本發(fā)明涉及黃酮類化合物，具體來說，涉及異鼠李素，尤其涉及沙棘果渣中異鼠李素的制備方法及其應用方法。

背景技術：

眾所周知，沙棘(Hippophae rhamnoides)富含多種維生素、氨基酸和酰胺類、有機酸和糖類、蛋白質、酚類和黃酮類、脂肪酸、微量元素等生物活性物質。沙棘中含有的黃酮類化合物，主要為異鼠李素、槲皮素、山奈酚及其苷類、氯原酸、黃芪苷、兒茶素、豬草苷、楊梅酮等；沙棘果肉中含量最高的三種黃酮苷元為異鼠李素、槲皮素、山奈酚。近年來，沙棘汁、油、葉茶等產品作為保健、藥用和日化添加劑已廣泛受到人們的重視。中國專利數據庫中，已有涉及異鼠李素應用的專利申請件，如031172202號《異鼠李素及其衍生物在治療腫瘤藥物中的應用》、2012100396334號《異鼠李素作為酪氨酸酶抑制劑的應用》、2012101871015號《一種異鼠李素的新用途》、2013101465069號《異鼠李素在制備用于阿霉素輔助治療藥物中的應用》等。

為了實現沙棘資源的深度開發(fā)，人們對沙棘提取異鼠李素進行實驗研究，得到的成果申請了一批中國專利，例如ZL2007101392240號《從沙棘果泥中提取精制異鼠李素的方法》、ZL201110296340X號《從沙棘果肉中連續(xù)提取分離沙棘油和異鼠李素的方法》和2013104234780號《一種異鼠李素的制備方法》。在加工沙棘果過程中產生的鮮果渣以及烘干得到干果渣，每年約有幾百萬噸。若不對其進行綜合利用，將會污染環(huán)境，同時造成沙棘資源的嚴重浪費。

沙棘果渣中含有大量糖類、脂類、蛋白質、維生素、氨基酸、微量元素、黃酮類等多種生物活性物質。沙棘果渣中的黃酮含量豐富，因此對沙棘果渣進行深加工以使沙棘果渣變廢為寶，合理利用自然資源。大量研究發(fā)現異鼠李素具有緩解心絞痛，抗心肌缺氧，抗心律失常，清除氧自由基，降低血清中膽固醇，促進血流通暢，抗腫瘤，調節(jié)免疫功能等多種生物活性及藥理作用，應用前景十分廣闊。

技術實現要素：

本發(fā)明旨在提供沙棘果渣中異鼠李素的制備方法，實現沙棘果渣變廢為寶，并使其能夠在制藥業(yè)中得到合理利用。

本發(fā)明的又一目的是提供異鼠李素在制備藥物方面的應用方法，使其能夠制備降血糖的藥物，得以用于治療糖尿病。

發(fā)明人提供的沙棘果渣中異鼠李素的制備方法包括以下步驟：

⑴冷提：

定量稱取沙棘果渣置于桶中，加入乙醇常溫浸提，之后將提取液倒入抽濾罐中真空抽濾，收集濾液；濾渣再加入乙醇，二次常溫浸提，之后將提取液倒入抽濾罐中真空抽濾，收集濾液，棄濾渣；

⑵濃縮：

將兩次提取的濾液抽入減壓濃縮罐中，減壓回收溶劑，濃縮得浸膏；

⑶去油：

將上一步所得的浸膏，趁熱用二氯甲烷去油，過濾，得粗晶體；

⑷重結晶：

將步驟⑶所得粗晶體，用丙酮或石油醚等有機溶劑溶解結晶，晶體烘干，即得異鼠李素。

上述第⑴步中，所述使用的沙棘果渣中總黃酮含量超過1％，其中異鼠李素含量約為0.20％～0.60％；所述加入的乙醇質量分數為95％；所述兩次常溫浸提的時間均為24h。

上述第⑵步中，所述減壓回收溶劑控制的真空度為0.08MPa。

上述第⑶步中，所述二氯甲烷的用量與浸膏質量的比例為20︰1～50︰1。

上述第⑷步中，所述異鼠李素晶體純度的質量控制指標為70％～75％

本發(fā)明的沙棘果渣中異鼠李素的制備方法，是經過大量實驗優(yōu)化后制定的，對提取方式常溫冷提、密封加熱和超聲波提取進行比較，發(fā)現密封加熱法雖然提取效果較好，但提取過程中提取出較多油脂和其他雜質，影響異鼠李素進一步分離純化；常溫冷提法在提取時提取出油脂和其他雜質較少，分離純化過程中異鼠李素結晶效果更好，故選用常溫冷提法進行提取沙棘中異鼠李素。通過對去油溶劑無水乙醇、乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷的篩選，選用二氯甲烷去油可溶解油脂成份，且HPLC測定溶劑溶解浸膏中異鼠李素峰面積較小，故篩選二氯甲烷去油；然后對甲醇、乙醇、乙酸乙酯、水、乙醚、丙酮、氯仿、石油醚等重結晶溶劑進行篩選，發(fā)現丙酮或石油醚等有機溶劑溶解粗晶體重結晶，得到的異鼠李素含量高、回收率高，可獲得具有明確降血糖藥理作用的沙棘果渣中異鼠李素。

