有Hurthle細(xì)胞的FA(濾泡性腺瘤)樣本(n＝22)中miR的表達(dá)水平的中值數(shù)組相對(duì)于具有Hurthle細(xì)胞的FA樣本(n＝9)中miR的表達(dá)水平的中值數(shù)組。虛線系數(shù)線＝×1.5。Bl.＝血液。NT，未測(cè)試。圖6B：y軸和x軸顯示在未顯示Hurthle細(xì)胞的FA樣本(n＝21)中miR的PCR表達(dá)水平的中值相對(duì)于具有Hurthle細(xì)胞指示的FA樣本(n＝9)中miR的PCR表達(dá)水平的中值。虛線系數(shù)線＝±0.6。圖7：具有微RNA的甲狀腺檢測(cè)組的惡性樣本和良性樣本的曲線圖。x軸和y軸分別顯示在良性(B)樣本(n＝166)中miR的表達(dá)水平相對(duì)于在惡性(M)樣本(n＝187)中miR的表達(dá)水平。hsa-miR-222-3p(SEQIDNO.1至SEQIDNO.2)、hsa-miR-551b-3p(SEQIDNO.3至SEQIDNO.4)、hsa-miR-31-5p(SEQIDNO.5至SEQIDNO.7)、hsa-miR-125b-5p(SEQIDNO.9)、hsa-miR-146b-5p(SEQIDNO.10至SEQIDNO.11)、hsa-miR-152-3p(SEQIDNO.12至SEQIDNO.13)、hsa-miR-346(SEQIDNO.14)、hsa-miR-181c-5p(SEQIDNO.15)、hsa-miR-424-3p(SEQIDNO.16)、和hsa-miR-375(SEQIDNO.8)的微RNA中值表達(dá)水平為高亮的。數(shù)量指(50-歸一化的Ct值)。菱形(◆)表示正規(guī)化子。Sign.＝顯著的；Diff.＝差異的；f-ch＝倍數(shù)變化。虛線系數(shù)線＝±0.6。圖8A至8C：使用微RNA表達(dá)值，將判別式分析分類器用于分類惡性(菱形，M)樣本和良性(方形，B)樣本。圖8A：兩種微RNA(hsa-miR-551b-3p和hsa-miR-146b-5p)的歸一化值用作分類的特征。該分類器的敏感性為84.8％且特異性為68.9％?；疑幱皡^(qū)域標(biāo)記其中樣本被分類器確定分類為惡性的空白。圖8B：三種微RNA(hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-146b-5p和hsa-miR-31-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為82.9％且特異性為72.2％。分類錯(cuò)誤的樣本(miscl.)由點(diǎn)表示。圖8C：8種微RNA(hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-375、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-152-3p、hsa-miR-181c-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸顯示正確診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為83.5％且特異性為81.5％。圖9A至9C：使用微RNA表達(dá)比例的歸一化值，判別式分析分類器用于將惡性(菱形，M)樣本和良性(方形，B)樣本分類。圖9A：兩種微RNA比例(hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p和hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為78％且特異性為79.5％?；疑幱皡^(qū)域標(biāo)記其中樣本被分類器確定分類為惡性的空白。圖9B：三種微RNA比例(hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-138-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為81.1％且特異性為82.1％。分類錯(cuò)誤的樣本(miscl.)由點(diǎn)表示。圖9C：8種微RNA比例(hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-138-5p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-222-3p:hsa-miR-486-5p、hsa-miR-200c-3p:hsa-miR-486-5p、MID-16582:hsa-miR-200c-3p、MID-16582:hsa-miR-138-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸顯示正確診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為74.4％且特異性為84.1％。圖10A至10C：使用微RNA和微RNA比例的組合的歸一化值，判別式分析分類器用于將惡性(菱形，M)樣本和良性(方形，B)樣本分類。圖10A：一種微RNA比例和一種微RNA(hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-551b-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為82.9％且特異性為82.8％?；疑幱皡^(qū)域標(biāo)記其中樣本被分類器確定分類為惡性的空白。圖10B：一種微RNA比例和兩種微RNA(hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-146b-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為82.9％且特異性為82.8％。圖10C：5種微RNA和3種微RNA比例(hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-138-5p、hsa-miR-375)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示了其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸顯示正確診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為93.3％且特異性為42.4％。圖11A至11C：使用微RNA的歸一化值，K最近鄰算法(KNN)分類器用于將惡性(M)樣本和良性(B)樣本分類。圖11A：6種微RNA(hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-375、hsa-miR-125b-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示了其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸顯示正確診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為82.3％且特異性為68.2％。圖11B：8種微RNA(hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-375、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-152-3p、hsa-miR-181c-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示了其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸顯示正確診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為82.9％且特異性為74.2％。圖11C:12種微RNA(hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-375、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-152-3p、hsa-miR-181c-5p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-424-3p、hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-346)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示了其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸顯示正確診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為81.1％且特異性為68.9％。圖12A至12B：使用微RNA比例的歸一化值，KNN分類器用于將惡性(M)樣本和良性(B)樣本分類。圖12A：6種微RNA比例(hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-138-5p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-222-3p:hsa-miR-486-5p、hsa-miR-200c-3p:hsa-miR-486-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示了其中x軸表示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸表示正確診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為78％且特異性為58.9％。圖12B：8種miR比例(hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-138-5p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-222-3p:hsa-miR-486-5p、hsa-miR-200c-3p:hsa-miR-486-5p、MID-16582:hsa-miR-200c-3p、MID-16582:hsa-miR-138-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示了其中x軸表示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸表示正確診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為80.5％且特異性為65.6％。圖13A至13C：使用微RNA和微RNA比例組合的歸一化值，KNN分類器用于將惡性(M)樣本和良性(B)樣本分類。圖13A：4種微RNA和2種微RNA比例(hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-222-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示了其中x軸表示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸表示正確診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為85.4％且特異性為66.9％。圖13B：5種微RNA和3種微RNA比例(hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-138-5p、hsa-miR-375)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示了其中x軸表示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸表示正確診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為83.5％且特異性為70.9％。圖13C:7種微RNA和5種微RNA比例(hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-138-5p、hsa-miR-375、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-222-3p:hsa-miR-486-5p、hsa-miR-152-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示了其中x軸表示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸表示正確診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為83.5％且特異性為66.9％。圖14A至14C：使用歸一化的微RNA值，支持向量機(jī)(SVM)分類器用于將惡性(菱形，M)樣本和良性(方形，B)樣本分類。圖14A：三種微RNA(hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-146b-5p和hsa-miR-31-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為82.3％且特異性為68.2％。分類錯(cuò)誤的樣本(miscl.)由點(diǎn)表示。圖14B：6種微RNA(hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-375、hsa-miR-125b-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示了其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸顯示正確診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為83.5％且特異性為75.5％。圖14C：8種微RNA(hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-375、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-152-3p、hsa-miR-181c-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示了其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸表示正確診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為86％且特異性為75.5％。圖15A至15C：使用微RNA比例的歸一化值，SVM分類器用于將惡性(菱形，M)樣本和良性(方形，B)樣本分類。圖15A：三種微RNA比例(hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-138-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為83.5％且特異性為80.8％。分類錯(cuò)誤的樣本(miscl.)由點(diǎn)表示。圖15B：6種微RNA比例(hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-138-5p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-222-3p:hsa-miR-486-5p、hsa-miR-200c-3p:hsa-miR-486-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示了其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸表示正確診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為83.5％且特異性為80.1％。圖15C：8種微RNA比例(hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-138-5p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-222-3p:hsa-miR-486-5p、hsa-miR-200c-3p:hsa-miR-486-5p、MID-16582:hsa-miR-200c-3p、MID-16582:hsa-miR-138-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示了其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸表示正確診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為82.9％且特異性為80.8％。圖16A至16C：使用微RNA值和微RNA比例組合的歸一化值，SVM分類器用于將惡性(菱形，M)樣本和良性(方形，B)樣本分類。圖16A：2種微RNA和1種微RNA比例(hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-146b-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為82.9％且特異性為83.4％。分類錯(cuò)誤的樣本(miscl.)由點(diǎn)表示。圖16B：4種微RNA和2種微RNA比例(hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-222-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示了其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸表示正確診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為86％且特異性為80.1％。圖16C：5種微RNA和3種微RNA比例(hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-138-5p、hsa-miR-375)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示了其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸表示正確診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為86.6％且特異性為79.5％。圖17A至17C：使用微RNA的歸一化值，判別式分析集成分類器用于將惡性(菱形，M)樣本和良性(方形，B)樣本分類。圖17A：兩種微RNA(hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-146b-5p)的歸一化值用作為用于分類的特征。該分類器的敏感性為84.8％且特異性為64.2％?；疑幱皡^(qū)域標(biāo)記其中樣本被分類器確定分類為惡性的空白。圖17B：三種微RNA(hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-146b-5p和hsa-miR-31-5p)的歸一化值使作為分類的特征。該分類器的敏感性為84.1％且特異性為65.6％。分類錯(cuò)誤的樣本(miscl.)由點(diǎn)表示。圖17C：8種微RNA(hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-375、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-152-3p、hsa-miR-181c-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸表示正確診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為84.8％且特異性為74.8％。圖18A至18C：使用微RNA比例的歸一化值，判別式分析集成分類器用于將惡性(菱形，M)樣本和良性(方形，B)樣本分類。圖18A：兩種微RNA比例(hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為83.5％且特異性為73.5％。灰色陰影區(qū)域標(biāo)記其中樣本被分類器確定分類為惡性的空白。Fig.18B:三種微RNA比例(hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-138-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為86％且特異性為79.5％。分類錯(cuò)誤的樣本(miscl.)由點(diǎn)表示。圖18C：8種微RNA比例(hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-138-5p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-222-3p:hsa-miR-486-5p、hsa-miR-200c-3p:hsa-miR-486-5p、MID-16582:hsa-miR-200c-3p、MID-16582:hsa-miR-138-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸表示正確診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為84.1％且特異性為78.1％。圖19A至19C：使用微RNA和微RNA比例的歸一化值的組合，判別式分析集成分類器用于將惡性(菱形，M)樣本和良性(方形，B)樣本分類。圖19A：一種微RNA和一種微RNA比例(hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-551b-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為85.4％且特異性為78.8％?；疑幱皡^(qū)域標(biāo)記其中樣本被分類器確定分類為惡性的空白。圖19B：2種微RNA和1種微RNA比例(hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-146b-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為85.4％且特異性為78.1％。分類錯(cuò)誤的樣本(miscl.)由點(diǎn)表示。圖19C：5種微RNA和3種微RNA比例(hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-138-5p、hsa-miR-375)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸顯示正確診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為86％且特異性為82.8％。圖20：髓樣(“Med.”)樣本、非髓樣惡性(“Mal.”)樣本和良性(“Ben.”)樣本的歸一化的hsa-miR-375表達(dá)(Exp.)水平以點(diǎn)陣圖顯示。線表示每組的中值。在每組內(nèi)，為提高點(diǎn)的可見性，點(diǎn)沿x軸隨機(jī)分布。圖21：非髓樣惡性(“Mal.”)樣本和良性(“Ben.”)樣本的歸一化的hsa-miR-146b-5p表達(dá)(Exp.)水平以點(diǎn)陣圖顯示。線表示每組的中值。在每組內(nèi)，為提高點(diǎn)的可見性，點(diǎn)沿x軸隨機(jī)分布。圖22：非髓樣惡性(“Mal.”)樣本和良性(“Ben.”)樣本的歸一化的微RNA比例hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p表達(dá)水平以點(diǎn)陣圖顯示。線表示每組的中值。在每組內(nèi)，為提高點(diǎn)的可見性，點(diǎn)沿x軸隨機(jī)分布。圖23A至23C：使用微RNA的歸一化值，判別式分析分類器用于將不確定的惡性(菱形，M)樣本和良性(方形，B)樣本分類。圖23A：兩種微RNA(hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-551b-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為80％且特異性為56.3％。灰色陰影區(qū)域標(biāo)記其中樣本被分類器確定分類為惡性的空白。圖23B:三種微RNA(hsa-miR-146b-5；hsa-miR-551b-3p；hsa-miR-222-3p)的歸一化值用作為用于分類的特征。該分類器的敏感性為82.6％且特異性為59.5％。分類錯(cuò)誤的樣本(miscl.)由點(diǎn)表示。圖23C：8種微RNA(hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-375、hsa-miR-152-3p、hsa-miR-181c-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示了其中x軸顯示分類器答案而y軸顯示正確診斷的混淆矩陣。該分類器的敏感性為81.7％且特異性為71.4％。該圖顯示了其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸顯示正確診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。圖24A至24C：使用微RNA比例的歸一化值，判別式分析分類器用于將不確定的惡性(菱形，M)樣本和良性(方形，B)樣本分類。圖24A：兩種微RNA的比例(hsa-miR-146b-5p-hsa-miR-342-3p、hsa-miR-31-5p-hsa-miR-342-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為80％且特異性為72.2％?；疑幱皡^(qū)域標(biāo)記其中樣本被分類器確定分類為惡性的空白。圖24B：三種微RNA的比例(hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為80％且特異性為69％。分類錯(cuò)誤的樣本(miscl.)由點(diǎn)表示。圖24C：8種微RNA比例的歸一化值不確定是惡性樣本還是良性樣本。8種微RNA比例(hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-138-5p、hsa-miR-222-3p:hsa-miR-486-5p、MID-16582:hsa-miR-200c-3p、MID-16582:hsa-miR-138-5p、hsa-miR-200c-3p:hsa-miR-486-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示了其中x軸顯示分類器答案而y軸顯示正確診斷的混淆矩陣。該分類器的敏感性為80％且特異性為66.7％。該圖顯示了其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸顯示正確診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。圖25A至25C：使用微RNA和微RNA比例的歸一化值的組合，判別式分析分類器用于將未定類的惡性(菱形，M)樣本和良性(方形，B)樣本分類。圖25A：一種微RNA和一種微RNA比例(hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-146b-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為80％且特異性為73.8％?；疑幱皡^(qū)域標(biāo)記其中樣本被分類器確定分類為惡性的空白。圖25B：2種微RNA和1種微RNA比例(hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-551b-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為79.1％且特異性為73％。圖25C：5種微RNA和3種微RNA的比例(hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-31-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為87.8％且特異性為67.5％。該圖顯示其中x軸顯示了分類器答案(Clas.Ans.)而y軸顯示正確診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。圖26A至26C：使用微RNA的歸一化值，KNN分類器用于將未定類的惡性(M)樣本和良性(B)樣本分類。圖26A：6種微RNA(hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-375)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示了其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸顯示正確診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為78.3％且特異性為65.9％。圖26B：8種微RNA(hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-375、hsa-miR-152-3p、hsa-miR-181c-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸顯示正確診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為82.6％且特異性為73％。