本發(fā)明涉及DNA變異檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種分子標(biāo)簽的制備方法。
背景技術(shù)：
：液態(tài)活檢技術(shù)，相比于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，因具有副作用小、操作簡(jiǎn)單、能重復(fù)取樣等特點(diǎn)，是目前腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療領(lǐng)域炙手可熱的技術(shù)，其主要檢測(cè)對(duì)象包括：循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)、循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)以及腫瘤外泌體等，可以提示腫瘤發(fā)展進(jìn)程及抗藥性等信息，指導(dǎo)個(gè)體化的用藥治療。ctDNA是一種存在于血漿或血清、腦脊液等體液中的細(xì)胞外游離的單鏈或雙鏈DNA，主要來(lái)自于壞死或凋亡的腫瘤細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞分泌的外排體及循環(huán)腫瘤細(xì)胞。ctDNA片段大小通常為160-180bp，在血液中半衰期2小時(shí)，攜帶有點(diǎn)突變、插入缺失、拷貝數(shù)、融合基因等突變信息，在人體血液循環(huán)系統(tǒng)中不斷流動(dòng)，可實(shí)時(shí)反映腫瘤患者當(dāng)前的信息。然而，在大部分實(shí)體瘤的早期和部分實(shí)體瘤的中晚期，血漿中的ctDNA含量極低，利用高通量測(cè)序技術(shù)(NGS)獲得的有效數(shù)據(jù)率偏低，同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)要求較高，限制實(shí)驗(yàn)樣本用量與實(shí)驗(yàn)次數(shù)。其次ctDNA樣本中含有大量的基因組DNA，導(dǎo)致高通量測(cè)序背景噪聲很高，用常規(guī)建庫(kù)測(cè)序方法時(shí)導(dǎo)致腫瘤信號(hào)完全淹沒(méi)在背景噪聲中，只能通過(guò)增加測(cè)序深度來(lái)提高ctDNA的檢測(cè)準(zhǔn)確性，這不僅增加了測(cè)序成本，同時(shí)不可避免的存在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中PCR引入的擴(kuò)增錯(cuò)誤。由于在文庫(kù)構(gòu)建、簇生成及邊合成邊測(cè)序過(guò)程中，存在PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))聚合酶的擴(kuò)增錯(cuò)誤，導(dǎo)致NGS測(cè)序每個(gè)堿基錯(cuò)誤率在5×10-4到10-2。因此，低于該頻率的變異檢測(cè)將無(wú)法與實(shí)驗(yàn)錯(cuò)誤區(qū)分出來(lái)?？茖W(xué)家通過(guò)計(jì)算算法和分子實(shí)驗(yàn)技術(shù)來(lái)改善NGS檢測(cè)的錯(cuò)誤率。CAPP-seq(深度測(cè)序癌癥個(gè)性化譜)系統(tǒng)利用統(tǒng)計(jì)模型來(lái)區(qū)分真正的變異，但僅限于已知的變異位點(diǎn)。目前，一種稱為UID(唯一標(biāo)識(shí))技術(shù)，也被稱為分子標(biāo)簽技術(shù)，用于NGS錯(cuò)誤糾正。該技術(shù)是在PCR擴(kuò)增前將每條分子引入了一個(gè)可識(shí)別的惟一序列編碼(barcode)，通過(guò)該惟一序列編碼來(lái)區(qū)分哪些是PCR擴(kuò)增引入的分子序列，哪些是樣本中原始的分子序列，從而提高測(cè)序數(shù)據(jù)有效率；同時(shí)也可以通過(guò)該惟一序列編碼來(lái)區(qū)分真正的變異與實(shí)驗(yàn)錯(cuò)誤，以提高測(cè)序準(zhǔn)確性，尤其對(duì)ctDNA樣本的低頻突變，意義重大。目前采用的UID技術(shù)，主要有兩種方法。