所得沙棘果渣中異鼠李素的成分分析：以純度≥98％異鼠李素對照品采用TLC和HPLC分析方法定性鑒別，確定其中含有異鼠李素。

所得沙棘果渣中異鼠李素進行含量測定：

異鼠李素含量：以純度≥98％的異鼠李素為對照品，采用高效液相法測定異鼠李素的含量。結果顯示，沙棘果渣所提純的晶體中異鼠李素含量為70％～75％。

色譜條件：C18(25cm×4.6mmID，5μm)，流動相：甲醇︰水︰磷酸為48︰52︰0.3，流速：0.8ml/min，檢測波長360nm，柱溫：45℃，HPLC-UV。

發(fā)明人提供的異鼠李素在制備藥物方面的應用方法是按照常規(guī)的制劑工藝將沙棘果渣中異鼠李素直接制成劑型為片劑、或膠囊劑、或顆粒劑、或口服液的降糖藥物；或者作為原料藥制備治療糖尿病的中藥復方制劑。

為進一步說明在制備降糖藥物中的應用，對沙棘果渣中異鼠李素進行α-葡萄糖苷酶的抑制活性實驗與異鼠李素促進細胞葡萄糖消耗活性測定，結果表明，沙棘果渣中異鼠李素隨著濃度的增加，對α-葡萄糖苷酶的抑制率呈現增加趨勢，在異鼠李素濃度達到0.5mg/ml之后，抑制率基本趨于穩(wěn)定；1mg/ml阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率為55.86％，異鼠李素濃度在0.1mg/ml時，對α-葡萄糖苷酶的抑制率為52.5％，抑制率與1mg/ml阿卡波糖無顯著差異；0.2μg/mL的異鼠李素促進HepG2細胞葡萄糖消耗的作用與0.17μg/mL的二甲雙胍相當。

據報道,按每加工1000kg沙棘果，可產生鮮果渣400～500kg，烘干得120～165kg干果渣，每年約有果渣資源上百萬噸。本發(fā)明的沙棘果渣中異鼠李素的制備方法具有工藝簡便、經濟實用、成本低廉的優(yōu)點，能夠用于工業(yè)化生產，本發(fā)明實現了對沙棘果渣資源的綜合利用，避免了沙棘果渣對環(huán)境的污染，適用于加工沙棘果的企業(yè)。

附圖說明

圖1為不同濃度異鼠李素溶液的抑制效果圖(n＝3)

具體實施方式

實施例1沙棘果渣中異鼠李素的制備

總黃酮含量超過1％、其中異鼠李素含量為0.20％～0.60％的沙棘果渣投料量為25kg，用250L質量分數為95％的乙醇常溫浸提24h。準確稱取5份沙棘果渣，每份5kg，置于5個塑料桶中，每個桶加入約50L 95％乙醇，常溫浸提24h，將提取液倒入抽濾罐中真空抽濾，收集濾液。濾渣再加入約50L 95％乙醇，常溫浸提24h，提取液倒入抽濾罐中抽濾，收集濾液，棄濾渣；將兩次提取的濾液抽入減壓濃縮罐中，真空度為0.08MPa下減壓回收溶劑，濃縮得浸膏；趁熱用二氯甲烷去油，二氯甲烷用量與浸膏質量的比例30︰1，過濾，得粗晶體；用丙酮或石油醚等有機溶劑溶解結晶，晶體烘干，即得沙棘果渣中異鼠李素晶體；所得異鼠李素晶體質量大于55g，其中異鼠李素含量達70％以上，異鼠李素回收率可達60％以上。

實施例2沙棘果渣中異鼠李素對α-葡萄糖苷酶抑制活性測定

1.實驗目的

觀察不同濃度異鼠李素對于α-葡萄糖苷酶的抑制活性，選取異鼠李素濃度與1mg/L阿卡波糖相當的抑制α-葡萄糖苷酶效果，為制備有效的降血糖藥物提供依據。

2.實驗用儀器及試劑

電子分析天平(BSA124S)：Sartorius；

酶標儀(MULTISKAN GO-1510-00816)：Thermo；

異鼠李素：由本實驗制得，純度為72.8％；

α-葡萄糖苷酶G0660(98％)：Sigma；

對硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷PNPG(99％)：Aladdin；

阿卡波糖Acarbose(97.4％)：中國藥品生物制品鑒定所；

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、碳酸鈉(分析純)：成都金山化學試劑有限公司；

3.實驗方法及結果

3.1不同濃度異鼠李素溶液對α-葡萄糖苷酶抑制活性測定

實驗分為對照組、樣品組、陽性組、空白組合背景組。各組分別加入緩沖液、阿卡波糖、樣品和α-葡萄糖苷酶混勻，37℃保溫10min后，再加2.5mmol/L的PNPG底物，37℃繼續(xù)反應20min，最后加入0.2mol/LNa2CO3，2min后終止反應，在400nm波長處測定吸光度OD值并記錄，計算抑制率。