圖26C：12種微RNA(hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-375、hsa-miR-152-3p、hsa-miR-181c-5p、hsa-miR-424-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-346)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示了其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)，而y軸顯示正確診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為73.9％且特異性為68.3％。圖27A至27B：使用微RNA比例的歸一化值，KNN分類器用于將未定類的惡性(M)樣本和良性(B)樣本分類。圖27A：6種微RNA比例(hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-138-5p、hsa-miR-222-3p:hsa-miR-486-5p、MID-16582:hsa-miR-200c-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示了其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸顯示正確診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為80.9％且特異性為65.9％。圖27B:8種微RNA比例(hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-138-5p、hsa-miR-222-3p:hsa-miR-486-5p、MID-16582:hsa-miR-200c-3p、MID-16582:hsa-miR-138-5p、hsa-miR-200c-3p:hsa-miR-486-5p)的歸一化值用作為用于分類的特征。該圖顯示了其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸顯示正確診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為76.5％且特異性為62.7％。圖28A至28C：使用微RNA和微RNA比例的歸一化值，KNN分類器用于將未定類的惡性(M)樣本和良性(B)樣本分類。圖27C：3種微RNA和3種微RNA比例(hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示了其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)，而y軸顯示正確診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為76.5％且特異性為57.9％。圖28B：5種微RNA和3種微RNA比例(hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-31-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示了其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸顯示真實(shí)診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為78.3％且特異性為64.3％。圖28C：12種微RNA和微RNA比例(hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-375、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-138-5p、hsa-miR-222-3p:hsa-miR-486-5p、hsa-miR-152-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示了其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸顯示真實(shí)診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為80.9％且特異性為67.5％。圖29A至29C：使用微RNA的歸一化值，SVM分類器用于將未定類的惡性(菱形，M)樣本和良性(方形，B)樣本分類。圖29A：三種微RNA(hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-222-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為82.6％，特異性為54.8％。分類錯(cuò)誤的樣本(miscl.)由點(diǎn)表示。圖29B：6種微RNA(hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-375)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為82.6％且特異性為59.5％。該圖顯示了其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸顯示真實(shí)診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。圖29C：8種微RNA(hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-375、hsa-miR-152-3p；hsa-miR-181c-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示了其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸顯示真實(shí)診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為90.4％且特異性為60.3％。圖30A至30C：使用微RNA比例的歸一化值，SVM分類器用于將未定類的惡性(菱形，M)樣本和良性(方形，B)樣本分類。圖30A：三種微RNA比例(hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為81.7％且特異性為67.5％。分類錯(cuò)誤的樣本(miscl.)由點(diǎn)表示。圖30B：6種微RNA比例(hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-138-5p、hsa-miR-222-3p:hsa-miR-486-5p、MID-16582:hsa-miR-200c-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示了其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸顯示真實(shí)診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為88.7％且特異性為63.5％。圖30C：8種微RNA比例(hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-138-5p、hsa-miR-222-3p:hsa-miR-486-5p、MID-16582:hsa-miR-200c-3p、MID-16582:hsa-miR-138-5p、hsa-miR-200c-3p:hsa-miR-486-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示了其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)，而y軸顯示真實(shí)診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為87.8％且特異性為58.7％。圖31A至31C：使用微RNA和微RNA比例的歸一化值的組合，SVM分類器用于將未定類的惡性(菱形，M)樣本和良性(方形，B)樣本分類。圖31A：2種微RNA和1種微RNA比例(hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-551b-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為80％且特異性為71.4％。圖31B：4種微RNA和2種微RNA比例(hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示了其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸顯示真實(shí)診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為89.9％且特異性為51.6％。圖31C：5種微RNA和3個(gè)微RNA比例(hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-31-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸顯示真實(shí)診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為84.3％且特異性為68.3％。圖32A至32C：使用微RNA的歸一化值，判別式分析集成分類器用于將未定類的惡性(菱形，M)樣本和良性(方形，B)樣本分類。圖32A：兩種微RNA(hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-551b-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為85.2％且特異性為45.2％?；疑幱皡^(qū)域標(biāo)記其中樣本被分類器確定分類為惡性的空白。圖32B：三種微RNA(hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-222-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為84.3％且特異性為45.2％。分類錯(cuò)誤的樣本(miscl.)由點(diǎn)表示。圖32C：8種微RNA(hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-375、hsa-miR-152-3p；hsa-miR-181c-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸顯示真實(shí)診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為88.7％且特異性為64.3％。圖33A至33C：使用微RNA比例的歸一化值，判別式分析集成分類器用于將未定類的惡性(菱形，M)樣本和良性(方形，B)樣本分類。圖33A：兩種微RNA比例(hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為86.1％且特異性為61.1％。灰色陰影區(qū)域標(biāo)記其中樣本被分類器確定分類為惡性的空白。圖33B：三種微RNA比例(hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為87％且特異性為57.1％。分類錯(cuò)誤的樣本(miscl.)由點(diǎn)表示。圖33C：8種微RNA比例(hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-138-5p、hsa-miR-222-3p:hsa-miR-486-5p、MID-16582:hsa-miR-200c-3p、MID-16582:hsa-miR-138-5p、hsa-miR-200c-3p:hsa-miR-486-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸顯示真實(shí)診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為89.6％且特異性為65.1％。圖34A至34C：使用微RNA和微RNA比例的歸一化值的組合，判別式分析集成分類器用于將未定類的惡性(菱形，M)樣本和良性(方形，B)樣本分類。圖34A：一種微RNA和一種微RNA比例(hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-146b-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為83.5％且特異性為58.7％?；疑幱皡^(qū)域標(biāo)記其中樣本被分類器確定分類為惡性的空白。圖34B：2種微RNA和1種微RNA比例(hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-551b-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為85.2％且特異性為65.9％。分類錯(cuò)誤的樣本(miscl.)由點(diǎn)表示。圖34C：5種微RNA和3種微RNA比例(hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-31-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸顯示真實(shí)診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為87.8％且特異性為62.7％。圖35：未定類的非髓樣惡性(“Mal.”)樣本和良性(“Ben.”)樣本的hsa-miR-146b-5p的歸一化的表達(dá)(Exp.)水平以點(diǎn)陣圖顯示。線表示每組的中值。在每組內(nèi)，為提高點(diǎn)的可見性，點(diǎn)沿x軸隨機(jī)分布。圖36：未定類的非髓樣惡性(“Mal.”)樣本和良性(“Ben.”)樣本的微RNA比例hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p的歸一化的表達(dá)水平(Exp.)以點(diǎn)陣圖顯示。線表示每組的中值。在每組內(nèi)，為提高點(diǎn)的可見性，點(diǎn)沿x軸隨機(jī)分布。圖37A至37C：使用微RNA的歸一化值，判別式分析分類器用于將BethesdaIV惡性(菱形，M)樣本和良性(方形，B)樣本分類。圖37A：兩種微RNA(hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-551b-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為91.5％且特異性為42.9％。灰色陰影區(qū)域標(biāo)記其中樣本被分類器確定分類為惡性的空白。圖37B：三種微RNA(hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-222-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為91.5％且特異性為39.7％。分類錯(cuò)誤的樣本(miscl.)由點(diǎn)表示。圖37C：8種微RNA(hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-375、hsa-miR-181c-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-138-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示了其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸顯示真實(shí)診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為89.4％且特異性為47.6％。圖38A至38C：使用微RNA比例的歸一化值，判別式分析分類器用于將BethesdaIV惡性(菱形，M)樣本和良性(方形，B)樣本分類。圖38A：兩種微RNA比例(hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為89.4％且特異性為28.6％?；疑幱皡^(qū)域標(biāo)記其中樣本被分類器確定分類為惡性的空白。圖38B：三種微RNA比例(hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p；hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p；hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為91.5％且特異性為30.2％。分類錯(cuò)誤的樣本(miscl.)由點(diǎn)表示。圖38C：8種微RNA比例(hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p、MID-16582:hsa-miR-138-5p、hsa-miR-222-3p:hsa-miR-486-5p、MID-16582:hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-138-5p、hsa-miR-200c-3p:hsa-miR-486-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示了其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸顯示真實(shí)診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為80.9％且特異性為57.1％。圖39A至39C：使用微RNA和微RNA比例的歸一化值，判別式分析分類器用于將BethesdaIV惡性(菱形，M)樣本和良性(方形，B)樣本分類。圖39A：一種微RNA和一種微RNA比例(hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為93.6％且特異性為33.3％?；疑幱皡^(qū)域標(biāo)記其中樣本被分類器確定分類為惡性的空白。圖39B：一種微RNA和兩種微RNA比例(hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為89.4％且特異性為41.3％。分類錯(cuò)誤的樣本(miscl.)由點(diǎn)表示。圖39C：4種微RNA和4種微RNA比例(hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p、MID-16582:hsa-miR-138-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示了其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸顯示真實(shí)診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為87.2％且特異性為46％。圖40A至40C：使用微RNA的歸一化值，KNN分類器用于將BethesdaIV惡性樣本和良性樣本分類。該圖顯示了其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸顯示真實(shí)診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。圖40A：6種微RNA(hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-375、hsa-miR-181c-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為72.3％且特異性為39.7％。圖40B：8種微RNA(hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-375、hsa-miR-181c-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-138-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為66％且特異性為61.9％。圖40C：12種微RNA((hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-375、hsa-miR-181c-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-138-5p、hsa-miR-200c-3p、MID-16582、hsa-miR-346、hsa-miR-152-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為66％且特異性為61.9％。圖41A至41B：使用微RNA比例的歸一化值，KNN分類器用于將BethesdaIV惡性樣本和良性樣本分類。該圖顯示了其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸顯示真實(shí)診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。圖41A：6種微RNA比例(hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p、MID-16582:hsa-miR-138-5p、hsa-miR-222-3p:hsa-miR-486-5p、MID-16582:hsa-miR-200c-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為78.7％且特異性為61.9％。圖41B：8種微RNA比例(hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p、MID-16582:hsa-miR-138-5p、hsa-miR-222-3p:hsa-miR-486-5p、MID-16582:hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-138-5p、hsa-miR-200c-3p:hsa-miR-486-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為80.9％且特異性為50.8％。圖42A至42C：使用微RNA和微RNA比例的歸一化值，KNN分類器用于將BethesdaIV惡性樣本和良性樣本分類。該圖顯示了其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸顯示真實(shí)診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。圖42A：4種微RNA和2種微RNA比例(hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-146b-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為63.8％且特異性為46％。圖42B：4種微RNA和4種微RNA比例(hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p、MID-16582:hsa-miR-138-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為68.1％且特異性為49.2％。圖42C：6種微RNA和6種微RNA比例(hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p、MID-16582:hsa-miR-138-5p、hsa-miR-375、hsa-miR-222-3p:hsa-miR-486-5p、hsa-miR-181c-5p、MID-16582:hsa-miR-200c-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為74.5％且特異性為58.7％。圖43A至43C：使用微RNA的歸一化值，SVM分類器用于將BethesdaIV惡性樣本和良性樣本分類。圖43A：三種微RNA(hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-222-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為97.9％且特異性為22.2％。惡性＝M(菱形)；良性＝B(方形)。圖43B：6種微RNA(hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-375、hsa-miR-181c-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示了其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸顯示真實(shí)診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為89.4％且特異性為38.1％。圖43C：8種微RNA(hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-375、hsa-miR-181c-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-138-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示了其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)，而y軸顯示真實(shí)診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為91.5％且特異性為55.6％。圖44A至44C：使用微RNA比例的歸一化值，SVM分類器用于將BethesdaIV惡性(菱形，M)樣本和良性(方形，B)樣本分類。圖44A：三種微RNA比例(hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p；hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為100％。圖44B：6種微RNA比例(hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p、MID-16582:hsa-miR-138-5p、hsa-miR-222-3p:hsa-miR-486-5p、MID-16582:hsa-miR-200c-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示了其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸顯示真實(shí)診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為93.6％且特異性為33.3％。圖44C：8種微RNA比例(hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p、MID-16582:hsa-miR-138-5p、hsa-miR-222-3p:hsa-miR-486-5p、MID-16582:hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-138-5p、hsa-miR-200c-3p:hsa-miR-486-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示了其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸顯示真實(shí)診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為93.6％且特異性為31.7％。圖45A至45C：使用微RNA和微RNA比例的歸一化值組合，SVM分類器用于將BethesdaIV惡性(菱形，M)樣本和良性(方形，B)樣本分類。圖45A：一種微RNA和兩種微RNA比例(hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為93.6％且特異性為22.2％。分類錯(cuò)誤的樣本(miscl.)由點(diǎn)表示。圖45B：4種微RNA和2種微RNA比例(hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-146b-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示了其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸顯示真實(shí)診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為95.7％且特異性為31.7％。圖45C：4種微RNA和4種微RNA比例(hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p、MID-16582:hsa-miR-138-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示了其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸顯示真實(shí)診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為91.5％且特異性為36.5％。圖46A至46C：使用微RNA的歸一化值，判別式分析集成分類器用于將BethesdaIV惡性(菱形，M)樣本和良性(方形，B)樣本分類。圖46A：兩種微RNA(hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-551b-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為91.5％且特異性為39.7％?；疑幱皡^(qū)域標(biāo)記其中樣本被分類器確定分類為惡性的空白。圖46B：三種微RNA(hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-222-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為89.4％且特異性為39.7％。