第一種方法，在雙鏈DNA分子模板上引入雙鏈barcode序列，最為典型的例子是雙重測(cè)序技術(shù)，具體方法如下：(1)合成兩條單鏈接頭序列，其中一條帶有12個(gè)堿基的DuplexTag(雙面標(biāo)簽)序列和4個(gè)GTCA固定序列，兩條接頭序列進(jìn)行退火互補(bǔ)；(2)通過(guò)DNA聚合酶延伸，合成互補(bǔ)堿基；(3)通過(guò)DNA聚合酶在雙鏈3′端加上A堿基。在建庫(kù)過(guò)程中，每條DNA片段化分子都分別標(biāo)記了兩個(gè)不同tag序列(分別用α和β表示)，通過(guò)PCR擴(kuò)增之后，形成兩種PCR產(chǎn)物，即αβ家族和βα家族。只有在所有αβ家族和βα家族reads中，且雙鏈DNA片段中都存在的變異位點(diǎn)才是真正的變異位點(diǎn)。隨后又出現(xiàn)了對(duì)雙重測(cè)序技術(shù)的改進(jìn)(NatureProtocols，2014，9，2586-2606)，將加barcode序列的Y字型接頭從3′端A堿基改為了3′端T堿基，提高了建庫(kù)過(guò)程中DNA片段與接頭的連接效率。第二種方法是在通過(guò)在擴(kuò)增引物上增加標(biāo)簽來(lái)識(shí)別每條DNA序列，然后再進(jìn)行擴(kuò)增子的高通量測(cè)序。隨著技術(shù)的不斷改進(jìn)，又出現(xiàn)了iDES方法(集成數(shù)字錯(cuò)誤抑制)CAPP-seq技術(shù)檢測(cè)ctDNA(NatureBiotechnology，2016)，檢測(cè)極限達(dá)到0.0025％。該技術(shù)結(jié)合了以上兩種分子標(biāo)簽方法，利用雙重測(cè)序方法引入了插入序列編碼，同時(shí)通過(guò)PCR引入了指數(shù)序列編碼，從而進(jìn)一步提高了檢測(cè)準(zhǔn)確性。雙重測(cè)序技術(shù)采用12bp的隨機(jī)引物，以及4bp或5bp的固定序列，導(dǎo)致DNA測(cè)序數(shù)據(jù)中前16-17bp的數(shù)據(jù)不可用，降低了數(shù)據(jù)有效率；CAGT固定序列對(duì)于區(qū)分DNA分子序列無(wú)幫助，導(dǎo)致測(cè)序質(zhì)量降低；該方法中限于所有αβ家族和βα家族reads中，且雙鏈DNA片段中都存在的變異位點(diǎn)才是真正的變異位點(diǎn)；而雙重測(cè)序技術(shù)的改進(jìn)方法，通過(guò)內(nèi)酶切方法在3′端引入T堿基，反應(yīng)時(shí)間16h，操作周期長(zhǎng)，酶切反應(yīng)效率較低。鑒于上述缺陷，本設(shè)計(jì)人積極加以研究創(chuàng)新，以期創(chuàng)設(shè)一種新型分子標(biāo)簽的制備方法，使其更具有產(chǎn)業(yè)上的利用價(jià)值。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種分子標(biāo)簽的制備方法，該分子標(biāo)簽制備方法通過(guò)改變barcode長(zhǎng)度，去除固定序列，barcode不限于兩種固定序列，減少測(cè)序中數(shù)據(jù)的浪費(fèi)；使用DNA聚合酶在接頭末尾引入胸腺嘧啶T，提高反應(yīng)速率；用增加的DNA序列識(shí)別DNA擴(kuò)增中同一DNA模板產(chǎn)生的多個(gè)副本，有效區(qū)分DNA擴(kuò)增過(guò)程中的錯(cuò)誤和真實(shí)的DNA變異，更正確地評(píng)估DNA擴(kuò)增的偏好性。本發(fā)明的分子標(biāo)簽的制備方法包括以下步驟：(1)在DNA分子模板的5′接頭端引入barcode序列；(2)用DNA聚合酶延伸3′接頭端，與barcode序列互補(bǔ)，得到補(bǔ)齊序列；(3)向步驟(2)得到的補(bǔ)齊序列中加入DNA聚合酶，在補(bǔ)齊序列的3′接頭端引入胸腺嘧啶，得到改造的接頭；(4)將待測(cè)DNA破碎成DNA短片段，用DNA連接酶連接DNA短片段與改造的接頭，得到DNA連接產(chǎn)物；(5)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA連接產(chǎn)物，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；(6)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，然后比對(duì)到人類(lèi)參考基因組，在多個(gè)DNA模板副本中選取堿基錯(cuò)誤率最低的DNA序列，即為分子標(biāo)簽。