抑制率(％)＝(對照組OD值一樣品組OD值)/(對照組OD值)x 100

實驗設置對照組、陽性組、樣品組、空白組和背景組。實驗組加入不同濃度(0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2mg/ml)的異鼠李素溶液，剩余四組按照表6.1所示加入所需的試劑。由于異鼠李素溶液有顏色干擾，因此每個樣品需測背景吸收，并對最終測定結果進行校正，每組分別設置三個平行樣，結果取平均值。具體操作和結果見下表1：

表1各組溶液配制

將采用酶標儀測定所得到的實驗數據加以整理后，以劑量為橫坐標，抑制率為縱坐標繪圖，平行3次實驗，取平均值繪圖，所得結果見附圖1。

由圖1可知，隨著異鼠李素濃度的增大，其對α-葡萄糖苷酶的抑制率也呈現增長趨勢，異鼠李素濃度為0.001、0.005、0.01mg/ml時，對α-葡萄糖苷酶的抑制率無顯著差異(P﹤0.05)，異鼠李素濃度在0.05、0.1、0.5mg/ml之間時，對α-葡萄糖苷酶的抑制率增長幅度較大，異鼠李素濃度在0.5、1、2mg/ml之間時，對α-葡萄糖苷酶的抑制率增長減緩，無顯著差異(P﹤0.05)。

3.2異鼠李素與阿卡波糖對比

不同濃度的異鼠李素分別與1mg/ml阿卡波糖對比其對α-葡萄糖苷酶的抑制作用，每組分別設置三個平行樣，結果取平均值后見表2：

表2不同濃度異鼠李素與阿卡波糖對比結果(n＝3)

表2數據表明：異鼠李素溶液濃度在0.5、1、2mg/ml時，其對α-葡萄糖苷酶的抑制率大于1mg/ml阿卡波糖，且差異顯著(P﹤0.05)；異鼠李素濃度在0.1mg/ml時，其對α-葡萄糖苷酶的抑制率與1mg/ml阿卡波糖無顯著差異(P﹤0.05)。說明異鼠李素溶液濃度在0.1mg/ml及以上時，即可達到與1mg/L阿卡波糖相當的抑制α-葡萄糖苷酶效果。

實施例3沙棘果渣中異鼠李素促進細胞葡萄糖消耗活性測定

1.實驗目的

觀察沙棘果渣中異鼠李素促進細胞葡萄糖消耗活性，為制備有效的降血糖藥物提供依據。

2.實驗用儀器及試劑

異鼠李素：由本實驗制得，純度為72.8％；

牛血清蛋白BSA(96％)：GEN-VIEW；

二甲基亞砜：美國Sigma公司；

3.篩選模型

葡萄糖消耗試驗(人肝癌HepG2細胞模型)

3.1模型原理

本試驗采用HepG2細胞，培養(yǎng)一定時間后，通過測定細胞培養(yǎng)上清液中葡萄糖含量，來判斷樣品是否促進細胞對葡萄糖的消耗。

3.2計算公式

葡萄糖消耗率(GC％)＝[(培養(yǎng)基葡萄糖含量－試驗組葡萄糖含量)/培養(yǎng)基葡萄糖含量]×100

樣品促進細胞葡萄糖消耗率(％)＝[(對照組葡萄糖含量－樣品組葡萄糖含量)/對照組葡萄糖含量]×100

4.實驗方法及結果

異鼠李素晶體樣0.1g(72.8％)，樣品準確稱量，用DMSO溶解；陽性對照二甲雙胍，分子量為165.63，其摩爾濃度為：1×10^-6mol/L。試驗樣品每個濃度平行3次，重復2次，試驗結果以M±SD表示。結果見表3：

表3測定結果(n＝3)

結果表明：異鼠李素促進細胞消耗葡萄糖的作用與陽性藥物二甲雙胍相當。

實施例4沙棘果渣中異鼠李素片劑的制備

取沙棘果渣中異鼠李素10g，粉碎過100目篩，加入糊精3g混合均勻，再加入10％淀粉漿適量制成軟材，20目篩網制粒，50℃干燥，過30目篩整粒，加入羥丙基纖維素3g和硬脂酸鎂1g充分混勻，壓片，薄膜包衣，制得片劑300片。

實施例5沙棘果渣中異鼠李素膠囊劑的制備

取沙棘果渣中異鼠李素10g，粉碎過100目篩，加入糊精3g，微晶纖維適量，用稀乙醇制粒，20目篩網制粒，50℃干燥，整粒，加入硬脂酸鎂適量，用30目篩混合均勻，采用膠囊板灌裝，即得膠囊劑300粒。

實施例6沙棘果渣中異鼠李素顆粒劑的制備

取沙棘果渣中異鼠李素10g，粉碎過100目篩，加入糊精100g，加入10％淀粉漿適量，制成顆粒，50℃下干燥，分裝，即得顆粒劑。