圖46C：8種微RNA(hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-375、hsa-miR-181c-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-138-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示了其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸顯示真實(shí)診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為93.6％且特異性為46％。圖47A至47C：使用微RNA比例的歸一化值，判別式分析集成分類器用于將BethesdaIV惡性(菱形，M)樣本和良性(方形，B)樣本分類。圖47A：兩種微RNA比例(hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為93.6％且特異性為19％?；疑幱皡^(qū)域標(biāo)記其中樣本被分類器確定分類為惡性的空白。圖47B：三種微RNA比例(hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為93.6％且特異性為17.5％。分類錯(cuò)誤的樣本(miscl.)由點(diǎn)表示。圖47C：8種微RNA比例(hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p、MID-16582:hsa-miR-138-5p、hsa-miR-222-3p:hsa-miR-486-5p、MID-16582:hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-138-5p、hsa-miR-200c-3p:hsa-miR-486-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示了其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸顯示真實(shí)診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為89.4％且特異性為44.4％。圖48A至48C：使用微RNA和微RNA比例的歸一化值組合，判別式分析集成分類器用于將BethesdaIV惡性(菱形，M)樣本和良性(方形，B)樣本分類。圖48A：一種微RNA和一種微RNA比例(hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為91.5％且特異性為33.3％?；疑幱皡^(qū)域標(biāo)記其中樣本被分類器確定分類為惡性的空白。圖48B：一種微RNA和兩種微RNA比例(hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為89.4％且特異性為36.5％。分類錯(cuò)誤的樣本(miscl.)由點(diǎn)表示。圖48C：4種微RNA和4種微RNA比例(hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p、MID-16582:hsa-miR-138-5p)的歸一化值用作為分類的特征。該圖顯示了其中x軸顯示分類器答案(Clas.Ans.)而y軸顯示真實(shí)診斷(真實(shí)類別＝re.cl.)的混淆矩陣。該分類器的敏感性為91.5％且特異性為34.9％。圖49：BethesdaIV非髓樣惡性(“Mal.”)樣本和良性(“Ben.”)樣本的hsa-miR-146b-5p的歸一化表達(dá)(實(shí)驗(yàn))水平以點(diǎn)陣圖顯示。線表示每組的中值。在每組中，點(diǎn)沿x軸隨機(jī)分布。圖50：BethesdaIV非髓樣惡性(“Mal.”)樣本和良性(“Ben.”)樣本的微RNA比例hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p的歸一化表達(dá)(實(shí)驗(yàn))水平以點(diǎn)陣圖顯示。線表示每組的中值。在每組中，點(diǎn)沿x軸隨機(jī)分布。圖51：使用判別式分析分類器將惡性(菱形，M)樣本和良性(方形，B)樣本分類，其中惡性組包括髓樣腫瘤的樣本。兩種微RNA(hsa-miR-222-3p、hsa-miR-551b-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為85.2％且特異性為53.6％。灰色陰影區(qū)域標(biāo)記其中樣本被分類器確定分類為惡性的空白。圖52：使用判別式分析分類器將惡性(菱形，M)樣本和良性(方形，B)樣本分類，其中惡性組包括髓樣腫瘤的樣本。兩種微RNA比例(hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-138-5p、hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p)的歸一化值用作為分類的特征。該分類器的敏感性為84.7％且特異性為80.8％。灰色陰影區(qū)域標(biāo)記其中樣本被分類器確定分類為惡性的空白。圖53：hsa-miR-486-5p和hsa-miR-200c-3p的表達(dá)模式?jīng)Q定了樣本的品質(zhì)。分析四個(gè)血液涂片(BS)樣本的hsa-miR-486-5p(SEQIDNO.22)和hsa-miR-200c-3p(SEQIDNO.23-24)表達(dá)和其在惡性(M)樣本和良性(B)樣本中的表達(dá)的對(duì)比。顯示了兩種miR的歸一化值(使用所有正規(guī)化子來歸一化)。圖54：甲狀腺良性腫瘤的亞型。建立良性腫瘤的兩個(gè)亞型，濾泡性腺瘤(FA，y軸，n＝81)和Hashimoto病(Hash.，x軸、n＝6)的微RNA表達(dá)譜(中值)。每個(gè)十字表示微RNA或微RNA比例。hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p比例與FA相關(guān)，同時(shí)hsa-miR-342-3p和hsa-miR-31-5p的表達(dá)與Hashimoto病相關(guān)。菱形表示正規(guī)化子。顯著的微RNA(t-test的p值<0.05)由圓圈表示。圖55：惡性甲狀腺腫瘤的亞型。建立惡性甲狀腺腫瘤的兩種亞型，乳頭狀癌(Pap.；y軸，n＝161)和濾泡性癌(FC；x軸，n＝16)的微RNA表達(dá)譜。每個(gè)十字表示微RNA或微RNA比例。菱形為正規(guī)化子。顯著的微RNA(t-test的p值<0.05)被圈出。只將歸一化的微RNA值標(biāo)記。未標(biāo)記的圓圈表示顯著比例。圖56：表示經(jīng)由FNA獲得的用于診斷未定類甲狀腺結(jié)節(jié)樣本的方案的流程圖。發(fā)明詳述盡管在甲狀腺病變確診的研究方面積累了大量努力，然而大量的技術(shù)問題仍沒有解決方案。由于所獲得材料的品質(zhì)，在細(xì)針穿刺(FNA)樣本中的甲狀腺病變?cè)\斷仍具有挑戰(zhàn)性。樣本中的低細(xì)胞數(shù)量、血液量、甲狀腺腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞之間的比例使得提取會(huì)提供決定性結(jié)果的足夠材料具有挑戰(zhàn)性。本發(fā)明提供用于區(qū)分惡性甲狀腺腫瘤和良性甲狀腺腫瘤、以及甲狀腺腫瘤的具體亞型的敏感的、特異性的和準(zhǔn)確的方法。區(qū)分甲狀腺腫瘤的不同亞型對(duì)于向患者提供最好和最適當(dāng)?shù)闹委熓侵匾?。本發(fā)明提供甲狀腺腫瘤分類和診斷領(lǐng)域中現(xiàn)有技術(shù)的顯著改進(jìn)。本發(fā)明開發(fā)了用于甲狀腺病變分類的整合平臺(tái)，其通過譜化和表征由FNA活組織檢查獲得的甲狀腺臨床樣本中的微RNA表達(dá)，同時(shí)還通過微RNA譜化克服了例如樣本中低細(xì)胞數(shù)量和樣本中低血液量的障礙而實(shí)現(xiàn)。該技術(shù)平臺(tái)作為甲狀腺結(jié)節(jié)術(shù)前管理的輔助工具被應(yīng)用于將甲狀腺病變分為良性贅生物或惡性贅生物，以及甲狀腺腫瘤的亞型。發(fā)明人意外地開發(fā)了用于分類良性甲狀腺病變和惡性甲狀腺病變以及甲狀腺癌特定亞型和濾泡性病變的方法，同時(shí)通過實(shí)施基于微RNA譜的特定算法而整合用于濾除次優(yōu)樣本的步驟。該方法是總體方案的一部分，其中可以使用具有來自FNA樣本涂片的現(xiàn)存的或可用的臨床細(xì)胞學(xué)載片，而無需產(chǎn)生或采集來自于患者的其他材料。本方法還包括來自細(xì)胞學(xué)樣本的微量RNA材料中的微RNA分析。FNA樣本一經(jīng)收集，將一代或若干代材料涂于載片上。目前可用的方法通常要求使用若干代以具有用于分析的足夠材料。本發(fā)明人開發(fā)一種方法，其中甚至只有一個(gè)FNA載片提供用于微RNA檢測(cè)的足夠材料。此外，本發(fā)明人能夠測(cè)量由小至0.1cm甲狀腺結(jié)節(jié)獲得的FNA樣本中的微RNA豐度?？紤]到約50％的甲狀腺病變小于1cm，這是特別有意義的[Jung等人(2014)JClinEndocrinolMetab99:E276–E285]。另外，發(fā)明人開發(fā)的方法能夠分析具有非常少量細(xì)胞的樣本，例如具有50個(gè)細(xì)胞，最高為120個(gè)細(xì)胞和以上的樣本。本方法包括排除或淘汰缺少甲狀腺細(xì)胞和/或其中非甲狀腺細(xì)胞如血細(xì)胞過度表現(xiàn)的樣本的步驟。本發(fā)明經(jīng)由譜化記為SEQIDNO.1至SEQIDNO.308的微RNA表達(dá)而確認(rèn)甲狀腺病變的獨(dú)特微RNA表達(dá)特征。更具體地，本發(fā)明人開發(fā)基于微RNA組表達(dá)水平而分類甲狀腺臨床樣本的平臺(tái)，該微RNA組包含至少兩種微RNA，選自：hsa-miR-31-5p(SEQIDNO.5至SEQIDNO.7)、hsa-miR-424-3p(SEQIDNO.16)、hsa-miR-222-3p(SEQIDNO.1至SEQIDNO.2)、hsa-miR-146b-5p(SEQIDNO.10至SEQIDNO.11)、hsa-miR-346(SEQIDNO.14)、MID-16582(SEQIDNO.25)、hsa-miR-342-3p(SEQIDNO.17至SEQIDNO.18)、hsa-miR-181c-5p(SEQIDNO.15)、hsa-miR-125b-5p(SEQIDNO.9)、hsa-miR-375(SEQIDNO.8)、hsa-miR-486-5p(SEQIDNO.22)、hsa-miR-551b-3p(SEQIDNO.3至SEQIDNO.4)、hsa-miR-152-3p(SEQIDNO.12至SEQIDNO.13)、hsa-miR-200c-3p(SEQIDNO.23至SEQIDNO.24)和hsa-miR-138-5p(SEQIDNO.19至SEQIDNO.21)、或與其至少80％、至少85％、或至少90％一致性的序列。該平臺(tái)是基于使用穩(wěn)健的組的訓(xùn)練性研究而建立的，其還包含作為正規(guī)化子的附加微RNA的測(cè)量。本發(fā)明對(duì)于其中FNA標(biāo)本表現(xiàn)出細(xì)胞病理學(xué)中非決定性的結(jié)果，通常被稱為“未定類”的25％的案例尤其有用，其包括分類為Bethesda類別III、Bethesda類別IV和Bethesda類別V的甲狀腺病變樣本。在現(xiàn)有的醫(yī)療實(shí)踐中，具有落入該類別的標(biāo)本的患者經(jīng)歷重復(fù)的FNA流程和手術(shù)，包括葉切除術(shù)或甲狀腺切除術(shù)。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供用于分類屬于“未定類”案例的甲狀腺病變樣本的方法，“未定類”案例分類為BethesdaSystem的類別III、類別IV和類別V(本文進(jìn)一步描述)。在一個(gè)具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供將分類為BethesdaSystem類別IV的甲狀腺病變樣本分類的方法，其涉及“濾泡性腺瘤”或“疑似濾泡性腺瘤”，其被認(rèn)為是最難進(jìn)行分類的類別。因此，本發(fā)明首先提供用于管理無法通過細(xì)胞病理學(xué)分析歸類的甲狀腺病變樣本的方案。感興趣的具體樣本為通過FNA獲得的那些。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用來自FNA樣本的常規(guī)涂片。在另一個(gè)實(shí)施方式中，可以使用防腐液中的FNA樣本。從FNA樣本中提取總RNA，并測(cè)量微RNA的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方式中，測(cè)量約2200個(gè)微RNA的表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，測(cè)量182個(gè)微RNA的表達(dá)，其包括序列SEQIDNO.1至SEQIDNO.182。在另一個(gè)實(shí)施方式中，測(cè)量包括序列SEQIDNO.1至SEQIDNO.37的微RNA的表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，測(cè)量選自hsa-miR-31-5p(SEQIDNO.5至SEQIDNO.7)、hsa-miR-424-3p(SEQIDNO.16)、hsa-miR-222-3p(SEQIDNO.1至SEQIDNO.2)、hsa-miR-146b-5p(SEQIDNO.10至SEQIDNO.11)、hsa-miR-346(SEQIDNO.14)、MID-16582(SEQIDNO.25)、hsa-miR-342-3p(SEQIDNO.17至SEQIDNO.18)、hsa-miR-181c-5p(SEQIDNO.15)、hsa-miR-125b-5p(SEQIDNO.9)、hsa-miR-375(SEQIDNO.8)、hsa-miR-486-5p(SEQIDNO.22)、hsa-miR-551b-3p(SEQIDNO.3至SEQIDNO.4)、hsa-miR-152-3p(SEQIDNO.12至SEQIDNO.13)、hsa-miR-200c-3p(SEQIDNO.23至SEQIDNO.24)和hsa-miR-138-5p(SEQIDNO.19至SEQIDNO.21)、或與其至少80％、至少85％、或至少90％一致性的序列中的至少3個(gè)、至少4個(gè)、至少5個(gè)、至少6個(gè)、至少7個(gè)、至少8個(gè)、至少9個(gè)、至少10個(gè)、至少11個(gè)、至少12個(gè)、至少13個(gè)、至少14個(gè)或全部微RNA，并將其用于分類。在另一個(gè)實(shí)施方式中，將甲狀腺樣品分類為惡性或良性包括測(cè)量以下序列的表達(dá)水平：hsa-miR-222-3p(SEQIDNO.1至SEQIDNO.2)、hsa-miR-551b-3p(SEQIDNO.3至SEQIDNO.4)、hsa-miR-31-5p(SEQIDNO.5至SEQIDNO.7)、hsa-miR-375(SEQIDNO.8)、hsa-miR-125b-5p(SEQIDNO.9)、hsa-miR-146b-5p(SEQIDNO.10至SEQIDNO.11)、hsa-miR-152-3p(SEQIDNO.12至SEQIDNO.13)、hsa-miR-346(SEQIDNO.14)、hsa-miR-181c-5p(SEQIDNO.15)、hsa-miR-424-3p(SEQIDNO.16)、hsa-miR-342-3p(SEQIDNO.17至SEQIDNO.18)、hsa-miR-138-5p(SEQIDNO.19至SEQIDNO.21)、hsa-miR-486-5p(SEQIDNO.22)、hsa-miR-200c-3p(SEQIDNO.23至SEQIDNO.24)、MID-16582(SEQIDNO.25)或其任意組合、或與其至少80％、至少85％、或至少90％一致性的序列，將表達(dá)水平供給分類器，該分類器將樣本分析和分類為惡性或良性。因此，本發(fā)明提供用于在有需要的受試者中區(qū)分惡性甲狀腺腫瘤病變和良性甲狀腺腫瘤病變的方法，所述方法包括從所述受試者獲得甲狀腺腫瘤病變樣本，或提供從所述受試者獲得的生物樣本，在一個(gè)或更多個(gè)所述樣本、或包括SEQIDNO:1至SEQIDNO:25中的至少4個(gè)微RNA、或者與其至少80％、至少85％、或至少90％一致性的序列、或所述微RNA的組合中通過雜交或擴(kuò)增確定表達(dá)譜，通過使用分類器算法比較所述表達(dá)譜和參考閾值；確定甲狀腺病變是惡性或者良性。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法用于區(qū)分惡性甲狀腺腫瘤病變或良性甲狀腺腫瘤病變的亞型。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法包括測(cè)量包括SEQIDNO:1至SEQIDNO:25中的至少四種微RNA的表達(dá)，獲得所述樣本的微RNA表達(dá)譜值，基于所述值使用分類器確定甲狀腺病變是惡性或良性，任選地還將該樣本分類為惡性亞型或良性亞型中的一種。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，通過雜交的所述確定表達(dá)譜包括使樣本和探針接觸，該探針與SEQIDNO:1至SEQIDNO:25中的每一個(gè)雜交，或者與與其至少80％、至少85％、至少90％一致性的序列雜交。在另一個(gè)實(shí)施方式中，通過雜交的所述確定表達(dá)譜包括使樣本和探針接觸，該探針與包括序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:25的所述微RNA的至少8個(gè)、至少10個(gè)、至少12個(gè)、至少14個(gè)、或至少16個(gè)連續(xù)核苷酸雜交。本發(fā)明還提供將樣本分類為惡性、或良性、和/或亞型所述樣本的方法，借此，進(jìn)一步測(cè)量微RNA在樣本中的表達(dá)水平，獲得表達(dá)譜，任選地應(yīng)用表達(dá)數(shù)據(jù)的多步分析計(jì)算微RNA比例。所述多步分析包括向微RNA表達(dá)譜、微RNA比例或其組合中的至少一個(gè)平行地或連續(xù)地應(yīng)用一種或更多種算法。所述多步分析可還包括分析一種或更多種單一微RNA的表達(dá)水平，該表達(dá)水平可以指示樣本的整體品質(zhì)。以任意順序或任意組合，可以包括于多步分析的準(zhǔn)則的實(shí)例為：非惡性細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)、與甲狀腺腫瘤特定亞型相關(guān)的微RNA表達(dá)等。因此例如，一個(gè)步驟可以為檢測(cè)非腫瘤細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)是高于還是低于在例如訓(xùn)練數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)集中建立的閾值，在這種情況下，該樣本是不合格的。另一個(gè)步驟可以為檢測(cè)與甲狀腺腫瘤亞型相關(guān)的微RNA表達(dá)或微RNA表達(dá)比例，例如，如果hsa-miR-342-3p(SEQIDNO.17至SEQIDNO.18)的表達(dá)相比于在如訓(xùn)練數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)集中建立的閾值是非常高的，可以將該樣本分類為良性、進(jìn)一步的亞型例如Hashimoto病?；蛘?，如果hsa-miR-342-3p(SEQIDNO.17至SEQIDNO.18)表達(dá)相比于在如訓(xùn)練數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)集中建立的閾值是非常高的，由于缺少足夠甲狀腺細(xì)胞，該樣本是不合格的。另一個(gè)任選的步驟可涉及MID-16582(SEQIDNO.25)的表達(dá)水平，可以用于確定樣本是否可被舍棄，或是否使用分類器具體分析MID-16582(SEQIDNO.25)是高的(相比于在訓(xùn)練集中建立的閾值)樣本。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述非甲狀腺細(xì)胞標(biāo)記為血細(xì)胞標(biāo)記。在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述細(xì)胞標(biāo)記為上皮細(xì)胞標(biāo)記。在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述細(xì)胞標(biāo)記為血細(xì)胞標(biāo)記、白血球標(biāo)記或上皮細(xì)胞標(biāo)記。血細(xì)胞標(biāo)記的實(shí)例為hsa-miR-486-5p(SEQIDNO.22)、hsa-miR-320a(SEQIDNO.173)、hsa-miR-106a-5p(SEQIDNO.150)、hsa-miR-93-5p(SEQIDNO.182)、hsa-miR-17-3p(SEQIDNO.160)、hsa-let-7d-5p(SEQIDNO.144)、hsa-miR-107(SEQIDNO.152)、hsa-miR-103a-3p(SEQIDNO.149)、hsa-miR-17-5p(SEQIDNO.161)、hsa-miR-191-5p(SEQIDNO.163)、hsa-miR-25-3p(SEQIDNO.167)、hsa-miR-106b-5p(SEQIDNO.151)、hsa-miR-20a-5p(SEQIDNO.166)、hsa-miR-18a-5p(SEQIDNO.40)、hsa-miR-144-3p(SEQIDNO.154)、hsa-miR-140-3p(SEQIDNO.51)、hsa-miR-15b-5p(SEQIDNO.157)、hsa-miR-16-5p(SEQIDNO.159)、hsa-miR-92a-3p(SEQIDNO.181)、hsa-miR-484(SEQIDNO.179)、hsa-miR-151a-5p(SEQIDNO.156)、hsa-let-7f-5p(SEQIDNO.)、hsa-let-7a-5p(SEQIDNO.141)、hsa-let-7c-5p(SEQIDNO.143)、hsa-let-7b-5p(SEQIDNO.142)、hsa-let-7g-5p(SEQIDNO.146)、hsa-let-7i-5p(SEQIDNO.147)、hsa-miR-185-5p(SEQIDNO.162)、hsa-miR-30d-5p(SEQIDNO.172)、hsa-miR-30b-5p(SEQIDNO.170)、hsa-miR-30c-5p(SEQIDNO.171)、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-26a-5p(SEQIDNO.168)、hsa-miR-26b-5p(SEQIDNO.169)、hsa-miR-425-5p(SEQIDNO.176)、MID-19433(SEQIDNO.133)和hsa-miR-4306(SEQIDNO.177)。白血球標(biāo)記的實(shí)例為hsa-miR-342-3p(SEQIDNO.17至SEQIDNO.18)、hsa-miR-146a-5p和hsa-miR-150-5p(SEQIDNO.59)。上皮細(xì)胞標(biāo)記的實(shí)例為hsa-miR-200c-3p(SEQIDNO.23至SEQIDNO.24)、hsa-miR-138-5p(SEQIDNO.19至SEQIDNO.21)、hsa-miR-3648(SEQIDNO.174)、hsa-miR-125b-5p(SEQIDNO.9)、hsa-miR-125a-5p(SEQIDNO.153)、hsa-miR-192-3p(SEQIDNO.164)、hsa-miR-4324(SEQIDNO.178)、hsa-miR-376a-3p(SEQIDNO.175)。如本文所述，所述微RNA比例為一對(duì)微RNA的歸一化表達(dá)水平，其中一個(gè)微RNA的歸一化表達(dá)水平用作分子，另一個(gè)微RNA的歸一化表達(dá)水平為分母。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述確定表達(dá)譜包括使樣本與包含如本文在實(shí)施例中示例的正向引物和反向引物的RT-PCR試劑接觸，產(chǎn)生RT-PCR產(chǎn)物。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述方法包括使RT-PCR產(chǎn)物與如本文在實(shí)施例中所示例的特異性探針或普通探針或其組合接觸，檢測(cè)并測(cè)量PCR產(chǎn)物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述確定表達(dá)譜包括使用微陣列等通過雜交測(cè)定微RNA表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述確定表達(dá)譜包括通過下一代測(cè)序測(cè)量微RNA表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法任選地還包括確定作為正規(guī)化子的至少一種微RNA的表達(dá)譜。在一個(gè)實(shí)施方式中，表1所述的任意微RNA可以用作正規(guī)化子。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，使用包括SEQIDNO.26至SEQIDNO.37、或與其至少80％、85％、90％或95％一致性序列的任意微RNA作為正規(guī)化子。本發(fā)明人已經(jīng)出人意料地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用如本文所定義和示例的不同類別的許多標(biāo)記時(shí)，改進(jìn)了甲狀腺腫瘤樣本的分類。所述標(biāo)記可以為以下任一種：包括SEQIDNOS:1至SEQIDNOS:25、或者與其至少80％、85％、90％或95％一致性的序列的惡性標(biāo)記、次級(jí)標(biāo)記和細(xì)胞型標(biāo)記或其任意組合。為了實(shí)施本發(fā)明的方法，可以使用全套的標(biāo)記?；蛘?，可以使用惡性標(biāo)記、次級(jí)標(biāo)記和細(xì)胞型標(biāo)記的任意組合。因此，該方法可以包括至少一個(gè)惡性標(biāo)記，其與至少一個(gè)次級(jí)標(biāo)記和/或至少一個(gè)細(xì)胞型標(biāo)記聯(lián)合。取決于數(shù)據(jù)分析，可以以原始特征或歸一化特征的形式使用每個(gè)細(xì)胞型標(biāo)記?；蛘?，為了確定樣本是否具有足夠的相關(guān)材料以實(shí)施分類，或者該樣本是否應(yīng)該被舍棄，可將細(xì)胞型標(biāo)記用作在實(shí)施分類之前的初步測(cè)試。另一個(gè)選擇為使用細(xì)胞型標(biāo)記作為最終分類器的一部分，其中由分類器使用細(xì)胞類型標(biāo)記的特征。另一種選擇為使用細(xì)胞型標(biāo)記作為MiR比例的分母，其任選地由分類器使用。例如，惡性標(biāo)記或次級(jí)標(biāo)記的表達(dá)水平可被細(xì)胞型標(biāo)記的表達(dá)水平除，獲得在分類器中使用的miR比例。因此，區(qū)分在有需要的受試者中的惡性和良性甲狀腺腫瘤病變的方法的另一實(shí)施方式中，所述分類器可為以下任一種：?jiǎn)畏诸惼?、多步分類器、使用所有惡性?biāo)記的分類器、使用惡性標(biāo)記子集的分類器、使用所有惡性標(biāo)記和次級(jí)標(biāo)記的分類器、使用惡性標(biāo)記子集和次級(jí)標(biāo)記子集的分類器、使用所有惡性標(biāo)記、次級(jí)標(biāo)記和細(xì)胞型標(biāo)記的分類器、使用所有惡性標(biāo)記、次級(jí)標(biāo)記和細(xì)胞型標(biāo)記的子集的分類器、使用所有惡性標(biāo)記或其子集以及細(xì)胞型標(biāo)記或其子集的分類器。在本發(fā)明方法或方案的其他實(shí)施方式中，可通過進(jìn)一步結(jié)合算法分類器結(jié)果和所分析甲狀腺樣本可獲得的其他臨床數(shù)據(jù)或分子數(shù)據(jù)來改進(jìn)分類的進(jìn)行。其他可獲得的數(shù)據(jù)可以關(guān)于甲狀腺病變，例如結(jié)節(jié)尺寸、結(jié)節(jié)數(shù)量；其可以關(guān)于從其獲得樣本的受試者中可獲得的其他臨床信息，例如分子測(cè)試結(jié)果，例如其他分子標(biāo)記的表達(dá)、基因標(biāo)記、生化測(cè)試結(jié)果、血液測(cè)試結(jié)果、尿測(cè)試結(jié)果、再發(fā)率、預(yù)后數(shù)據(jù)、家族史、患者病史等?？山Y(jié)合的其他數(shù)據(jù)為甲狀腺基因數(shù)據(jù)，例如突變分析、基因融合、染色體重排、基因表達(dá)、蛋白質(zhì)表達(dá)等。治療型適應(yīng)癥可以根據(jù)用本發(fā)明方法或方案獲得的診斷而不同。典型地，存在可以施用于甲狀腺癌患者的五種療法：手術(shù)、放療、化療、甲狀腺激素療法和靶向療法。手術(shù)是甲狀腺癌的最常用療法?？墒褂靡韵铝鞒讨唬?葉切除術(shù):去除發(fā)現(xiàn)甲狀腺癌的葉。進(jìn)行該區(qū)域內(nèi)的淋巴結(jié)活組織檢查以確認(rèn)其是否含有癌。-甲狀腺近全切除術(shù)：去除除了非常小部分以外的全部甲狀腺。-甲狀腺全切除術(shù)：去除全部甲狀腺。-淋巴切除術(shù)：去除含有癌的頸部中的淋巴結(jié)。甲狀腺切除術(shù)是具有若干潛在并發(fā)癥或后遺癥的手術(shù)流程，潛在并發(fā)癥或后遺癥包括暫時(shí)或永久性聲音改變、暫時(shí)或永久性低鈣、終身需要甲狀腺激素替代、流血、感染、由于雙側(cè)聲帶麻痹導(dǎo)致的極小可能性的氣道阻塞。