進(jìn)一步的，在步驟(1)中，barcode序列的長(zhǎng)度為2-20bp。進(jìn)一步的，在步驟(1)中，barcode序列可以是已知的或未知的序列。進(jìn)一步的，在步驟(2)中，DNA聚合酶為T(mén)AQDNA聚合酶或Klenow酶。進(jìn)一步的，在步驟(3)中，DNA聚合酶為T(mén)AQDNA聚合酶或Klenow酶。進(jìn)一步的，在步驟(4)中，DNA短片段的長(zhǎng)度為150-300bp。進(jìn)一步的，在步驟(4)中，DNA連接酶為T(mén)4DNA連接酶或E·coliDNA連接酶。進(jìn)一步的，在步驟(6)中，用增加的DNA序列識(shí)別PCR擴(kuò)增中同一DNA模板產(chǎn)生的多個(gè)副本。進(jìn)一步的，在步驟(6)中，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙端測(cè)序或單端測(cè)序。進(jìn)一步的，在步驟(6)中，將DNA序列比對(duì)到參考基因組時(shí)，DNA片段在參考基因組上的位置的起點(diǎn)與終點(diǎn)相同的序列分為一組，比較同組DNA序列兩端的barcode序列，barcode序列相同的DNA序列認(rèn)為來(lái)自于同一DNA模板，來(lái)自同一DNA模板的多條類(lèi)似或相同序列合并為或保留其中一條序列。進(jìn)一步的，在步驟(6)中，由同一DNA模板產(chǎn)生的多個(gè)DNA副本的序列，通過(guò)計(jì)算每個(gè)位置堿基出錯(cuò)的概率，選取堿基錯(cuò)誤率最低的DNA序列，即為分子標(biāo)簽。進(jìn)一步的，分子標(biāo)簽用于基因變異檢測(cè)。借由上述方案，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：Barcode序列為隨機(jī)序列，最小長(zhǎng)度為2bp，能夠減少測(cè)序數(shù)據(jù)量的浪費(fèi)，且barcode序列不限于固定序列；接頭末尾引入堿基T，構(gòu)成粘性末端，提高了反應(yīng)速率；使用隨機(jī)序列標(biāo)記來(lái)源于同一DNA模板的測(cè)序序列，2個(gè)及以上DNA模板共同支持的變異即為真實(shí)變異；可有效識(shí)別DNA擴(kuò)增過(guò)程中同一DNA模板產(chǎn)生的多個(gè)副本，有效區(qū)分DNA擴(kuò)增過(guò)程中的錯(cuò)誤和真實(shí)的DNA變異，更正確地評(píng)估DNA擴(kuò)增的偏好性。上述說(shuō)明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，并可依照說(shuō)明書(shū)的內(nèi)容予以實(shí)施，以下以本發(fā)明的較佳實(shí)施例并配合附圖詳細(xì)說(shuō)明如后。附圖說(shuō)明圖1是本發(fā)明接頭改造過(guò)程示意圖；圖2是本發(fā)明將DNA對(duì)比到人類(lèi)參考基因組的過(guò)程示意圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例11、接頭(adapter)的合成與退火(1)各取序列為5'-TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'和5’-TCTTCTACAGTCANNNNNNAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-3’的測(cè)序adapterDNA一管，其中序列中的NNNNNN為6bp的隨機(jī)barcode，這里的N表示A/T/G/C中任何一個(gè)堿基都可以。即這管adapterDNA中包含的序列最多是4的6次方種，這些序列的差異取決于N為何種堿基。