因此，防止甲狀腺不必要去除的準(zhǔn)確診斷是非常需要的。放療使用高能X射線或其他類型射線以消除癌細(xì)胞或阻止其增殖。存在兩種類型的放療。外部放療使用體外儀器向惡性腫瘤發(fā)出射線。體內(nèi)放療使用直接置于惡性腫瘤內(nèi)部或附近的密封在針、核、線或?qū)Ч軆?nèi)的放射性物質(zhì)。放療的選擇取決于甲狀腺癌的類型和階段。放療可作為手術(shù)的補(bǔ)充以消除未成功去除的癌細(xì)胞。濾泡性甲狀腺癌和乳頭狀甲狀腺癌可使用放射性碘(RAI)療法治療。RAI通過口服施用，并在任何殘留的甲狀腺組織中聚集，包括已經(jīng)擴(kuò)散到體內(nèi)其他位置的甲狀腺癌細(xì)胞。由于只有甲狀腺組織攝取碘，RAI破壞甲狀腺組織和甲狀腺癌細(xì)胞而不損傷其他組織。在施用全部治療劑量的RAI之前，施用小的測(cè)試劑量以確定腫瘤是否攝取碘。化療是甲狀腺癌治療的另一種選擇。化療可通過口服、或通過靜脈內(nèi)注射或肌肉內(nèi)注射來給藥?；熯€可以直接給藥于惡性腫瘤影響的區(qū)域而不是全身。給藥的選擇取決于甲狀腺癌的類型和階段。已被批準(zhǔn)的用于甲狀腺癌治療的藥物的一些實(shí)例為：AdriamycinPFS(DoxorubicinHydrochloride)、AdriamycinRDF(DoxorubicinHydrochloride)、Cabozantinib-S-Malate,Caprelsa(Vandetanib)、Cometriq(Cabozantinib-S-Malate)、DoxorubicinHydrochloride,Nexavar(SorafenibTosylate)、SorafenibTosylate和Vandetanib。甲狀腺激素療法為去除激素或阻斷其活性并抑制癌細(xì)胞增殖的癌癥治療。在甲狀腺癌的治療中，可施用藥物以抑制促甲狀腺激素(TSH)產(chǎn)生，以避免激素會(huì)導(dǎo)致甲狀腺癌的生長(zhǎng)或再發(fā)。另外，由于甲狀腺癌治療特異性地靶向于甲狀腺細(xì)胞，甲狀腺無法產(chǎn)生足夠的甲狀腺激素。對(duì)患者施用甲狀腺激素替代藥物。靶向治療使用藥物或其他物質(zhì)以識(shí)別并攻擊特定癌細(xì)胞而不傷害正常細(xì)胞。酪氨酸激酶抑制劑(TKI)療法阻斷在甲狀腺癌細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制其生長(zhǎng)。凡德他尼(Vandetanib)是用于治療甲狀腺癌的TKI。任意療法的劑量和持續(xù)時(shí)間取決于患者的個(gè)體評(píng)估以及醫(yī)療服務(wù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐。治療的持續(xù)時(shí)間為在該時(shí)間段中藥物制劑或藥物組合物的劑量施用的時(shí)間。通過分析差異化表達(dá)的微RNA，首先區(qū)分為良性或惡性，然后將其分類為不同亞型，甲狀腺腫瘤的識(shí)別和區(qū)分可提供亞型之間生物學(xué)差異、其不同腫瘤形成過程和類型特異性靶向治療的可能新靶標(biāo)的進(jìn)一步線索。本發(fā)明提供定量和定性的診斷分析和方法，通過比較如本文描述的特異的微RNA分子的水平，用于檢測(cè)、診斷、監(jiān)測(cè)、分級(jí)和預(yù)測(cè)甲狀腺癌。該水平在患者樣本中測(cè)量，患者樣本可來自于活組織檢查、腫瘤樣本、細(xì)胞、組織和/或體液。因此，本發(fā)明的方法對(duì)于識(shí)別惡性甲狀腺腫瘤的不同亞型以及對(duì)于確定診斷之后的治療過程是特別有用的，該亞型為濾泡癌、乳頭狀癌、乳頭狀癌的濾泡變體(FVPC或FVPTC)、包膜內(nèi)型FVPTC(或包膜內(nèi)型FVPTC)、髓樣癌、未分化甲狀腺癌、低分化甲狀腺癌。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供用于分類良性甲狀腺腫瘤亞型的方法，例如濾泡性癌、Hashimoto甲狀腺炎、增生(甲狀腺腫大)。本發(fā)明還提供治療甲狀腺癌的方法，所述方法包括如本文所述的區(qū)分良性甲狀腺腫瘤或惡性甲狀腺腫瘤的方法，任選地亞型化甲狀腺腫瘤類型，并根據(jù)本發(fā)明方法提供的診斷給藥治療。本發(fā)明的所有方法還任選地可以包括測(cè)量其他癌標(biāo)記的水平。除了在本發(fā)明中有用的所述微RNA分子，其他癌標(biāo)記取決于測(cè)試的癌，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的?？梢杂糜诖_定在來自患者的樣本中基因表達(dá)水平例如本發(fā)明的核酸序列的測(cè)定技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。該分析方法包括但不限于，放射免疫測(cè)定、逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)測(cè)定、免疫組織化學(xué)測(cè)定、原位雜交測(cè)定、競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定、RNA印跡測(cè)定、ELISA測(cè)定、核酸微陣列和生物芯片測(cè)定?？梢栽O(shè)置一種或更多種核酸序列表達(dá)水平的任意閾值以將樣本或腫瘤樣本指定為兩組中的一個(gè)?；蛘?，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過取兩種核酸序列表達(dá)水平的比例和/或通過例如邏輯回歸的方法使本發(fā)明的一種或更多種核酸序列的表達(dá)水平結(jié)合以定義度量，然后將其與之前測(cè)量的樣本或閾值比較。指定的閾值作為參數(shù)，其可用于量化將樣本指定為各類的置信度?？梢詼y(cè)量指定的閾值以得到有利的敏感性或特異性，這取決于臨床情況。與參考數(shù)據(jù)相關(guān)的值產(chǎn)生連續(xù)的可測(cè)量計(jì)分，并提供樣本屬于甲狀腺亞型的特定類別的可能性的診斷信息。在多變量分析中，微RNA特征提供高水平的預(yù)后信息。本發(fā)明還提供新型微RNA分子，包括標(biāo)記為SEQIDNO.27至SEQIDNO.29、SEQIDNO.33、SEQIDNO.34、SEQIDNO.139、SEQIDNO.140、SEQIDNO.307和SEQIDNO.308的核酸。應(yīng)理解，本發(fā)明還包括對(duì)應(yīng)于SEQIDNO.27至SEQIDNO.29、SEQIDNO.33、SEQIDNO.34、SEQIDNO.139、SEQIDNO.140、SEQIDNO.307和SEQIDNO.308中的任一種的cDNA、補(bǔ)序列和反miR。另外，本申請(qǐng)?zhí)峁┌疚乃龅奈NA的組合物、制劑和藥劑。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包含作為活性物質(zhì)的微RNA的組合物、制劑和藥劑，該微RNA具有SEQIDNO.27至SEQIDNO.29、SEQIDNO.33、SEQIDNO.34、SEQIDNO.139、SEQIDNO.140、SEQIDNO.307和SEQIDNO.308中任一種、其變體、或與其至少80％、至少85％、或至少90％一致性的序列。所述組合物、制劑和藥劑還可以任選地包括輔料、載體、稀釋劑和賦形劑中的任一個(gè)?？梢詫⒈疚拿枋龅奈NA通過與適當(dāng)?shù)?、藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑組合以配制為組合物、制劑和藥劑，并可以配制為固體、半固體、液體或氣體形式的制劑，例如片劑、膠囊、粉劑、顆粒、軟膏劑、溶液、栓劑、注射劑、吸入劑和噴劑。同樣地，微RNA或包含其的藥物組合物可以以不同途徑施用，包括口服、經(jīng)口腔、經(jīng)直腸、非腸道、經(jīng)腹膜內(nèi)、經(jīng)皮內(nèi)、經(jīng)皮膚、經(jīng)氣管內(nèi)等。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的藥物組合物包含本發(fā)明的一種或更多種核酸和一種或更多種賦形劑。在某些這種實(shí)施方式中，賦形劑選自水、鹽溶液、醇、聚乙二醇、明膠、乳糖、淀粉酶、硬脂酸鎂、滑石、硅酸、粘性石蠟、羥甲基纖維素和聚乙烯吡咯烷酮。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的藥物組合物使用已知技術(shù)制備，包括但不限于混合、溶解、造粒、糖衣化、研磨、乳化、膠囊化、包埋或壓片過程。在文獻(xiàn)中，例如在Gennaro,A.R.(2000)Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,第20版中可以找到用于制備藥物組合物的方法。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的藥物組合物為液體(例如，懸浮液、酏劑和/或溶液)。在某些實(shí)施方式中，液體藥物組合物使用本領(lǐng)域已知的成分制備，包括但不限于，水、二醇、油、醇、調(diào)味劑、防腐劑和著色劑。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的藥物組合物為固體(例如，粉劑、片劑和/或膠囊)。在某些這種實(shí)施方式中，包含本發(fā)明的一種或更多種核酸的固體藥物組合物使用本領(lǐng)域已知的成分制備，包括但不限于，淀粉、糖、稀釋劑、成粒劑、潤(rùn)滑劑、粘合劑和崩解劑。此外，本發(fā)明提供了包含本文所述的化合物(核酸)的載體和探針。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，本申請(qǐng)?zhí)峁┌瑯?biāo)記為SEQIDNO.27至SEQIDNO.29、SEQIDNO.33、SEQIDNO.34、SEQIDNO.139、SEQIDNO.140、SEQIDNO.307和SEQIDNO.308的核酸、其變體、或與其至少80％、至少85％、或至少90％一致性的序列的載體或探針。應(yīng)理解本文使用的術(shù)語是僅出于描述具體實(shí)施方式的目的，而不旨在限制。必須注意的是，如說明書和所附權(quán)利要求中所使用的，指示物前不加數(shù)量詞包括復(fù)數(shù)指示物，除非本文明確指出其他。為記載本文的數(shù)值范圍，明確預(yù)期了介于其間的具有相同精確度的每個(gè)中間數(shù)字。例如，對(duì)于范圍6至9，除了6和9外也預(yù)期數(shù)字7和8，例如對(duì)于范圍6.0至7.0，明確預(yù)期6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。如本文所使用的，術(shù)語“異常增殖”指偏離正常的、適當(dāng)?shù)?、或預(yù)期過程的細(xì)胞增殖。異常細(xì)胞增殖可以包括特征與由不適當(dāng)高水平的細(xì)胞分裂、不適當(dāng)?shù)退降募?xì)胞凋亡或二者引起或介導(dǎo)或?qū)е碌闹刚飨嚓P(guān)的細(xì)胞增殖。該指征可以例如由單一或多種局部異常增殖的細(xì)胞、細(xì)胞群或組織來表征是否為癌性的或非癌性的、良性的或惡性的。異常增殖是癌癥的主要特征之一。如本文所使用的，術(shù)語“約”指+/-10％。“附著的”或“固定的”，如本文使用的指探針和固體支撐物，指在探針和固體支撐物之間的結(jié)合在結(jié)合、洗滌、分析和去除條件下足夠穩(wěn)定。結(jié)合可為共價(jià)的或非共價(jià)的。共價(jià)鍵可直接形成于探針和固體支撐物之間、或通過交聯(lián)劑或通過在或固體支撐物或探針或二者分子上特定活性基團(tuán)的內(nèi)含物來形成。非共價(jià)結(jié)合可以為靜電相互作用、親水相互作用和疏水相互作用中的一種或更多種。包括于非共價(jià)結(jié)合中的是分子例如鏈霉親和素共價(jià)附著到支撐物上，以及生物素標(biāo)記探針和鏈霉親和素的非共價(jià)結(jié)合。固定化還可以涉及共價(jià)相互作用和非共價(jià)相互作用的的組合。本文使用的“生物樣本”或“樣本”指尤其包括核酸、微RNA的生物組織或液體的樣本。這種樣本包括但不限于從受試者分離的組織或液體。生物樣本也可以包括組織的切片例如活組織檢查樣本和尸體解剖樣本、細(xì)針穿刺(FNA)樣本、出于組織學(xué)目的取得的冷凍切片、血液、血液的部分、血漿、血清等。通過從受試者移除細(xì)胞樣本可提供生物學(xué)樣本，然而也可通過使用先前分離的細(xì)胞(例如，由另一個(gè)人、在另一時(shí)間和/或出于另一目的而分離的)，之后可以經(jīng)培養(yǎng)或不經(jīng)培養(yǎng)來提供生物學(xué)樣本。還可以使用歸檔的組織，例如具有治療歷史或結(jié)果歷史的歸檔組織。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，制備FNA活組織切片作為涂片。術(shù)語“分類”指程序和/或算法，其中將個(gè)體項(xiàng)目基于項(xiàng)目中的一個(gè)或更多個(gè)固有特征的定量信息(被稱為特質(zhì)、變量、特征、特點(diǎn)等)，和基于統(tǒng)計(jì)模型和/或先前示蹤項(xiàng)目的訓(xùn)練集被置于群或類。如本文所述的，術(shù)語“將甲狀腺腫瘤分類”指識(shí)別甲狀腺組織樣本的一種或更多種特性(例如，包括但不限于，在癌組織中表達(dá)的微RNA的存在、在可能變?yōu)榘┬缘陌┣敖M織中表達(dá)的微RNA的存在、在可能轉(zhuǎn)移的癌組織中表達(dá)的微RNA的存在)。本文使用的術(shù)語“分類器”指用于將甲狀腺腫瘤(或病變)分類、區(qū)分、或識(shí)別為良性或惡性的算法，或用于分類、區(qū)分、或識(shí)別甲狀腺腫瘤亞型的算法。一旦取得任意研究組樣本的微RNA表達(dá)譜，例如來自訓(xùn)練組，就產(chǎn)生數(shù)據(jù)庫，其中存儲(chǔ)組中樣本的所有微RNA的表達(dá)水平。該數(shù)據(jù)庫還被稱作“訓(xùn)練數(shù)據(jù)”，其用于選擇用于分類的優(yōu)化算法。通過用于分類甲狀腺樣本的算法，還可使用核酸(或微RNA)比例、單獨(dú)或與核酸(或微RNA)水平組合。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法或方案中使用的算法為機(jī)器學(xué)習(xí)型算法。機(jī)器學(xué)習(xí)型算法的實(shí)例為判別式分析、K最近鄰算法分類器(KNN)、支持向量機(jī)(SVM)分類器、邏輯回歸分類器、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分類器、高斯混合模型(GMM)、最鄰近重心分類器、線性回歸分類器、決策樹分類器、和隨機(jī)森林分類器、分類器集成、或其任意組合。當(dāng)使用判別式分析分類器時(shí)，判別式可為線性的、二次的、線性協(xié)方差矩陣對(duì)角線、二次協(xié)方差矩陣對(duì)角線、線性協(xié)方差矩陣偽逆、二次協(xié)方差矩陣偽逆中的任一種。當(dāng)使用KNN分類器時(shí)，k可以改變且距離測(cè)度可以為Pearson相關(guān)、spearman相關(guān)、Euclidean或cityblock(Manhattan)距離。當(dāng)使用SVM分類器時(shí)，核心可為線性的、高斯的或多項(xiàng)式的。當(dāng)使用集成方法分類器時(shí)，其通常應(yīng)用算法例如分類樹、KNN或判別式分析分類器。集成可以使用或boosting算法或bagging算法，集成學(xué)習(xí)周期可為二至最高幾千。如本文所使用的，“混淆矩陣”指特定的表格布局，其允許算法性能的可視化，典型的算法為監(jiān)督式學(xué)習(xí)算法。“混淆矩陣”還可稱為列聯(lián)表或誤差矩陣。如本文所使用的“互補(bǔ)”與核酸有關(guān)，可指在核酸分子的核苷酸或核苷酸類似物之間的Watson-Crick(例如，A-T/U和C-G)或Hoogsteen堿基對(duì)。完全互補(bǔ)指核酸分子的核苷酸或核苷酸類似物之間100％互補(bǔ)的堿基對(duì)。在一些實(shí)施方式中，互補(bǔ)序列具有反方向(5’-3’)。本發(fā)明還提供標(biāo)記為SEQIDNO.7至SEQIDNO.29、SEQIDNO.33、SEQIDNO.34、SEQIDNO.139和SEQIDNO.140的核酸的互補(bǔ)序列。如本文所使用的，“CT特征”或“CT”表示PCR的第一循環(huán)，其中擴(kuò)增跨越了熒光的閾值(循環(huán)閾值)。因此，CT的低值表示微RNA的高豐度或高表達(dá)水平。在一些實(shí)施方式中，將PCR的CT特征歸一化以使歸一化的CT為表達(dá)水平的倒數(shù)。在其他實(shí)施方式中，PCR的CT特征可被歸一化然后取倒數(shù)，以使低的歸一化的取倒數(shù)的CT表示微RNA的低豐度和低表達(dá)水平。如本文中所使用的，“數(shù)據(jù)處理程序”指可體現(xiàn)在包含在軟件中的程序，其確定關(guān)于一個(gè)或更多個(gè)樣本所采集數(shù)據(jù)(例如，測(cè)試或分析的最終結(jié)果)的生物重要性。例如，數(shù)據(jù)處理程序可以基于采集的數(shù)據(jù)確定從其中采集或獲得樣本的甲狀腺病變是良性的或是惡性的，或?yàn)榫唧w的亞型。在本文的系統(tǒng)和方法中，基于所確定的結(jié)果，數(shù)據(jù)處理程序還可以控制數(shù)據(jù)采集程序。數(shù)據(jù)處理程序和數(shù)據(jù)采集程序可被整合并提供反饋以運(yùn)行數(shù)據(jù)采集，從而提供基于分析的判斷方法?！皺z測(cè)”指檢測(cè)在樣本中成分的存在。檢測(cè)還指檢測(cè)成分的缺失。檢測(cè)還指或定量或定性地確定成分的水平?！安町惢磉_(dá)”或“表達(dá)水平的差異”指在甲狀腺樣本中微RNA表達(dá)模式的定性差別或定量差別。因此，差異化表達(dá)的微RNA可以定性地改變其表達(dá)，包括活化或失活，例如正常的甲狀腺組織相對(duì)于病變的甲狀腺組織。定性調(diào)節(jié)的微RNA可以在甲狀腺樣本或細(xì)胞型中表現(xiàn)出可由標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)的表達(dá)模式。一些微RNA可以在一種甲狀腺樣本或細(xì)胞型中表達(dá)而不在其他甲狀腺樣本或細(xì)胞型中表達(dá)，或者在不同細(xì)胞型或不同樣本之間以不同水平表達(dá)。因此，表達(dá)的差異可以是定性的，例如，表達(dá)可以是調(diào)節(jié)的、上調(diào)的，這導(dǎo)致微RNA的量增加，或下調(diào)的，這導(dǎo)致微RNA的量降低。表達(dá)差異的程度只需要足夠大以通過標(biāo)準(zhǔn)表征方法來定量，標(biāo)準(zhǔn)表征方法例如表達(dá)陣列、下一代測(cè)序(NGS)、定量逆轉(zhuǎn)錄PCR、Northern印跡分析、實(shí)時(shí)PCR、原位雜交和核糖核酸酶保護(hù)。廣義地使用術(shù)語“表達(dá)譜”以包括例如基因組表達(dá)譜和微RNA表達(dá)譜。如本文所使用的，表達(dá)譜指為核酸(或微RNA)表達(dá)所獲得的數(shù)據(jù)集。其可以指原始數(shù)據(jù)或歸一化的表達(dá)值。表達(dá)譜可以通過確定核酸序列的水平德便利方法產(chǎn)生，例如微RNA的定量雜交、標(biāo)記的微RNA、擴(kuò)增的微RNA、擴(kuò)增的cDNA等、定量PCR等。進(jìn)一步測(cè)量核酸序列水平，可以將獲得的數(shù)據(jù)歸一化——數(shù)據(jù)的歸一化已經(jīng)在本申請(qǐng)的其他部分討論。表達(dá)譜允許在兩個(gè)或更多個(gè)樣本之間以及在樣本和閾值之間的差異化基因表達(dá)的分析。此外，可將分類器應(yīng)用于表達(dá)譜以獲得關(guān)于樣本的信息、例如樣本的分類、診斷、亞型等。所研究的核酸序列為發(fā)現(xiàn)為預(yù)測(cè)性的核酸序列，包括在本文表1中提供的核酸序列，其中表達(dá)譜可包括5個(gè)、10個(gè)、20個(gè)、25個(gè)、50個(gè)、100個(gè)或更多個(gè)包括所有列出的核酸序列的表達(dá)數(shù)據(jù)。根據(jù)一些實(shí)施方式，術(shù)語“表達(dá)譜”指測(cè)量在所測(cè)量樣本中的核酸序列豐度。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，在每個(gè)甲狀腺樣本中表征微RNA表達(dá)譜。如本文所使用的，“表達(dá)比例”指兩個(gè)或更多個(gè)核酸即微RNA的相對(duì)表達(dá)水平，如通過檢測(cè)生物樣本例如甲狀腺樣本中對(duì)應(yīng)核酸的相對(duì)表達(dá)水平而確定。由于微RNA表達(dá)水平表示為在對(duì)數(shù)尺度上獲得的CT，實(shí)際上表達(dá)比例通過CT的差值獲得而不是通過除法。如本文所使用的，“FDR”或“錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率”為用于多重假設(shè)檢驗(yàn)中以校正多重比較的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。當(dāng)進(jìn)行多重假設(shè)檢驗(yàn)時(shí)，例如在比較具有多重?cái)?shù)據(jù)特征中兩組之間的特征時(shí)，通過組之間的可以達(dá)到原本被視為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的水平的隨機(jī)差異，存在獲得假陽性結(jié)果越來越高的可能性。為了限制該錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)的比例，將統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的定義為僅針對(duì)差異達(dá)到閾值以下的p值(通過雙側(cè)t檢驗(yàn))的數(shù)據(jù)特征，這取決于進(jìn)行測(cè)試的數(shù)量以及在這些測(cè)試中獲得的p值分布。如本文所使用的，“FNA”涉及“細(xì)針穿刺”。細(xì)針穿刺活組織檢查(FNAB、FNA或NAB)，或細(xì)針穿刺(FNAC)細(xì)胞學(xué)檢查，是用于研究表皮(就在皮膚以下)腫塊或包塊的診斷程序，其對(duì)于甲狀腺病變活組織檢查是尤其有用的。活組織檢查通過將細(xì)空心針插入包塊中以收集細(xì)胞樣本，該細(xì)胞樣本在染色后在顯微鏡下檢查?？梢赃M(jìn)行抽出物的細(xì)胞學(xué)檢查(細(xì)胞樣本評(píng)估，F(xiàn)NAC)或組織學(xué)檢查(活檢組織樣本評(píng)估，F(xiàn)NAB)。由于實(shí)施用針穿刺活組織檢查代替可以避免大多數(shù)的手術(shù)(切除或切開)活組織檢查，F(xiàn)NA是用于甲狀腺結(jié)節(jié)的流行活組織檢查方法。樣本采集和制備的詳細(xì)描述可見于“AtlasofFineNeedleAspirationCytology”HenrykA.Domanski(2014)，其內(nèi)容通過引用并入本文。穿刺樣本的制備在現(xiàn)有技術(shù)中已被充分描述。通常，適量的抽出物(通常為約一滴)薄而均勻地鋪展于顯微鏡載片上，其之后被染色和裝載。以該方法制備的FNA樣本也稱為“涂片”。關(guān)于樣品厚度和均勻度，結(jié)果應(yīng)與切片組織學(xué)載片一致。FNA涂片的固定通常通過風(fēng)干(通常稱為“風(fēng)干流程，F(xiàn)NAB”)或使用95％的乙醇或細(xì)胞色素氧化酶噴霧作為固定劑來濕法固定。其他適當(dāng)?shù)囊后w固定劑為甲醇、丙酮、異丙醇、丙酮/甲醇等?；蛘撸蓪NA樣本添加至試管中的防腐劑或與其混合。如本文所提及的，“濾泡性”病變可為濾泡性腺瘤(FA)、濾泡性癌(FC)乳頭狀癌的濾泡性變體(FVPCA)中的任一種。本文使用的“片段”指核酸的非全長(zhǎng)部分。因此，片段本身也是核酸。本文使用的“槽溝結(jié)合劑”和/或“小溝結(jié)合劑”(MGB)可交換使用，指一般以序列特異性方式適于雙鏈DNA小溝中的小分子。小溝結(jié)合劑可為狹長(zhǎng)的、平面的分子，其可以采用新月形，因此緊密地位于雙螺旋的小溝中，其通常置換水。小溝結(jié)合劑分子可以一般具有通過自由旋轉(zhuǎn)的鍵連接的若干芳香族環(huán)，例如呋喃環(huán)、苯環(huán)或吡咯環(huán)。小溝結(jié)合劑可為抗生素，例如紡錘菌素、偏端霉素、貝尼爾、戊烷脒和其他芳香族聯(lián)脒，Hoechst33258、SN6999、金霉抗腫瘤藥物例如色霉素和光神霉素、CC-1065、二氫環(huán)化吲哚卟啉三肽(DPI3)、1,2-二氫-(3H)-吡咯并[3,2-e]吲哚-7-羧酸鹽(CDPI3)，以及相關(guān)化合物和類似物，其包括NucleicAcidsinChemistryandBiology,第2版,Blackburn和Gait著,OxfordUniversityPress,1996，以及PCT公開申請(qǐng)WO03/078450中所描述的那些，其內(nèi)容通過引用并入本文。小溝結(jié)合劑可為引物、探針、雜交標(biāo)簽補(bǔ)序列或其組合的成分。小溝結(jié)合劑可提高其附著的引物或探針的Tm，使得這些引物或探針在較高溫度下能夠有效雜交。如在本文兩種或更多種核酸序列的情況下所使用的“相同的”或“一致性”指具有在特定區(qū)域相同的特定百分比的殘基的序列。該百分比可通過以下方式計(jì)算：最佳地對(duì)齊兩個(gè)序列，對(duì)比特定區(qū)域內(nèi)的兩個(gè)序列，確定在兩個(gè)序列中出現(xiàn)相同殘基的位置數(shù)量以獲得匹配位置的數(shù)量，用匹配位置的數(shù)量除以特定區(qū)域位置的總數(shù)，將結(jié)果乘以100以獲得序列一致性的百分比。在兩個(gè)序列具有不同長(zhǎng)度或?qū)R過程產(chǎn)生一個(gè)或更多個(gè)交錯(cuò)末端且比較的特定區(qū)域僅包含單一序列的情況下，單一序列的殘基包含于分母中，而不是計(jì)算的分子。當(dāng)比較DNA和RNA序列時(shí)，將胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)視為等同的。一致性可手動(dòng)實(shí)施或通過使用計(jì)算機(jī)序列算法例如BLAST、BLAST2.0等實(shí)施。如本文所使用的，“原位檢測(cè)”指檢測(cè)在原始位點(diǎn)的表達(dá)或表達(dá)水平，該原始位點(diǎn)在此指組織樣本例如活組織切片。如本文所使用的，“標(biāo)記”指可被光譜方法、光化學(xué)方法、生物化學(xué)方法、免疫化學(xué)方法、化學(xué)方法或其他物理學(xué)方法檢測(cè)到的組合物。標(biāo)記可為不在蛋白質(zhì)或核酸中天然存在并允許核酸或蛋白質(zhì)可檢測(cè)到的任意實(shí)體。例如，可用的標(biāo)記包括32P、熒光染料、電子致密試劑、酶、生物素、地高辛、或半抗原和可以檢測(cè)到的其他實(shí)體等。標(biāo)記可在任何位置并入核酸和蛋白質(zhì)中?！斑壿嫽貧w”是一類稱作廣義線性模型的統(tǒng)計(jì)模型類別的一部分。邏輯回歸能夠從變量集中預(yù)測(cè)離散結(jié)果如群組成員關(guān)系，變量集可為連續(xù)的、離散的、對(duì)分的或其任意混合物。從屬變量或響應(yīng)變量可為對(duì)分的，例如，兩種可能癌癥類型中的一種。邏輯回歸模擬讓步比的自然對(duì)數(shù)，即屬于第一組的概率(P)相對(duì)于屬于第二組的概率(1–P)的比例，其作為不同表達(dá)水平的線性組合(在對(duì)數(shù)空間)。通過規(guī)定當(dāng)P大于0.5或50％時(shí)情況或樣本被分類為第一類型，邏輯回歸輸出可以用作分類器。或者，在其他情況下，計(jì)算的概率P可以用作變量，例如1D或2D閾值分類器。如本文所使用的，術(shù)語“先驗(yàn)值”指每種類別的概率，例如分至不同類別并根據(jù)樣品為惡性或良性的可能性而使用，而不需要在分類中關(guān)于樣品的表達(dá)譜的其他認(rèn)識(shí)。先驗(yàn)值可為不同比例的集合，例如80％至20％的惡性-良性、75％至25％的惡性-良性、70％至30％的惡性-良性、65％至35％的惡性-良性、60％至40％的惡性-良性、50％至50％的惡性-良性(即平均的)。另外，先驗(yàn)值可為經(jīng)驗(yàn)性的，即基于樣本在訓(xùn)練組中的分布?？尚Ｕ闰?yàn)值以實(shí)現(xiàn)預(yù)定的敏感性或特異性。如本文所使用的，“標(biāo)志”為微RNA或核酸序列，將其存在或缺失在樣本中測(cè)量?！皹?biāo)志”還提供樣本狀態(tài)的指示。如本文所使用的，“惡性標(biāo)志”為在惡性樣本中比在良性樣本中以更高水平存在的微RNA或核酸序列。惡性標(biāo)志可存在于或不存在于測(cè)試樣本中。如本文所使用的，“次級(jí)標(biāo)志”為用于區(qū)分惡性樣本和良性樣本的微RNA或核酸序列，所述次級(jí)標(biāo)志在惡性樣本和良性樣本中的表達(dá)水平的差值或比值小于在惡性標(biāo)志中的表達(dá)水平的差值或比值。次級(jí)標(biāo)志可存在于或不存在于測(cè)試樣本中。如本文所使用的，“細(xì)胞型標(biāo)志”指表達(dá)與特定細(xì)胞類型有關(guān)的微RNA或核酸序列。所述細(xì)胞型通常存在于樣本中，例如血細(xì)胞、白血球、紅血球、上皮細(xì)胞、Hurthle細(xì)胞、線粒體富集細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、濾泡細(xì)胞、濾泡旁細(xì)胞(C細(xì)胞)、轉(zhuǎn)移細(xì)胞、免疫細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。包括為“細(xì)胞型標(biāo)志”的其他標(biāo)志可為物種特異性標(biāo)志，例如來自細(xì)菌、真菌等的標(biāo)志。如本文所使用的，“正規(guī)化子”指其特征(即表達(dá)水平)用于歸一化各樣品的微RNA或核酸序列。正規(guī)化子可單獨(dú)使用(一種微RNA作為正規(guī)化子)或作為正規(guī)化子集合(超過一種RNA作為正規(guī)化子，例如2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、16種、或17種微RNA可用作該集中的正規(guī)化子)的一部分。如本文所提及的，在樣本中檢測(cè)的任何微RNA可用作正規(guī)化子。為此，本文定義的作為“標(biāo)志”的微RNA也可以用作“正規(guī)化子”?；旧?，任何微RNA可以用作正規(guī)化子。為此，表示為SEQIDNO1至SEQIDNO182中任一個(gè)的微RNA可用作正規(guī)化子。表示為SEQIDNO1至SEQIDNO37中任一個(gè)的微RNA可用作正規(guī)化子?？捎米髡?guī)化子的微RNA的具體實(shí)例為hsa-miR-23a-3p、MID-20094、MID-50969、hsa-miR-345-5p、hsa-miR-3074-5p、MID-50976、MID-50971、hsa-miR-5701和hsa-miR-574-3p。數(shù)據(jù)值的“歸一化”指將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為另一比例。可以通過以下步驟實(shí)現(xiàn)歸一化：減去正規(guī)化子集合的表達(dá)平均值，減去正規(guī)化子集合的表達(dá)中值，擬合正規(guī)化子的表達(dá)值與值的參考集合(使用多項(xiàng)式擬合)并將該擬合應(yīng)用于所有特征?？墒褂盟械恼?guī)化子或正規(guī)化子亞集合。如本文所使用的，“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”指至少兩個(gè)核苷酸共價(jià)地鍵結(jié)在一起。單鏈的描述也定義了互補(bǔ)鏈的序列。因此，核酸也包括所描述的單鏈的互補(bǔ)鏈。出于相同目的，核酸的多種變體可以用作給定的核酸。因此，核酸也包括基本相同的核酸和其互補(bǔ)鏈。單鏈可以提供在嚴(yán)格雜交條件下與靶序列雜交的探針。因此，核酸還包括在嚴(yán)格雜交條件下雜交的探針。核酸可為單鏈或雙鏈，或者可含有雙鏈-單鏈序列和單鏈-雙鏈序列二者的部分。核酸可以為DNA、基因組和cDNA兩者、RNA、或其中核酸可以含有脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的組合的雜合體，以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤、肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、異胞嘧啶和異鳥嘌呤的堿基對(duì)組合。通過化學(xué)合成法或通過重組法可以獲得核酸。盡管可以包括核酸類似物，核酸一般含有磷酸二酯鍵。類似物可以包括非天然存在的鍵、主鏈或核苷酸。類似物可以具有至少一個(gè)不同鍵，例如氨基磷酸酯鍵、硫代磷酸酯鍵、二硫代磷酸酯鍵、O-甲基氨基亞磷酸酯鍵以及肽核酸主鏈和鍵。其他核酸類似物包括具有正向主鏈、非離子主鏈和非核糖主鏈的那些，包括US5235033和US5034506中描述的那些，其通過引用并入本文。含有一種或更多種非天然存在的核苷酸或修飾的核苷酸的核酸也包括于核酸的一種定義中。修飾的核苷酸類似物可以位于例如核酸分子的5'末端和/或3'末端。核酸類似物的代表性實(shí)例可以選自糖修飾或主鏈修飾的核糖核苷酸。然而應(yīng)注意的是，堿基修飾的核糖核苷酸，即含有非天然存在堿基代替天然存在堿基的核糖核苷酸，例如在5位置修飾的尿苷或胞嘧啶核苷，例如5-(2-氨基)丙基尿苷、5-溴尿苷；在8位置修飾的腺苷和鳥苷，例如8-溴鳥苷；去氮核苷酸，例如7-去氮腺苷；O-烷基化核苷酸和N-烷基化核苷酸，例如N6-甲基腺苷也是合適的。2'-OH-基團(tuán)可以由選自以下的基團(tuán)替代：H、OR、R、鹵素、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN，其中R為C1至C6的烷基、烯基或炔基，鹵素為F、Cl、Br或I。修飾的核苷酸還包括與膽固醇通過例如羥脯氨醇鍵共軛的核苷酸，其如Krutzfeldt等人(Nature2005；438:685-689),Soutschek等人(Nature2004；432:173-178)和WO2005/079397中所描述的，其通過引用并入本文?？捎捎诓煌?qū)颂橇姿嶂麈溸M(jìn)行修飾，例如以提高這種分子在生理環(huán)境下的穩(wěn)定性和半衰期，增強(qiáng)穿過細(xì)胞膜的擴(kuò)散，或作為生物芯片的探針。主鏈修飾還可以增強(qiáng)抗降解性，例如在細(xì)胞內(nèi)吞作用環(huán)境中。主鏈修飾還可減小由肝細(xì)胞導(dǎo)致的核酸清除，例如在肝臟和甲狀腺中?？梢灾苽涮烊淮嬖诤塑账岷皖愃莆锏幕旌衔铩；蛘撸梢灾苽洳煌塑账犷愃莆锏幕旌衔?、天然存在核苷酸和類似物的混合物。因此，本文提供新的分離核苷酸。本文提供的核酸可以為非天然存在的、合成的核酸。因此，本文提供的核酸可以為合成核酸。合成核酸的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，在例如US7579451中描述，其內(nèi)容通過引用并入本文。核酸可包括序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:308中的至少一個(gè)或其變體。在一個(gè)實(shí)施方式中，核酸包括序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:182中的至少一個(gè)。變體可以為參照核苷酸序列的互補(bǔ)序列。變體可為70％、75％、80％、85％、90％或95％與參照核苷酸序列或其互補(bǔ)序列一致性的核苷酸序列。變體可以為在嚴(yán)格條件下與參照核苷酸序列、其互補(bǔ)序列、或基本與其相同的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。本文描述的核酸可以具有約10個(gè)至約250個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。核苷酸可以具有至少10個(gè)、11個(gè)、12個(gè)、13個(gè)、14個(gè)、15個(gè)、16個(gè)、17個(gè)、18個(gè)、19個(gè)、20個(gè)、21個(gè)、22個(gè)、23個(gè)、24個(gè)、25個(gè)、26個(gè)、27個(gè)、28個(gè)、29個(gè)、30個(gè)、35個(gè)、40個(gè)、45個(gè)、50個(gè)、60個(gè)、70個(gè)、80個(gè)、90個(gè)、100個(gè)、125個(gè)、150個(gè)、175個(gè)、200個(gè)或250個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。可以使用合成基因在細(xì)胞中合成或表達(dá)(體外或體內(nèi))核酸。核酸可作為單鏈分子合成并與基本上互補(bǔ)的核酸雜交以形成雙鏈體。核酸可以單鏈或雙鏈形式引入細(xì)胞、組織或器官，或能夠通過合成基因使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法而被表達(dá)，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法包括如在US6506559中所描述的，其內(nèi)容通過引用并入本文。核酸可以包括如表1所示的微RNA序列或其變體。在某些情況下，相同微RNA的變體也提供于表1中。應(yīng)注意的是，表1中的SEQIDNO.1至SEQIDNO.180表示與天然存在微RNA的序列對(duì)應(yīng)的cDNA，即該序列以胸腺嘧啶(T)代替尿嘧啶(U)出現(xiàn)。應(yīng)理解，核酸指脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、或修飾核苷酸以及其以單鏈或雙鏈形式的聚合物。該術(shù)語包括含已知核苷酸類似物或修飾的主鏈殘基或鍵的核酸，其為合成的、天然存在的和非天然存在的，其具有與參照核酸相似的結(jié)合性能，并以與參照核酸類似方式進(jìn)行新陳代謝。該類似物的實(shí)例包括但不限于，硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)和解鎖核酸(UNA；參見例如Jensen等人，NucleicAcidsSymposiumSeries52:133-4)、及其衍生物。核甘酸如本領(lǐng)域公知地使用，包括本領(lǐng)域所熟知的具有天然堿基(標(biāo)準(zhǔn))和修飾的堿基的那些。這些堿基一般位于核苷酸糖部分的1'位置。核苷酸一般包含堿基、糖和磷酸酯基團(tuán)。核苷酸可以為在糖部分、磷酸酯部分和/或堿基部分不經(jīng)修飾或經(jīng)修飾，也可交換地稱為核苷酸類似物、修飾核苷酸、非天然核苷酸、非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸以及其他(參見例如WO92/07065；WO93/15187，其內(nèi)容通過引用并入本文)。本領(lǐng)域已知的修飾核酸堿基的若干實(shí)例如Limbach等人NucleicAcidsRes.22:2183,1994總結(jié)的?？梢砸牒怂岱肿又械膲A基修飾的一些非限制性實(shí)例包括次黃嘌呤、嘌呤、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2,4,6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氫尿苷、萘基、氨基苯基、5-烷基胞苷(例如5-甲基胞苷)、5-烷基尿苷(例如核糖胸核苷)、5-鹵尿苷(例如5-溴尿苷)或6-氮嘧啶或6-烷基嘧啶(例如6-甲基尿苷)、丙炔以及其他(Burgin等人，Biochemistry35:14090,1996)。該方面中的“修飾堿基”指在1'位置不同于腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶或其等同物的核苷酸堿基。修飾核苷酸指具有一個(gè)或更多個(gè)對(duì)核苷、堿基、戊糖環(huán)或磷酸酯基團(tuán)修飾的核苷酸。修飾包括通過修飾核苷酸的酶修飾而獲得的天然存在的那些，所述酶例如甲基轉(zhuǎn)移酶。修飾核苷酸還包括合成的或非天然存在的核苷酸。核苷酸中合成的或非天然存在的核苷酸修飾包括具有2’位修飾的那些，例如2'-甲氧基乙氧基、2'-氟、2'-烯丙基，2'-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基]、4'-巰基、4'-CH2-O-2'-橋，4'-(CH2)2-O-2'-橋、2'-LNA或其他二環(huán)或“橋的”核苷類似物，和2'-O-(N-氨基甲酸甲酯)，或包含堿基類似物的那些。如本公開所描述的，與2’位修飾核苷酸有關(guān)的“氨基”指2'-NH2或2'-O-NH2，其可為修飾的或未修飾的。這種修飾基團(tuán)例如在US5672695和US6248878中描述。本發(fā)明“修飾核苷酸”也可以包括如上所述的核苷酸類似物。如本文使用的，“堿基類似物”指位于修飾核酸中的核酸糖部分1’位置的雜環(huán)部分，其能夠并入核酸雙鏈體中(或在核酸糖部分取代物的等同位置，其能夠并入核酸雙鏈體中)。堿基類似物一般為除常見堿基鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)以外的嘌呤堿基或嘧啶堿基。堿基類似物可與dsRNA中的其他堿基或堿基類似物成為雙鏈體。堿基類似物包括在發(fā)明的化合物和方法中使用的那些，例如，US5432272、US6001983和US7579451中公開的那些，其通過引用并入本文。堿基的非限制性實(shí)例包括次黃嘌呤(I)、黃嘌呤(X)、313-D-呋喃核糖基-(2,6-二氨基嘧啶)(K)、3-γ-D-呋喃核糖基-(1-甲基-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5,7(4H，6H)-二酮)(P)、異胞嘧啶(iso-C)、異鳥嘌呤(iso-G)、1-γ-D-呋喃核糖基-(5-硝基吲哚)、1-γ-D-呋喃核糖基-(3-硝基吡咯)、5-溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤、4-硫代-dT、7-(2-噻吩基)-咪唑并[4,5-b]吡啶(Ds)和吡咯-2-甲醛(Pa)、2-氨基-6-(2-噻吩基)嘌呤(S)、2-氧代吡啶(Y)、二氟甲苯基、4-氟-6-甲基苯并咪唑、4-甲基苯并咪唑、3-甲基異喹諾基、5-甲基異喹諾基和3-甲基-7-丙炔基異喹諾基、7-氮雜吲哚基、6-甲基-7-氮雜吲哚基、咪唑并吡啶基、9-甲基-咪唑并吡啶基、pyrrolopyrizinyl、異喹諾基、7-丙炔基異喹諾基、丙炔基-7-氮雜吲哚基、2,4,5-三甲基苯基、4-甲基吲哚基、4,6-二甲基吲哚基、苯基、萘基、蒽基、菲基、芘基、茋基、并四苯基、并五苯基及其結(jié)構(gòu)衍生物(Schweitzer等人,J.Org.Chem.,59:7238-7242(1994)；Berger等人,NucleicAcidsResearch,28(15):2911-2914(2000)；Moran等人,J.Am.Chem.Soc.,119:2056-2057(1997)；Morales等人,J.Am.Chem.Soc.,121:2323-2324(1999)；Guckian等人,J.Am.Chem.Soc.,118:8182-8183(1996)；Morales等人,J.Am.Chem.Soc.,122(6):1001-1007(2000)；McMinn等人，J.Am.Chem.Soc.,121:11585-11586(1999)；Guckian等人,J.Org.Chem.,63:9652-9656(1998)；Moran等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,94:10506-10511(1997)；Das等人,J.Chem.Soc.,PerkinTrans.,1:197-206(2002)；Shibata等人,J.Chem.Soc.,PerkinTrans.,1:1605-1611(2001)；Wu等人，J.Am.Chem.Soc.,122(32):7621-7632(2000)；O'Neill等人,J.Org.Chem.,67:5869-5875(2002)；Chaudhuri等人,J.Am.Chem.Soc.,117:10434-10442(1995)；U.S.專利第6218108號(hào))。堿基類似物還可為通用堿基?！巴ㄓ脡A基”指在修飾核苷酸中位于核苷酸糖部分1'位置的雜環(huán)部分，或者在核酸糖部分取代物的等同位置，當(dāng)存在于核酸雙鏈體中時(shí)，其可位于超過一種堿基相反而不改變雙螺旋結(jié)構(gòu)(例如磷脂主鏈的結(jié)構(gòu))。另外，通用堿基不破壞其所存在于雙鏈體的單鏈核酸形成靶向核酸的能力。表1：本發(fā)明的微RNA1“N”可為G、C、A、T/U中的任一個(gè)；miR名稱為miRBase注冊(cè)名稱(20期)，除了由MID-[數(shù)字]或MD2-[數(shù)字]表示的miR名稱；MID-00078、MID-00321、MID-00387、MID-00671、MID-00672、MID-00690、MID-15965、MID-16318、MID-17144、MID-17866、MID-18468、MID-19433、MID-19434、MID-23168、MID-23794、MID-24496、MID-24705、MD2-495和MD2-437為假定的微RNA，其在RosettaGenomics被預(yù)測(cè)和/或克隆。核酸也包括表2中所示的微RNA發(fā)夾序列或其變體。表2：本發(fā)明的微RNA發(fā)夾應(yīng)注意的是，表2中的SEQIDNO.183至SEQIDNO.306表示與天然存在pre-miR的序列對(duì)應(yīng)的cDNA，即該序列以胸腺嘧啶(T)代替尿嘧啶(U)出現(xiàn)。核酸可以以核酸復(fù)合物的形式，可以還包括肽、蛋白質(zhì)、RNA-DNA雜合體、抗體、抗體片段、Fab片段或適配子的一種或更多種。核酸可以包括pri-miRNA序列或其變體。pri-微RNA序列可包括45個(gè)至30000個(gè)、50個(gè)至25000個(gè)、100個(gè)至20000個(gè)、1000個(gè)至1500個(gè)或80個(gè)至100個(gè)核苷酸。pri-miRNA序列可包含如本文所述的pre-miRNA、miRNA和miRNA*及其變體。pri-miRNA序列可以包括SEQIDNO.183至SEQIDNO.308或其變體中的任意序列。pri-miRNA可以包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)。發(fā)夾可以包含基本互補(bǔ)的第一核酸序列和第二核酸序列。第一核酸序列和第二核酸序列可以來自37個(gè)至50個(gè)核苷酸。第一核酸序列和第二核酸序列可以被來自8個(gè)至12個(gè)核苷酸的第三序列分離。如Hofacker等人所描述的，該發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以具有小于-25千卡/摩爾的自由能，其由含默認(rèn)參數(shù)的Vienna算法計(jì)算(Monatsheftef.Chemie1994；125:167-188)，其內(nèi)容通過引用并入本文。該發(fā)夾可以具有4個(gè)至20個(gè)、8個(gè)至12個(gè)或10個(gè)核苷酸的末端循環(huán)。pri-miRNA可以包括至少19％的腺苷核苷酸、至少16％的胞嘧啶核苷酸、至少23％的胸腺嘧啶核苷酸和至少19％的鳥嘌呤核苷酸。核酸也可以包括pre-miRNA序列或其變體。pre-miRNA序列可以包括45個(gè)至90個(gè)、60個(gè)至80個(gè)或60個(gè)至70個(gè)核苷酸。pre-miRNA序列可以包含如本文所述的miRNA和miRNA*。pre-miRNA序列還可以為不包含從pri-miRNA的5’和3’末端算起的0至160個(gè)核苷酸的pre-miRNA序列。pre-miRNA序列可以包括序列SEQIDNO.183至SEQIDNO.308或其變體。如本文所描述的，核酸可為在8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、11個(gè)、12個(gè)、13個(gè)、14個(gè)、15個(gè)、16個(gè)、17個(gè)、18個(gè)、19個(gè)、20個(gè)、21個(gè)、22個(gè)、23個(gè)、24個(gè)、25個(gè)、30個(gè)、35個(gè)、40個(gè)、45個(gè)、50個(gè)或更多個(gè)核苷酸區(qū)域中，與表1或表2中的核酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％一致性(80％至99％具有1％增量)。核酸還可以包括微RNA序列(包括miRNA*)或其變體，包括那些由MID-[數(shù)字]表示的假定微RNA。如本文所提及的，微RNA包括已經(jīng)列于miRBase注冊(cè)名稱(發(fā)行20)中的那些miR，以及已經(jīng)由RosettaGenomics預(yù)測(cè)和/或克隆并由MID-[數(shù)字]表示的假定微RNA。微RNA序列可以包括13個(gè)至33個(gè)、18個(gè)至24個(gè)或21至23個(gè)核苷酸。微RNA可以具有總計(jì)至少5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、11個(gè)、12個(gè)、13個(gè)、14個(gè)、15個(gè)、16個(gè)、17個(gè)、18個(gè)、19個(gè)、20個(gè)、21個(gè)、22個(gè)、23個(gè)、24個(gè)、25個(gè)、26個(gè)、27個(gè)、28個(gè)、29個(gè)、30個(gè)、31個(gè)、32個(gè)、33個(gè)、34個(gè)、35個(gè)、36個(gè)、37個(gè)、38個(gè)、39個(gè)或40個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。微RNA序列可為pre-miRNA中最初的13個(gè)至33個(gè)核苷酸。微RNA序列也可以為pre-miRNA中最后的13個(gè)至33個(gè)核苷酸。微RNA序列可以包括SEQIDNO.1至SEQIDNO.182中任一個(gè)的序列或其變體。本發(fā)明使用微RNA用于甲狀腺結(jié)節(jié)的鑒別、分類和診斷。如本文所使用的，“變體”指核酸，其意為(i)參照核苷酸序列的部分；(ii)參照核酸苷序列或其部分的互補(bǔ)序列；(iii)通過點(diǎn)突變而與參照核苷酸序列或其互補(bǔ)序列不同的核酸；(iv)存在普通群組中的參照核苷酸序列的天然存在變體或其互補(bǔ)序列；或(iv)在嚴(yán)格條件下與參照核酸或其互補(bǔ)序列雜交的核酸。如本文所使用的，“探針”指能夠通過一種或更多種化學(xué)鍵與靶核酸互補(bǔ)序列結(jié)合的寡核苷酸，通常通過互補(bǔ)堿基對(duì)，通常經(jīng)過氫鍵形成。取決于雜交條件的嚴(yán)格性，探針可以結(jié)合缺少與探針序列完整互補(bǔ)的靶序列。例如，為進(jìn)行雜交試驗(yàn)，探針可以與被檢測(cè)的微RNA序列中至少8個(gè)、至少9個(gè)、至少10個(gè)、至少11個(gè)、至少12個(gè)、至少13個(gè)、至少14個(gè)、至少15個(gè)、至少16個(gè)、至少17個(gè)、至少18個(gè)、至少19個(gè)、至少20個(gè)連續(xù)核苷酸互補(bǔ)?；蛘?，為進(jìn)行PCR試驗(yàn)，探針可與被檢測(cè)的PCR產(chǎn)物中至少8個(gè)、至少9個(gè)、至少10個(gè)、至少11個(gè)、至少12個(gè)、至少13個(gè)、至少14個(gè)、至少15個(gè)、至少16個(gè)、至少17個(gè)、至少18個(gè)、至少19個(gè)、至少20個(gè)連續(xù)核苷酸互補(bǔ)。因此，探針可與其靶核酸的至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％互補(bǔ)或雜交。探針可以為單鏈或部分單鏈和部分雙鏈的。探針的成鏈?zhǔn)怯山Y(jié)構(gòu)、組成和靶序列特性所控制的。探針可以包括標(biāo)記、附著物、或者本文描述的非天然存在于核酸中的核苷酸序列。例如使用可結(jié)合鏈霉親和素復(fù)合物的生物素，探針可被直接標(biāo)記或間接標(biāo)記。“探針”可以為檢測(cè)本文描述的核酸序列的試劑。探針可以為標(biāo)記的核酸探針，其能夠與本發(fā)明核酸序列的部分或由其派生的擴(kuò)增產(chǎn)物雜交。在一些實(shí)施方式中，核酸探針為本文公開的核酸序列的反向互補(bǔ)的核酸分子。探針可以為在嚴(yán)格條件下與本文公開的核酸充分特異性雜交的核酸序列。探針任選地使用熒光分子標(biāo)記，熒光分子例如熒光素，如6-羧基熒光素(FAM)、吲哚羰花青如QUASAR-670(QUA)、六熒光素(hexafluorocine)如6-羧基六熒光素(HEX)、或其他熒光團(tuán)分子和任選的猝滅劑。猝滅劑優(yōu)選與熒光團(tuán)匹配。猝滅劑的示例性實(shí)施例為黑洞猝滅劑BHQ1和黑洞猝滅劑BHQ2，或小溝結(jié)合劑(MGB)，例如二氫環(huán)吡咯并吲哚三肽。其他熒光團(tuán)和猝滅劑是本領(lǐng)域已知的，并在本文中是類似可用的。因此，本發(fā)明還提供探針，所述探針具有本文描述的新核酸序列，其定義為SEQIDNO.27至SEQIDNO.29、SEQIDNO.33、SEQIDNO.34、SEQIDNO.139、SEQIDNO.140、SEQIDNO.307和SEQIDNO.308中的任一種或其變體。探針可以用于篩查方法和診斷方法。探針可以附著于或固定于固體載體例如生物芯片上。探針可以具有8個(gè)至500個(gè)、10個(gè)至100個(gè)或20個(gè)至60個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。探針可以具有至少8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、11個(gè)、12個(gè)、13個(gè)、14個(gè)、15個(gè)、16個(gè)、17個(gè)、18個(gè)、19個(gè)、20個(gè)、21個(gè)、22個(gè)、23個(gè)、24個(gè)、25個(gè)、26個(gè)、27個(gè)、28個(gè)、29個(gè)、30個(gè)、35個(gè)、40個(gè)、45個(gè)、50個(gè)、60個(gè)、70個(gè)、80個(gè)、90個(gè)、100個(gè)、120個(gè)、140個(gè)、160個(gè)、180個(gè)、200個(gè)、220個(gè)、240個(gè)、260個(gè)、280個(gè)或300個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。探針還可以具有10個(gè)至60個(gè)核苷酸的接頭序列。探針還可以包含接頭。該接頭可以包含本文描述的非天然存在于核酸序列的序列。接頭可具有10個(gè)至60個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。接頭可以具有20個(gè)至27個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。接頭可以為足以使探針總長(zhǎng)度為45個(gè)至60個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。接頭可以無法形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，或無法自身折疊，或無法在含于探針中的核苷酸的非接頭部分上折疊。接頭序列為異源的，其可以不出現(xiàn)在動(dòng)物基因組中，探針非接頭核酸來自該動(dòng)物。如本文所使用的，術(shù)語“參考值”指相比于試驗(yàn)結(jié)果，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上和具體結(jié)果相關(guān)的值。在一個(gè)實(shí)施方式中，參考值由將微RNA表達(dá)和已知臨床結(jié)果比較的研究的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析確定。在另一個(gè)實(shí)施方式中，參考值可以根據(jù)所使用的分類器(即算法)而不同。因此，參考值可以為訓(xùn)練數(shù)據(jù)中的所有微RNA的表達(dá)水平(或值)。參考值可以為由分類器建立的一個(gè)或更多個(gè)閾值。參考值還可以為系數(shù)或系數(shù)集合?；旧蠀⒖贾抵杆惴ㄐ枰幕蚴褂玫娜魏螀?shù)。如本文所使用的，“敏感性”可以指二元分類測(cè)試在多大程度上正確識(shí)別條件的統(tǒng)計(jì)學(xué)測(cè)量，例如其在多大頻率上將癌正確分類為兩種可能類型中的正確類型。如通過一些絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)或金標(biāo)準(zhǔn)所確定的，A類的敏感性為由測(cè)試確定的屬于A類的情況在A類情況中所占的比例。如本文所使用的，“敏感性”可以指分類測(cè)試在多大程度上正確識(shí)別條件的統(tǒng)計(jì)學(xué)測(cè)量，例如其在多大頻率上將癌正確分類為兩種或更多種可能類型中的正確類型。如通過一些絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)或金標(biāo)準(zhǔn)所確定的，A類的敏感性為由測(cè)試確定的屬于A類的情況在A類情況中所占的比例。如本文所使用的，“涂片”指用于檢測(cè)、一般用于醫(yī)療診斷的薄鋪于顯微鏡載片的甲狀腺組織樣本。FNA涂片通常具有非常少量的細(xì)胞，這導(dǎo)致少量的RNA，相應(yīng)地RNA的量可以為1ng至1000ng、1ng至100ng、1ng至50ng、1ng至40ng。涂片可使用領(lǐng)域技術(shù)人員已知的細(xì)胞學(xué)、組織學(xué)或病理學(xué)上任意著色劑染色，例如在病理學(xué)樣本中用于區(qū)分細(xì)胞的任意著色劑。著色劑的實(shí)例為多色著色劑，例如Papanicolaou，其為細(xì)胞核著色劑和細(xì)胞質(zhì)著色劑的組合；細(xì)胞結(jié)構(gòu)著色劑例如Wright、Giemsa、Romanowsky等；細(xì)胞核著色劑例如Hoescht著色劑等；細(xì)胞生存力著色劑例如Trypanblue等，酶活性，例如對(duì)于HRP的聯(lián)苯胺以形成可見的沉淀等。如本文所使用的，“特異性”可指二元分類測(cè)試在多大程度上正確識(shí)別不具有特定條件的情況的統(tǒng)計(jì)學(xué)測(cè)量，例如，當(dāng)樣本為非癌性樣本時(shí)，二元分類測(cè)試在多大頻率上將樣本正確歸類為非癌性。如通過一些絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)或金標(biāo)準(zhǔn)所確定的，A類的特異性為由測(cè)試確定的屬于“非A”類的情況在“非A”類情況中所占的比例。如本文所使用的，“特異性”可指分類測(cè)試在多大程度上正確識(shí)別不具有特定條件的情況的統(tǒng)計(jì)學(xué)測(cè)量。如通過一些絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)或金標(biāo)準(zhǔn)所確定的，A類的特異性為由測(cè)試確定的不屬于A類的情況在A類情況中所占的比例。