在4℃下，20000g離心10min，保證adapter粉末聚集在管底部，標(biāo)號(hào)分別為adapter-1、adapter-2。(2)開(kāi)啟管蓋，此時(shí)需注意不要讓adapter粉末從管中飄出。分別向adapter-1、adapter-2中加入Nuclease-Freewater(無(wú)核酸酶水)溶解粉末，使其濃度為100nmol/mL，即100μM；然后在-20℃保存，若長(zhǎng)期不使用在-80℃下保存。(3)各取25μLadapter-1(100μM)與25μLadapter-2(100μM)，均勻混合，得到50μL濃度為50μM的母液。在PCR儀(ABI9700)上進(jìn)行梯度溫度降溫退火，退火程序選擇如表1所示。表1退火程序選擇(4)將退火后的母液置于-20℃保存，取用時(shí)再根據(jù)需要稀釋至工作液濃度。2、退火后Adapter質(zhì)控抽取退火后的母液，用水稀釋到1μM(1:49加水稀釋)，測(cè)Aglient2100，峰值在90-100bp。3、Adapter補(bǔ)齊實(shí)驗(yàn)使用TAKARAPrimeSTARHSDNAPolymerase(R010Q)補(bǔ)齊接頭，將50μL接頭分兩管，配制50μLPCR反應(yīng)液體系反應(yīng)，每管組分如表2所示?？稍谑覝叵屡渲芇CR反應(yīng)液，配制反應(yīng)液時(shí)，將各組份放于冰上。配制完成后，在68℃下孵育30min。表2各管中的反應(yīng)體系組分體積(μL)終濃度5×PrimeSTARBuffer(Mg2+Plus)101xdNTPMixture(2.5mMeach)4200μMeachTemplate(接頭)25～82.5ngPrimeSTARHSDNAPolymerase(2.5U/μl)0.51.25U/50μL滅菌蒸餾水10.5Total504、Adapter補(bǔ)齊后純化然后采用乙醇沉淀法純化補(bǔ)齊后的adapter后，步驟如下：(1)加入30μL醋酸鈉和250μL的無(wú)水乙醇，混勻后-20℃放置一夜；(2)4℃下離心，16000rcf離心30min；(3)棄掉上清液，然后加750μL冷凍的80％乙醇，4℃下離心，16000rcf離心5min；(4)棄掉上清液，瞬時(shí)離心到1000rcf，然后停止；(5)吸干液體，室溫下開(kāi)蓋，晾干5min；(6)加30μLNuclease-Freewater，徹底溶解沉淀，混勻離心，瞬時(shí)離心到1000rcf，然后停止。5、Adapter加“T”使用TAKARAExTaqDNAPolymerase(RR001Q)、TAKARAdTTP(4029Q)，反應(yīng)體系50μL，各組分如表3所示。將反應(yīng)體系在72℃下孵育2h。表3adapter加“T”反應(yīng)體系組分體積(μL)終濃度10×ExTaqBuffer(Mg2+Plus)51xdTTP(20μmol100mM)12mMTemplate(adapter)31～82.5ngTaKaRaExTaq(5U/μl)15U滅菌蒸餾水12Total506、Adapter加“T”后純化使用乙醇沉淀法對(duì)引入了胸腺嘧啶的adapter進(jìn)行純化，具體步驟如下：(1)加入30μL醋酸鈉和125μL的無(wú)水乙醇，混勻后于-80℃下放置2h；(2)4℃離心，16000rcf離心30min；(3)棄掉上清液，加750μL冷凍的80％乙醇，4℃離心16000rcf5min；(4)棄掉上清液，瞬時(shí)離心到1000rcf，然后停止；(5)吸干液體，室溫下開(kāi)蓋晾干5min；(6)加30μLNuclease-Freewater，溶解沉淀，混勻離心，瞬時(shí)離心到1000rcf，然后停止，將其保存于-20℃下。Adapter制備好后，按Illumina常規(guī)建庫(kù)方法對(duì)DNA進(jìn)行建庫(kù)，即將待檢測(cè)DNA用DNA破碎儀破碎成長(zhǎng)度為200bp的DNA短片段，用T4DNA連接酶連接DNA短片段與改造的adapter，得到DNA連接產(chǎn)物；PCR擴(kuò)增得到的DNA連接產(chǎn)物，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；用IlluminaHiseq4000測(cè)序儀對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙端測(cè)序。