如本文所使用的，“癌癥的階段”指癌癥進(jìn)展水平的數(shù)據(jù)化測(cè)量。用于確定癌癥階段的標(biāo)準(zhǔn)包括但不限于，腫瘤尺寸、腫瘤是否擴(kuò)散到身體其他部位和癌癥已經(jīng)擴(kuò)散的位置(例如在身體的相同器官或區(qū)域以內(nèi)還是擴(kuò)散到其他器官)。如本文所使用的，“嚴(yán)格雜交條件”指在該條件下第一核酸序列(例如探針)與第二核酸序列(例如靶)雜交，例如在核酸的復(fù)合混合物中。嚴(yán)格條件為序列依賴性的，在不同環(huán)境下是不同的。嚴(yán)格條件可以選擇為在定義的離子強(qiáng)度pH下，低于特定序列的熱熔點(diǎn)(Tm)約5℃至10℃。Tm可以為在平衡(靶序列在Tm過量存在，50％的探針在平衡時(shí)被占據(jù))時(shí)50％的與目標(biāo)互補(bǔ)探針與靶序列雜交的溫度(在定義的離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下)。嚴(yán)格條件可為鹽濃度小于約1.0M鈉離子，例如在pH7.0至8.3下約0.01至1.0M鈉離子濃度(或其他鹽)，對(duì)于短探針(例如約10個(gè)至50個(gè)核苷酸)，溫度為至少約30℃，對(duì)于長(zhǎng)探針(例如大于約50個(gè)核苷酸)，溫度為至少約60℃。嚴(yán)格條件還可以通過添加去穩(wěn)定劑例如甲酰胺實(shí)現(xiàn)。對(duì)于選擇性或特異性雜交，陽性特征可以為背景雜交的至少2至10倍。示例性嚴(yán)格雜交條件包括以下：50％的甲酰胺、5xSSC和1％的SDS，在42℃下保溫，或5xSSC，1％的SDS，在65℃下保溫，在0.2xSSC中洗滌，以及在65℃下0.1％的SDS、DMSO、6XSSPE+0.005％的N-月桂酰肌氨酸+0.005％的TritonX-102、0.06X的SSPE+0.005％的N-月桂酰肌氨酸+0.005％的TritonX-102。如本文所使用的，術(shù)語“受試者”指哺乳動(dòng)物，包括人類和其他哺乳動(dòng)物。本發(fā)明的方法優(yōu)選應(yīng)用于人類受試者。如本文所使用的，“癌癥的亞型”指影響相同器官的癌癥不同類型(例如，甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺濾泡性癌和甲狀腺乳頭狀癌的濾泡性變體)。如本文所使用的，“甲狀腺病變”可指甲狀腺腫瘤，包括甲狀腺腫瘤的亞型，例如Hashimoto病、濾泡型癌、乳頭狀癌、乳頭狀癌的濾泡性病變(FVPC或FVPTC)、包膜內(nèi)型FVPC(或包膜內(nèi)型FVPTC)、非包膜內(nèi)型(滲透的/擴(kuò)散的)FVPC或FVPTC、髓樣癌、未分化甲狀腺癌、或低分化甲狀腺癌。如本文所使用的，短語“閾值表達(dá)譜”指測(cè)量值與之比較以將腫瘤分類的標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)譜。如本文所使用的，組織樣本為使用相關(guān)醫(yī)療領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的方法由組織活檢獲得的組織。如本文所使用的，短語“疑似癌性的”指醫(yī)療領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為含有癌細(xì)胞的癌組織樣品。由活組織檢查獲得樣本的方法包括包塊的粗分配、顯微解剖、激光顯微解剖或其他本領(lǐng)域已知的細(xì)胞分離方法。如本文所使用的，“腫瘤”指所有贅生性細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，無論惡性或良性，以及所有癌前和癌性細(xì)胞和組織。本文所使用的甲狀腺病變或腫瘤樣本的細(xì)胞學(xué)分類是基于“TheBethesdaSystemforReportingThyroidCytopathology”,“BSRTC”(Syed,Z.Ali和EdmundS.Cibas著；DOI10.1007/978-0-387-87666-5_1；SpringerScience+BusinessMedia,LLC2010)。BSRTC推薦帶有一般診斷分類的各種甲狀腺FNA報(bào)告，其中每種分類具有隱含的患癌風(fēng)險(xiǎn)。Bethesda分類推薦的命名法如下所示：I.非診斷性的或不符合要求的僅囊腫液幾乎為非細(xì)胞樣本其他(渾濁的血液、凝血制品等)。II.良性與良性濾泡性結(jié)節(jié)(包括類腺瘤結(jié)節(jié)、胞質(zhì)結(jié)節(jié)等)一致在適當(dāng)?shù)呐R床條件下，與淋巴細(xì)胞性(Hashimoto)甲狀腺炎一致與肉芽腫(亞急性)甲狀腺炎一致其他III.未定類顯著性的異型性或未定類顯著性的濾泡性病變IV.濾泡性腫瘤或疑似濾泡性腫瘤特別在Hurthle細(xì)胞(嗜酸瘤細(xì)胞)型V.疑似惡性疑似乳頭狀癌疑似髓樣癌疑似轉(zhuǎn)移性癌疑似淋巴瘤其他VI.惡性乳頭狀甲狀腺癌低分化癌甲狀腺髓樣癌不分化(未分化)癌鱗狀細(xì)胞癌具有混合特性的癌轉(zhuǎn)移性癌非霍奇金淋巴瘤其他如本文所使用的，“未定類”指進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢查并根據(jù)Bethesda分類而分類為III、IV和V類的甲狀腺病變或腫瘤樣本。本發(fā)明還提供用于鑒別受試者中甲狀腺病變亞型的方法，所述甲狀腺病變亞型為甲狀腺腫瘤的所述惡性亞型或良性亞型。亞型為以下任一種：濾泡性癌、乳頭狀癌、乳頭狀癌的濾泡性變體(FVPC或FVPTC)、包膜內(nèi)型FVPC(或包膜內(nèi)型FVPTC)、非包膜內(nèi)型FVPC(或非包膜內(nèi)FVPTC)、髓樣癌、未分化甲狀腺癌或低分化甲狀腺癌。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述亞型為Hashimoto甲狀腺炎、濾泡性腺瘤或增生中的任一種。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述亞型為Hashimoto細(xì)胞癌。在另一方面，本發(fā)明提供用于區(qū)分濾泡性腺瘤和濾泡性癌的方法。在另一方面，本發(fā)明提供用于區(qū)分濾泡性腺瘤和乳頭狀癌的方法。在另一方面，本發(fā)明提供用于區(qū)分濾泡性腺瘤和乳頭狀癌的濾泡性變體的方法。在另一方面，本發(fā)明提供用于區(qū)分乳頭狀癌的非包膜內(nèi)型濾泡性變體和良性病變的方法。在另一方面，本發(fā)明提供用于區(qū)分乳頭狀癌和Hashimoto甲狀腺炎的方法?！拜d體”指任意已知載體例如質(zhì)粒載體、噬菌體載體、噬菌粒載體、粘粒載體或病毒載體。本文所述的核酸可包含于載體中。載體可用于輸送核酸。載體優(yōu)選至少含有提高所負(fù)載核酸表達(dá)的啟動(dòng)子，在該情況下，核酸優(yōu)選與該啟動(dòng)子切實(shí)連接。載體在宿主細(xì)胞中是或不是可復(fù)制的，基因轉(zhuǎn)錄可以在宿主細(xì)胞的細(xì)胞核外或細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行。在后述情況下，核酸可以包含于宿主細(xì)胞的基因組。載體可以為DNA載體或RNA載體。載體可以為可自我復(fù)制型染色體外載體或融入宿主基因組的載體。在本發(fā)明方法或方案的一個(gè)實(shí)施方式中，通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測(cè)量微RNA水平。cDNA的靶序列通過靶RNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，其可以為本文描述的核酸(包含表1和表2中提供的序列)。產(chǎn)生cDNA的已知方法涉及逆轉(zhuǎn)錄聚腺苷酸或逆轉(zhuǎn)錄具有連接的銜接子序列的RNA。在逆轉(zhuǎn)錄之前，RNA可以連接于銜接子序列。通過T4RNA連接酶可進(jìn)行連接反應(yīng)以在RNA的3’末端連接銜接子序列。然后可以使用引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)，該引物具有與銜接子序列的3’末端互補(bǔ)的序列。或者，使用包含5’銜接子序列poly(T)引物，聚腺苷酸RNA可以用于逆轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)中。poly(T)序列可以包含8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、11個(gè)、12個(gè)、13個(gè)或14個(gè)連續(xù)胸腺嘧啶。然后使用包含與靶核酸互補(bǔ)的至少15個(gè)核苷酸和5’末端序列的特異性正向引物，與銜接子序列的3’末端互補(bǔ)的反向引物和包含與靶核酸互補(bǔ)的至少8個(gè)核酸的探針，通過實(shí)時(shí)PCR可以擴(kuò)增RNA的逆轉(zhuǎn)錄。該探針可部分與銜接子序列的5’末端互補(bǔ)?？赏ㄟ^PCR等進(jìn)行靶核酸(微RNA，包括本文描述的假定性微RNA)逆轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)的第一循環(huán)可具有56℃、57℃、58℃、59℃或60℃的退火溫度。第一循環(huán)可包含1個(gè)至10個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)的剩余循環(huán)可為60℃。剩余循環(huán)可具有2個(gè)至40個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)具有正向引物。在一個(gè)實(shí)施方式中，正向引物可具有與靶核酸相同的15個(gè)、16個(gè)、17個(gè)、18個(gè)、19個(gè)、20個(gè)或21個(gè)核苷酸。正向引物的3’末端可對(duì)靶核酸和高度相似序列之間的序列差異性敏感。正向引物還可以具有5’突出末端。5’末端可以提高正向引物的熔融溫度。5’末端的序列可以包含與靶核酸不相同的序列。5’末端的序列也可以是合成的。5’末端可以包含8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、11個(gè)、12個(gè)、13個(gè)、14個(gè)、15個(gè)或16個(gè)核苷酸。本發(fā)明使用的正向引物實(shí)例提供于表8中。PCR反應(yīng)包含反向引物。反向引物可以與靶核酸互補(bǔ)。反向引物也可以包含與銜接子序列互補(bǔ)的序列。本發(fā)明使用的反向引物實(shí)例提供于實(shí)施例8中。用于檢測(cè)RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的探針可為通用探針或序列特異性探針。通用探針設(shè)計(jì)為以非序列特異性方式檢測(cè)RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(或與其雜交)。所述探針為16個(gè)至20個(gè)核苷酸長(zhǎng)，優(yōu)選18個(gè)核苷酸長(zhǎng)，并包含與RT引物反向互補(bǔ)的序列，在5’末端包含4個(gè)腺嘌呤(A)。序列特異性探針設(shè)計(jì)為基于在探針序列和RT-PCR產(chǎn)物序列之間全部或部分的互補(bǔ)性檢測(cè)RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(或與其雜交)。所述探針為20個(gè)至28個(gè)核苷酸長(zhǎng)，優(yōu)選24個(gè)核苷酸長(zhǎng)，并在5’末端包含3個(gè)核苷酸，其中至少兩個(gè)為與RT引物互補(bǔ)，然后是10至14個(gè)、優(yōu)選12個(gè)胸腺嘧啶(T)，然后是6個(gè)至10個(gè)、優(yōu)選8個(gè)連續(xù)核苷酸，其對(duì)應(yīng)于特異性對(duì)應(yīng)的微RNA的反向互補(bǔ)序列。提供包含本文描述的新核苷酸的生物芯片。在一個(gè)實(shí)施方式中，該生物芯片可以包含識(shí)別本文所述的新核苷酸的探針。所述核酸為分離的核酸，其包含至少12個(gè)連續(xù)核苷酸，其與SEQIDNO.27至SEQIDNO.29、SEQIDNO.33、SEQIDNO.34、SEQIDNO.139、SEQIDNO.140、SEQIDNO.307和SEQIDNO.308中任一的序列至少80％一致性。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述分離的核酸包含至少13個(gè)、至少14個(gè)、至少15個(gè)、至少16個(gè)、至少17個(gè)、至少18個(gè)、至少19個(gè)或至少20個(gè)連續(xù)核苷酸，其與SEQIDNO.27至SEQIDNO.29、SEQIDNO.33、SEQIDNO.34、SEQIDNO.139、SEQIDNO.140、SEQIDNO.307和SEQIDNO.308中任一的序列具有一致性。該生物芯片可以包括含有附著的核酸的固體載體、本文描述的探針或多個(gè)探針。該探針在嚴(yán)格雜交條件下能夠與靶序列雜交。探針可以附著于載體上空間限定的位置。每個(gè)靶序列可以使用超過一個(gè)探針，可以為重疊探針或?yàn)獒槍?duì)具體靶序列不同部分的探針。該探針能夠與本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的單一病癥相關(guān)的靶序列雜交?？梢詫⑻结樖紫群铣扇缓蟾街缴镄酒?，或者可以直接在生物芯片上合成。固體載體可以為經(jīng)修飾以含有離散單個(gè)位點(diǎn)以有利于探針的附著或連接的材料，并適用于至少一種檢測(cè)方法。載體的代表性實(shí)例包括玻璃以及改性或功能化的玻璃、塑料(包括丙烯酸樹脂、聚苯乙烯和苯乙烯與其它材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、TeflonJ等)、多糖、尼龍或硝酸纖維素、樹脂、二氧化硅或基于二氧化硅的材料包括硅膠和改性硅膠、碳、金屬、無機(jī)玻璃和塑料。載體可以允許光學(xué)檢測(cè)而沒有明顯地?zé)晒?。載體可為平面的，但也可以使用其他形狀的載體。例如，探針可置于試管的內(nèi)表面以進(jìn)行流入式樣品分析以最小化樣品體積。類似地，載體可為柔性的，例如柔性泡沫，包括特定塑料制造的閉孔泡沫。生物芯片和探針可以衍生自化學(xué)官能團(tuán)以進(jìn)行二者的隨后連接。例如，生物芯片可以衍生自的化學(xué)官能團(tuán)包括但不限于：氨基基團(tuán)、羧基基團(tuán)、氧代基團(tuán)或巰基基團(tuán)。使用這些官能團(tuán)，可以使用探針上的官能團(tuán)直接或間接地使用接頭使探針附著。探針可以通過5’末端、3’末端或經(jīng)由內(nèi)部核苷酸附著于固體支撐物。探針還可以非共價(jià)地附著于固體支撐物。例如，可以制備生物素化的寡核苷酸，其可以共價(jià)地連接于涂覆有鏈霉親和素的表面以實(shí)現(xiàn)附著?；蛘?，可以使用例如光聚合和光刻蝕的技術(shù)在表面上合成探針。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，可以通過高通量測(cè)序法實(shí)現(xiàn)測(cè)定用于甲狀腺病變分類的微RNA。高通量測(cè)序法可以涉及合成測(cè)序法、連接測(cè)序法和超深測(cè)序法。合成測(cè)序法可以通過使用與核酸標(biāo)簽上的排序元素互補(bǔ)的測(cè)序引物啟動(dòng)。在聚合酶反應(yīng)中，該方法涉及在標(biāo)記核酸或核酸類似物進(jìn)入到互補(bǔ)核酸序列增長(zhǎng)鏈之后立刻(基本實(shí)時(shí))檢測(cè)每個(gè)核酸的同一性，或者標(biāo)記核酸或核酸類似物一經(jīng)(實(shí)時(shí))進(jìn)入到互補(bǔ)核酸序列增長(zhǎng)鏈就檢測(cè)每個(gè)核酸的同一性。在成功結(jié)合標(biāo)記核酸之后，使用本領(lǐng)域已知方法測(cè)量特征然后清零。合成序列法的實(shí)例是本領(lǐng)域已知的，并在例如US7056676、US8802368和US7169560中描述，其內(nèi)容通過引用并入本文。合成序列法中可以用于標(biāo)記核苷酸或核苷酸類似物的標(biāo)記實(shí)例包括但不限于發(fā)色團(tuán)、熒光部分、酶、抗原、重金屬、磁探針、染料、磷光基團(tuán)、放射性材料、化學(xué)發(fā)光部分、散射納米顆?；驘晒饧{米顆粒、產(chǎn)生拉曼信號(hào)的部分和電化學(xué)檢測(cè)部分。合成序列法每小時(shí)可以產(chǎn)生至少1000個(gè)、至少5000個(gè)、至少10000個(gè)、至少20000個(gè)、30000個(gè)、至少40000個(gè)、至少50000個(gè)、至少100000個(gè)或者至少500000個(gè)測(cè)序片段。該測(cè)序片段的每個(gè)測(cè)序片段可以具有至少40個(gè)、至少45個(gè)、至少50個(gè)、至少60個(gè)、至少70個(gè)、至少80個(gè)、至少90個(gè)、至少100個(gè)、至少120個(gè)或者至少150個(gè)堿基?？梢酝ㄟ^使用折回PCR和錨定引物在固體載體(或芯片)上進(jìn)行合成測(cè)序法。由于微RNA作為小核酸片段出現(xiàn)——銜接子被添加到片段的5’末端和3’末端。附著于流動(dòng)細(xì)胞通道表面的核酸片段被延長(zhǎng)并被橋擴(kuò)增。片段變?yōu)殡p鏈的，并將該雙鏈分子變性。變性之后的固相擴(kuò)增多循環(huán)可以在每個(gè)流動(dòng)細(xì)胞通道中生成幾百萬簇的約1000個(gè)拷貝的相同模板單鏈核酸分子。使用引物、聚合酶和四個(gè)熒光標(biāo)記的可逆終止核苷酸進(jìn)行連續(xù)測(cè)序。在核酸結(jié)合之后，使用激光刺激發(fā)色團(tuán)，捕獲圖像并記錄第一堿基的同一性。去除每個(gè)結(jié)合堿基的3'終止子和發(fā)色團(tuán)，并重復(fù)合并、檢測(cè)和鑒別步驟。在例如測(cè)序平臺(tái)上使用該技術(shù)。另一種測(cè)序方法涉及使擴(kuò)增區(qū)域與在LST中和與序列元素互補(bǔ)的引物雜交(列出fasta文件名稱的文件)。使用聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶和載體熒光素和腺苷5’磷酰硫酸保溫該雜交復(fù)合物。然后，相繼加入對(duì)應(yīng)于A、C、G和T(U)的三磷酸脫氧核苷酸。每個(gè)堿基的合并伴隨著焦磷酸的釋放，通過硫酸化酶轉(zhuǎn)變?yōu)锳TP，這驅(qū)動(dòng)氧化熒光素的合成和可見光的釋放。由于焦磷酸釋放與合并的堿基是等摩爾的，發(fā)出的光與在任一步驟添加的核苷酸數(shù)量是成比例的。重復(fù)該過程直至確定整個(gè)序列。另一種測(cè)序方法涉及通過連接方案(簡(jiǎn)并連接)的四色測(cè)序，其涉及使錨定引物與四個(gè)位置中的一個(gè)雜交。然后進(jìn)行錨定引物和用熒光染料標(biāo)記的簡(jiǎn)并九聚體群組的酶促連接反應(yīng)。在任意給定的循環(huán)，構(gòu)建使用的九聚體群組以使其位置之一的同一性與附著于該九聚體的發(fā)色團(tuán)的同一性相關(guān)。對(duì)于在所查詢的位置處連接酶區(qū)別于互補(bǔ)性的程度，熒光信號(hào)允許堿基同一性的推斷。實(shí)施連接和四色成像之后，剝除錨定引物：九聚物復(fù)合物并開始新循環(huán)。在實(shí)施連接之后的序列信息成像方法是本領(lǐng)域已知的。在一些情況下，高通量測(cè)序涉及使用超深測(cè)序，例如在Marguiles等人,Nature437(7057):376-80(2005)中所描述的。微RNA測(cè)序(miRNA-seq)是一種RNA測(cè)序(RNA-Seq)類型，其使用下一代測(cè)序或大規(guī)模并行高通量DNA測(cè)序以對(duì)微RNA測(cè)序。miRNA-seq與其他形式RNA-seq的不同之處在于輸入原料通常富集小RNA。miRNA-seq提供組織特異性表達(dá)模式，其可導(dǎo)致疾病關(guān)聯(lián)性和微RNA亞型。miRNA-seq也可以用于發(fā)現(xiàn)先前未表征的微RNA，例如表示為SEQIDNO.139至SEQIDNO.140和SEQIDNO.307至SEQIDNO.308的核酸序列。如本文所使用的，術(shù)語“診斷”指將病理或癥狀分類，確定病理嚴(yán)重程度(等級(jí)或階段)，監(jiān)測(cè)病理進(jìn)展，預(yù)測(cè)病理結(jié)果和/或康復(fù)預(yù)期。如本文所使用的，短語“需要其的受試者”指已知患有癌癥的人類受試者、具有患癌風(fēng)險(xiǎn)的人類受試者(例如，有遺傳傾向的受試者、有癌癥醫(yī)療史和/或家族史的受試者、已暴露于致癌物質(zhì)、職業(yè)危害、環(huán)境危害的受試者)和/或表現(xiàn)出疑似癌癥臨床癥狀的受試者(甲狀腺中結(jié)節(jié))。另外或者，需要其的受試者可以為經(jīng)歷常規(guī)健康體檢的健康人類受試者。分析惡性細(xì)胞或惡變前期細(xì)胞的存在可以在體內(nèi)或體外實(shí)現(xiàn)，借此回收生物樣本(例如活組織檢查)。該活組織樣本包含細(xì)胞并可以為切開的或切除的活組織。樣本可以從受試者的甲狀腺回收，可以使用FNA回收?；蛘呒?xì)胞可以從完整切除物中回收。當(dāng)采用本發(fā)明的教導(dǎo)時(shí)，可以收集與確定治療方案、療程和/或疾病嚴(yán)重程度測(cè)量相關(guān)的其他信息。如本文所使用的，“治療方案”指指定提供給需要其的受試者(例如，診斷為具有病癥的受試者)的治療類型、劑量、治療時(shí)間表和/或治療持續(xù)時(shí)長(zhǎng)的治療計(jì)劃。選定的治療方案可以為預(yù)期獲得最好臨床效果(例如，病狀完全治愈)的積極治療，或可以緩解病理學(xué)癥狀的更穩(wěn)健治療，其導(dǎo)致病癥的不完全治愈。應(yīng)理解的是，在某些情況下，治療方案可以與受試者的某些不適或不利副作用(例如破壞健康細(xì)胞或組織)有關(guān)。治療的類型可以包括手術(shù)治療(例如去除病變、患病細(xì)胞、組織或器官)、細(xì)胞替代療法、以局部或全身方式施用治療藥物(例如受體激動(dòng)劑、拮抗劑、激素、化療藥物)、使用外源(例如，外粒子束)和/或內(nèi)源(例如，近距離放射療法)暴露于放射線的療法和/或其任意組合。取決于病癥的嚴(yán)重程度和治療的選擇類型，劑量、治療時(shí)間表和治療持續(xù)時(shí)長(zhǎng)可以不同，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過治療劑量、治療時(shí)間表和病癥持續(xù)時(shí)長(zhǎng)來調(diào)整治療類型。還提供診斷方法。該方法包括檢測(cè)生物樣本中與具體癌癥相關(guān)的核酸表達(dá)水平。患者具體癌癥狀態(tài)的診斷可以考慮到預(yù)后和治療策略的選擇。此外，通過確定臨時(shí)表達(dá)的與具體癌癥相關(guān)的核酸，可分類細(xì)胞發(fā)育階段?？梢詫?shí)施標(biāo)記探針與組織切片或FNA涂片的原位雜交。通過對(duì)比單個(gè)樣本之間的指紋，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于該發(fā)現(xiàn)作出診斷、預(yù)后、或預(yù)測(cè)。還應(yīng)理解的是，指示診斷的核酸序列可以不同于指示預(yù)后的核酸序列，細(xì)胞狀況的分子譜可以導(dǎo)致應(yīng)答條件或受阻條件之間的差別，或可以預(yù)測(cè)結(jié)果。還提供試劑盒，該試劑盒可以包括本文描述的核酸以及任何或全部的以下物質(zhì)：分析試劑、緩沖劑、探針和/或引物、和滅菌鹽水或另一個(gè)藥學(xué)上可接受的乳化基料和懸浮基料。另外，試劑盒可以包括含有用于本文所述方法實(shí)踐的指示(例如方案)的指導(dǎo)材料。試劑盒可還以包含用于表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析的軟件包。例如，試劑盒可以為用于靶核酸序列的擴(kuò)增、檢測(cè)、鑒別或定量的試劑盒。該試劑盒可以包含poly(T)引物、正向引物、反向引物和探針。任意本文所述的組合物可以包含于試劑盒中。在一個(gè)非限制性實(shí)例中，用于分離微RNA的試劑、標(biāo)記微RNA的試劑、和/或使用陣列評(píng)估微RNA群組的試劑包含于試劑盒中。試劑盒還可以包括用于制備或合成微RNA探針的試劑。因此在適當(dāng)容器中，試劑盒可以包括通過結(jié)合標(biāo)記核酸或未標(biāo)記核酸用于標(biāo)記微RNA的酶，該未標(biāo)記核酸隨后會(huì)被標(biāo)記。試劑盒還可以包括一種或更多種緩沖劑，例如反應(yīng)緩沖劑、標(biāo)記緩沖劑、洗滌緩沖劑或雜交緩沖劑、用于制備微RNA探針的化合物、用于原位雜交的成分和用于分離微RNA的成分。本發(fā)明的其他試劑盒可以包括制備包含微RNA的核酸陣列的成分，從而可以包括例如固體支撐物。提供以下實(shí)施例以更充分地說明本發(fā)明的某些實(shí)施方式。然而，其不應(yīng)以任何方式解釋為限制本發(fā)明的廣義范圍。實(shí)施例材料和方法1.微RNA分析可以使用本領(lǐng)域已知方法來評(píng)估甲狀腺腫瘤樣本中微RNA的存在和/或水平，該方法例如Northern印跡法、RNA表達(dá)分析如微陣列分析、RT-PCR、高通量測(cè)序(下一代測(cè)序)、克隆和定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)。確定RNA表達(dá)的分析技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，參見例如Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第三版,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(2001)。以下更詳細(xì)地描述本文所使用具體方法的實(shí)施例。2.RNA提取物FNA細(xì)胞阻斷樣本從7個(gè)至10個(gè)10μm厚的組織切片中分離總RNA。在二甲苯中、在57℃下將切片保溫幾次(1至3次)持續(xù)5分鐘以去除多余的石蠟，然后在環(huán)境溫度下以10000g離心2分鐘。然后用1ml100％的乙醇洗滌樣本若干次(約3次)以洗去組織中的二甲苯，然后在環(huán)境溫度下以10000g離心10分鐘。舍棄上清液，在65℃下干燥組織5分鐘。通過500μl的緩沖劑B(10mM的NaCl、pH7.5的500mMTris、pH8的20mMEDTA、1％的SDS)中的蛋白酶K溶液(5至12μl的蛋白酶K(例如Sigma或ABI)，在45℃下使蛋白質(zhì)降解幾小時(shí)(約16小時(shí))。通過在95℃下保溫7分鐘使蛋白酶K失活。在試管冷卻之后，添加10μl的RNA合成內(nèi)標(biāo)物(例如，0.15飛摩爾/μl的2個(gè)內(nèi)標(biāo)物)。使用等體積的酸化酚-氯仿提取RNA，渦旋，然后在4℃下以12000g離心15分鐘。然后使用8μl的線性丙烯酰胺、0.1體積的pH5.2的3MNaOAc、和3體積的100％無水乙醇沉淀RNA30分鐘至16小時(shí)，然后在4℃下以20000g(14000rpm)離心至少40分鐘。將小球通過添加1ml的85％冷乙醇洗滌。在37℃下引入DNA酶60分鐘以酶解DNA(例如，10μl的TurboTMDNA酶)，然后如上所述地使用酸化酚-氯仿提取并用乙醇沉淀。FNA涂片樣本(示例)通過在環(huán)境溫度下在二甲苯中浸漬載玻片若干小時(shí)(約2至20小時(shí)，通常約16小時(shí))以去除過量石蠟或膠，去除蓋玻片(當(dāng)存在時(shí))之后，從非染色的或染色的(例如，通過Papanicolaou、Giemsa或Diff-Quick)載玻片上的FNA涂片樣本分離總RNA。然后用100％的乙醇洗滌載玻片若干次(約3次)以洗掉二甲苯。在雙蒸水(DDW)中浸漬載玻片1分鐘。使用解剖刀將細(xì)胞從載玻片刮除。然后將載玻片用500μl的緩沖液B(10mM的NaCl、pH7.5的500mMTris、pH8的20mM的EDTA、1％的SDS)洗滌，轉(zhuǎn)移至1.7ml試管。在45℃下，通過蛋白酶K(例如，5μl至12μl的Sigma或ABI)降解蛋白質(zhì)幾小時(shí)(約16小時(shí))。通過在95℃下保溫試管7分鐘使蛋白酶K失活。在試管冷卻之后，添加10μl的RNA合成內(nèi)標(biāo)物(例如，0.15飛摩爾/微升的2個(gè)內(nèi)標(biāo)物)。使用等體積的酸化酚-氯仿提取RNA，渦旋，然后在4℃下以12000g離心15分鐘。然后使用8μl的線性丙烯酰胺、0.1體積的pH5.2的3MNaOAc、和3體積的無水乙醇沉淀RNA30分鐘至16小時(shí)。然后將試管在4℃下以20000g(14000rpm)離心至少40分鐘。將小球用約1ml的85％冷乙醇洗滌。在37℃下引入DNA酶60分鐘以酶解DNA(例如，10μl的TurboTMDNA酶，Ambion，LifeTechnologies)，然后如上所述地使用酸化酚-氯仿提取并用乙醇沉淀。3.總RNA定量在NanoDrop3300(ND3300)熒光光譜儀中使用染料(ThermoFisherWilmington，DE)，通過熒光光譜進(jìn)行總RNA定量。當(dāng)使用高濃度的染料(1:200稀釋)時(shí)，ND3300RNA檢測(cè)范圍為25ng/ml至1000ng/ml，當(dāng)使用1:2000稀釋的染料時(shí)，ND3300RNA檢測(cè)范圍為5ng/ml至50ng/ml。ND3300確定的RNA量與檢測(cè)表達(dá)的微RNA高度相關(guān)。4.微陣列中的微RNA譜化通過將DNA寡核苷酸探針打印至以下物質(zhì)以生成常規(guī)微陣列(AgilentTechnologies，SantaClara，CA)：2172個(gè)miR序列、17個(gè)陰性對(duì)照、23個(gè)內(nèi)標(biāo)物和10個(gè)陽性對(duì)照(總共2222個(gè)探針)。將每個(gè)微RNA探針打印一式三份，運(yùn)送至位于微RNA補(bǔ)充序列的3’末端的28個(gè)核苷酸(nt)接頭。將陰性內(nèi)標(biāo)物和陽性探針打印3次至200次。使用不匹配基因組的序列設(shè)計(jì)17個(gè)陰性對(duì)照探針。設(shè)計(jì)兩組陽性對(duì)照探針以與微RNA陣列雜交：(i)在標(biāo)記之前將合成小RNA內(nèi)標(biāo)到RNA以確認(rèn)標(biāo)記有效性；(ii)在陣列上印跡用于豐富的小RNA的探針以確認(rèn)RNA品質(zhì)，該小RNA如小細(xì)胞核RNA(U43、U24、Z30、U6、U48、U44)、5.8s和5s的核糖體RNA中。5.用于微陣列的微RNA的Cy染料標(biāo)記用Cy3或Cy5，通過將RNA接頭、p-rCrU-Cy/染料或若干連續(xù)Cy(BioSpringGmbH，IBAGmbH或等同物)連接至3’末端來標(biāo)記總RNA(20ng至1000ng)(Thomson等人,NatureMethods2004；1:47-53)。標(biāo)記反應(yīng)包含總RNA、內(nèi)標(biāo)物(0.1至100飛摩爾)、250ng至400ng的RNA-接頭-染料、15％的DMSO、1x連接酶緩沖劑和20單位的T4RNA連接酶(NEB或等同物)，在4℃下進(jìn)行1小時(shí)，然后在37℃下進(jìn)行1小時(shí)，然后在4℃最高進(jìn)行40分鐘。標(biāo)記的RNA與30μl的雜交混合物(45μL的10XGEAgilent阻斷劑和246μL的2XHi-RPM雜合體的混合物)混合。將標(biāo)記混合物在100℃下保溫5分鐘，然后在水浴中冰孵5分鐘。在54℃至55℃將載玻片雜交16小時(shí)至20小時(shí)，然后洗滌兩次。第一次洗滌用AgilentGE洗滌緩沖液1(例如，6XSSPE+0.005％的N-月桂酰肌氨酸+0.005％的TritonX-102)在室溫下進(jìn)行5分鐘，然后在37℃下用AgilentGE洗滌緩沖液2(例如，0.06XSSPE+0.005％N-月桂酰肌氨酸+0.005％的TritonX-102)進(jìn)行第二洗滌5分鐘。使用微陣列掃描器(Agilent微arrayScannerBundleG2565BA，在100％的XDRHi、10％的XDRLo下分辨率為5μm)掃描陣列。使用適當(dāng)?shù)能浖?FeatureExtraction10.7軟件，Agilent)分析陣列圖像。6.RT-PCR在1ng至500ng的總RNA上實(shí)施聚腺苷酸化和逆轉(zhuǎn)錄。在37℃下，在poly(A)聚合酶(poly(A)聚合酶NEB-M0276L)、ATP、具有一致序列的寡T引物和逆轉(zhuǎn)錄酶(IIRT，Invitrogen，Carlsbad，CA)的存在下將RNA保溫1小時(shí)。然后，將cDNA通過RT-PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)包括微RNA特異性正向引物，以及與寡T尾的一致3’序列互補(bǔ)的通用反向引物，正向引物為與特異的微RNA序列的3’互補(bǔ)的(MGB)探針或?yàn)榕cpoly(A)銜接子序列部分互補(bǔ)的探針。RT-PCR方法的詳細(xì)說明可見于出版物WO2008/029295中，其內(nèi)容通過引用并入本文。確定每個(gè)微RNA的循環(huán)閾值(CT，在其探針信號(hào)達(dá)到閾值的PCR循環(huán))。為了能夠比較來自RT-PCR的微RNA表達(dá)結(jié)果和來自微陣列的微RNA表達(dá)結(jié)果，用50中減去通過RT-PCR獲得的每個(gè)值(50-CT)。每個(gè)患者的每個(gè)微RNA的50-CT表達(dá)與由微陣列方法獲得的信號(hào)進(jìn)行比較。7.陣列數(shù)據(jù)歸一化原始數(shù)據(jù)集由每個(gè)樣品的多探針測(cè)量信號(hào)組成。為進(jìn)行分析，僅使用設(shè)計(jì)為測(cè)量已知表達(dá)水平或經(jīng)確認(rèn)的人類微RNA的探針信號(hào)。通過對(duì)可靠點(diǎn)取對(duì)數(shù)的方式將一式三份的點(diǎn)組合到一個(gè)信號(hào)中。所有數(shù)據(jù)為對(duì)數(shù)變換的，分析在對(duì)數(shù)空間進(jìn)行。通過在兩個(gè)代表性樣本中對(duì)每個(gè)探針取平均表達(dá)水平，計(jì)算用于歸一化的參照數(shù)據(jù)向量R，兩個(gè)代表性樣本中每個(gè)腫瘤類型中取一個(gè)。對(duì)于具有數(shù)據(jù)向量Sk的每個(gè)樣本k，發(fā)現(xiàn)二次多項(xiàng)式Fk以提供在樣本數(shù)據(jù)和參照數(shù)據(jù)之間的最佳擬合，以使R≈Fk(Sk)。不使用遠(yuǎn)程數(shù)據(jù)點(diǎn)(“離群值”)擬合多項(xiàng)式F。對(duì)于樣本中的每個(gè)探針(向量Sk中的元素)，由初始值通過用多項(xiàng)式函數(shù)Fk將其轉(zhuǎn)換以計(jì)算歸一化值(在對(duì)數(shù)空間)以使在對(duì)數(shù)空間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。為表現(xiàn)和計(jì)算倍數(shù)變化，通過取指數(shù)將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換回線性空間。8.miRNA-seq序列庫構(gòu)建取決于所使用的高通量測(cè)序平臺(tái)，可使用多種不同試劑盒進(jìn)行序列庫構(gòu)建。然而，存在用于準(zhǔn)備小RNA測(cè)序的若干常規(guī)步驟。連接步驟將DNA銜接子添加到小RNA的兩端，其在逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增期間充當(dāng)引物結(jié)合位點(diǎn)。使用連接酶如T4RNA連接酶，或使用5’RACE反應(yīng)2添加5’銜接子，將5’銜接子之后的轉(zhuǎn)換成腺苷酸的單鏈DNA3’銜接子與小RNA連接。銜接子還被設(shè)計(jì)為捕獲具有5’磷酸基團(tuán)的小RNA，典型的微RNA，而不捕獲具有5’羥基的RNA降解產(chǎn)物。逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增步驟將連接RNA的小銜接子轉(zhuǎn)換為在測(cè)序反應(yīng)中使用的cDNA克隆產(chǎn)物。然后進(jìn)行PCR以擴(kuò)增cDNA序列池。在該步驟中還可以使用設(shè)計(jì)為具有獨(dú)特核苷酸標(biāo)簽的引物以生成在合并庫多重測(cè)序中的ID標(biāo)簽。9.下一代測(cè)序(NGS)來自每個(gè)FFPE樣本的500ngRNA用于小RNA深度測(cè)序(miRSeq)。將庫負(fù)載于序列分析儀(HiSeqTM2000DNA)的兩條路徑上。每個(gè)庫平均獲得約63000000個(gè)測(cè)序片段。為發(fā)現(xiàn)新微RNA，對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)(整理引物-銜接子序列)應(yīng)用序列分析軟件(miRDeep2，F(xiàn)riedlanderMR等人,NucleicAcidsRes.2012Jan；40(1):37-52)。10.統(tǒng)計(jì)分析對(duì)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換的歸一化熒光信號(hào)使用雙側(cè)(不成對(duì)的)Student’st測(cè)試以計(jì)算P值。通過設(shè)置0.05至0.1的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)確定顯著差別的閾值，從而校正多重假設(shè)測(cè)試的結(jié)果，獲得在0.01至0.06的p值截止值。對(duì)于每個(gè)差異化表達(dá)的微RNA，計(jì)算應(yīng)答運(yùn)行特性(ROC)曲線的倍數(shù)差異(歸一化熒光中值的比例)和曲線下面積(AUC)。從統(tǒng)計(jì)學(xué)分析中排除三組miR：(a)先前發(fā)現(xiàn)在血液樣本中高表達(dá)的miR(由于在FNA樣本中血液的高百分比)，(b)表達(dá)水平與RNA的下降量無關(guān)的miR，即這些miR沒有顯示與測(cè)量的RNA量下降有關(guān)信號(hào)線性下降，(c)表達(dá)水平與(b)組中的miR相關(guān)的miR。實(shí)施例1：預(yù)操作的樣本中微RNA的檢測(cè)在幾個(gè)來自體外FNA活檢樣本的Papanicolaou、Giemsa和Diff-Quick染色的涂片中，進(jìn)行微RNA譜的初步研究以確保方法的可行性。由于FNA涂片通常具有非常少的細(xì)胞，提供極小量的RNA用于研究，例如1ng至1000ng，首先需要評(píng)價(jià)在如此低的RNA量下，微RNA是否可檢測(cè)。因此，在Giemsa染色的乳頭狀癌涂片和非乳頭狀癌涂片中，測(cè)量約2200個(gè)單獨(dú)微RNA的微RNA表達(dá)水平。在乳頭狀癌涂片中，發(fā)現(xiàn)先前顯示與乳頭狀癌相關(guān)的五種微RNA(hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-221-3p和hsa-miR-21-5p)過度表達(dá)。圖1顯示Giemsa染色的乳頭狀癌樣本和非乳頭狀癌樣本之間微RNA表達(dá)的對(duì)比，揭示在乳頭狀癌中高度上調(diào)的微RNA標(biāo)志。這些結(jié)果強(qiáng)烈表明了在FNA涂片中可以成功確定微RNA譜。實(shí)施例2：惡性甲狀腺病變和良性甲狀腺病變之間的差異化微RNA表達(dá)在本實(shí)驗(yàn)分析中使用的樣本群組由73個(gè)預(yù)操作的甲狀腺FNA細(xì)胞阻斷物組成，該甲狀腺FNA細(xì)胞阻斷物選自DepartmentofPathologyTempleUniversityHospital(Philadelphia，USA)的歸檔材料。該73個(gè)樣本包括35個(gè)良性甲狀腺病變樣本和38個(gè)惡性甲狀腺病變樣本。該35個(gè)良性腫瘤由18個(gè)濾泡性腺瘤樣本、8個(gè)Hashimoto甲狀腺炎樣本和9個(gè)增生(甲狀腺腫大)樣本組成。該38個(gè)惡性腫瘤由10個(gè)濾泡性癌和28個(gè)乳頭狀癌組成。28個(gè)乳頭狀癌樣本中，9個(gè)為乳頭狀癌，13個(gè)為包膜內(nèi)型的乳頭狀癌濾泡性變體，6個(gè)為非包膜內(nèi)型的乳頭狀癌濾泡性變體。組織學(xué)診斷最終評(píng)估了甲狀腺病變的惡性或良性。細(xì)胞學(xué)分類是基于“TheBethesdaSystemforReportingThyroidCytopathology”(Syed,Z.Ali和EdmundS.Cibas著；DOI10.1007/978-0-387-87666-5_1；SpringerScience+BusinessMedia,LLC2010)。通過InstitutionalReviewBoard(IRB,等同于EthicalReviewBoard)的參與機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)該研究方案。腫瘤分類是基于WorldHealthOrganization(WHO)指南。其他的群組由在甲狀腺切除術(shù)后制備的13個(gè)甲狀腺體外FNA涂片組成，從米蘭-比可卡大學(xué)(米蘭，意大利)獲得。從這些樣本中提取總RNA(至少10ng)，使用含有約2200個(gè)miR的常規(guī)微陣列譜化微RNA的表達(dá)。結(jié)果顯示若干miR的良性和惡性病變之間表達(dá)模式的顯著差異(惡性病變對(duì)比良性病變的上調(diào)或下調(diào))，在表3中列出。表3：惡性甲狀腺腫瘤中的上調(diào)或下調(diào)miRNA對(duì)比良性甲狀腺腫瘤中的上調(diào)或下調(diào)miRNA使用雙側(cè)(不成對(duì)的)Student’st測(cè)試計(jì)算p值。倍數(shù)變化表示每組中值的比例。AUC：當(dāng)使用miRNA分類兩組時(shí)曲線以下面積。中值：表達(dá)值的中值(大約)?；谠?5個(gè)良性FNA樣本和38個(gè)惡性樣本中的miRNA表達(dá)，開發(fā)用于區(qū)分惡性甲狀腺腫瘤和良性甲狀腺腫瘤的分類算法?；诎l(fā)現(xiàn)在這些情況中差異化表達(dá)的8個(gè)miR(hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-138-5p和MID-23794)，將邏輯回歸分類器訓(xùn)練為區(qū)分惡性甲狀腺病變和良性甲狀腺病變，該情況為或在良性或惡性之間或在具體甲狀腺腫瘤亞型之間(數(shù)據(jù)未顯示)。該分類器對(duì)于鑒別惡性腫瘤達(dá)到89％的準(zhǔn)確率，87％的敏感性，91％的特異性。hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-146b-5p和hsa-miR-181a-5p在惡性病變中表現(xiàn)出更高表達(dá)，hsa-miR-138-5p和MID-23794在良性病變中表現(xiàn)出更高表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。實(shí)施例3：區(qū)分惡性甲狀腺病變和良性甲狀腺病變的不同亞型在18個(gè)濾泡性腺瘤樣本和10個(gè)濾泡性癌樣本之間比較miR的表達(dá)水平。表4中示出濾泡性腺瘤對(duì)比濾泡性癌中的上調(diào)或下調(diào)微RNA。表4：濾泡性腺瘤中上調(diào)或下調(diào)miRNA對(duì)比濾泡性癌中上調(diào)或下調(diào)miRNA使用雙側(cè)(不成對(duì)的)Student’st測(cè)試計(jì)算p值。倍數(shù)變化表示每組中值的比例。AUC：當(dāng)使用miRNA分類兩組時(shí)曲線以下的面積。中值：表達(dá)值的中值(大約)。比較18個(gè)濾泡性腺瘤樣本和9個(gè)乳頭狀癌(非濾泡性變體)樣本的miR表達(dá)水平，使用hsa-miR-146b-5p和hsa-miR-21-5p的表達(dá)水平產(chǎn)生具有100％準(zhǔn)確率(數(shù)據(jù)未顯示)的分類器用于區(qū)分濾泡性腺瘤樣本和乳頭狀癌樣本。比較18個(gè)濾泡性腺瘤樣本相對(duì)于19個(gè)乳頭狀癌的濾泡性變體樣本的miR表達(dá)水平。表5中示出在乳頭狀癌的濾泡性變體中對(duì)比濾泡性腺瘤的上調(diào)或下調(diào)的微RNA。表5：乳頭狀癌濾泡性變體(FVPC)對(duì)比濾泡性腺瘤(FA)的上調(diào)或下調(diào)miRNA。使用雙側(cè)(不成對(duì)的)Student’st測(cè)試計(jì)算p值。倍數(shù)變化表示每組中值的比例。AUC：當(dāng)使用miRNA分類兩組時(shí)曲線以下面積。中值：表達(dá)值的中值(大約)比較6個(gè)非包膜內(nèi)型的乳頭狀癌的濾泡性變體樣本和35個(gè)良性樣本的miR表達(dá)水平，使用hsa-miR-221-3p和hsa-miR-200b-3p的表達(dá)水平產(chǎn)生具有98％準(zhǔn)確率、83％敏感性和100％特異性的分類器(數(shù)據(jù)未顯示)。在8個(gè)Hashimoto甲狀腺炎樣本和9個(gè)(非濾泡性)乳頭狀癌樣本之間比較miR的表達(dá)水平。表6中示出在乳頭狀癌中相對(duì)于Hashimoto甲狀腺炎的上調(diào)或下調(diào)的微RNA。用于比較這兩種甲狀腺病變的譜特征的miR的最佳候選為hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-200a-3p和MID-23794。表6：乳頭狀癌(PC)對(duì)比Hashimoto甲狀腺炎(Ht)的上調(diào)或下調(diào)miRNA。使用雙側(cè)(不成對(duì)的)Student’st測(cè)試計(jì)算p值。倍數(shù)變化表示每組中值的比例。AUC：當(dāng)使用miRNA分類兩組時(shí)曲線以下面積。中值：表達(dá)值的中值(大約)實(shí)施例4：通過深度測(cè)序鑒別新型微RNA生物標(biāo)志從拉賓醫(yī)療中心病理部(DepartmentofPathologyatRabinMedicalCenter)獲得來自濾泡性病變的11個(gè)FFPE(福爾馬林固定，嵌入到石蠟)甲狀腺切除樣本(從手術(shù)活檢中獲得，在福爾馬林中固定并在石蠟中保藏)。該樣本包括6個(gè)濾泡性腺瘤和5個(gè)濾泡性癌。在所有樣本中腫瘤細(xì)胞含量高于50％。使用序列分析軟件發(fā)現(xiàn)總共386個(gè)新型候選微RNA，其中27個(gè)通過qPCR選擇為有效的。本文公開兩種新型微RNA，MD2-495和MD2-437，其序列提供于表1中，其各自的發(fā)夾結(jié)構(gòu)顯示于表2中。圖2A顯示兩種新型微RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其由序列分析軟件預(yù)測(cè)。圖2B顯示在11個(gè)樣本中的每個(gè)中兩種新型微RNA的表達(dá)(測(cè)序片段的歸一化個(gè)數(shù))。右側(cè)的顏色編碼欄表示表達(dá)尺度。實(shí)施例5：特異性微RNA在良性甲狀腺病變和惡性甲狀腺病變中差異化表達(dá)從以色列的醫(yī)療中心獲得染色的甲狀腺FNA涂片(群組I)；從美國(guó)的醫(yī)療中心獲得甲狀腺FNA細(xì)胞阻斷物(群組II)。對(duì)于兩個(gè)群組，基于被切除腫瘤的組織學(xué)診斷，將甲狀腺病變最終分類為惡性或良性。表7中顯示兩個(gè)群組中樣本的分類總結(jié)。表7：FNA樣本–群組I和群組IIFNA樣本描述群組I群組II病變數(shù)(#患者)181(65)73(73)結(jié)節(jié)性增生(結(jié)節(jié)性甲狀腺腫)139濾泡性腺瘤2718格雷夫斯病30Hashimoto甲狀腺炎38良性結(jié)節(jié)總數(shù)4635乳頭狀癌109乳頭狀癌的濾泡性變體1319濾泡性癌410髓樣癌60甲狀腺癌(混合組織學(xué))20惡性結(jié)節(jié)總數(shù)3538Bethesda2類別II、類別VI330Bethesda2類別III、類別IV、類別V48731某些患者患有超過一種病變。2BethesdaSystemforReportingThyroidCytopathology(BSRTC)來自2007年在國(guó)立衛(wèi)生研究院舉辦的會(huì)議(CibasES,AliSZ.TheBethesdaSystemforReportingThyroidCytopathology.AmJClinPathol2009；132:658-65)。該系統(tǒng)基于六種診斷類別獲得標(biāo)準(zhǔn)化FNA報(bào)告：DCI＝非診斷的，DCII＝良性，DCIII＝非典型/未定類顯著性的濾泡性病變(AUS/FLUS)，DCIV＝濾泡性腫瘤/疑似濾泡性腫瘤(FN/SFN)，DCV＝疑似惡性和DCVI＝惡性。使用上述的內(nèi)部開發(fā)方案從樣本中提取含有微RNA片段的高度純化的RNA。通過常規(guī)打印微陣列測(cè)量超過2000個(gè)微RNA譜化FFPE樣本和細(xì)胞學(xué)(FNA)樣本以鑒別差異化表達(dá)的微RNA并開發(fā)分類器。通過qPCR用常規(guī)打印微陣列測(cè)量超過2000個(gè)微RNA和96個(gè)微RNA譜化超過150個(gè)甲狀腺FNA樣本(表7)。圖3A(群組I)和3B(群組II)顯示在患有惡性結(jié)節(jié)(y軸)的患者中和在患有良性結(jié)節(jié)(x軸)的患者中微陣列上微RNA表達(dá)水平的中值。對(duì)于每個(gè)微RNA，兩組中的該值通過FDR＝0.1的Mann-Whitney測(cè)試比較。發(fā)現(xiàn)在良性贅生物和惡性贅生物之間微RNA的差異化表達(dá)?；趦煞N微RNA：hsa-miR-146b-5p和hsa-miR-375，惡性涂片相對(duì)于良性涂片的分類獲得超過85％的準(zhǔn)確率(基于10個(gè)10倍交叉驗(yàn)證運(yùn)行的中值，數(shù)據(jù)未顯示)。實(shí)施例6：hsa-miR-375為FNA樣本中髓樣甲狀腺癌的顯著性標(biāo)志比較髓樣甲狀腺癌樣本(n＝6)和來自其他甲狀腺結(jié)節(jié)的樣本(n＝75)之間的FNA群組I中hsa-miR-375(SEQIDNO.8)的表達(dá)水平。結(jié)果示于圖4中。因此，hsa-miR-375為FNA樣本中髓樣甲狀腺癌的顯著性標(biāo)志。實(shí)施例7：染色甲狀腺涂片可以用于微RNA譜化在用不同染料染色的樣本中比較微RNA的表達(dá)水平以評(píng)估微RNA的穩(wěn)定性和一經(jīng)染色的微RNA檢測(cè)水平的再現(xiàn)性。將來自FNA群組I中的總共143個(gè)涂片進(jìn)行如下染色：60個(gè)用May-GrünwaldGiemsa染色，64個(gè)用DiffQuik染色和19個(gè)用Papanicolaou染色。用不同染料染色的相同樣本副本中的微RNA表達(dá)水平顯示出顯著的相關(guān)性(超出預(yù)期)。在圖5A-5B中進(jìn)一步證明了不同染料之間miR-146b-5p表達(dá)水平的相似性，其顯示hsa-miR-146b-5p(SEQIDNO.10至SEQIDNO.11)的歸一化表達(dá)水平在用不同染料染色相同樣本時(shí)是相似的，可以參見52個(gè)May-GrünwaldGiemsa-DiffQuik對(duì)(圖5A)和15個(gè)DiffQuik-Papanicolaou對(duì)(圖5B)。因此，在臨床設(shè)置中使用的不同細(xì)胞學(xué)染料(Papanicolaou、May-GrünwaldGiemsa和DiffQuik)不影響微RNA表達(dá)的檢測(cè)和定量。實(shí)施例8：甲狀腺分類——測(cè)試開發(fā)總共24個(gè)微RNA全部被選為用于確立甲狀腺樣本為惡性還是良性的狀態(tài)(表12)。用以上描述的RT-PCR測(cè)量微RNA表達(dá)。表8提供miR和其各自正向引物的列表。使用以下提供的polyT銜接子實(shí)現(xiàn)第一鏈產(chǎn)生。正向引物是序列特異性的，但是反向引物是通用的。使用針對(duì)hsa-miR-31-5p(SEQIDNO.5至SEQIDNO.7)、hsa-miR-5701(SEQIDNO.35)、hsa-miR-424-3p(SEQIDNO.16)、MID-50971(SEQIDNO.34)、MID-20094(SEQIDNO.27至SEQIDNO.28)、MID-50976(SEQIDNO.33)、hsa-miR-3074-5p(SEQIDNO.32)、hsa-miR-222-3p(SEQIDNO.1至SEQIDNO.2)、MID-50969(SEQIDNO.29)、hsa-miR-146b-5p(SEQIDNO.10至SEQIDNO.11)、hsa-miR-346(SEQIDNO.14)、MID-16582(SEQIDNO.25)的miR的通用MGB探針實(shí)現(xiàn)RT-PCR產(chǎn)物的檢測(cè)，或使用表9中提供的miR特異性探針。以下提供了反向引物、polyT銜接子和MGB探針的序列：-反向引物GCGAGCACAGAATTAATACGAC(SEQIDNO.309)；-polyT銜接子GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATCGGTTTTTTTTTTTTVN(SEQIDNO.310)，其中“V”可以是A、G或C中的任一個(gè)；“N”可以是G、C、A或U/T的任一個(gè)；-通用MGB探針AAAACCGATAGTGAGTCG(SEQIDNO.311).表8：測(cè)試開發(fā)——微RNA和正向引物表9：測(cè)試開發(fā)——微RNA特異性探針微RNA特異性探針序列SEQIDNO.hsa-miR-342-3pCCGTTTTTTTTTTTTACGGGTGC336hsa-miR-181c-5pCCGTTTTTTTTTTTTACTCACCG337hsa-miR-125b-5pCCGTTTTTTTTTTTTCACAAGTT338hsa-miR-375CCGTTTTTTTTTTTTCACGCGAG339hsa-miR-486-5pCCGTTTTTTTTTTTTCTCGGGGC340hsa-miR-551b-3pCCGTTTTTTTTTTTTCTGAAACC341hsa-miR-23a-3pCCGTTTTTTTTTTTTGGAAATCC342hsa-miR-574-3pCCGTTTTTTTTTTTTGTGGGTGT343hsa-miR-152-3pCGTTTTTTTTTTTTCCAAGTTC344hsa-miR-200c-3pCGTTTTTTTTTTTTCCATCATT345hsa-miR-138-5pCGTTTTTTTTTTTTCGGCCTGA346hsa-miR-345-5pCGTTTTTTTTTTTTGAGCCCTG347表11：在甲狀腺測(cè)試中微RNA標(biāo)志基于其在發(fā)明人實(shí)施的若干初步研究中的表達(dá)模式(數(shù)據(jù)未顯示)選擇標(biāo)志微RNA，并提供將其分類為“惡性”、“細(xì)胞類型”或用作正規(guī)化子的理由。當(dāng)與這些微RNA在良性樣本中的表達(dá)的對(duì)比時(shí)，基于其在惡性樣本中的表達(dá)水平，確立“惡性標(biāo)志”hsa-miR-222-3p、hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-375、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-152-3p、hsa-miR-346、hsa-miR-181c-5p、hsa-miR-424-3p和hsa-miR-146b-5p。根據(jù)以下示范的其模式或表達(dá)，發(fā)明人選擇“細(xì)胞類型”標(biāo)志hsa-miR-486-5p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-138-5p、hsa-miR-200c-3p和MID-16582。在與甲狀腺上皮細(xì)胞相關(guān)的全部血液中發(fā)現(xiàn)hsa-miR-486-5p(SEQIDNO.22)。與其他微RNA一起(數(shù)據(jù)未顯示)，發(fā)現(xiàn)其與甲狀腺FNA樣本中的血液量有關(guān)。因此，hsa-miR-486-5p(SEQIDNO.22)為全部血液標(biāo)志的一個(gè)實(shí)例。檢測(cè)到若干微RNA與miR-486-5p高度相關(guān)(>0.85)，也可以視為血液標(biāo)志，包括hsa-miR-320a、hsa-miR-106a-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-17-3p、hsa-let-7d-5p、hsa-miR-107、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-18a-5p、hsa-miR-144-3p、hsa-miR-140-3p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-484、hsa-miR-151a-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7a-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-let-7b-5p、hsa-let-7g-5p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-30d-5p、hsa-miR-30b-5p、hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-425-5p、MID-19433和hsa-miR-4306。一旦測(cè)量血液腔中的微RNA表達(dá)譜，發(fā)明人就觀察到在不同的血細(xì)胞類型中發(fā)現(xiàn)大量微RNA提高(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，hsa-miR-342-3p(SEQIDNO.17至SEQIDNO.18)為微RNA之一，尤其是，其在白血球中富集，因此可視為白血球標(biāo)志的實(shí)例。令人關(guān)注的是，顯示hsa-miR-342-3p的表達(dá)與hsa-miR-150-5p相關(guān)，這說明hsa-miR-150-5p也是白血球標(biāo)志。另外，在白血球中還顯示了hsa-miR-146a-5p的表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。發(fā)現(xiàn)hsa-miR-200c-3p(SEQIDNO.23至SEQIDNO.24)和hsa-miR-138-5p(SEQIDNO.19至SEQIDNO.21)在上皮細(xì)胞中富集。在初步試驗(yàn)中，用無甲狀腺組織材料的血液制備涂片，并與來自甲狀腺組織的涂片比較。發(fā)現(xiàn)hsa-miR-200c-3p(SEQIDNO.23至SEQIDNO.24)和hsa-miR-138-5p(SEQIDNO.19至SEQIDNO.21)二者在甲狀腺涂片(良性和惡性二者)中相比血液涂片以高得多的水平表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。還發(fā)現(xiàn)其他微RNA在上皮細(xì)胞中富集(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，發(fā)現(xiàn)hsa-miR-200c-3p(SEQIDNO.23至SEQIDNO.24)和hsa-miR-138-5p(SEQIDNO.19至SEQIDNO.21)為上皮細(xì)胞標(biāo)志的實(shí)例。