然后用bwa比對(duì)軟件將測(cè)序得到的DNA序列比對(duì)到人類(lèi)參考基因組hg19，具體如下：如圖2所示，序列標(biāo)簽中“～”代表從樣本中擴(kuò)增到的DNA序列，“～”兩端的“-”代表adapter中引入的序列標(biāo)簽(barcode序列)，兩端的“-”可以一樣也可以不一樣，按照比對(duì)后DNA序列在hg19參考基因組上的位置將序列分成A、B兩組，小寫(xiě)字母表示barcode序列名稱。將DNA序列比對(duì)到參考基因組時(shí)，DNA片段在參考基因組上的位置的起點(diǎn)與終點(diǎn)相同的序列分為一組，如在圖2中，A-a----A-d和B-j-----B-l序列分別有多條，分別是同一DNA模板的多個(gè)副本，將多條類(lèi)似或相同序列合并為或保留其中一條序列，形成新的DNA待檢測(cè)數(shù)據(jù)；其中如果同一DNA模板的多個(gè)副本之間序列有差異，這些有差異的位置的堿基將通過(guò)計(jì)算聯(lián)合錯(cuò)誤概率得到錯(cuò)誤率最低的堿基型，得到處理后的序列，即為分子標(biāo)簽，如圖中B-j------B-l序列，處理后的序列可能與原來(lái)序列中某一條相同，也可能與原來(lái)的序列都不同。本專(zhuān)利制備的分子標(biāo)簽用于識(shí)別DNA或者cDNA文庫(kù)制備中PCR步驟產(chǎn)生的DNA副本，提高基因變異檢測(cè)的準(zhǔn)確性，2個(gè)及以上DNA模板共同支持的變異即為真實(shí)變異。實(shí)施例21、接頭(adapter)的合成與退火(1)各取序列為5'-TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'和5’-TCTTCTACAGTCANNAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-3’的測(cè)序adapterDNA一管，其中序列中的NN為2bp的隨機(jī)barcode，這里的N表示A/T/G/C中任何一個(gè)堿基都可以。在4℃下，20000g離心10min，保證adapter粉末聚集在管底部，標(biāo)號(hào)分別為adapter-1、adapter-2。(2)開(kāi)啟管蓋，此時(shí)需注意不要讓adapter粉末從管中飄出。分別向adapter-1、adapter-2中加入Nuclease-Freewater(無(wú)核酸酶水)溶解粉末，使其濃度為100nmol/mL，即100μM；然后在-20℃保存，若長(zhǎng)期不使用在-80℃下保存。(3)各取25μLadapter-1(100μM)與25μLadapter-2(100μM)，均勻混合，得到50μL濃度為50μM的母液。在PCR儀(ABI9700)上進(jìn)行梯度溫度降溫退火，退火程序選擇如表1所示。表1退火程序選擇(4)將退火后的母液置于-20℃保存，取用時(shí)再根據(jù)需要稀釋至工作液濃度。2、退火后Adapter質(zhì)控抽取退火后的母液，用水稀釋到1μM(1:49加水稀釋)，測(cè)Aglient2100，峰值在90-100bp。3、Adapter補(bǔ)齊實(shí)驗(yàn)使用TAKARAPrimeSTARHSDNAPolymerase(R010Q)補(bǔ)齊接頭，將50μL接頭分兩管，配制50μLPCR反應(yīng)液體系反應(yīng)，每管組分如表2所示?？稍谑覝叵屡渲芇CR反應(yīng)液，配制反應(yīng)液時(shí)，將各組份放于冰上。配制完成后，在68℃下孵育30min。表2各管中的反應(yīng)體系組分體積(μL)終濃度5×PrimeSTARBuffer(Mg2+Plus)101xdNTPMixture(2.5mMeach)4200μMeachTemplate(接頭)25～82.5ngPrimeSTARHSDNAPolymerase(2.5U/μl)0.51.25U/50μL滅菌蒸餾水10.5Total504、Adapter補(bǔ)齊后純化然后采用乙醇沉淀法純化補(bǔ)齊后的adapter后，步驟如下：(1)加入30μL醋酸鈉和250μL的無(wú)水乙醇，混勻后-20℃放置一夜；(2)4℃下離心，16000rcf離心30min；(3)棄掉上清液，然后加750μL冷凍的80％乙醇，4℃下離心，16000rcf離心5min；(4)棄掉上清液，瞬時(shí)離心到1000rcf，然后停止；(5)吸干液體，室溫下開(kāi)蓋，晾干5min；(6)加30μLNuclease-Freewater，徹底溶解沉淀，混勻離心，瞬時(shí)離心到1000rcf，然后停止。