令人關(guān)注的是，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)hsa-miR-138-5p的表達(dá)與上皮細(xì)胞的存在相關(guān)，在數(shù)據(jù)的某些子集中發(fā)現(xiàn)hsa-miR-138-5p在良性樣本中是上調(diào)的(數(shù)據(jù)未顯示)。發(fā)現(xiàn)MID-16582(SEQIDNO.25)在Hurthle細(xì)胞中以更高水平表達(dá)。在初步研究中，發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)了該微RNA在存在Hurthle細(xì)胞的濾泡性腺瘤中相對(duì)在不顯示具有Hurthle細(xì)胞的濾泡性腺瘤中是上調(diào)的(圖6A至6B)。該結(jié)果可以有助于在Hurthle細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的線粒體富集。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了在Hurthle細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的MID-16582的序列(SEQIDNO.25)以及其他核酸序列可圖譜化為線粒體DNA(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，MID-16582為Hurthle細(xì)胞標(biāo)志的實(shí)例。測(cè)試開發(fā)訓(xùn)練集包括約360個(gè)不同樣品。樣品中的大多數(shù)為染色的FNA涂片(Papanicolaou、May-GrünwaldGiemsa或Diff-Quik)。45個(gè)FNA樣本在細(xì)胞塊中。從以色列、歐洲和美國(guó)的醫(yī)療中心收集樣本。樣本中的大多數(shù)為“未定類”FNA(根據(jù)Bethesda分類法，71個(gè)類別III、113個(gè)類別IV和74個(gè)類別V)，其余為“定類”(38個(gè)類別II、60個(gè)類別VI)。訓(xùn)練集由惡性(n＝197)和良性(n＝155)甲狀腺結(jié)節(jié)組成，并含有甲狀腺結(jié)節(jié)的八個(gè)主要組織學(xué)亞型代表。來自甲狀腺結(jié)節(jié)的33個(gè)樣本尺寸小于1cm。最小的結(jié)節(jié)尺寸為0.1cm。從大多數(shù)測(cè)試中排除髓樣癌樣本，除非有說明之處。表10提供每類樣本的分布。表10：訓(xùn)練研究群組組成和Bethesda分布組織學(xué)類型No.乳頭狀癌84乳頭狀癌，濾泡性變體77濾泡性癌16非特異性癌6髓樣的14結(jié)節(jié)性增生65濾泡性腺瘤81Hashimoto6Graves3惡性總數(shù)197良性總數(shù)155無結(jié)果4BethesdaNo.I0II38III71IV113V74VI60未知98定類總數(shù)258未定類總數(shù)84將來自常規(guī)制備FNA涂片的樣本和細(xì)胞塊用于總RNA提取和RT-PCR擴(kuò)增。將15個(gè)標(biāo)志微RNA群體和作為正規(guī)化子的9個(gè)微RNA測(cè)試所有樣本(表11)。圖7中顯示在樣本子集(n＝353)中的訓(xùn)練結(jié)果。發(fā)現(xiàn)在閾值以上的微RNA表達(dá)與惡性樣本相關(guān)，該微RNA為hsa-miR-222-3p(SEQIDNO.1至SEQIDNO.2)、hsa-miR-551b-3p(SEQIDNO.3至SEQIDNO.4)、hsa-miR-31-5p(SEQIDNO.5至SEQIDNO.7)、hsa-miR-125b-5p(SEQIDNO.9)、hsa-miR-146b-5p(SEQIDNO.10至SEQIDNO.11)、hsa-miR-346(SEQIDNO.14)、hsa-miR-181c-5p(SEQIDNO.15)和hsa-miR-375(SEQIDNO.8)。通過以下公式獲得圖7中顯示的表達(dá)水平：[50–每個(gè)標(biāo)志的歸一化Ct]。通過減去正規(guī)化子的平均信號(hào)實(shí)現(xiàn)歸一化。將全部樣本使用的正規(guī)化子的平均信號(hào)值加上所有檢測(cè)的表達(dá)值，以使值進(jìn)入更容易計(jì)算的范圍中。令人關(guān)注的是，hsa-miR-125a-5p的表達(dá)水平和hsa-miR-125b-5p的表達(dá)水平相關(guān)。實(shí)施例9：甲狀腺測(cè)試分類器的建立使用四個(gè)算法以建立甲狀腺測(cè)試、判別式分析、K最近鄰算法(KNN)、支持向量機(jī)(SUV)、判別分析分類器集合(判別式分析集合)中使用的最佳分類器。用以下參數(shù)確立先驗(yàn)值：-先驗(yàn)值：對(duì)于所有使用的算法，對(duì)于惡性樣本設(shè)置先驗(yàn)值為70％，對(duì)于良性樣本設(shè)置先驗(yàn)值為30％。-樣本集合：在該實(shí)施例中，分析三個(gè)樣本設(shè)置。一個(gè)樣本設(shè)置包括惡性樣本(n＝183)和良性樣本(n＝155)，排除惡性髓樣樣本；在下文和附圖中稱為“惡性+良性”。另一樣品設(shè)置包括所有“未定類”樣本，其包括所有分類為BethesdaIII、IV和V的樣本，在下文和附圖中稱為“未定類”。第三樣本設(shè)置包括僅分類為BethesdaIV的樣本，在下文和附圖中稱為“Bethesda”。分類為BethesdaIV的甲狀腺病變樣本通常難以通過細(xì)胞學(xué)參數(shù)分類。因此，建立基于該樣本子集的分類器是重要的。另外，存在技術(shù)問題的特定樣本(例如，BethesdaII的惡性樣本；取自淋巴結(jié)的樣本)由于各種原因被排除。-將髓樣樣本從分類中排除。因此，在該實(shí)施例中，當(dāng)提及惡性樣本其指非髓樣惡性。-微RNA表達(dá)水平歸一化：使用所謂的正規(guī)化子微RNA[hsa-miR-23a-3p、MID-20094、MID-50969、hsa-miR-345-5p、hsa-miR-3074-5p、MID-50976、MID-50971、hsa-miR-5701和hsa-miR-574-3p]將微RNA表達(dá)水平歸一化，用50減去該值，以使得較低CT與較高表達(dá)值相關(guān)。-微RNA比例：從微RNA對(duì)獲得比例以試圖從分類器中除去某些因素。因此，例如hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p的比例使得白血球在hsa-miR-31-5p(分子)表達(dá)中的貢獻(xiàn)減少(經(jīng)由hsa-miR-342-3p的表達(dá)，分母)。由于CT為對(duì)數(shù)尺度，通過從其他中減去一個(gè)miR表達(dá)產(chǎn)生比例。通過加上常數(shù)使每個(gè)比例進(jìn)一步歸一化，以使得比例與微RNA歸一化值在相同范圍內(nèi)。實(shí)施例9.1：判別式分析分類器當(dāng)使用判別式分析作為算法時(shí)，在上述三個(gè)樣品集合中應(yīng)用判別式分析的線性判別式類型(使用微RNA表達(dá)水平(圖8A至8C、圖23A至23C和圖37A至37C)、微RNA比例(圖9A至9C、圖24A至24C和圖38A至38C)、或微RNA表達(dá)水平和微RNA比例的組合(圖10A至10C、圖25A至25C和圖39A至39C)的不同組合作為特征)。如上所述，使用該算法運(yùn)行三個(gè)樣品集合。圖8A至8C、圖9A至9C和圖10A至10C提供了該算法對(duì)于惡性樣本+良性樣本的結(jié)果。圖23A至23C、圖24A至24C和圖25A至25C提供了該算法對(duì)于未定類樣本的結(jié)果。圖37A至37C、圖38A至38C和圖39A至39C提供了該算法對(duì)于BethesdaIV樣本的結(jié)果。實(shí)施例9.2：KNN分類器使用KNN(K最鄰近算法)作為算法進(jìn)行一種分析，其中使用k＝5的Pearson相關(guān)系數(shù)的距離量度。使用微RNA表達(dá)水平(圖11A至11C、圖26A至26C和圖40A至40C)、微RNA比例(圖12A至12B、圖27A至27B和圖41A至41B)、或者微RNA表達(dá)水平和微RNA比例的組合(圖13A至13C、圖28A至28C和圖42A至42C)的不同組合作為特征，將使用KNN算法的分類器應(yīng)用于如上所述的三個(gè)樣品集合(惡性+良性、未定類和BethesdaIV)。如上所述，使用該算法運(yùn)行三個(gè)樣品集合。圖11A至11C、圖12A至12B和圖13A至13C提供該算法對(duì)于惡性樣本+良性樣本的結(jié)果。圖26A至26C、圖27A至27B和圖28A至28C提供該算法對(duì)于未定類樣本的結(jié)果。圖40A至40C、圖41A至41C和圖42A至42C提供該算法對(duì)于BethesdaIV樣本的結(jié)果。實(shí)施例9.3：SVM分類器應(yīng)用SVM(支持向量機(jī))作為算法進(jìn)行第三分析，其中使用線性內(nèi)核。分別使用微RNA表達(dá)水平(圖14A至14C、圖29A至29C和圖43A至43C)、微RNA比例(圖15A至15C、圖30A至30C和圖44A至44C)、或者微RNA表達(dá)水平和微RNA比例的組合(圖16A至16C、圖31A至31C和圖45A至45C)的不同組合作為特征，將使用SVM算法的分類器應(yīng)用于如上所述的三個(gè)樣品集合(惡性+良性、未定類和BethesdaIV)。如上所述，使用該算法運(yùn)行三個(gè)樣品集。圖14A至14C、圖15A至15C和圖16A至16C提供了該算法對(duì)于惡性樣本+良性樣本的結(jié)果。圖29A至29C、圖30A至30C和圖31A至31C提供了該算法對(duì)于未定類樣本的結(jié)果。圖43A至43C、圖44A至44C和圖45A至45C提供該算法對(duì)于BethesdaIV樣本的結(jié)果。實(shí)施例9.4：集成方法分類器使用集成方法作為算法進(jìn)行第四分析。使用AdaBoost創(chuàng)建最高為100個(gè)判別式分析分類器的集合，并將其應(yīng)用于數(shù)據(jù)。使用微RNA表達(dá)水平(圖17A至17C、圖32A至32C和圖46A至46C)、微RNA比例(圖18A至18C、圖33A至33C和圖47A至47C)、或者微RNA表達(dá)水平和微RNA比例的組合(圖19A至19C、圖34A至34C和圖48A至48C)的不同組合作為特征，將使用集成算法的分析應(yīng)用于如上所述的三個(gè)樣品集(惡性+良性、未定類和BethesdaIV)。如上所述，使用該算法運(yùn)行三個(gè)樣品集。圖17A至17C、圖18A至18C和圖19A至19C提供了該算法對(duì)于惡性樣本+良性樣本的結(jié)果。圖32A至32C、圖33A至33C和圖34A至34C提供了該算法對(duì)于未定類樣本的結(jié)果。圖46A至46C、圖47A至47C和圖48A至48C提供了該算法對(duì)于BethesdaIV樣本的結(jié)果。實(shí)施例10.用于含有髓質(zhì)的惡性樣本的分類器將實(shí)施例9使用的、但包括髓樣惡性樣本的相同樣本集合用于建立分類器。在該樣本集合中應(yīng)用所有分類器，在圖51和52中提供了從應(yīng)用于樣本集的判別式分析算法獲得的代表集。當(dāng)使用兩個(gè)微RNA比例(hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-138-5p和hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p)的歸一化值作為分類特征時(shí)，分類器的敏感性為84.7％，特異性為80.8％。當(dāng)使用兩個(gè)微RNA(hsa-miR-222-3p和hsa-miR-551b-3p)的歸一化值作為分類特征時(shí)，敏感性為85.2％，特異性為53.6％。實(shí)施例11：通過細(xì)胞特異性標(biāo)志的表達(dá)淘汰樣品貫穿本研究的一個(gè)重要考慮為結(jié)果的準(zhǔn)確率，其被提供于已采集FNA樣本的患者。實(shí)驗(yàn)室傾向于誤差以避免提供假陰性結(jié)果。另一方面，在FNA樣本的分析中，疑似診斷會(huì)使患者經(jīng)歷手術(shù)，其中25％的案例被發(fā)現(xiàn)是不必要的。例如，參考文獻(xiàn)中的至少一個(gè)報(bào)告描述了在9個(gè)案例中的7個(gè)，具有大量血液或甚至為純血的甲狀腺腫瘤樣本被誤診為疑似(Walsh等人.(2012)JClinEndocrinMetab.doi:10.1210/jc.2012-1923)?？紤]到該目標(biāo)，本發(fā)明人尋找可以用作細(xì)胞類型標(biāo)志并幫助篩查檢測(cè)樣本品質(zhì)的微RNA。因此，在訓(xùn)練群組中評(píng)價(jià)hsa-miR-486-5p(SEQIDNO.22)和hsa-miR-200c-3p(SEQIDNO.23至24)的表達(dá)，訓(xùn)練群組包括具有來自良性和惡性(非髓樣)甲狀腺病變的樣本的細(xì)胞塊，以及僅血液的四個(gè)樣本(出于該目的制備血液涂片載玻片，如本文所描述的提取RNA)。圖53顯示了該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。相比于在訓(xùn)練集中建立的閾值，血液微RNA標(biāo)志hsa-miR-486-5p非常高，上皮細(xì)胞標(biāo)志hsa-miR-200c-3p非常低。因此使用這些標(biāo)志濾除血液涂片樣本。這種表達(dá)模式說明這些樣本不具有足夠的上皮細(xì)胞(由于缺少上皮細(xì)胞標(biāo)志)以繼續(xù)測(cè)試。在測(cè)試條件下，該四個(gè)血液涂片樣本將被淘汰和舍棄。在血液涂片中，相比于閾值，也顯示出低的hsa-miR-138-5p(SEQIDNO.19至SEQIDNO.21)的表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。具有該表達(dá)譜的樣本適合從甲狀腺病變樣本分類的方案中被淘汰和/或舍棄。發(fā)明人先前建立了與白細(xì)胞相關(guān)的hsa-miR-342-3p(SEQIDNO.17至SEQIDNO.18)的表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，hsa-miR-342-3p相比于閾值的高表達(dá)顯示缺乏足夠的甲狀腺細(xì)胞，具有該表達(dá)譜的樣本適合從甲狀腺病變樣本分類的方案中被淘汰和/或舍棄。同時(shí)，hsa-miR-200c-3p的高表達(dá)一般為上皮細(xì)胞、特別地為甲狀腺細(xì)胞存在的象征(數(shù)據(jù)未顯示，圖53)。因此，hsa-miR-200c-3p高于閾值的表達(dá)可以作為樣本中甲狀腺細(xì)胞充足的指標(biāo)。實(shí)施例12：甲狀腺腫瘤亞型的分類使用來自Hashimoto(n＝6)的樣本和來自訓(xùn)練群組的濾泡性腺瘤(FA；n＝81)實(shí)現(xiàn)良性甲狀腺腫瘤亞型的分類。結(jié)果示于圖54中。hsa-miR-342-3p(SEQIDNO.17至SEQIDNO.18)和hsa-miR-31-5p在Hashimoto樣本中的表達(dá)比在訓(xùn)練集中建立的閾值高。因此，hsa-miR-342-3p單獨(dú)或與hsa-miR-31-5p組合的高表達(dá)可以用于將樣本分類為良性并進(jìn)一步歸類為亞型例如Hashimoto。進(jìn)一步地，發(fā)明人還檢測(cè)用于亞型良性甲狀腺腫瘤的微RNA比例。在該情況下，hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p的miR比例對(duì)于區(qū)分濾泡性腺瘤(FA)和Hashimoto樣本是重要的(數(shù)據(jù)未顯示)。使用訓(xùn)練群組的樣本子集(n＝177)實(shí)現(xiàn)惡性甲狀腺腫瘤亞型的分類。圖55提供了分析的一個(gè)實(shí)例，其中發(fā)現(xiàn)在乳頭狀癌中146b-5p、222-3p、31-5p、125b-5p、551-3p和375高度表達(dá)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)MID-16582在濾泡性癌中被高度表達(dá)。以下miR對(duì)的比例對(duì)于分類乳頭狀癌(PC)樣本與濾泡性癌樣本是重要的：hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p、hsa-miR-125b-5p:hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-222-3p:hsa-miR-486-5p、hsa-miR-31-5p:hsa-miR-342-3p、MID-16582:hsa-miR-200c-3p、MID-16582:hsa-miR-138-5p(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，發(fā)明人證明了可以使用miR比例特別是分母為細(xì)胞標(biāo)志微RNA如hsa-miR-486-5p、hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-138-5p和hsa-miR-342-3p的miR比例，進(jìn)行惡性甲狀腺腫瘤亞型化。實(shí)施例13：用于將甲狀腺結(jié)節(jié)分類為惡性或良性的方案圖56提供了用于甲狀腺結(jié)節(jié)樣本分析的方案的流程圖，從FNA樣本采集到實(shí)驗(yàn)室分析和診斷。從患有甲狀腺結(jié)節(jié)的患者采集FNA樣本，并將其進(jìn)行常規(guī)處理。由FNA樣本制備涂片。作為第一步，細(xì)胞病理學(xué)?？漆t(yī)生檢查FNA樣本并提供分析。在分析為非結(jié)論性的情況下，特別是在分類為BethesdaIII、IV或V，即所謂的“未定類”的樣本中，將該樣品送往RosettaGenomics實(shí)驗(yàn)室以進(jìn)行微RNA譜化和結(jié)論性診斷。從經(jīng)歷微RNA譜化的樣本中提取總RNA。如以上實(shí)施例中所示的，可通過擴(kuò)增(RT-PCR或NGS)或雜交(微陣列)實(shí)施微RNA譜化。該方案可包括以下任意一項(xiàng)：-在分類期間可使用一種或更多種算法，其可以應(yīng)用于包含單一微RNA表達(dá)、微RNA比例或其組合的數(shù)據(jù)。-其中hsa-miR-375的表達(dá)水平高于特定閾值的樣本可以被確定為惡性(例如至少10的閾值，或至少18的閾值)，例如在圖4(由陣列分析的表達(dá))中和圖20(由PCR分析的表達(dá))中所證明的。該閾值取決于樣本的歸一化，以及用于測(cè)量微RNA的方法。該閾值也可以為靶敏感性和特異性的函數(shù)。-其中hsa-miR-146b-5p的表達(dá)水平高于特定閾值的樣本會(huì)被確定為惡性(例如至少16的閾值)，例如在圖21、35和49中所證明的。該閾值取決于樣本的歸一化，以及用于測(cè)量微RNA的方法。該閾值也可以為靶敏感性和特異性的函數(shù)。-其中進(jìn)一步歸一化的hsa-miR-146b-5p:hsa-miR-342-3p比例高于特定閾值的樣本會(huì)被確定為惡性(例如至少16的閾值)，例如在圖22、36和50中所證明的。該閾值取決于樣本的歸一化，以及用于測(cè)量微RNA的方法。-由于不充足的來自腫瘤的材料，正規(guī)化子的表達(dá)水平可以用作舍棄樣本的指標(biāo)。因此，可以舍棄表現(xiàn)出任意正規(guī)化子的低水平、或正規(guī)化子表達(dá)的最小值、中值或最大值的樣本。例如，hsa-miR-23a-3p的低水平(相比于在群組中hsa-miR-23a-3p表達(dá)的整體水平)是可能被錯(cuò)誤分類的。對(duì)應(yīng)地，hsa-miR-23a-3p的高水平通過提高敏感性和特異性而改善分類(數(shù)據(jù)未顯示)。微RNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)的分析使得甲狀腺結(jié)節(jié)診斷為良性或惡性。如圖54和圖55中所示，包括微RNA表達(dá)可以與甲狀腺腫瘤亞型相關(guān)的結(jié)果使得，例如該樣本根據(jù)其甲狀腺腫瘤亞型被進(jìn)一步分類。前述具體實(shí)施例的描述充分揭示了本發(fā)明的一般特性，其他人可通過應(yīng)用現(xiàn)有知識(shí)輕而易舉地針對(duì)不同應(yīng)用修改和/或調(diào)整這些特定實(shí)施例，而無需過度實(shí)驗(yàn)也無需偏離一般構(gòu)思，因此，這種調(diào)整和修改應(yīng)該且旨在理解為在實(shí)施方式公開的等同方案的含義和范圍之內(nèi)。盡管本發(fā)明已經(jīng)結(jié)合其具體實(shí)施方式進(jìn)行描述，許多替代方案、修改方案和變體對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是明顯的。因此，其旨在包括所有落入隨附權(quán)利要求的寬范圍和精神中的這些替代方案、修改方案和變體。應(yīng)該理解盡管表明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，詳細(xì)的說明和具體實(shí)施例僅通過舉例說明方式給出，因?yàn)樵诒景l(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種變化和修改通過該詳細(xì)說明對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)變得顯而易見。序列表<110>羅塞塔金諾米克斯有限公司<120>在甲狀腺腫瘤分類中的MIRNA表達(dá)特征<130>184PCT<150>61/992,756<151>2014-05-13<150>61/992,531<151>2014-05-13<150>62/069,353<151>2014-10-28<150>62/139,066<151>2015-03-27<160>347<170>PatentIn版本3.5<210>1<211>21<212>DNA<213>人<400>1agctacatctggctactgggt21<210>2<211>24<212>DNA<213>人<400>2agctacatctggctactgggtctc24<210>3<211>22<212>DNA<213>人<400>3gacccatacttggtttcagagg22<210>4<211>21<212>DNA<213>人<400>4gcgacccatacttggtttcag21<210>5<211>21<212>DNA<213>人<400>5aggcaagatgctggcatagct21<210>6<211>23<212>DNA<213>人<400>6aggcaagatgctggcatagctgt23<210>7<211>21<212>DNA<213>人<400>7ggcaagatgctggcatagctg21<210>8<211>22<212>DNA<213>人<400>8tttgttcgttcggctcgcgtga22<210>9<211>22<212>DNA<213>人<400>9tccctgagaccctaacttgtga22<210>10<211>22<212>DNA<213>人<400>10tgagaactgaattccataggct22<210>11<211>24<212>DNA<213>人<400>11tgagaactgaattccataggctgt24<210>12<211>21<212>DNA<213>人<400>12tcagtgcatgacagaacttgg21<210>13<211>22<212>DNA<213>人<400>13tcagtgcatgacagaacttggg22<210>14<211>23<212>DNA<213>人<400>14tgtctgcccgcatgcctgcctct23<210>15<211>22<212>DNA<213>人<400>15aacattcaacctgtcggtgagt22<210>16<211>21<212>DNA<213>人<400>16caaaacgtgaggcgctgctat21<210>17<211>23<212>DNA<213>人<400>17tctcacacagaaatcgcacccgt23<210>18<211>24<212>DNA<213>人<400>18tctcacacagaaatcgcacccgtc24<210>19<211>17<212>DNA<213>人<400>19agctggtgttgtgaatc17<210>20<211>23<212>DNA<213>人<400>20agctggtgttgtgaatcaggccg23<210>21<211>24<212>DNA<213>人<400>21agctggtgttgtgaatcaggccgt24<210>22<211>22<212>DNA<213>人<400>22tcctgtactgagctgccccgag22<210>23<211>22<212>DNA<213>人<400>23taatactgccgggtaatgatgg22<210>24<211>23<212>DNA<213>人<400>24taatactgccgggtaatgatgga23<210>25<211>19<212>DNA<213>人<400>25agtgaagcattggactgta19<210>26<211>21<212>DNA<213>人<400>26atcacattgccagggatttcc21<210>27<211>21<212>DNA<213>人<400>27taagccagtttctgtctgata21<210>28<211>25<212>DNA<213>人<400>28tttctaagccagtttctgtctgata25<210>29<211>23<212>DNA<213>人<400>29atgacagattgacatggacaatt23<210>30<211>22<212>DNA<213>人<400>30gctgactcctagtccagggctc22<210>31<211>21<212>DNA<213>人<400>31tgctgactcctagtccagggc21<210>32<211>21<212>DNA<213>人<400>32gttcctgctgaactgagccag21<210>33<211>17<212>DNA<213>人<400>33ctgtctgagcgccgctc17<210>34<211>18<212>DNA<213>人<400>34atactctggtttcttttc18<210>35<211>19<212>DNA<213>人<400>35ttattgtcacgttctgatt19<210>36<211>21<212>DNA<213>人<400>36cacgctcatgcacacacccac21<210>37<211>22<212>DNA<213>人<400>37cacgctcatgcacacacccaca22<210>38<211>23<212>DNA<213>人<400>38tggaagactagtgattttgttgt23<210>39<211>23<212>DNA<213>人<400>39taccctgtagatccgaatttgtg23<210>40<211>23<212>DNA<213>人<400>40taaggtgcatctagtgcagatag23<210>41<211>21<212>DNA<213>人<400>41caacaccagtcgatgggctgt21<210>42<211>22<212>DNA<213>人<400>42tagcttatcagactgatgttga22<210>43<211>22<212>DNA<213>人<400>43tgtaaacatccttgactggaag22<210>44<211>22<212>DNA<213>人<400>44tgctatgccaacatattgccat22<210>45<211>23<212>DNA<213>人<400>45tggcagtgtcttagctggttgtt23<210>46<211>22<212>DNA<213>人<400>46agggacgggacgcggtgcagtg22<210>47<211>23<212>DNA<213>人<400>47tttggcactagcacatttttgct23<210>48<211>22<212>DNA<213>人<400>48aacccgtagatccgaacttgtg22<210>49<211>22<212>DNA<213>人<400>49tcgtaccgtgagtaataatgcg22<210>50<211>22<212>DNA<213>人<400>50gctacttcacaacaccagggcc22<210>51<211>21<212>DNA<213>人<400>51taccacagggtagaaccacgg21<210>52<211>22<212>DNA<213>人<400>52taacactgtctggtaaagatgg22<210>53<211>23<212>DNA<213>人<400>53tgtagtgtttcctactttatgga23<210>54<211>21<212>DNA<213>人<400>54cataaagtagaaagcactact21<210>55<211>22<212>DNA<213>人<400>55tgccctgtggactcagttctgg22<210>56<211>22<212>DNA<213>人<400>56tgagaactgaattccatgggtt22<210>57<211>22<212>DNA<213>人<400>57tcagtgcactacagaactttgt22<210>58<211>22<212>DNA<213>人<400>58ctggtacaggcctgggggacag22<210>59<211>22<212>DNA<213>人<400>59tctcccaacccttgtaccagtg22<210>60<211>23<2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