5、Adapter加“T”使用TAKARAExTaqDNAPolymerase(RR001Q)、TAKARAdTTP(4029Q)，反應(yīng)體系50μL，各組分如表3所示。將反應(yīng)體系在72℃下孵育2h。表3adapter加“T”反應(yīng)體系組分體積(μL)終濃度10×ExTaqBuffer(Mg2+Plus)51xdTTP(20μmol100mM)12mMTemplate(adapter)31～82.5ngTaKaRaExTaq(5U/μl)15U滅菌蒸餾水12Total506、Adapter加“T”后純化使用乙醇沉淀法對(duì)引入了胸腺嘧啶的adapter進(jìn)行純化，具體步驟如下：(1)加入30μL醋酸鈉和125μL的無(wú)水乙醇，混勻后于-80℃下放置2h；(2)4℃離心，16000rcf離心30min；(3)棄掉上清液，加750μL冷凍的80％乙醇，4℃離心16000rcf5min；(4)棄掉上清液，瞬時(shí)離心到1000rcf，然后停止；(5)吸干液體，室溫下開(kāi)蓋晾干5min；(6)加30μLNuclease-Freewater，溶解沉淀，混勻離心，瞬時(shí)離心到1000rcf，然后停止，將其保存于-20℃下。Adapter制備好后，按Illumina常規(guī)建庫(kù)方法對(duì)DNA進(jìn)行建庫(kù)，即將待檢測(cè)DNA用DNA破碎儀破碎成長(zhǎng)度為200bp的DNA短片段，用T4DNA連接酶連接DNA短片段與改造的adapter，得到DNA連接產(chǎn)物；PCR擴(kuò)增得到的DNA連接產(chǎn)物，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；用IlluminaHiseq4000測(cè)序儀對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙端測(cè)序。然后用bwa比對(duì)軟件將測(cè)序得到的DNA序列比對(duì)到人類(lèi)參考基因組hg19，具體如下：如圖2所示，序列標(biāo)簽中“～”代表從樣本中擴(kuò)增到的DNA序列，“～”兩端的“-”代表adapter中引入的序列標(biāo)簽(barcode序列)，兩端的“-”可以一樣也可以不一樣，按照比對(duì)后DNA序列在hg19參考基因組上的位置將序列分成A、B兩組，小寫(xiě)字母表示barcode序列名稱。將DNA序列比對(duì)到參考基因組時(shí)，DNA片段在參考基因組上的位置的起點(diǎn)與終點(diǎn)相同的序列分為一組，如在圖2中，A-a----A-d和B-j-----B-l序列分別有多條，分別是同一DNA模板的多個(gè)副本，將多條類(lèi)似或相同序列合并為或保留其中一條序列，形成新的DNA待檢測(cè)數(shù)據(jù)；其中如果同一DNA模板的多個(gè)副本之間序列有差異，這些有差異的位置的堿基將通過(guò)計(jì)算聯(lián)合錯(cuò)誤概率得到錯(cuò)誤率最低的堿基型，得到處理后的序列，即為分子標(biāo)簽，如圖中B-j------B-l序列，處理后的序列可能與原來(lái)序列中某一條相同，也可能與原來(lái)的序列都不同。本專(zhuān)利制備的分子標(biāo)簽用于識(shí)別DNA或者cDNA文庫(kù)制備中PCR步驟產(chǎn)生的DNA副本，提高基因變異檢測(cè)的準(zhǔn)確性，2個(gè)及以上DNA模板共同支持的變異即為真實(shí)變異。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，并不用于限制本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和變型，這些改進(jìn)和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3